THESE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSITE PARIS 6Spcialit
Chimie AnalytiquePrsente par
Mr SOLTANI MohamedPour obtenir le grade de
DOCTEUR de l'UNIVERSITE PARIS 6 Sujet de thse:
Distribution lipidique et voies mtaboliques chez quatre bactries
Gram-ngatives hydrocarbonoclastes. Variation en fonction de la
source de carbone.
soutenue le 18 juin 2004
devant le jury compos de:
M. Jean-Claude BERTRAND M. Pierre DOUMENQ M. Jean GUEZENNEC M.
Alain SALIOT M. Claude LARGEAU
Rapporteur Rapporteur Examinateur Examinateur Directeur de
thse
Avant Propos
Les travaux prsents dans ce manuscrit ont t raliss au
Laboratoire de Chimie Bioorganique et Organique Physique (UMR 7573)
de l'Ecole Nationale Suprieure de Chimie de Paris. Je tiens
exprimer ma profonde gratitude Mr Claude Largeau pour m'avoir
accueilli dans son laboratoire et d'avoir accept de diriger mon
travail de recherche.
Au cours de ces annes de thse j'tais encadr par Monsieur Pierre
Metzger, Ingnieur de recherche au CNRS. Qu'il trouve ici
l'expression de ma plus vive gratitude pour ses conseils
scientifiques, sa disponibilit et pour l'amlioration de la rdaction
de ce rapport.
Je remercie vivement Monsieur le Professeur Alain Saliot,
Monsieur le Professeur JeanClaude Bertrand, Monsieur le Professeur
Pierre Doumenq et Monsieur Jean Guezennec d'avoir accept de juger
ce travail.
J'exprime toute ma reconnaissance toutes les personnes qui un
moment ou un autre, se sont intresses mes recherches. Parmi
celles-ci je cite notamment tout le personnel du Laboratoire de
Chimie Bioorganique et Organique Physique l'ENSCP: Batrice Allard,
Odile Largeau, Yves Pouet, Jolle Templier et Sylvie Derenne; du
Laboratoire d'Ocanographie de Marseille, particulirement Monique
Acquaviva qui m'a initi aux cultures des bactries sur
hydrocarbures.
Enfin, un grand merci tous mes collgues du Laboratoire de Chimie
Bioorganique et Organique physique l'ENSCP pour l'ambiance
sympathique qu'ils ont su crer tout au long de ces annes de
thse.
toute ma famille Anne-lise tous mes amis
2
SOMMAIREINTRODUCTION GENERALE.11
CHAPITRE I
Rappels bibliographiquesI. POLLUTION DE LENVIRONNEMENT MARIN PAR
LES HYDROCARBURES..14 I.1. INTRODUCTION14 I.2. FORMULES CHIMIQUES
DES HYDROCARBURES DE DIFFERENTES SOURCES DANS LES ENVIRONNEMENTS
MARINS...16 I.2.1. Les composs ptroliers17 I.2.1.1. Les
hydrocarbures saturs..17 I.2.1.2. Les hydrocarbures aromatiques..18
I.2.1.3. Les composs polaires.....18 I.2.1.4. Les asphaltnes18
I.2.2. Les hydrocarbures biognes.....20 I.2.2.1. Les hydrocarbures
aliphatiques saturs.20 I.2.2.2. Les hydrocarbures aliphatiques
insaturs.21 I.2.2.3. Les cycloalcanes et les cycloalcnes..21
I.2.2.4. Les hydrocarbures aromatiques21 I.3. DEVENIR DES
HYDROCARBURES EN MILIEU MARIN..22 I.3.1. Facteurs abiotiques dans
llimination des hydrocarbures..22 I.3.1.1. Evaporation23 I.3.1.2.
Solubilisation..23 I.3.1.3. Emulsification... 23 I.3.1.4.
Sdimentation 23 I.3.1.5. Photo-oxydation. 23 I.3.1.6.
Biodgradation23 I.3.2. Pntration des hydrocarbures dans la chane
alimentaire. 24 II. BIODEGRADATION AEROBIE DES HYDROCARBURES PAR
LES MICROORGANISMES..... 25 II.1. INTRODUCTION. 25
3
II.2. PROCESSUS DOXYDATION DES HYDROCARBURES.. 26 II.2.1. Voies
mtaboliques de la dgradation des hydrocarbures aliphatiques.. 27
II.2.1.1. Dgradation des n-alcanes... 27 II.2.1.1.1. Loxydation
monoterminale... 27 II.2.1.1.2. Oxydation des n-alcanes par le
systme de dioxygnase... 29 II.2.1.1.3. Oxydation des alcanes via
alcnes. 30 II.2.1.1.4. Oxydation subterminale. 30 II.2.1.1.5.
Oxydation diterminale 31 II.2.1.2. Biodgradation des alcanes
ramifis... 32 II.2.1.3. Biodgradation des alcnes.. 36 II.2.2. Voies
mtaboliques de dgradation des hydrocarbures saturs cycliques.... 37
II.2.3. Biodgradation des hydrocarbures aromatiques. 40 II.3.
FACTEURS PHYSIQUES ET CHIMIQUES AFFECTANT LA BIODEGRADATION DES
HYDROCARBURES. 43 II.3.1. Composition chimique des hydrocarbures...
43 II.3.2. Etat physique et concentration des hydrocarbures ou du
ptrole..... 45 II.3.3. Influence de la temprature.. 46 II.3.4.
Influence de loxygne.....47 II.3.5. Influences des lments
nutritifs.. 48 II.3.6. Effet de la salinit et du pH.... 48 II.3.7.
Effet de la pression.. 48 III. BIODEGRADATION DES HYDROCARBURES
DANS LES GISEMENTS DE PETROLE ET VOIES ANAEROBIES..... 50 III.1.
BIODEGRADATION DES HYDROCARBURES DANS LES PUITS DE PETROLE... 50
III.1. VOIES DE DEGRADATION ANAEROBIE.. 52 IV. LES LIPIDES DES
BACTERIES GRAM-NEGATIVES. 55 IV.1. LES PHOSPHOLIPIDES.... 57 IV.2.
LES LIPOPOLYSACCHARIDES... 58 IV.3. INFLUENCE DES PARAMETRES
ENVIRONMENTAUX SUR LA COMPOSITION LIPIDIQUE DES BACTERIES
GRAM-NEGATIVES.. 61 IV.3.1. Influence de la temprature sur la
composition lipidique. 61 IV.3.2. Influence de la salinit sur la
composition lipidique...... 62 IV.3.3. Influence de la source de
carbone sur la composition lipidique 63 V. BIOMARQUEURS.... 63 V.1.
NOTION DE BIOMARQUEURS. 63 V.2. BIOMARQUEURS BACTERIENS...... 65
V.2.1. Les acides gras. 66
4
V.2.1.1. Les acides gras saturs normaux... 67 V.2.1.2. Les
acides gras insaturs68 V.2.1.3. Les acides gras ramifis. 69
V.2.1.4. Les acides gras cyclopropaniques.. 70 V.2.2. Les hydroxy
acides... 71 V.2.3. Autres marqueurs bactriens.. 74 V.3. LES
HYDROCARBURES.. 77
CHAPITRE II
Etude exprimentaleI. ORIGINE DES SOUCHES... 80 II. MILIEUX ET
CONDITIONS DE CULTURE.. 80 II.1. COMPOSITION CHIMIQUE DES MILIEUX
DE CULTURES .80 II.2. CONSEVATION DES SOUCHES. 81 II.3. CULTURE SUR
HYDROCARBURES. 81 III. SYNTHESE DES HYDROCARBURES.. 82 IV.
EXTRACTION DES LIPIDES DES DIFFERENTES CULTURES. 84 IV.1. ISOLEMENT
DES LIPIDES FACILEMENT EXTRACTIBLES. 85 IV.2. EXTRACTION DES
LIPIDES EN MILIEU BASIQUE 85 IV.3. EXTRACTION DES ACIDES LABILES EN
MILIEU ACIDE.. 86
V. SYNTHESE DU DIAZOMETHANE86VI. PREPARATION DES DERIVES
DIMETHYL DISULFURES (DMDS). 87 VII. DETERMINATION DE LA POSITION DU
GROUPEMENT HYDROXYLE DES HYDROXYACIDES ET DES ALCOOLs: PREPARATION
DES DERIVES TRIMETHYLSILYLES... 88 VIII. FORMATION DES DERIVES
N-ACYL-PYRROLIDIDES.. 88 IX. REDUCTION CATALYTIQUE DES ACIDES GRAS
INSATURES.. 88 X. METHODES UTILISEES POUR L'ANALYSE DES
LIPIDES..... 89 X.1. CHROMATOGRAPHIE GAZEUSE.. 89 X.2.
CHROMATOGRAPHIE GAZEUSE COUPLEE A LA SPECTROMETRIE DE MASSE PAR
IMPACT ELECTRONIQUE. 89
5
CHAPITRE III
Biodgradation de diffrentes familles d'hydrocarbures par
Marinobacter hydrocarbonoclasticus: influence sur la composition
lipidique et voies mtaboliques.
I. INTRODUCTION. 92 II. CARACTERISTIQUES PHYSIOLOGIQUES ET
BIOCHIMIQUES DE M. hydrocarbonoclasticus... 93 III. HYDROCARBURES
TESTES ET CULTURES 94 IV. PROTOCOLE D'EXTRACTION DES LIPIDES ET
RESULTATS QUANTITATIFS. 96 V. IDENTIFICATION ET DISTRIBUTION DES
LIPIDES DE M. hydrocarbonoclasticus CULTIVEE SUR ALCANES NORMAUX
(C19 ET C21)... 99 V.1. IDENTIFICATION DES LIPIDES EN SPECTROMETRIE
DE MASSE. 99 V.1.1. Esters mthyliques d'acides gras normaux
saturs... 99 V.1.2. Drivs DMDS des esters mthyliques d'acides gras
insaturs... 103 V.1.3. Drivs N-acyl pyrrolidides 105 V.1.4. Drivs
TMS des alcools gras saturs et insaturs 107 V.I.5. Drivs TMS des
esters mthyliques des -hydroxy acides.. 111 V.1.6. -Mthoxy acides..
115 V.2. LIPIDES "NON LIES".. 117 V.3. LIPIDES LABILES EN MILIEU
BASIQUE 122 V.4. LIPIDES LABILES EN MILIEU ACIDE. 127 VI. CULTURE
DE M. hydrocarbonoclasticus SUR HYDROCARBURES RAMIFIES 130 VI.1.
IDENTIFICATION DES LIPIDES. 130 VI.2. LIPIDES "NON LIES" 132 VI.3.
LIPIDES LABILES EN MILIEU BASIQUE.. 140 VI.4. LIPIDES LABILES EN
MILIEU ACIDE... 144 VI.5. CONCLUSIONS PARTIELLES SUR L'INFLUENCE
DES ALCANES LINEAIRES 147 VI.5.1. Influence de la parit des alcanes
sur la composition lipidique. 147 VI.5.2. Influence de la
ramification des alcanes sur la composition lipidique.. 149 VI.5.3.
Voies de dgradation des alcanes linaires par M.
hydrocarbonoclasticus 152 VII. CULTURE DE M. hydrocarbonoclasticus
SUR ALCENE: n-NONADEC-1-ENE 158
6
VII.1. IDENTIFICATION DES LIPIDES. 158 VII.2. LIPIDES "NON
LIES".... 160 VII.3. LIPIDES LABILES EN MILIEU BASIQUE ...164
VII.4. LIPIDES LABILES EN MILIEU ACIDE...... 164 VII.5. CONCLUSIONS
PARTIELLES SUR LA DEGRADATION DU NONADEC-1-ENE. 169 VII.5.1.
Influence sur la composition lipidique. 169 VII.5.2. Voies
mtaboliques du n-nonadc-1-ne.. 169 VIII. CULTURES DE M.
hydrocarbonoclasticus SUR CYCLOHEXYLET PHENYL-ALCANES.. 172 VIII.1.
