HIDROLISIS PROTEIN DENGAN ENZIM PROTEASE MELALUI TITRASI FORMAL ASAM AMINO

Novi Puspa Ningrom PlaikoilFakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pendidikan Ganesha

e-mail : noviplaikoil@outlook.com

AbstractProteins are the most abundant macromolecules in living cells and is 50 % or more by weight of dry

cells. Protein is found in all cells and all parts of the cell . Proteins can be broken down into amino acids through hydrolysis . When a protein is hydrolysed , the constituent amino acids will decompose . Hydrolysis of proteins can be performed using the protease enzyme of trypsin . Formal Titration of amino acids carried out in order to hydrolyze the protein using protease enzymes , and made the relationship between the volume of NaOH curve versus time curves mg of nitrogen and amino acids to time in the formal titration of amino acids . Protein can be hydrolyzed using the enzyme protease through formal titration of amino acids obtained by hydrolysis of power is 0.093 . Curve relationship between the volume of NaOH versus time curves mg of nitrogen and amino acids to the time the formal titration of amino acids is directly proportional to where the longer the solution allowed to stand , the more volume of NaOH solution required to titrate the amino acids so that the more nitrogen mg of amino acids generated .

Keywords : formal titration, amino acid, curve

1. PENDAHULUANProtein adalah makromolekul yang paling

berlimpah di dalam sel hidup dan merupakan 50% atau lebih berat kering sel. Protein ditemukan didalam semua sel dan semua bagian sel. Protein juga amat bervariasi; ratusan jenis yang berbeda dapat ditemukan dalam satu sel. Kunci struktur ribuan protein yang berbeda-beda adalah gugus pada molekul unit pembangun protein yang relatif sederhana. Semua protein, baik yang berasal dari bakteri yang paling tua atau yang berasal dari bentuk kehidupan tertinggi, dibangun dari rangkaian dasar yang sama dari 20 asam amino yang berikatan kovalen dalam urutan yang khas. Karena masing-masing asam amino mempunyai rantai samping yang khusus, yang memberikan sifat kimia masing-masing individu, kelompok 20 molekul unit pembangun ini dapat dianggap sebagai abjad struktur protein (Lehninger, 1982).

Protein dapat dipecah menjadi asam-asam amino melalui hidrolisis. Apabila suatu protein mengalami hidrolisis, maka asam-asam amino

penyusunnya akan terurai. Hidrolisis protein dapat dilakukan dengan menggunakan enzim protease dari tripsin. Asam amino bebas yang dihasilkan dari hidrolisis ini apabila direaksikan dengan formaldehid berlebih akan membentuk derivat metilol. Reaksi ini menyebabkan asam amino bebas bentuk isoelektrik kehilangan satu proton dari gugus ̶ NH3+ (Tika, 2010).

H3N+CHRCOO- H2NCHRCOO- + H+

H2NCHRCOO- + 2HCHO (HOCH2)2 NCHRCOO-

(Tika, 2010)

Asam amino merupakan ion dipolar yang pada umumnya memiliki dua atau lebih pKa. Suatu protein tertentu memiliki kadar asam amino yang tidak sama. Protein jika dihidrolisis akan menghasilkan asam amino bebas. Asam amino tidak larut di dalam eter karena merupakan senyawa dipolar dan dalam air menunjukkan struktur kutub ganda (zwitter-ion), yaitu:

(Frieda, 2002).

1

Gambar 1. Struktur dipolar asam α-amino

Ion H+ yang dilepaskan pada reaksi ini dapat dititrasi langsung dengan NaOH sampai dengan pH 8,0 (titik akhir indikator ekuivalen). Titrasi asam amino atau campuran asam amino dalam keberadaan formaldehid disebut dengan titrasi formal asam amino. Titrasi ini merupakan metode analisis untuk mengikuti pembentukan asam amino bebas yang dihasilkan pada proses hidrolisis protein oleh enzim proteotik. Selama hidrolisis suatu protein, sejumlah gugus karboksil dan gugus amino bertambah terus. Penentuan secara kuantitatif salah satu gugus akan dapat memberikan indikasi untuk mengetahui derajat hidrolisis protein. Menurut teori zwitter ion, apabila suatu asam amino dalam larutan dititrasi dengan basa, berarti ion hidrogen dari ammonium yang dititrasi. Gugus ammonium dari asam amino yang bersifat buffer pada daerah pH tinggi atau di atas pH 11, sehingga tidak mungkin dititrasi sampai titik akhir. Hal yang sama juga terjadi pada gugus karboksil yang bersifat buffer pada pH rendah sehingga tidak mungkin juga dititrasi dengan basa. Penambahan formalin ke dalam larutan asam amino akan membentuk dimetilol. Dengan terbentuknya dimetilol berarti gugus amino dari protein sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi titik akhir titrasi sehingga titik akhir titrasi dapat ditentukan dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah fenolftalein (Tika, 2010).