IDENTIFICATION DES LIPIDES... 172 VIII.2. LIPIDES "NON LIES".. 177
VIII.3. LIPIDES LABILES EN MILIEU BASIQUE.... 179 VIII.4. LIPIDES
LABILES EN MILIEU ACIDE.... 181 VIII.5. CONCLUSION PARTIELLE SUR LA
DEGRADATION DES HYDROCARBURES CYCLIQUES PAR M.
hydrocarbonoclasticus.... 188 VIII.5.1. Influence des cyclohexyl-
et phnyl-alcanes sur la composition en acides gras de M.
hydrocarbonoclasticus..... 188 VIII.5.2. Voies mtaboliques des
cyclohexyl- et phnyl-alcanes.. 190 IX. Les hydroxy acides
indicateurs de l'activit bactrienne... 180 X. CONCLUSION. 196
CHAPITRE IV Influence de la source de carbone sur la composition
lipidique de bactries Gram-ngatives, Marinobacter aquaeolei,
Acinetobacter calcoaceticus et Pseudomonas oleovorans. Distribution
des -hydroxy acides de la membrane extrieure
I. INTRODUCTION.. 199 II. PRESENTATION DES BACTERIES ETUDIEES...
199 II.1. CARACTERISTIQUES PHYSIOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES DE
Marinobacter
aquaeolei.... 199II.2. CARACTERISTIQUES PHYSIOLOGIQUES ET
BIOCHIMIQUES D'Acinetobacter
calcoaceticus.. 200
7
II.3. CARACTERISTIQUES PHYSIOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES DE
Pseudomonas
Oleovorans.. 201III. RESULTATS QUANTITATIfs......202 IV.
IDENTIFICATION DES LIPIDES... 205 V. DISTRIBUTION DES LIPIDES DE M.
AQUAEOLEI EN FONCTION DE LA SOURCE DE CARBONE ET COMPARAISONS AVEC
M. hydrocarbonoclasticus. 209 V.1. RESULTATS.... 209 V.1.1.
Cultures sur actate d'ammonium.. 210 V.1.1.1. Lipides "non lis"...
210 V.1.1.2. Lipides labiles en milieu basique.217 V.1.1.3. Lipides
labiles en milieu acide218 V.1.2. Cultures sur n-nonadcane.. 218
V.1.2.1. Lipides "non lis"218 V.1.2.2. Lipides labiles en milieu
basique.... 219 V.1.2.3. Lipides labiles en milieu acide220 V.1.3.
Culture sur iso-nonadcane..221 V.1.3.1. Lipides "non lis"221
V.1.3.2. Lipides labiles en milieu basique.. 222 V.1.3.3. Lipides
labiles en milieu acide... 222 V.2. DISCUSSION.. 224 V.2.1.
Influence de la nature de la source de carbone sur la composition
lipidique. 224 V.2.2. Variation de la composition en -hydroxy
acides. 225 V.2.3. Mtabolisme des hydrocarbures. 225 VI.
DISTRIBUTION DES LIPIDES D'A. calcoaceticus EN FONCTION DE LA
SOURCE DE CARBONE ET COMPARAISON AVEC M. hydrocarbonoclasticus..
226 VI.1. RESULTATS. 226 VI.1.1. Culture sur actate. 226 VI.1.1.1.
Lipides "non lis" 226 VI.1.1.2. Lipides labiles en milieu basique.
230 VI.1.1.3. Lipides labiles en milieu acide. 230 VI.1.2. Culture
sur n-nonadcane.. 231 VI.1.2.1. Lipides "non lis". 231 VI.1.2.2.
Lipides labiles en milieu basique.. 231 VI.1.2.3. Lipides labiles
en milieu acide...232 VI.1.3. Culture sur iso-nonadcane... 232
VI.1.3.1. Lipides "non lis". 232
8
VI.1.3.2. Lipides labiles en milieu basique.. 233 VI.1.3.3.
Lipides labiles en milieu acide.. 233 VI.2. DISCUSSION. 233 VI.2.1.
Influence de la nature de la source de carbone sur la composition
lipidique 233 VI.2.2. Influence de la source de carbone sur la
composition en alcools 234 VI.2.3. Variation de la composition en
hydroxy acides 234 VI.2.4. Mtabolisme des hydrocarbures 236 VII.
INFLUENCE DE LA SOURCE DE CARBONE SUR LA COMPOSITION LIPIDIQUE DE
Pseudomonas oleovorans 59.11T. 236 VII.1. RESULTATS 236 VII.1.1.
Culture sur actate d'ammonium 237 VII.1.1.1. Lipides "non lis" 237
VII.1.1.2. Lipides labiles en milieu basique 237 VII.1.1.3. Lipides
labiles en milieu acide..237 VII.1.2. Culture sur n-octane. 243
VII.1.2.1. Lipides "non lis"... 243 VII.1.2.2. Lipides labiles en
milieu basique .243 VII.1.2.3. Lipides labiles en milieu acide 243
VII.1.3. Culture sur 2-mthylheptane... .243 VII.1.3.1. Lipides "non
lis"... 244 VII.1.3.2. Lipides labiles en milieu basique 244
VII.1.3.3. Lipides labiles en milieu acide 245 VII.2. DISCUSSION...
245 VII.2.1. Influence de la source de carbone sur la composition
lipidique 245 VII.2.2. Variation de la composition en -hydroxy
acides... 247 VII.2.3. Mtabolisme des alcanes courts par P.
oleovorans. 248 VIII. CONCLUSION 249 CONCLUSION GENERALE.. 252
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 256
AnnexesANNEXE 1: SYNTHESE DES ALCANES RAMIFIES 279 ANNEXE 2:
SPECTRES DE MASSE DES HYDROCARBURES SYNTHETISES. 281
9
Introduction gnrale
INTRODUCTION GENERALE
L'exploitation humaine des gisements de ptrole n'a cess
d'augmenter depuis le dbut du sicle dernier. L'extraction, le
transport et l'utilisation de cette source d'nergie entranent des
risques de pollution (accidentelle et chronique) pour
l'environnement marin pouvant influencer l'quilibre cologique et
parfois entrainer la destruction de l'cosystme. L'limination du
ptrole de l'environnement marin ncessite l'intervention de
diffrents facteurs biotiques et abiotiques. Parmi ces facteurs la
biodgradation par les microorganismes et en particulier les
bactries est le processus naturel le plus important dans la
dpollution de l'environnement marin. En consquence, les mcanismes
de dgradation des hydrocarbures ptroliers (alcanes linaires,
phnylalcanes, cycloalcanes, hydrocarbures polycycliques et
polyaromatiques) par les bactries marines ainsi que les paramtres
pouvant influencer la biodgradation ont t largement tudis.
Cependant, il apparat que trs peu d'tudes ont t entreprises sur les
voies mtaboliques d'oxydation d'hydrocarbures de structures
diffrentes par une mme bactrie. Si l'influence des hydrocarbures
sur la composition en acides gras des bactries a t bien tudie, par
contre celle sur la composition d'autres lipides, tels les hydroxy
acides est encore assez mal connue.
Dans le but d'amliorer nos connaissances sur de tels composs,
nous avons entrepris une tude complte de la composition lipidique
de la bactrie marine Marinobacter hydrocarbonoclasticus en fonction
de la nature de l'hydrocarbure (n-alcanes, iso- et antisoalcanes,
phnyl- et cyclohexyl-alcanes, alcane ramifi en milieu de chane et
1-alcne) utilis comme source unique de carbone et d'nergie. Dans le
but d'avoir une meilleure connaissance des lipides des bactries
Gram-ngatives et en particulier de la distribution des -hydroxy
acides de la membrane extrieure, la composition lipidique de trois
autres espces, Marinobacter aquaeolei, Acinetobacter calcoaceticus
et Pseudomonas oleovorans a t galement dtermine en fonction de la
source de carbone.
Les principaux objectifs de ce travail de recherche taient donc
(i) l'analyse qualitative et quantitative dtailles de la
composition lipidique de quatre bactries en fonction de la source
de carbone, (ii) la dtermination des voies mtaboliques mises en jeu
au cours de la dgradation des hydrocarbures tests, (iii) mieux
connatre la composition en -hydroxy
11
acides des lipopolysaccharides des bactries Gram-ngatives et
(iv) en dfinir les implications gochimiques ventuelles. Ce document
comporte quatre chapitres. Le premier chapitre prsente un rappel
des principales donnes bibliographiques concernant, d'une part,
l'origine des hydrocarbures dans l'environnement et leurs voies
mtaboliques chez les bactries, d'autre part, quelques lments
relatifs la notion de biomarqueurs. L'ensemble du matriel et des
mthodes utiliss pour la culture et l'tude de la composition
lipidique des bactries Gram-ngatives est ensuite dcrit dans le
deuxime chapitre. Le troisime chapitre est consacr l'tude de
l'influence des hydrocarbures sur les lipides de la bactrie marine
M. hydrocarbonoclasticus et les voies mtaboliques de dgradation de
ces composs. Dans le quatrime et dernier chapitre, nous exposons et
discutons l'ensemble des rsultats relatifs aux lipides de trois
autres bactries Gram-ngatives, M. aquaeolei, A. calcoaceticus et P.
oleovorans en fonction de la source de carbone et nous les
comparons ceux de M. hydrocarbonoclasticus afin de dterminer
l'influence des hydrocarbures comportant des chanes aliphatiques
sur la distribution des hydroxy acides de la membrane extrieure des
bactries Gram-ngatives. Une conclusion gnrale et une bibliographie
compltent cette rdaction. Enfin, deux annexes, la premire dcrit la
procdure de synthse des hydrocarbures ramifis utiliss pour les
cultures et la deuxime rassemble les spectres de masse de tous les
hydrocarbures synthtiss.
12
CHAPITRE I
Rappels bibliographiques
13
I. POLLUTION DE LENVIRONNEMENT MARIN PAR LES HYDROCARBURES
I.1. INTRODUCTION Le ptrole, premire source dnergie, a connu une
progression ininterrompue de son extraction pendant plus dun sicle.
Suite au dveloppement du transport et de lindustrie, la production
mondiale na cess daugmenter pour atteindre 11 millions de tonnes
par jour (11 Mt/j) en 2000 et on sattend une augmentation de la
production de 1,9 % / an dans la dcennie actuelle. Des estimations
de la consommation mondiale de ptrole, suggrent une augmentation de
lordre de 44,7 millions de barils par jour (soit 6,4 Mt/j) entre
1999 et 2020. La consommation mondiale passera ainsi de 74,9 Mb/j
(soit 10,7 Mt/j) en 1999 119,6 Mb/j (soit 17 Mt/j) en 2020. La
croissance annuelle est donc estime 2,3 % / an, alors quelle ntait
que de 1,6 % / an entre 1970 et 1999 (National Research
Council-U.S., 2002). Le ptrole est une source de pollution des
environnements marins qui peut largement influencer les quilibres
cologiques et par extension les activits conomiques des rgions
sinistres. "The National Research Council" a estim dans la revue
"Oil in the sea: inputs, fates and effects, 2002", la quantit de
ptrole introduite annuellement dans les ocans par les diverses
voies 1,3 millions de tonnes / an, sachant quune tonne de ptrole
peut couvrir environ une surface de 12 kilomtres carrs. Les mares
noires dues des accidents ptroliers, ne reprsentent quune faible
proportion du total des hydrocarbures dverss en mer chaque anne, de
faon plus insidieuse, invisible mais quotidienne.
Le tableau I.1, montre les catastrophes les plus importantes
ainsi que les quantits de ptrole dverses et les zones affectes,
depuis 1967 (premier chouage dun ptrolier sur les ctes franaises)
nos jours. La plus grande catastrophe fut celle de la tte du puits
sous marin dIxtoc one, dans le golfe du Mexique o 350 000 tonnes de
ptrole brut se sont dverses dans locan entre juin 1979 et fvrier
1980 (soit 3 Amoco Cadiz). Dautres sources viennent alourdir le
bilan, citons lexemple de la premire guerre du Golfe, o la fin du
conflit en 1991 a rvl la catastrophe des champs de puits de ptrole
en flamme et le naufrage de ptroliers bombards, dversant des
quantits importantes de brut. Le bilan total a t estim 800 000
tonnes dverses, 40 millions de tonnes de sols saturs de ptrole et
700 km de ctes pollues.
14
Tableau I.1. Accidents ptroliers les plus importants de 1967
2002 (Kennish, 2001 modifi).Anne 1967 1970 1976 1977 1978 1979 1979
1979 1979 1979 1979 1979 1979 1980 1980 1983 1984 1984 1985 1985
1989 1992 1993 1999 2001 2002 Nom du ptrolier Torrey Canyon Texaco
Oklahoma Urquiola Grand Zenith Amoco Cadiz Ixtoc / Platform Andros
Patria Betelgeuse Gino Aviles Atlantic Express Burmah Agate
Independenta Irenes Serenade Juan A. Lavalleja Castello deBelver
Assimi Pericles GC Neptunia Nova Exxon Valdez Aegean Sea Brear
Erika Baltic Carrier Prestige Quantit de ptrole (tonne) 117 000 31
500 100 000 32 000 230 000 350 000 60 000 35 000 42 000 25 000 276
000 40 000 94 600 102 000 40 000 255 500 51 400 46 600 60 000 71
100 35 000 79 000 84 000 28 000 30 000 77 000 Zones affectes France
U.S. Espagne Canada France Golf du Mexique Espagne Irlande France
Mer dArabie Tobago U.S. Turkie Grece Algrie Sud Afrique Oman Qatar
Iran Iran Alaska France / Espagne Norvge / Scotland France Mer
Baltiqus France / Espagne
Les hydrocarbures ptroliers qui arrivent dans lenvironnement
marin peuvent avoir quatre origines majeures: les sources
gochimiques, lextraction de ptrole, le transport et la
consommation. La part des sources gochimiques dues des fuites
naturelles qui apparaissent au fond des ocans slve 47 %. Les 53 %
restant se rpartissent ainsi: 38 % proviennent des rejets suite la
consommation (exemple: rejets dindustries bases terre et des
grandes agglomrations urbaines), 12 % sont dus au transport et 3 %
la production ptrolire offshore (Figure I.1).
Il faut enfin signaler quune quantit non ngligeable
dhydrocarbures peut provenir de lactivit de nombreux
microorganismes et des plantes (Albro, 1976; Bachofen, 1982;
Saliot, 1981).
15
Production 3% Transport 12 %
Sources Gochimiques 47 % Consommation 38 %
Figure I.1. Les diffrentes sources ptrolires responsables de la
pollution de lenvironnement marin (National Research Council,
2002).
Les impacts de la pollution par les hydrocarbures sont
multiples. Les aspects les plus vidents sont les grandes
catastrophes trs mdiatises comme les mares noires: forte mortalit
de la faune aquatique, bords de mer englus,. Il ne faut pas ngliger
les consquences conomiques de ces vnements pour les riverains
vivant de la pche ou du tourisme ainsi que pour les collectivits
territoriales et ltat. Mais les effets court terme comme trs long
terme sur les cosystmes terrestres et aquatiques sont mal
connus.
I.2.
FORMULES
CHIMIQUES
DES
HYDROCARBURES DE DIFFERENTES
SOURCES DANS LES ENVIRONNEMENTS MARINS
Les hydrocarbures dans lenvironnement marin peuvent avoir trois
origines principales: Les rejets industriels et urbains, sources
dhydrocarbures ptroliers ou pyrolytiques. Les vgtaux aquatiques
(phytoplancton, macrophytes) et organismes
htrotrophiques (zooplancton, bacterioplancton). Les vgtaux
suprieurs terrestres via la matire organique dtrique des sols,
rsultant du drainage des bassins versants.
Notons que la premire origine est anthropique, alors que les
deux dernires sont biogniques, donc issues de la biosynthse
rcente.
16
I.2.1. Les composs ptroliers
Les ptroles bruts sont constitus de diffrentes familles des
composs (Figure I.2.) dont la composition chimique varie normment
selon leur origine gographique et gologique (Tissot et Welte,
1984). Les hydrocarbures constituent la fraction la plus importante
d'un brut ptrolier, ils reprsentent entre 65 et 95 % de la plupart
des ptroles bruts. Les composs ptroliers peuvent tre classs en
quatre familles principales qui sont prsentes en proportions
variables selon lorigine: les hydrocarbures saturs (30 70 %), les
hydrocarbures aromatiques et polyaromatiques (20 40 %), les composs
polaires (5 25 %) et les asphaltnes (0 10 %). Les produits
ptroliers sont aussi introduits dans lenvironnement marin sous
forme de produits raffins: carburants et huiles, leurs compositions
dpendent de lorigine du ptrole et des oprations subies au cours du
raffinage. On dnombre environ 230 composants pour lessence et de
lordre de 2000 pour un fuel lourd.
I.2.1.1. Les hydrocarbures saturs
Parmi lesquels, on distingue * Les alcanes linaires (n-alcanes,
CnH2n+2), dont la longueur de chane varie de 7 40 atomes de
carbone, constituent une des classes les plus abondantes (10 40 %
des hydrocarbures totaux d'un brut ptrolier). * Les alcanes
ramifis: les plus abondants sont les iso-alcanes (groupement mthyle
en position 2), les autres composs ramifis antiso (groupement
mthyle en position 3) ou polyramifis tels que les isoprnodes
(exemple: pristane, phytane) sont beaucoup moins nombreux. Ces
composs se trouvent dans le ptrole brut dans des proportions
sensiblement gales celles des n-alcanes. Par contre le ptrole brut
dorigine fossile ne contient en gnral pas dalcnes. * Les
cycloalcanes: renferment des composs cycliques ( 5 ou 6 atomes de
carbone) saturs et le plus souvent substitus. Quelques drivs
polycycliques sont aussi prsents et certains dentre eux tels les
stranes et les triterpanes sont caractristiques dun ptrole brut.
Cette famille peut reprsenter entre 30 et 50 % des hydrocarbures
totaux dun ptrole brut.
17
I.2.1.2. Les hydrocarbures aromatiques
Plusieurs familles d'hydrocarbures aromatiques et
polyaromatiques dont le nombre de noyaux varie de 2 6 sont prsents
dans les ptroles bruts. Ces composs sont domins par des composs
mono-, di- et tri-aromatiques (Neff, 1979). En gnral, les
hydrocarbures aromatiques sont moins abondants que les alcanes, et
ne reprsentent que 10 30 % des hydrocarbures totaux d'un brut
ptrolier. Les composs alkyls sont, la plupart du temps, plus
abondants que les molcules parentales dont ils drivent. Certains
cycles aromatiques peuvent tre associs des noyaux (cycle 5 ou 6
atomes de carbone) saturs (naphtoaromatiques).
I.2.1.3. Les composs polaires
Cette fraction correspond des molcules htrocycliques, telles
que: des composs oxygns: phnols, acides carboxyliques, alcools,
aldhydes, des composs soufrs: mercaptans, sulfures, disulfures, des
composs azots: pyridines, quinolines,
Les drivs soufrs sont dans la plupart des cas plus abondants que
les composs oxygns ou azots.
I.2.1.4. Les asphaltnes
Les asphaltnes correspondent une classe de composs de hauts
poids molculaires, insolubles dans le pentane ou lhexane. La
structure de ces composs est mal connue du fait, dune part de leur
composition chimique complexe ( base de cycles aromatiques
condenss, de naphto-aromatiques, de ramifications et dhtroatomes
(O, N, S), dautre part de mthodes analytiques difficilement
utilisables.
Les mtaux sont galement prsents mais ltat de traces. Les plus
abondants sont le vanadium et le nickel, mais du fer, du sodium, du
cuivre et de luranium ont galement t dtects.
18
Aromatiquesn-heptadecane (n-C17)
Tetramethyl-2,6,10,14pentadecane (pristane)
n-alcanes Alcanes chaines ramifies
Benzenes
Phenanthrene
AlcnesTetramethyl-2,6,10,14hexadecane (phytane)
Naphtalenes
Pyrene
PETROLE BRUT
Cycloalcanes
Chrysene
Fluoranrhene Cyclopentanes
Benzopyrene-3,4
Cyclohexanes
Perylene
Composs azotsN N
Composs oxygnsR - OH AlcoolsOH
Composs soufrsR - SH MercaptansS
AsphaltnesPyridineN N
PorphyrinesQuinoline R - CHO Aldehydes PhenolO
ThiophneS
MtauxPyrrole Carbazole
R-S-R Sulfures R - COOH Acides
Dibenzothiophne Furanne
R-S-S-R Disulfures
Figure I.2. Composs hydrocarbons et non hydrocarbons prsents
dans le ptrole brut.
19
I.2.2. Les hydrocarbures biognes
Les organismes vivants biosynthtisent des hydrocarbures
aliphatiques, aromatiques et polyaromatiques condenss. Le
dveloppement des techniques analytiques
(chromatographiques et spectroscopiques) a dmontr la complexit
de ces composs prsents en faibles quantits dans les colonnes deau
et les sdiments. En effet, la biosynthse et les mcanismes de
transformations (dissolution, vaporation, photo-oxydation,
adsorptiondesorption sur des particules, transformations
biologiques, ) conduisent un mlange de composs dont la spcificit
dpend des organismes producteurs et des conditions physicochimiques
du milieu. Ainsi, la stabilit de ces composs a fait deux des
marqueurs biologiques et gochimiques dune trs grande valeur.
Plusieurs travaux de recherche se sont intresss la distribution et
labondance des hydrocarbures dans les environnements marins, ce qui
permet dvaluer les niveaux de pollution, destimer une ventuelle
augmentation en concentration suite aux phnomnes de transport et
aux activits industrielles et de prdire les effets des
hydrocarbures anthropogniques sur les processus physiques,
chimiques et biologiques (Saliot, 1981).
I.2.2.1. Les hydrocarbures aliphatiques saturs
* Les alcanes linaires (n-alcanes): Les n-alcanes sont des
constituants prdominants dans la distribution des hydrocarbures
dans lenvironnement marin. Les espces phytoplanctoniques et les
macro-algues synthtisent des n-alcanes dont les longueurs de chanes
varient respectivement de n-C14 n-C32 et de n-C20 n-C30 (Saliot,
1981), avec un maximum n-C15 ou n-C17 (Blumer et al. 1971; Gelpi et
al., 1970; Clark et Blumer, 1967; Youngblood et al., 1971). Une
distribution des n-alcanes sans prdominance paire / impaire a t
observe chez les bactries (C13 C31) et les plantes infrieures
terrestres (C15 C23) avec un maximum dans la zone de C17 C20 pour
les bactries (Han and Calvin, 1969; Oro et al., 1967). Cependant,
les plantes suprieures synthtisent des n-alcanes de haut poids
molculaire (C23 C33) prdominance impaire. * Les alcanes ramifis:
Les hydrocarbures isoprniques sont les plus frquents dans
lenvironnement marin et ils prsentent plusieurs origines (Saliot,
1981). Le pristane (2,6,10,1420
tetramthylpentadcane) a t identifi en faible quantit chez les
phytoplanctons, chez les macro-algues, les zooplanctons et pourrait
tre lhydrocarbure majeur chez certaines bactries anarobies. Han et
Clavin (1969), ont identifi le phytane
(2,6,10,14-tetramethylhexadecane) en faibles concentrations chez
des bactries, qui a t aussi identifi chez des micro-algues (Volkman
et al., 1980). On trouve galement dautres composs comme le
7-mthylheptadcane et 8mthylheptadcane, identifis chez les
micro-algues. Ces alcanes portant une ramification mthyle sont
absents chez les autres organismes et en particulier les bactries.
Ces dernires sont caractrises par des hydrocarbures courtes chanes,
avec une prdominance marque de composs nombre impair datomes de
carbone et surtout ramifis en position iso et antiso (Kolattukudy,
1976). Dautres sources peuvent tre galement lorigine des
hydrocarbures ramifis notamment les plantes dont les iso-alcanes
pourraient constituer dans certains cas plus de 50 % des
hydrocarbures totaux (Eglinton et al., 1962; Saliot, 1981).
I.2.2.2. Les hydrocarbures aliphatiques insaturs Les organismes
marins synthtisent un grand nombre dolfines chanes droites,
possdant jusqu' six doubles liaisons, o prdominent les composs
suivants (Saliot, 1981; Volkman et al., 1980, 1981): n-C17:1,
n-C18:1, n-C19:1, n-C21:5 et n-C21:6 chez les micro-algues.
n-C17:1, n-C19:5, n-C21:5 et n-C21:6 chez les macro-algues.
n-C21:6, n-C14:1, n-C19:1, n-C22:1 et n-C30:1 chez le zooplancton.
n-C17:1 et n-C17:2 chez les bactries.
Des polyolfines ramifies telles que le squalne et les carotnes
ont t galement identifis.
I.2.2.3. Les cycloalcanes et les cycloalcnes Le plus simple
hydrocarbure cyclique est un alkylcyclopropane identifi dans des
algues marines (Youngblood et al., 1971) mais la plupart de ces
composs sont des terpnodes comme les triterpnodes pentacycliques
(Saliot, 1981).
I.2.2.4. Les hydrocarbures aromatiques La biosynthse directe de
ces composs par des microorganismes ou des vgtaux est un sujet
controvers. En effet, lexception dune faible contribution des
algues, des bactries et 21
des plantes, les hydrocarbures aromatiques sont gnralement
considrs comme produits de pyrolyse des activits humaines et des
phnomnes naturels (incendies de forts, ruptions volcaniques)
(Bouchez et al., 1996; Saliot, 1981).