Titrasi formal asam amino dilakukan dengan tujuan untuk menghidrolisis protein menggunakan enzim protease, dan dibuat kurva hubungan antara volume NaOH terhadap waktu dan kurva mg nitrogen asam amino terhadap waktu pada titrasi formal asam amino.

2. METODEPenyiapan Alat dan Bahan

Praktikum diawali dengan tahap persiapan alat dan bahan. Alat yang digunakan adalah gelas kimia, labu Erlenmeyer, buret dan statif, spatula, batang pengaduk, labu ukur, kaca arloji, termometer, pemanas listrik, dan pipet tetes. Bahan yang digunakan adalah larutan gelatin, larutan NaOH 0,2 M, larutan HCl 0,1 M, indikator fenolftalein 1%, larutan formaldehida 40%, larutan tripsin 1 %, dan akuades

Titrasi Formal Asam Amino

Larutan gelatin sebanyak 100 mL disiapkan dengan melarutkan sebanyak 5,0056 gram padatan gelatin dan ditambahkan akuades sampai volume 100 mL. Setelah itu, ditambahkan 1 mL larutan PP ke dalam larutan gelatin kemudian ditambahkan dengan larutan NaOH 0,2 M tetes demi tetes hingga timbul warna merah muda. Kemudian ditambahkan tetes demi tetes larutan HCl 0,1 M sampai warna merah muda hilang. Selanjutnya larutan tersebut direndam dalam inkubator air pada suhu 38oC. Pada tabung lain, 25 mL larutan Tripsin ditambahkan dengan beberapa tetes indikator PP dan tetes demi tetes larutan NaOH 0,2 M sampai timbul warna merah muda. Setelah itu, ditambahkan tetes demi tetes larutan HCl 0,1 M ke dalam larutan tersebut sampai warna merahnya hilang. Kemudian larutan ini diinkubasi dalam inkubator air pada suhu 38oC selama beberapa menit. Selanjutnya, ditambahkan larutan tripsin ke dalam larutan gelatin dan diaduk perlahan. Setelah tercampur merata, diambil 10 mL campuran dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 100 mL (larutan ini digunakan sebagai kontrol atau waktu nol). Dilakukan pendidihan untuk merusak enzim kemudian didinginkan. Kemudian ditambahkan 15 mL formalin netral dan 3 tetes fenolftalein kemudian titrasi dilakukan menggunakan NaOH 0,02 M dengan interval waktu 15, 30, dan 45 menit dari waktu nol dilakukan yang sama seperti pada kontrol.

3. HASIL DAN PEMBAHASANDerajat hidrolisis protein (gelatin) oleh enzim protease dari tripsin dapat ditentukan dengan titrasi formal asam amino. Titrasi formal asam amino ini pada prinsipnya adalah titrasi asama basa, sehingga formalin, tripsin, dan gelatin yang digunakan pada percobaan harus dinetralkan dulu supaya tidak mengganggu hasil percobaan nantinya. Kondisi bahan-bahan yang tidak netral dapat merubah kebutuhan NaOH dalam mentitrasi sampel dan dapat menyebabkan data yang diperoleh tidak valid. Larutan gelatin ditambahkan larutan PP dan larutan NaOH 0,2 M hingga warna merah muda timbul dengan tujuan agar larutan gelatin bersifat basa yang kemudian ditambahkan dengan larutan HCl 0,1 M sampai warna merah muda larutan hilang (pH 8,0). Larutan gelatin akan mampu bereaksi secara sempurna dengan enzim protease, yaitu tripsin pada pH 8,0 yang merupakan pH optimum bagi suatu enzim untuk menghasilkan asam amino. Perlakuan yang sama juga dilakukan terhadap larutan enzim protease (tripsin).

2

Tujuan menjaga pH larutan 8,0 adalah untuk mengaktifkan enzim tripsin dalam memecah protein (gelatin), karena tripsin bekerja efektif pada pH 7,7-8,0. Proses inkubasi dilakukan sebelum dan sesudah larutan gelatin dan tripsin dicampur agar hidrolisis secara sempurna dapat terjadi. Inkubasi larutan dilakukan pada suhu 38oC. Hal ini disesuaikan dengan kondisi optimum aktivitas enzim untuk bereaksi dengan substrat dalam menghasilkan asam amino (produk). Suhu ini dijaga supaya tidak lebih dari 38oC karena dapat menyebabkan enzim rusak yang ditandai dengan pembentukan gel yang sangat mempengaruhi proses degradasi menghasilkan asam amino.