I.3. DEVENIR DES HYDROCARBURES EN MILIEU MARIN I.3.1. Facteurs
abiotiques dans llimination des hydrocarbures
Du fait de la trs faible solubilit des hydrocarbures dans leau
et de leur densit qui est lgrement infrieure lunit, les
hydrocarbures rejets dans les ocans stalent la surface avant de
subir une srie de modifications suite laction de facteurs
abiotiques et biologiques (Figure I.3). Laction simultane de ces
diffrents facteurs aboutira llimination de cette pollution
(Bertrand et Mille, 1989; U.S. Congress, Office of Technology
Assessement, 1991). Les facteurs environmentaux sont:
Figure I.3. Processus physico-chimiques et biologiques
intervenant dans lvolution dune nappe de ptrole en milieu marin
(Bertrand et Mille, 1989).
22
I.3.1.1. Evaporation Ce phnomne touche les fractions de faible
poids molculaire et dpend des conditions atmosphriques (vent,
vagues, temprature,). Les hydrocarbures les plus lgers, ayant de 4
12 atomes de carbone (Teb < 270 C), qui reprsentent gnralement
prs de 50 % des hydrocarbures totaux dun brut moyen, sont limins
rapidement ds les premiers jours, pouvant conduire une pollution de
latmosphre.
I.3.1.2. Solubilisation La solubilit des hydrocarbures dans leau
de mer est trs faible. Un hydrocarbure est dautant plus soluble que
sa masse molculaire est faible et que sa polarit est leve. Il est
important de noter que ces hydrocarbures solubles sont parmi les
plus dangereux pour lenvironnement, ils sont difficiles liminer et
sont adsorbs par la faune et la flore.
I.3.1.3. Emulsification Deux types dmulsions peuvent se former :
eau-dans-huile appele "mousse Chocolat" et huile-dans-eau. Les
mulsions eau-dans-huile sont constitues par des hydrocarbures de
haut poids molculaires. Ces mulsions difficilement dgradables sont
les prcurseurs des rsidus goudronneux retrouvs sur les plages,
alors que les mulions huiledans-eau facilitent llimination des
hydrocarbures.
I.3.1.4. Sdimentation La sdimentation est le passage du ptrole
de la surface vers le fond. Ce phnomne concerne les rsidus
goudronneux constitus de la fraction ptrolire la plus lourde et
dont la densit est suprieure celle de leau de mer. La sdimentation
conduit la constitution dagrgats de haute densit difficilement
dgradable par voie naturelle.
I.3.1.5. Photo-oxydation La photo-oxydation est observe au
niveau de la surface de leau o lair (oxygne) et la lumire
(radiations solaires) sont prsents pour la transformation des
hydrocarbures (Payne
23
et Phillips, 1985). Lefficacit de ce phnomne dpend de la nature
des hydrocarbures et de la prsence de composs non hydrocarbons
(Bertrand et Mille, 1989). Ainsi, la photooxydation touche plus
particulirement les composs aromatiques qui sont plus
photosensibles que les composs aliphatiques. Parmi ces derniers,
les composs ramifis sont plus facilement photo-oxyds que les
n-alcanes (Rontani et Giusti, 1987). La photo-oxydation conduit la
formation de composs solubles dans leau (acides, alcools, ctones,
peroxides et sulfoxides) et certains travaux de recherche ont montr
leur toxicit pour les communauts microbiennes (Payne and Phillips,
1985; Larson et al., 1979; Maki et al., 2001) alors que Rontani et
al. (1987, 1992), ont montr lexistence dinteractions entre la
photo-oxydation et la biodgradation pour llimination des
alkylbenznes et de lanthracne. Laction simultane de ces deux
phnomnes permet une limination plus rapide de ces deux familles de
composs.
I.3.1.6. Biodgradation la biodgradation est le processus naturel
le plus important dans la dpollution de lenvironnement marin. Les
microorganismes en sont responsables, en particulier les bactries.
Limportance de la biodgradation dans llimination du ptrole, les
voies mtaboliques doxydation des hydrocarbures par les bactries et
les paramtres qui peuvent influencer la biodgradation seront traits
dans les paragraphes suivants.
I.3.2. Pntration des hydrocarbures dans la chane alimentaire
Les produits ptroliers rejets dans lenvironnement ont des
rpercussions sur les plantes, animaux et tres humains. Les
consquences de la contamination dpendent des organismes eux-mmes et
de la structure chimique des hydrocarbures. Certaines espces
prouvent des changements de comportement peine perceptibles ou des
problmes de sant court terme. Certaines dentre elles prouvent des
effets toxiques instantans et aigus parfois mortels, tandis que
chez dautres espces, les repercussions se manifestent lentement
long terme (Agence Franaise de Scurit Sanitaire des Aliments,
communique de presse, 6 Janvier 2000). Face ces polluants, les
organismes susceptibles dtre contamins doivent tre considrs en
fonction de leur capacit de rponse spcifique.
24
Les bactries, nourriture de nombreuses espces aquatiques,
peuvent tre des vecteurs de contamination par lesquels les
hydrocarbures peuvent entrer dans la chane alimentaire (Bertrand et
Mille, 1989 et articles cits). Les connaissances les plus
nombreuses portent sur les hydrocarbures aromatiques polycycliques
(HAPs) dont la toxicit la plus souvent rapporte correspond leur
potentiel carcinogne.
II. BIODEGRADATION AEROBIE DES HYDROCARBURES PAR LES
MICROORGANISMES
II.1. INTRODUCTION La biodgradation est lun des premiers
mcanismes conduisant llimination des hydrocarbures de
lenvironnement. La littrature concernant loxydation des
hydrocarbures par les microorganismes indique que la croissance
cellulaire dpend des processus de transport des hydrocarbures la
surface cellulaire et de passage travers lenveloppe cellulaire
jusquau cytoplasme.
Trois modes de transport des hydrocarbures sont gnralement
considrs (Hommel, 1994; Goswani et Singh, 1991; Husain et al.,
1997):
1- Linteraction des cellules avec les hydrocarbures dissous dans
la phase aqueuse par les facteurs de solubilisation
extracellulaires. 2- Linteraction des cellules avec les
hydrocarbures mulsifis par les agents actifs de surface appels
biosurfactants. 3- Le contact direct des cellules avec les
hydrocarbures.
La
biodgradation
des
hydrocarbures
par
les
microorganismes
appels
hydrocarbonoclastes a t mise en vidence ds 1946 par ZoBell.
Depuis cette date le nombre despces bactriennes identifies possdant
cette proprit na cess daugmenter. En se basant sur la frquence
disolement, les genres bactriens prdominants sont Pseudomonas,
Acinetobacter, Alcalignes, Vibro, Flavobacterium, Achromobacter,
Micrococcus,
Corynebacteria, et Nocardia (Leahy et Colwell, 1990; Floodgate,
1995). Ces organismes dgradant les hydrocarbures sont ubiquistes
(Atlas, 1995 a, b; Olivera et al., 1997), ils ont
25
mme t rencontrs dans les cosystmes extrmes comme les rgions
polaires (Whyte et al., 1995; Aislabie et al., 1998), les dserts
(Al-Hadrami et al., 1995) ou les sources chaudes (Zarilla et Perry,
1984).
Lactivit humaine, au travers des multiples sources de pollution
et par la mondialisation des dplacements, favorise lapparition de
nouvelles souches aptes la dgradation des hydrocarbures (Van der
Meer et al., 1992). Ainsi, mme si les conditions de temprature,
aration, pH, toxicit ou nutriments sont dfavorables, une dpollution
intrinsque reste possible avec une efficacit amoindrie (Leahy et
Colwell, 1990; Delille et al., 1998).
La capacit de se dvelopper sur les hydrocarbures ne se limite
pas uniquement aux bactries, certains sites contamins contiennent
galement de nombreux champignons et levures capables de les dgrader
(Klug et Markovetz, 1971; Blasig et al., 1984; Davies et Westlake,
1979; Fedorak et al, 1984; Meulenberg et al., 1997; Yamada-Onodera
et al., 2002). Signalons enfin que certaines micro-algues sont
capables dattaquer les hydrocarbures, citons lexemple de Protatheca
zopfii qui dgrade 40 % du ptrole brut (Walker et al., 1975).
Cependant parmi les microorganismes aptes se dvelopper sur les
hydrocarbures, les bactries restent qualitativement et
quantitativement prpondrantes pour mtaboliser ces substrats
(Bertrand et Mille, 1989; MacNaughton et al., 1999). Le rejet des
produits ptroliers dans les milieux marins ou terrestres entrane
une prolifration des microorganismes aptes se dvelopper sur les
hydrocarbures et leurs produits de dgradation. Leur nombre est
beaucoup plus important dans les zones pollues de faon chronique et
saccrot aprs un apport dhydrocarbures dans les sites dpourvus de
contamination (Bartha et Atlas, 1977; Atlas, 1981; Floodgate,
1984).
II.2. PROCESSUS DOXYDATION DES HYDROCARBURES Ltude de loxydation
des hydrocarbures se base sur lanalyse des milieux de culture des
microorganismes dont la croissance dpend de la nature de
lhydrocarbure utilis comme source de carbone ainsi que des capacits
mtaboliques des cellules. Les produits dtects peuvent directement
provenir du substrat, mais leur accumulation ultrieure peut tre due
au fait quils sont faiblement mtaboliss ou non mtaboliss. Dautre
part, plusieurs produits doxydation peuvent tre de nature
transitoire et napparaissent jamais en quantits dtectables. Les
informations obtenues par lanalyse cellulaire et des milieux de
cultures 26
permettent dtablir le processus mtabolique de dgradation des
hydrocarbures. La confirmation de ces mcanismes ncessite des
vrifications enzymologiques. Quand la dgradation suit des chemins
alternatifs, ceux-ci doivent tre vrifis par inhibition slective de
chacun dentre eux.
II.2.1. Voies mtaboliques de la dgradation des hydrocarbures
aliphatiques
II.2.1.1. Dgradation des n-alcanes
Les n-alcanes courtes chanes, tel le n-nonane ne sont pas
toujours assimils, mais peuvent tre oxyds. Seulement quelques
bactries ont la capacit de crotre sur les alcanes plus courts que
le n-octane alors que les n-alcanes dont le nombre de carbone est
suprieure 9, sont les hydrocarbures les plus facilement dgradables
par une trs grande varit de microorganismes (Ratledge, 1978).
Plusieurs modes dattaque des n-alcanes ont t dcrits. Ils font
intervenir loxygne molculaire.
II.2.1.1.1. Loxydation monoterminale Loxydation monoterminale
est le principal processus utilis par la plupart des bactries,
conduisant la formation de lalcool primaire puis de laldhyde et de
lacide gras correspondant (Pirnick et al, 1974; Nieder et Shapiro,
1975; Grund et al, 1975). Les acides gras forms peuvent tre oxyds
par , ou -oxydation; les composs forms pourront par la suite tre
incorpors aux lipides cellulaires. Une longation de la chane
carbone est alors possible. Les voies mtaboliques doxydation
monoterminale des n-alcanes sont indiques sur la Figure I.4.
27
CH3-(CH2)m-CH2-CH2-CH3
CH3-(CH2)m-CH2-CH2-CH2-OH
CH3-(CH2)m-CH2-CH2-CHO
CH3-(CH2)m-CH2-CH2-COOH
-oxydation CH3-(CH2)m-CH CH-COOH
-oxydation CH3-(CH2)m-CH2-CH-COOH OH
-oxydation OH-CH2-(CH2)m-CH2-CH2-COOH
CH3-(CH2)m-CH-CH2-COOH OH
CH3-(CH2)m-CH2-CHO + CO2
OHC-(CH2)m-CH2-CH2-COOH
CH3-(CH2)m-CH2-COOH CH3-(CH2)m-C-CH2-COOH
HO2C-(CH2)m-CH2-CH2-COOH
O
Oxydations ultrieures: , ,
Oxydations ultrieures: ,
CH3-(CH2)m-COOH + CH3COOH
Oxydations ultrieures: , ,
Figure I.4. Voie mtabolique de loxydation monoterminale des
n-alcanes.
Cette oxydation monoterminale pour donner lalcool primaire est
catalyse par un mcanisme complexe dhydroxylase qui peut tre reli un
systme de transport dlectrons permettant lincorporation de latome
doxygne. Les deux meilleurs systmes dcrits sont: le Cytochrome P450
et le Rubredoxin.
* Cytochrome P450: Ce systme a t dcrit en premier lieu chez les
bactries pour lhydroxylation des nalcanes par Corynebacterium sp
(Cardini et Jurtshut, 1968, 1970) via lincorporation d'oxygne
atmosphrique (Figure I.5).
28
R - CH3
O2
cytochrome P450 rduite (Fe )2+
ion proteine oxyd
flavoproteine rduite
NADP+
cytochrome P450 H2OR - CH2OH
oxyde (Fe )
3+
ion proteine rduite
flavoproteine oxyde
NADPH
Figure I.5. Mcanisme de loxydation dun n-alcane en alcool
primaire par le systme cytochrome P450 (Cardini et Jurtshuk, 1968,
1970).
* Systme rubredoxin: Ce systme enzymatique a t initialement
dcouvert chez Pseudomonas oleovorans (Figure I.6).
R - CH3
O2
rubredoxine rduite (Fe2+)
flavoproteine oxyde
NADH
H2OR - CH2OH
rubredoxine oxyde (Fe3+)
flavoproteine rduite
NAD+
Figure I.6. Mcanisme de loxydation dun n-alcane en alcool
primaire par le systme Rubredoxin (Cardini et Jurtshuk, 1968,
1970).
II.2.1.1.2. Oxydation des n-alcanes par le systme de
dioxygnase
Cette voie mtabolique d'oxydation des n-alcanes a t propose pour
la premire fois par Finnerty (1977, 1988) pour les bactries du
genre Acinetobacter. Les n-alcanes sont oxyds par une dioxygnase
conduisant la formation d'un n-alkyl-hydroperoxyde, qui sera son
tour oxyd en aldhyde puis en acide. Chez d'autres souches, une tape
supplmentaire dans la voie mtabolique d'oxydation des n-alcanes a t
dmontre: il s'agit de la formation d'un alcool partir du
n-alkyl-hydroperoxyde, qui est ensuite oxyd en aldhyde (Finnerty,
1990 a, b). La figure suivante montre ces deux voies
mtaboliques:
R - CH3 + O2
R - CH2 - OOH R - CH2 - OH
R - CHO
R - COOH
29
II.2.1.1.3. Oxydation des alcanes via alcnes
Les tudes de Senez et Azoulay (1961) et Azoulay et al. (1963)
sur la bactriePseudomonas aeruginosa, ont montr que les alcnes sont
des mtabolites intermdiaires de
la dgradation des alcanes. Les alcnes forms subissent une
poxidation suivie dune rduction en alcool primaire, qui son tour
sera oxyd en acide. Les rsultats d'Azoulay et al. (1963) et Senez
et Azoulay (1961) suggrent que les alcanes et les alcnes sont
dgrads suivant la mme voie mtabolique et que les produits
doxydation des deux hydrocarbures devraient tre les mmes. Le
mcanisme de loxydation via la formation dalcne est prsent la Figure
I.7.CH3 - (CH2)4 - CH2 - CH3NAD NADH2
CH3 - (CH2)4 - CH = CH2+ O2 + Fe++
CH3 - (CH2)4 - CH - CH2 O CH3 - (CH2)4 - CH2 - CH2OH
Figure I.7. Oxydation terminale via la formation dalcne par une
souche de Pseudomonasaeruginosa (Azoulay et al., 1963).
II.2.1.1.4. Oxydation subterminale
Dans certains cas, loxydation peut tre subterminale, ce qui
conduit la formation dun alcool secondaire puis une ctone. La
dgradation ultrieure de la ctone par incorporation dun atome
doxygne conduit la formation dun ester (raction de type
Bayer-Villiger) qui est hydrolys en alcool et en acide, comme le
montre la Figure I.8.
30
CH3-(CH2)m-CH2-CH2-CH3 CH3-(CH2)m-CH2-CH-CH3 OH
CH3-(CH2)m-CH2-C-CH3 O CH3-(CH2)m-CH2-O-C-CH3 O CH3-(CH2)m-CH2-OH +
HOCO-CH3
CH3-(CH2)m-COOH
Oxydation ultrieure: ,,
Figure I.8. voie mtabolique de loxydation subterminale (Klug et
Markovetz, 1971)
II.2.1.1.5. Oxydation diterminale
Aprs formation de lacide gras, une deuxime oxydation peut se
produire au niveau du groupement mthyl- pour donner un di-acide. La
formation de 1--alcane-diol et de dialdhyde na pas t observe (Rehm
et Reiff, 1981). Loxydation subterminale de lacide gras peut
galement se produire pour donner le (-1)-hydroxy acide de mme
longueur de chane que le n-alcane (Figure I.9).
31
CH3-CH2-(CH2)m-COOH
CH3-CH-(CH2)m-COOH OH acide gras (1)hydroxyl
HO-CH2-CH2-(CH2)m-COOH
acide gras -hydroxyl
OHC-CH2-(CH2)m-COOH oxydations ultrieures
acide gras -aldehydique
HOOC-CH2-(CH2)m-COOH acide gras dicarboxylique
oxydations ultrieures: ,
Figure I.9. Voie mtabolique via loxydation terminale et
subterminale des acides (daprs Bertrand et Mille, 1989; Ratledge,
1978).
II.2.1.2. Biodgradation des alcanes ramifis
Les alcanes ramifis sont gnralement moins sensibles la
biodgradation, ce qui peut provoquer leur accumulation dans
lenvironnement. La prsence dun groupement mthyle en position , va
empcher la -oxydation, ce qui ncessite lintervention dun autre
mcanisme comme l-oxydation ou une oxydation lautre extrmit. Chez
certaines bactries, la voie mtabolique passe alors par la voie dite
de "citronelleol"; cest le cas dePseudomonas citronellolis capable
de dgrader le 2-octene, le 3,6-dimethyloctane et le 2,6-
dimethyldecane (Figure I.10) (Fall et al., 1978), ainsi que chez
plusieurs autres espcesPseudomonas (Cantwell et al., 1978).
Laugmentation du nombre de ramifications a pour
effet de diminuer leur biodgradabilit (Davis, 1967; Foster,
1962; McKenna, 1972). Par contre une ramification en nempche pas
une -oxidation (Rontani et Giusti, 1986; Schaeffer et al., 1979),
cest ce qui explique la biodgradation de composs polyramifis de
type isoprenoque tel le pristane (2,6,10,14-ttramthyl pentadecane)
(Mckenna et Kallio, 1971; Pirnik et al., 1974; Rontani et al.,
1986; Ko et Lebealt, 1999; Alvarez, 2003).
32
Loxydation des alcanes ramifis commence gnralement par le
groupement mthyle terminal le plus loign de la ramification et
lacide gras form est ensuite incorpor dans les lipides cellulaires.
Par -oxydation, la dgradation peut se poursuivre jusqu' la
ramification o une -oxydation sera alors ncessaire pour une
minralisation complte de lalcane.
2,6-dimethyl-2-octne
3,6-dimthy-octane
2,6-dimthyl-dcane
CH2OH
CH2OH
CH2OH
Voie Citronellol
-oxydation
CH3COSCoA R COSCoA
.R COSCoA
.CO2 R
CO2
CH2 CO2H
.
O R COSCoA
COSCoA Oxydations ultrieures
Avec R:
,
ou
Figure I.10. Voies mtaboliques de la dgradation des
hydrocarbures ramifis parPseudomonas citronellolis suivant la voie
"Citronellol"
Plusieurs travaux se sont intresss aux mcanismes de dgradation
du pristane puisque les hydrocarbures isoprnoques sont des produits
naturels ubiquistes et que le pristane est un compos relativement
inerte et trs utilis comme marqueur biologique. Les mcanismes de
dgradation du pristane souvent rencontrs chez les bactries sont
indiqus la Figure I.11.
33
Pristane (ttramthyl-2,6,10,14 pentadcane)
oxydation monoterminale
oxydation en position antiso
OH OH
COOH
O O O
oxydation
CH3HOOC COOH COOH
OH CH3
HOOC
COOH
Units C2 Units C3
oxydation
oxydation
Units C2 Units C3
HOOC OH HOOC HOOC
Figure I.11. Mcanisme de dgradation du pristane. La prsence de
deux groupements mthyles chacun en position des extrmits de la
chane hydrocarbone (ramification antiso) bloque la dgradation des
alcanes linaires (Schaeffer et al., 1979).
34
Par ailleurs, Rontani et Giusti (1986) ont montr que loxydation
directe en position 3 tait possible: une population mixte de
bactries marines a en effet oxyd un compos disubstitu aux deux
extrmits, le 2,2,4,4,6,8,8-heptamthylnonane.
Berekaa et Steinbchel (2000) ont isol deux souches Mycobacterium
: Mycobacteriumfortuitum et Mycobacterium ratisbonense, capables
dutiliser lalcane ramifi le squalane
(2,6,10,15,19,23-hexamthyltetracosane) et son hydrocarbure
parent insatur le squalne comme source unique de carbone. Une
partie du mcanisme de dgradation de ce compos correspond celle du
pristane et une autre partie correspond la voie de Citronellol
(Figure I.12).CH3 H3C CH3 CH3 CH3
Squalane
CH3
CH3
CH3
CH3 HOOC
CH3
CH3 COOH CH3 3 x C3 3 x C2 CH3 CH3 CH3
-oxydations successives
CH3
CH3 COOH
HOOC
Mcanisme du "Citronellol"
CH3 HOOC
CH3
O COOH
Dgradation incluant des -oxydations successives
Figure I.12. Voie mtabolique de la dgradation du squalane par
Mycobacterium fortuitum etratisbonense (Berekaa et Steinbchel,
2000).
35
II.2.1.3. Biodgradation des alcnes
La voie mtabolique la plus importante dans la dgradation des
alcnes, correspond loxydation du groupement mthyle terminal pour
donner un alcool primaire -insatur, qui son tour sera oxyd en acide
(Stewart et al., 1960). Une autre voie mtabolique a t montre par
les tudes de Van der Linden (1963) et de Huybregtse et Van der
Linden (1964) sur loxydations des alcnes, qui est la formation dun
poxyde, dun diol-1,2, dun -hydroxy acide et enfin dun acide satur
(laldhyde qui est un mtabolite intermdiaire na pas t dtect). Des
tudes ultrieures ont confirm ce deuxime mcanisme (Markovetz et al.,
1967; Klug et Markovetz, 1967; Makula et Finnerty, 1968b; Schwartz
et McCoy, 1973; Vaz et al., 1998; Small et Ensign, 1997). La Figure
I.13, montre ces deux voies mtaboliques dans le cas des alcnes
terminaux.CH3 - (CH2)n - CH CH2
HO - CH2 - (CH2)n - CH
CH2
CH3 - (CH2)n - CH - CH2 O
HO - CH2 - (CH2)n - CH - CH2 O
HOOC - (CH2)n - CH
CH2
CH3 - (CH2)n - CH - CH2 OH OH
CH3 - (CH2)n - CH - COOH OH
CH3 - (CH2)n -COOH + CO2
Figure I.13. Voies mtaboliques de la dgradation des alcnes
terminaux (daprs Ratledge, 1978).
36
II.2.2. Voies mtaboliques de dgradation des hydrocarbures saturs
cycliques
Le ptrole brut est un mlange complexe contenant notamment des
sries homologues de cyclanes alkyls tel que les
n-alkyl-cyclohexanes et les n-alkyl-cyclopentanes (Williams et al,
1988; Kissin, 1990; Dong et al., 1993). De nombreux drivs
polycycliques sont aussi prsents et certains dentre eux, tels les
stranes et les triterpanes sont caractristiques de lorigine du
ptrole. Cette famille peut reprsenter entre 30 et 50 % des
hydrocarbures dun ptrole brut (Bertrand et Mille, 1989).
Laccumulation de ces composs dans lenvironnement, montre leur
caractre relativement rfractaire aux attaques microbiennes.
Cependant, un grand nombre de microorganismes incluant les
champignons, les algues et essentiellement les bactries sont
capables de les dgrader (Davis et Raymond, 1961; Beam et Perry,
1974a; Feinberg et al., 1980; Rontani et Bonin, 1992; Dutta et
Harayama, 2001; Rios-Hermandez et al., 2003). Les cycloalkanes non
substitus peuvent tre oxyds et transforms en lactones
hydrolysables, conduisant ultrieurement un diacide (Figure I.14)
(Beam et Perry, 1974a; Trudgill, 1978).
(CH2)n
CH2
(CH2)n
CHOH
(CH2)n
C
O
COOH Dgradations ultrieures (CH2)n-1 COOH (CH2)n
O C O
Figure I.14. Biodgradation des cycloalcanes non-substitus
(Bertrand et Mille, 1989).
Les drivs substitus des cycloalcanes sont plus facilement dgrads
que les molcules parentales homologues. La dgradation des
cyclohexanes n-alkyl substitus a t largement tudie du fait de leur
prsence dans le ptrole brut et leur accumulation dans
lenvironnement.