Pemanasan sampel larutan setelah masa inkubasi dimaksudkan untuk menghentikan aktivitas enzim sehingga tidak lagi bereaksi dengan substrat. Penghentian aktivitas enzim ini akan memberikan nilai/angka pasti terhadap produk yang dihasilkan, sehingga jumlah asam amino yang terbentuk tepat dan tidak bertambah lagi ketika proses titrasi berlangsung dan dapat diperhitungkan dengan benar. Proses titrasi dilakukan dengan menambahkan larutan formalin terlebih dahulu dan diikuti dengan penambahan indikator PP. Titrasi dilakukan dengan interval waktu 0, 15, 30, dan 45 menit. Reaksi yang terjadi dalam proses ini adalah sebagai berikut.

3

Gambar 2. (a) larutan gelatin + indikator PP + larutan NaOH 0,2 M(b) larutan gelatin + indikator PP + larutan NaOH 0,2 M +

larutan HCl 0,1 M

Gambar 3. (a) larutan tripsin + indikator PP + larutan NaOH 0,2 M(b) larutan tripsin + indikator PP + larutan NaOH 0,2 M +

larutan HCl 0,1 M

(b)(a)

(b)(a)

Gambar 4. Persamaan reaksi pada proses titrasi formal asam amino

Kurva Hubungan Volume NaOH Terhadap Waktu

Volume NaOH yang diperlukan pada saat titrasi formal asam amino ini pada menit ke- 0, 15, 30, dan

45 serta kurva titrasi antara volume NaOH (ordinat) terhadap waktu (absis) berdasarkan data tabel adalah sebagai berikut.

Tabel 1. Volume NaOH yang Diperlukan dalam Titrasi Formal Asam Amino Waktu (menit) Volume NaOH (mL)

0 12,4715 14,5030 15,6745 16,73

4

Natrium dimethilol

formalin

(pada pH netral)

Gambar 5. Kurva hubungan volume NaOH (mL) terhadap waktu (menit)

Kurva di atas menunjukkan bahwa semakin lama larutan didiamkan, maka semakin banyak volume NaOH yang digunakan untuk proses titrasi karena selama proses hidrolisis gelatin oleh tripsin dihasilkan sejumlah asam amino yang konsentrasinya bertambah seiring dengan lamanya kontak antara larutan gelatin dengan larutan tripsin.

Enzim tripsin yang semakin lama menghidrolisis gelatin menyebabkan gugus karboksil dan gugus amino yang dihasilkan semakin banyak yang menyebabkan jumlah NaOH yang digunakan pada saat titrasi juga bertambah. Hubungan antara waktu dan volume NaOH rata-rata dalam persamaan regresi linear adalah sebagai berikut.

Tabel 2. Analisis Perhitungan Slop dan Intersep Volume NaOH Terhadap WaktuX

(waktu)Y

(volume NaOH)XY X2

0 12,47 0 015 14,50 217,50 22530 15,67 470,10 90045 16,73 752,85 2025

Slop = a = (1)

=

Intersep = b = (2)

5

Persamaan regresi linear:

(3)

Daya hidrolisis dari enzim tripsin dalam titrasi formal ini adalah:

(4)Tabel 3. Volume NaOH dalam Persamaan Regresi Linear

X(waktu)

Y(volume NaOH)

0 12,7515 14,14530 15,5445 16,935

Gambar 6. Kurva regresi linear hubungan volume NaOH (mL) terhadap waktu (menit)

Kurva Hubungan mg Nitrogen Asam Amino Terhadap Waktu

Persamaan regresi linear mg nitrogen asam amino diperoleh dengan mengasumsikan 1 mL NaOH ekivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga dapat dihitung jumlah mg asam amino pada tiap volume NaOH pada saat titrasi, dengan analisis perhitungan sebagai berikut.

Pada waktu t = 0,Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 12,47 mLMol NaOH = 12,47 mL x 0,02 M = 0,2494 mmol1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,2494 mmol NaOH ekuivalen dengan

nitrogen asam amino (5)

6

y = ax + b = 0,093x + 12,75

Perhitungan yang sama juga dilakukan untuk memperoleh mg asam amino pada menit ke-15, 30,

dan 45. Data mg asam amino untuk tiap volume NaOH dapat dilihat pada kurva berikut.