37
(CH2)n-CH3 Alkyl-cyclohexane
n pair
n impair
COOH
CH2-COOH
COOH
CH2-COOH
OH
OH
COOH
CH2-COOH
OH
OH
COOH CH2-COOH OH OH ORTHO META Rupture COOH COOH COOH COOH O
C-CH2-COOH COOH O OH OH HO CH2-COOH OH
OHC HOOC
OH
CH2-COOH CHO COOH OH
CO2 + Acide pyruvique
Acide succinique + Acetyl - CoA
Acide succinique + Acide pyruvique
Acide furamique + Acide actoactique
Figure I.15. Voies mtaboliques de la dgradation des
alkyl-cyclohexanes (Bertrand et Mille, 1989). 38
Gnralement, le groupement mthyle terminal de la chane n-alkyl de
ces composs est initialement oxyd en acide carboxylique ; un
processus de dgradation par -oxydation conduit ensuite lacide
cyclohexylcarboxylique ou lacide cyclohexyl-actique suivant que le
nombre datomes de la chane alkyle est impair ou pair (Dutta et
Harayama, 2001; Rontani et Bonin, 1992; Trudgill, 1978; Feinberg et
al., 1980). Ces derniers mtabolites peuvent tre dgrads par un
mcanisme dhydroxylation, aromatisation et une ouverture du cycle
selon plusieurs mcanismes dpendant de la parit de la chane alkyle
(Trudgill, 1978). Les voies mtaboliques sont rapportes sur la
Figure I.15. Rontani et Bonin (1992) ont montr quen prsence dun
mcanisme d-oxydation la production de lacide cyclohexylcarboxylique
est possible partir dun alkyl-cyclohexane nombre pair datomes de
carbone tel que le dodecylcyclohexane. Lacide
cyclohexylcarboxylique form est ensuite mtabolis par un mcanisme
classique de -oxydation (Guyer et Hegeman, 1969; Blakley et Papish,
1982; Rontani et Bonin, 1992), comme le montre la Figure I.16.
COOH
COOH
COOH
OH
oxydation
COOH COOH O
COOH
Figure I.16. Assimilation de lacide cyclohexyl-carboxylique par
Alcaligenes sp. PHY 12 suivant un mcanisme de -oxydation (Rontani
et Bonin, 1992).
Nous tenons signaler que les phnomnes de co-oxydation sont trs
importants dans la dgradation totale de ce type de composs. En
effet, certaines bactries prsentent une complmentarit enzymatique
leur permettant la dgradation totale des cycloalcanes et des
cyclanes substitus.
39
II.2.3. Biodgradation des hydrocarbures aromatiques
Les hydrocarbures aromatiques sont des polluants ubiquistes dans
lenvironnement. Plusieurs sortes dhydrocarbures aromatiques et
polycycliques aromatiques existent avec une grande varit de
substituants alkyles en certaines positions, dpendant de leurs
origines. En plus de leur prsence dans le ptrole (10 30 % des
hydrocarbures totaux), les hydrocarbures aromatiques sont produits
en quantit importante par lactivit humaine, et notamment dans les
processus de pyrolyse et de combustion mis en uvre dans lindustrie,
le transport et le chauffage. Ils sont dtects dans des chantillons
dair, deau et de sol, ainsi que dans les vgtaux et les aliments. A
part le cas particulier des aromatiques monocycliques, les pouvoirs
mutagne et cancrogne apparaissent pour les hydrocarbures
aromatiques polycycliques partir de quatre cycles et sont
particulirement marqus pour les hydrocarbures polycycliques
aromatiques cinq et six cycles (Bouchez et al., 1996). Plusieurs
travaux de recherche ont fait lobjet de la distribution des
hydrocarbures polycycliques aromatiques dans lenvironnement et
leurs effets sur la sant humaine: plusieurs de ces composs ont t
reconnus cancrignes.
Les hydrocarbures de faible poids molculaire sont trs solubles
dans leau et par consquent trs toxiques pour les microorganismes.
Ils peuvent interagir avec la membrane cellulaire des
microorganismes (Sikkema et al., 1992, 1994; de Smet et al., 1978;
Uribe et al. 1985). Ces interactions conduisent des changements
structuraux et fonctionnels de la membrane, ce qui par consquent,
peut diminuer la croissance et lactivit cellulaire (Uribe et al.,
1990; Sikkema et al., 1994) .
La dgradation des hydrocarbures aromatiques par les
microorganismes est trs importante pour llimination de ces composs
des systmes aquatiques et terrestres. Les procaryotes et les
eucaryotes ont des capacits enzymatiques qui leur permettent
doxyder les composs aromatiques et polyaromatiques dont la taille
peut varier du benzne au benzo(a)pyrne (Cerniglia, 1984). Les
bactries oxydent initialement les hydrocarbures aromatiques par
lincorporation de deux atomes doxygnes molculaires dans le substrat
pour former des dihydrodiols de configuration cis (Gibson et al.,
1975). Cette raction est catalyse par une enzyme, la dioxygnase.
Loxydation des cis-dihydrodiols conduit la formation de catchols
(Gibson et al., 1968). Gnralement, loxydation se poursuit par une
rupture ortho (rupture de la liaison entre les deux groupements
hydroxyle) ou mta (rupture dune laison entre un 40
carbone portant un groupement hydroxyle et le carbone
immdiatement voisin ne portant pas de groupement hydroxyle) du
cycle qui est assur par une autre dioxygnase (Dagley, 1971), comme
le montre la Figure I.17 correspondant la dgradation du benzne.
Pour les drivs mthyls du benzne tel que le tolune ou le xylne,
loxydation dpend du microorganisme. Lattaque enzymatique initiale
peut se faire au niveau du groupement mthyle pour donner lacide
benzoque, ou sur le cycle aromatique pour former des
mthyl-catchols, ou sur les deux la fois (Hopper, 1978; Cerniglia,
1984).
En ce qui concerne les alkyl-benznes qui sont des produits
caractristiques du ptrole et dont la prsence est utilise comme
indicateur de contamination ptrolire des sdiments et des organismes
marins (Bouchez et al., 1996), plusieurs travaux de recherche se
sont intresss ltude de leur voies mtaboliques de dgradation par les
bactries (Chablain et al., 2001; Wilkes et al., 2000; Budzinski et
al., 1998; Amund et Higgins, 1985; Dutta et Harayama, 2001;
Sariaslani et al., 1974). Gnralement, il se produit une oxydation
du groupement mthyle terminal qui donne lacide phnyl-alcanoque
correspondant, qui par une srie de -oxydations peut conduire lacide
benzoque ou lacide phenyl-actique en fonction du nombre datomes de
la chane alkyle. La dgradation peut sarrter ce stade ou se
poursuivre au niveau du cycle aromatique. Dans certains cas la
co-oxydation par des populations microbiennes mixtes peut jouer un
rle trs important dans la dgradation complte de ces composs
(Hopper, 1978). Par ailleurs, Rontani et al. (1987) ont montr que
la photo-oxydation des alkylbenznes permettait dacclrer leur
dgradation par les bactries.
41
Benzne
O2 H OH OH H
cis-1,2-dihydroxy-1,2-dihydrobenzne
OH
CatcholOH Fission ortho Fission mta CHO COOH COOH Acide
cis,cis-muconique COOH OH Semialdehyde 2-hydroxymuconique
COOH O C=O R1COOH COOH COOH OH
COOH O C=O CO2 COOH OH
HC O COOH COOH
H
HO2C - CH2 - CH2 - CO2H + Acetyl - CoA HO
CH3
COOH O
H CH2 CHO
CH3
+
C=O COOH
Figure I.17. Voies mtaboliques de la dgradation du cycle
aromatique: cas du benzne.
42
II.3. FACTEURS PHYSIQUES ET CHIMIQUES AFFECTANT LA
BIODEGRADATION DES HYDROCARBURES
La biodgradation des hydrocarbures est lun des premiers
mcanismes conduisant la transformation de ces polluants en produits
moins toxiques. Les travaux de recherche sur loxydation des
hydrocarbures par les microorganismes ont montr que ce processus
dpend de la structure chimique des hydrocarbures et des conditions
environnementales. Les facteurs physico-chimiques influant sur la
vitesse de biodgradation microbienne sont: la temprature, loxygne
disponible, le pH, la salinit, les lments nutritifs, losmose et la
pression hydrostatique (Leahy et Colwell, 1990; Atlas, 1981).
II.3.1. Composition chimique des hydrocarbures
La spcificit des substrats lattaque microbienne a t largement
tudie. Atlas (1981) et Leahy et Colwell (1990), ont class les
composs du ptrole en quatre familles: les hydrocarbures saturs, les
aromatiques, les asphaltnes (phnols, acides gras, ktones, esters et
porphyrines) et les rsines (pyridines, quinolines, carbazoles,
sulfoxides, et amides). Ces composs diffrents par leur
susceptibilit lattaque microbienne. Ainsi la vitesse de
biodgradation est plus leve pour les saturs, viennent ensuite les
aromatiques lgers, les aromatiques haut poids molculaire, les
composs polaires ayant la vitesse de dgradation la plus faible. Les
hydrocarbures saturs incluent les n-alcanes, les alcanes ramifis et
les cycloalcanes (naphtnes). Les alcanes normaux ou chanes linaires
sont les plus abondants (10 40 % des hydrocarbures totaux dans le
cas du ptrole lger et peuvent atteindre dans certains cas 60 %) et
les plus rapidement dgradables: les n-alcanes nombre de carbone
suprieur 44 peuvent tre mtaboliss par les microorganismes mais ceux
ayant de 10 24 atomes de carbone (C10-C24) sont gnralement les plus
facilement dgradables. Les alcanes ramifis sont plus rcalcitrants
la biodgradation que les n-alcanes et plus le nombre de
ramifications augmente, moins ces composs sont susceptibles la
dgradation microbienne. Les hydrocarbures cycliques constituent une
fraction importante des hydrocarbures dans la plupart des bruts
ptroliers, ils sont plus difficilement dgradables que les deux
sries prcdentes cause de leur toxicit suite linteraction avec la
membrane cellulaire des microorganismes (Sikkema et al., 1994,
1995). Les expriences montrent de faon non quivoque que la
biodgradation des cycloalkanes est trs limite (Atlas, 1981). La non
accumulation des 43
hydrocarbures cycliques dans lenvironnement, implique des
phnomnes non conventionnels de dgradation tel que lintervention des
phnomnes de co-oxydations impliquant plusieurs souches microbiennes
dont lquipement enzymatique est complmentaire (Bertrand et al.,
1983; Perry, 1979; Rontani et al., 1985; Leahy et Colwell, 1990).
Les hydrocarbures aromatiques constituent gnralement 10 30 % des
hydrocarbures totaux dun brut ptrolier (Bertrand et Miller, 1989).
Des tudes sur la transformation de ces hydrocarbures par les
microorganismes ont montr leur toxicit cellulaire (Sikkema et al.,
1995). Les hydrocarbures aromatiques de faible poids molculaires
constituent gnralement 2 20 % des hydrocarbures des ptroles lgers
et moins de 2 % des hydrocarbures des ptroles lourds (Congress of
the United States, Office of Technology Assessment, 1991), tels que
les alkyl-benznes lgers qui sont les plus toxiques cause de leur
solubilit dans leau, mais peuvent cependant tre mtaboliss par les
microorganismes quand ils sont prsents en faibles concentrations.
La structure molculaire de ces substrats dtermine la vitesse de
leur dgradation: un grand nombre de substituants mthyle empche
loxydation initiale (Cooney et Summers, 1976; Atlas et al., 1981).
Les polyaromatiques sont moins toxiques pour les microorganismes,
mais ils sont rarement mtaboliss et quand ils le sont leur
biodgradation est lente: cest ce qui explique leur accumulation
dans lenvironnement. Ces hydrocarbures aromatiques lourds
constituent 2 10 % des hydrocarbures des ptroles lgers et plus de
35 % des hydrocarbures des ptroles lourds. Les asphaltnes et les
rsines constituent une faible partie du ptrole brut, 1 5 % du
ptrole lger alors quun ptrole lourd peut contenir plus de 25 %
dasphaltnes et 20 % de rsines. Cette dernire classe de composs
ptroliers nest pas biodgradable ou trs lentement dgradable La
biodgradabilit des ptroles bruts est trs fortement dpendante de
leur composition (Atlas, 1975); une temprature dtermine, un ptrole
lger est plus susceptible dtre biodgrad quun ptrole lourd.
Par exemple, un brut trs faible teneur en soufre et trs riche en
composs saturs (exemple: Louisiane du Sud) (Tableau I.2) sera
facilement biodgrad, contrairement un fuel de type "Buncker C", trs
haute teneur en soufre et composs aromatiques. Nous signalons
galement que les n-alcanes contenus dans un ptrole provenant du
Vnzula sont moins bien dgrads que ceux prsents dans un ptrole de
type "Lger dArabie", par suite de la prsence de produits plus
longue chane.
44
Tableau I.2. Proportions des diffrentes familles de composs dans
divers bruts ptroliers (daprs Bertrand et Mille, 1989).Bruts
Ptroliers Saturs Aromatiques Polaires (rsines) Asphaltnes
Louisiane du Sud Koweit Buncker C Lger dArabie Tunisien
(Asthart) Vnzulien Prudhoe Bay
69 44 21.1 48 48 46 55
20 28.3 34.2 35 32 21.6 25
10.3 23.2 30.3 9 12 19.3 10
0.3 4.5 14.4 7.5 8 9 10
Ratledge (1978), a rassembl des rgles qui ont une application
gnrale lensemble des micro-organismes: 1- Les hydrocarbures
aliphatiques sont assimils par une grande varit de microorganismes,
les composs aromatiques peuvent tre oxyds mais sont assimils par
quelques bactries seulement. 2- Les n-alcanes chanes courtes, tel
que le n-nonane ne sont pas toujours assimils, mais peuvent tre
oxyds. Seules quelques bactries ont la capacit de crotre sur des
alcanes plus courts que le n-octane. Quand la longueur de chane
augmente au del de C9, le facteur de production augmente, mais la
vitesse doxydation dcrot. 3- Les composs saturs sont plus
rapidement dgrads que les insaturs. 4- Les composs ramifis sont
moins rapidement dgrads que les composs non substitus.
II.3.2. Etat physique et concentration des hydrocarbures ou du
ptrole.
Les hydrocarbures tendent se dissiper dans leau formant ainsi
des mares noires. Sous laction du vent et des vagues, le ptrole
dans leau et leau dans le ptrole peuvent former des mulsions, ce
qui augmente la surface du ptrole et par consquence favorise
lattaque microbienne. Par contre les grandes masses ou les nappes
de mousse ptrolire de viscosit trs importante et qui ont un rapport
surface/volume faible inhibent la croissance.
45
La formation d'mulsions par la production et la scrtion de
biosurfactants est un processus trs important dans lassimilation
des hydrocarbures par les bactries (Kaplan et al., 1987; Hommel,
1994; Goswani et Singh, 1991; Broderick et Cooney, 1982; Pines et
Gutnick, 1986, Zhang et Miller, 1992). La dispersion artificielle a
t tudie comme moyen daugmentation de la surface de contact entre
les hydrocarbures et les membranes cellulaires des microorganismes,
cependant, les dispersants sont dans la plupart du temps toxiques
et peuvent conduire des dommages dans la faune et la flore, et ils
peuvent aussi inhiber le processus microbien (Leahy et Colwell,
1990). Les hydrocarbures faibles poids molculaires sont considrs
comme des composs toxiques pour les microorganismes cause de leur
grande solubilit et par consquent leur concentration trs leve dans
les phases aqueuses. Ratledge (1978) rapporte que les n-alcanes de
courtes chanes (< C9) sont trs toxiques pour les mircrooganismes
alors que ceux plus longs que le n-nonane, les alcnes > C12, les
alkyle-bromides > C10, et les alcanols > C14 ne sont toxiques
pour aucun microorganisme. Broderick et Cooney (1982), ont montr
que la dgradation des n-alcanes longs ( C12), pour lesquels les
solubilits sont infrieures 0,01 mg/l seffectue des vitesses qui
dpassent les vitesses de dissolution des hydrocarbures et sont
fonction de la surface des hydrocarbures disponibles pour
lmulsification et leur fixation par les cellules.
II.3.3. Influence de la temprature
La temprature est un paramtre pouvant influencer la
biodgradation du ptrole en modifiant son tat physique, sa
composition chimique, lactivit physiologique des microorganismes et
par consquence la vitesse de dgradation des hydrocarbures, ainsi
que la nature et la concentration des espces microbiennes prsentes
(Atlas, 1981; Leahy et Colwell, 1990). A basse temprature, la
viscosit du ptrole augmente, la volatilisation des composs toxiques
pour les microorganismes tels que les alcanes de faibles poids
molculaires est rduite et leur solubilit dans leau augmente par
diminution de leur volatilisation, ce qui entrane un ralentissement
du mtabolisme des microorganismes (Atlas et Bartha, 1972; Atlas,
1975). Une diminution de la temprature est gnralement accompagne
par une diminution de la vitesse de biodgradation qui peut tre
explique par une dcroissance de
46
lactivit enzymatique. Des tempratures plus leves ont pour effet
daugmenter la vitesse de biodgradation (Walworth et al., 2001;
Sandvik et al., 1986; Song et al., 1990). Si loxydation des
hydrocarbures a t observe des tempratures infrieures 0 C (Rike et
al., 2003), ou leves 70-80 C (Annweiler et al, 2000), le maximum de
lactivit mtabolique des microorganismes est gnralement observ une
temprature comprise entre 30 et 40 C (Bossard et Bartha, 1984). Au
del de la temprature optimale de croissance et de biodgradation on
assiste une augmentation de la toxicit des hydrocarbures et une
diminution de lactivit mtabolique. Rling et al. (2003) mentionnent
une inhibition totale de la biodgradation au del de 80-90C malgr
lisolement de bactries thermophiles (Thermotoga,Thermoanaerobacter,
Thermodesulfobacterium)
et
dArchae
hyperthermophiles (Thermococcus, Archeaoglobus) dans des puits
temprature peut atteindre 100C.
de ptrole o la
II.3.4. Influence de loxygne
Ltape initiale du catabolisme des hydrocarbures aliphatiques,
cycliques et aromatiques par les bactries et les champignons inclut
loxydation de ces substrats par lintermdiaire dhydroxylases et
doxygnases, pour lesquelles loxygne molculaire est indispensable
(Leahy et Colwell, 1990; Atlas, 1981; Bertrand et Mille, 1989). Les
conditions arobies sont, par suite, ncessaires pour cette voie
doxydation microbienne des hydrocarbures dans lenvironnement. Le
problme de la limitation de l'oxygne molculaire dans les couches
superficielles des colonnes deau est inexistant, en effet la
concentration en oxygne est suffisamment leve pour assurer lactivit
des microorganismes
hydrocarbonoclastes. Thoriquement, 3,5 g doxygne sont ncessaires
pour loxydation complte de 1 g de ptrole; Zobell (1969), a calcul
que la quantit doxygne dissoute dans 320 m3 deau de mer est
ncessaire pour loxydation de 1 l de ptrole brut. Dans un site trs
pollu, on aboutira frquemment un ralentissement de la biodgradation
par suite dune carence en oxygne. Marin et al. (1996), en tudiant
les facteurs influenant la biodgradation des hydrocarbures par la
bactrie Acinetobactercalcoaceticus, ont constat une augmentation de
la dgradation des hydrocarbures totaux et
des n-alcanes de 10 % aprs un apport supplmentaire doxygne par
agitation. Les sdiments aquatiques, sont par contre gnralement
anoxiques, lexception de la fine couche superficielle (Leahy et
Colwell, 1990). Bertrand et al.(1986), ont tudi dans des systmes
flux continu, lvolution des diffrents hydrocarbures en fonction de
la 47
concentration en oxygne. Ils ont trouv que la dgradation des
hydrocarbures a lieu essentiellement dans la partie superficielle
des sdiments (0-1 cm), o la concentration en oxygne est de 8 ppm,
alors quelle est plus faible en profondeur. Par contre aucune
dgradation na t observe dans des conditions anarobies (0,2-0,3
ppm), en dpit dune activit sulfato-rductrice trs leve dans les
sdiments. La concentration en oxygne a t identifie comme une
variable limitante de la vitesse de la biodgradation du ptrole dans
les sols (Hurst et al., 1996, El-Kadi, 2001) et les eaux
souterraines (Boyd et al., 2001). La dgradation anarobie des
hydrocarbures par les microorganismes peut se produire mais des
vitesses ngligeables et son importance cologique est considre comme
de moindre importance.
II.3.5. Influences des lments nutritifs
Le rejet des hydrocarbures dans les environnements aquatiques,
qui contiennent des lments nutritifs inorganiques en faibles
concentrations, conduit gnralement des rapports carbone/azote et
carbone/phosphore trs levs, dfavorables pour la croissance
microbienne (Leahy et Colwell, 1990). Le ptrole lui-mme contient de
tels nutriments en petites quantits, mais ils sont toujours prsents
sous forme de composs htrocycliques (exemple: drivs de la pyridine
et du pyrrole pour lazote) ou organomtalliques complexes; ils ne
sont donc pas utilisables par les microorganismes (Bertrand et
Mille, 1989). Les sources dazote et de phosphore sont toujours
faibles, surtout pendant les priodes de forte activit des
organismes photosynthtiques. Lazote et le phosphore sont aussi des
facteurs limitant la biodgradation des hydrocarbures dans les sols
(Walworth et al., 2001, 2003; Mohn et Stewart, 2000).
II.3.6. Effet de la salinit et du pH
La salinit moyenne des milieux ocaniques est de lordre de 3,5 %
et lintervalle de variation se situe en gnral entre les limites de
3,3% et 3,7%. Ces concentrations en sels sont compatibles avec la
croissance des microorganismes hydrocarbonoclastes (Bertrand et
Mille, 1989). Quand la concentration en chlorure de sodium dpasse 1
M, llimination du ptrole brut diminue rapidement. Pour ce type de
substrat, les fortes salinits constituent donc une barrire
naturelle pour la biodgradation (Al Mallah, 1988; Tagger et al.,
1976; Bertrand et 48
al., 1990). Bertrand et al. (1993) ont tudi linfluence de la
concentration en chlorure de sodium sur la biodgradation des
hydrocarbures par deux communauts microbiennes, ils ont trouv que
la biodgradation est maximale pour une concentration de 0,4 M et
diminue lentement pour des valeurs suprieures et infrieures
celle-ci. Ward et Brock (1978) ont montr que la vitesse de la
biodgradation des hydrocarbures dcroit lorsque la salinit passe de
3,3 28,4%, et ils ont attribu ces rsultats une rduction gnrale des
vitesses mtaboliques des microorganismes. Leffet de la
concentration en NaCl sur la biodgradation dpend de la nature du
substrat utilis comme source de carbone (Bertrand et al., 1993);
Fernandez et al. (1996) ont montr que la souche Marinobacter
hydrocarbonoclasticus, bactrie marine halotolrante dgrade
leicosane, avec un taux de biodgradation de 90% pour des
concentrations en chlorure de sodium comprises entre 0,2 et 2,5
M.
Linfluence du pH a t trs peu tudie, mais il ne semble jouer quun
rle relativement mineur en milieu marin. Contrairement la plupart
des cosystmes aquatiques, les sols peuvent avoir des valeurs de pH
trs variables, allant de 2,5 11,0. Des valeurs extrmes de pH, ce
qui est le cas pour quelques types de sols, pourraient avoir une
influence ngative sur la capacit des microorganismes dgrader les
hydrocarbures. La croissance des bactries htrotrophes et des
champignons tant favorise par un pH proche de la neutralit (Leahy
et Colwell, 1990). Dibble et Bartha (1979) et Hambrick et al.
(1980) ont trouv que la dgradation des hydrocarbures est plus leve
dans des conditions lgrement basiques. Quel quil soit, le pH des
milieux marins natteint jamais des valeurs suffisamment extrmes
pour inhiber la biodgradation.
II.3.7. Effet de la pression
La pression nest considre comme une variable dans la
biodgradation des hydrocarbures que dans les profondeurs des ocans
(Leahy et Colwell, 1990; Bertrand et Mille, 1989; Atlas, 1981). En
effet, le ptrole qui nest pas dgrad dans les eaux de surface va
progressivement senfoncer, en subissant une lente transformation,
et ce sont les molcules difficilement dgradables qui atteindront le
fond des ocans. La profondeur moyenne de ceuxci est de 3800 m (ce
qui correspond une pression de 380 bars) et la temprature est
infrieure 5 C (Bertrand et Mille, 1989). Schwarz et al. (1974,
1975) ont tudi la croissance et lutilisation des hydrocarbures par
les bactries isoles de sdiments marins 49
profonds, en fonction de la pression. Ils ont trouv que la
vitesse dutilisation des hydrocarbures est fortement diminue hautes
pressions. Sous une pression de 1 bar (pression atmosphrique), ces
bactries dgradent 94 % de lhexadcane en 8 semaines alors quil leur
faut 40 semaines pour arriver au mme rsultat 500 bars. Il apparat
donc, que les hydrocarbures qui parviennent aux grandes profondeurs
ocaniques sont trs lentement dgrads par les microorganismes et par
consquent peuvent persister pendant de longues priodes.