Gambar 7. Kurva hubungan nitrogen asam amino (mg) terhadap waktu (menit)

Tabel 4. Analisis Perhitungan Slop dan Intersep Nitrogen Asam Amino (mg) untuk Tiap Volume NaOHX

(waktu)Volume NaOH

(mL)Y

(mg asam amino)XY X2

0 12,47 3,49 0 015 14,50 4,06 60,9 22530 15,67 4,3876 131,628 90045 16,73 4,6844 210,798 2025

Slop = a = (6)

=

Intersep = b = (7)

Persamaan regresi linear:

(8)

7

y = ax + b = 0,026072x + 3,56888

8

Tabel 5. Nitrogen Asam Amino (mg) dalam Persamaan Regresi LinearX

(waktu)Y

(mg asam amino)0 3,5688815 3,9599630 4,3510445 4,74212

Gambar 8. Kurva regresi linear hubungan nitrogen asam amino (mg) terhadap waktu (menit)

Kurva di atas menunjukkan peningkatan jumlah mg nitrogen asam amino seiring dengan bertambahnya waktu kontak antara larutan gelatin dengan larutan tripsin. Enzim tripsin yang semakin lama menghidrolisis gelatin menyebabkan gugus karboksil dan gugus amino yang dihasilkan semakin banyak, sehingga nitrogen yang terdapat pada dimetilol juga ikut bertambah.

4. KESIMPULANProtein dapat dihidrolisis menggunakan enzim

protease melalui titrasi formal asam amino dengan daya hidrolisis yang diperoleh adalah 0,093. Kurva hubungan antara volume NaOH terhadap waktu dan kurva mg nitrogen asam amino terhadap waktu pada titrasi formal asam amino berbanding lurus dimana semakin lama larutan didiamkan, maka semakin banyak volume NaOH yang diperlukan untuk mentitrasi larutan asam amino tersebut sehingga semakin banyak pula mg nitrogen dari asam amino yang dihasilkan.

5. UCAPAN TERIMA KASIH

Terimakasih penulis ucapkan kepada Bapak Dewa Subamia sebagai laboran Lab Kimia Organik Jurdik Kimia UNDIKSHA atas bantuannya untuk menyiapkan alat dan bahan selama penulis melaksanakan praktikum.

6. REFERENSIFessenden, F dan Fessenden. 1994. Kima Organik

Jilid 2. Jakarta : ErlanggaFrieda Nurlita, dkk. 2002. Kimia Organik II.

Singaraja : Institut Keguruan dan Ilmu Pendidikan Negeri Singaraja.

Girindra, Aisyah dan Titin Supriyanti. 1994. Dasar – dasar Biokimia. Jakarta ; Universitas Indonesia.

Lehninger, Albert.L. 1982. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1 dan 3 Alih Bahasa Maggy Thenawidjaya. Jakarta: Erlangga.

Morrison, Robert Thornton and Robert Neilson Boyd.1983.Organic Chemistry Fourth Edition.Singapore: Allyn and Bacon, Inc

Murray Robert K.et al.1995.Biokimia Harper Edisisi ke-22., alih bahasa dr.Andry

9

Hartono.Harper’s Biochemistry 22nd

edition. Jakarta: Penerbit Buku KedokteranNurcahyo, Heru. 2005. Regulasi Metabolisme

Protein. Yogyakarta : Universitas Negeri Yogyakarta

Purba, Michael. 2004. Kimia Untuk SMA Kelas XII. Jakarta : Erlangga

Redhana, I Wayan. 2004. Buku Ajar Biokimia Jilid I. Singaraja : Institut Keguruan dan Ilmu Pendidikan Negeri Singaraja.

Redhana, I Wayan. 2010. Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja : Universitas Pendidikan Ganesha

Stryer, Lubert. 2000. Biokimia Edisi 4. Jakarta: EGC

Sudarmadji, S., B. Haryono dan Suhardi. 1989. Prosedur Analisa untuk Bahan Makanan dan Pertanian. Edisi ketiga. Fakultas Teknologi Pertanian, UGM. Penerbit Liberty. Yogyakarta.

Tika, I Nyoman. 2010. Buku Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja: Universitas Pendidikan Ganesha.

Voet, Donald et al.1999.Fundamentals of Biochemistry.USA: John Wiley & Sons, Inc

Wirahadikusuma, Muhamad. 2001. Biokimia : Protein, Enzim, dan Asam Nukleat. Bandung : Penerbit ITB.

10