III. BIODEGRADATION DES HYDROCARBURES DANS LES gisements DE
PETROLE et voies anaerobies
III.1. BIODEGRADATION DES HYDROCARBURES DANS LES PUITS DE
PETROLE
La biodgradation du ptrole conduit une diminution du pourcentage
des hydrocarbures facilement biodgradables (n-alcanes, alcanes
monocycliques, phnylalcanes) et par consquence une augmentation de
sa densit, de sa teneur en soufre, de son acidit et sa viscosit
(Connan, 1984; Lal et Khanna, 1996). Ces changements ont des
consquences conomiques ngatives sur la production du ptrole et les
oprations de son raffinage. Lactivit microbiologique dans les puits
de ptrole peut tre le rsultat des activits humaines par
introduction de microorganismes et de produits chimiques
(nutriments, accepteurs dlectrons) lors de lexploitation des
gisements. Ces derniers peuvent stimuler la croissance microbienne
et donc induire des modifications dans la composition du ptrole. La
biodgradation arobie des hydrocarbures dans les gisements de ptrole
a t largement tudie (Evans et al., 1971; Hunt, 1979; Winters et
Williams, 1969). Cependant, il a t montr que lapport en oxygne dans
ces gisements est insuffisant pour assurer lactivit microbiologique
arobie (Horstad et al., 1990, 1992), il a donc t suggr que la
biodgradation anarobie est le processus prpondrant dans la
dgradation des hydrocarbures dans les roches rservoirs de ptrole
(Rling et al., 2003; Zengler et al., 1999; Wilkes et al., 2001;
Widdel et Rabus, 2001). En effet, les premires bactries isoles des
eaux provenant des champs de ptrole par Bastin (1926) taient
anarobies et Connan et ses collaborateurs (Bernard et Connan, 1992;
Magot et Connan, 1993; Connan et al., 1996) ont montr la prsence de
diffrents organismes anarobies dans les gisements de ptrole. Ils
ont avanc l'hypothse que ces organismes sont majoritairement
responsables de la dgradation des
50
hydrocarbures en profondeurs. La dtection de mtabolites
spcifiques, produits uniquement par voies mtaboliques anarobies a
confirm cette hypothse (Rling et al., 2003). Dans les rservoirs, 80
% du volume est occup par le ptrole alors que les 20 % restants
(sous forme de pores) le sont par de leau de salinit variable
constituant le milieu de croissance des organismes. Les rservoirs
de ptrole sont aussi caractriss par des tempratures leves puisque
la temprature augmente de 2 3 par 100 mtres de profondeur.
Gnralement, une biodgradation significative se produit des
tempratures infrieures 80 C (Connan, 1984) correspondant une
profondeur maximale de lordre de 4 km, mais cela ne signifie pas
que tous les rservoirs basse temprature contiennent du ptrole
biodgrad (Wilhelms et al., 2001). Au de l dune temprature de 80-90
C, on assiste une inhibition de la biodgradation (Connan, 1984;
Bernard et Connan, 1992; Rling et al., 2003).
Les organismes majeurs responsables de la dgradation des
hydrocarbures dans les rservoirs de ptrole sont les bactries et les
archaea et la connaissance du degr de dgradation du ptrole est trs
importante avant toute exploitation (Larter et al., 2003). Cette
dgradation se passe une vitesse trs faible de lordre de 10-6 10-7
kg dhydrocarbures/kg de ptrole/an; ce qui ncessite des millions
dannes pour perturber la composition du ptrole dans les roches
rservoirs (Larter et al., 2003). Par exemple: 15 millions dannes
sont approximativement ncessaires pour liminer les n-alcanes dun
ptrole lourd et 5 millions dannes pour un ptrole lger. La vitesse
de biodgradation est limite par la diffusion des nalcanes vers la
surface de contact entre leau et le ptrole et la disponibilit
dlments nutritifs tels que lazote et le phosphore. Les conditions
physico-chimiques dans les rservoirs de ptrole telles que le pH, la
salinit, la pression, les conditions redox et la temprature,
reprsentent des obstacles dans lisolement et ltude des
microorganismes prsents. La reproduction des conditions in situ
permet gnralement disoler des organismes reprsentatifs
(Yanagibayashi et al., 1999). La plupart des informations obtenues
ont t recueillies partir dchantillons de ptrole provenant des
rservoirs: des bactries thermophiles (Thermotoga,
Thermoanaerobacter,Thermodesulfobactrium) et des archaea
hyperthermophiles (Thermococcus, Archeaoglobus)
ont t isoles dchantillons de ptrole provenant dun gisement 1670
mtres de profondeur (Grassia et al., 1996), ces microorganismes
peuvent se dvelopper dans des conditions comparables celles in situ
(74-171 mM NaCl, 65-70 C et une pression comprise entre 50 et 150
bars). 51
III.1. VOIES DE DEGRADATION ANAEROBIE
De nombreux microorganismes ont dvelopp des capacits mtaboliques
leur permettant d'utiliser les hydrocarbures comme donneurs
d'lectrons et comme sources de carbone pour la synthse cellulaire.
La dgradation des hydrocarbures par les microorganismes dans des
conditions arobies est bien connue depuis plus d'un sicle, alors
que l'utilisation de ces composs dans des conditions anoxiques
(sdiments profonds et rservoirs de ptrole) n'a t tudie que durant
la dernire dcennie. En effet, il a t largement admis que pour les
bactries dgradant les hydrocarbures en arobiose, la prsence
d'oxygne molculaire est indispensable pour l'activation enzymatique
initiale des hydrocarbures (Britton, 1984; Gibson et Subramanian,
1984). Cette activation se traduit par l'introduction d'un ou
plusieurs groupements hydroxyles dans la molcule apolaire.
L'absence de l'oxygne molculaire dans les environnements anoxiques
ncessite un nouveau mode d'activation biochimique pour convertir
les hydrocarbures apolaires en des composs comportant des
groupements fonctionnels: la prsence de groupements fonctionnels
(hydroxyle, carbonyle ou carboxyle) dans les composs organiques est
indispensable pour toute raction d'oxydation ultrieure (Spormann et
Widdel, 2000; Widdel et Rabus, 2001). Diffrentes souches de
bactries anarobies capables de dgrader les hydrocarbures ont t
isoles de sites contamins. Ces bactries utilisent le nitrate, le
fer (III) ou le sulfate comme accepteurs d'lectrons (Figure I.18).
Un mcanisme de dgradation par mthanognse peut avoir lieu dans des
environnement o l'oxygne, le nitrate, le fer (III) et le sulphate
sont totalement absents (Zengler et al., 1999). Le tableau I.3,
montre des exemples de bactries anarobies dgradant les
hydrocarbures aliphatiques et aromatiques classes en fonction de
l'accepteur d'lectrons.
52
Hydrocarbures CnHm
H2O
SO42-
Fe (III)
NO3-
Biomasse
Biomasse
Biomasse
Biomasse
CH4 CO2
H2S CO2
Fe (II) CO2
N2 CO2
Figure I.18. Les diffrentes voies mtaboliques de la dgradation
des hydrocarbures en fonction de l'accepteur d'lectrons.
Tableau I.3. Exemples de bactries anarobies dgradant les
hydrocarbures aromatiques et aliphatiques.
Espce ou souche bactrienne
HYDROCARBURES METABOLISES
Rfrences
Bactries dnitrifiantes Thauera aromatica T1 Azoarcus tolulyticus
Td15 Azoarcus sp. souche EB1 Souche HxN1 Souche HdN1 Tolune Tolune,
m-xylne Ethylbenzne Alcanes (C6-C8) Alcanes (C14-C20) Evans et al.
(1991) Fries et al. (1994) Ball et al. (1996) Ehrenreich et al.
(2000) Ehrenreich et al. (2000)
Bactries rduisant le fer Geobacter metallireducens GS15 Tolune
Loveley et Lonergan (1990)
Bactries rduisant le sulfate Desulfobacula toluolica
Desulfobacterium cetonicum Souche AK-01 Tolune Tolune Alcanes
(C13-C18) Rabus et al. (1993) Harms et al. (1999) So and Young
(1999)
53
La dgradation des hydrocarbures aromatiques et en particulier le
tolune a t la plus tudie du fait qu'elle assure une croissance
rapide des bactries. Des tudes rcentes, ont montr que l'tape
initiale dans la dgradation des n-alcanes, du tolune, des xylnes et
de l'thylbenzne par les bactries dnitifiantes se traduit par
l'introduction d'une molcule de fumarate pour former un substituant
succinate (Heider et al., 1999; Spormann et Widdel, 2000; Widdel et
Rabus, 2001), comme le montre la Figure I.19.
COO CH3
2 [H]
COO -
COO CO-S-CoA COO -
COO -
COO -
2 [H]
COO -
CO-S-CoA
H 2O
COO CO-S-CoA HS-CoA HO
CO-S-CoA
COO -
CO22 [H]
Figure I.19. Mtabolisme de dgradation du tolune par les bactries
dnitrifiantes.
La dgradation du propylbenzne par les bactries dnitrifiantes
s'effectue par hydroxylation pour donner le 1-phenyl-1-propanol et
ensuite la propiophnone (Figure I.20; Rabus et Widdel, 1995).COOHO
H2O O CO2, "Energie" O
2 [H]
2 [H]
HS-CoA, "Energie"
CO2
O
S-CoA O S-CoA
O CO2
S-CoAHS-CoA
O
Figure I.20. Mtabolisme de dgradation du propylbenzne par les
bactries dnitrifiantes.
54
La dgradation anarobie du tolune et des alkylbenznes tel que le
m-xylne ou l'thylbenzne a t galement tudie pour diffrents
accepteurs d'lectrons. L'activation des hydrocarbures saturs
s'effectue par l'addition d'un compos carbon plutt que par
dsaturation ou hydratation. Enfin, il faut noter que la dgradation
des hydrocarbures en anarobiose compte encore des domaines mal
connus.
IV. LES LIPIDES DES BACTERIES GRAM-NEGATIVES
Un trs grand nombre de bactries hydrocarbonoclastes sont des
bactries Gramngatives (Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas,
Mycobacterium), et incluent les bactries tudies dans nos travaux.
Il est donc important de faire le point sur la composition de leurs
lipides. Ceux-ci sont essentiellement localiss dans lenveloppe
cellulaire constitue essentiellement de trois couches: la membrane
cytoplasmique, la couche peptidoglycane et la membrane
extrieure:
la membrane cytoplasmique: contient des phospholipides et des
protines en quantits quasiment gales et joue un rle dans le
transport des lments nutritifs, dans la phosphorylation oxydative
et dans la synthse des phospholipides, du peptidoglycane et des
lipopolysaccharides.
la couche peptidoglycane: est constitue de chanes linaires
contenant alternativement la N-actyl-glucosamine et lacide
N-actylmuranique. Dans les bactries Gramngatives, une monocouche de
peptidoglycane entoure la membrane cytoplasmique et sa rigidit
permet la cellule de supporter la pression osmotique du cytoplasme
qui est de lordre de 3,5 bars.
la membrane extrieure: elle a la mme paisseur que la membrane
cytoplasmique, qui est de lordre de 7,5 nm. Elle contient 9 12 %
des protines cellulaires, alors que les phospholipides et les
lipopolysaccharides sont les constituants majeurs. Cette membrane
est relie la couche peptidoglycane par des liaisons covalentes via
des lipoprotines. Il existe une nette diffrence de composition
entre les parois cellulaires des bactries
Gram-ngatives et celles des bactries Gram-positives (Figures
I.21 et I.22). La paroi cellulaire des bactries Gram-positives est
essentiellement constitue par un peptidoglycane, auquel est attache
une fraction lipidique gnralement peu importante, et il ny a pas de
membrane externe. En plus du peptidoglycane, on distingue les
acides tichoques qui sont
55
des polymres de glycrol ou de ribitol joints par des groupes
phosphates. Ils sont chargs ngativement et jouent un rle dans la
fixation des ions Mg++.
Figure I.21. Structure de la paroi cellulaire des bactries
Gram-ngatives (daprs Lugtenberg et Van Alphen, 1983).
Figure I.22. Structure de la paroi cellulaire chez les bactries
Gram-positives.
56
IV.1. LES PHOSPHOLIPIDES
Les phospholipides membranaires constituent entre 3 et 9 % du
poids sec des bactries Gram-ngatives (Raetz 1978). Gnralement, la
phosphatidylethanolamine est le constituant majeur des
phospholipi
