TOKSISITAS EKSTRAK SENYAWA BIOAKTIF DARI

BAKTERI YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS

DAN ANALISIS DNA YANG BERPERAN

DALAM BIOSINTESISNYA

MOHAMMAD FADHILLAH

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul “Toksisitas Ekstrak

Senyawa Bioaktif dari Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons dan Analisis DNA

yang Berperan dalam Biosintesisnya” adalah benar karya saya dengan arahan dari

komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan

tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang

diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks

dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skipsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, Februari 2014

Mohammad Fadhillah

NIM G34090094

ABSTRAK

MOHAMMAD FADHILLAH. Toksisitas Ekstrak Senyawa Bioaktif dari

Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons dan Analisis DNA yang Berperan dalam

Biosintesisnya. Dibimbing oleh ARIS TRI WAHYUDI dan DUDI TOHIR.

Spons merupakan organisme penghasil banyak senyawa bioaktif yang hidup

bersimbiosis dengan banyak mikroorganisme. Mikroorganisme simbion salah

satunya berperan sebagai penghasil senyawa bioaktif untuk pertahanan diri spons

inangnya. Penelitian ini bertujuan menguji toksisitas ekstrak etil asetat bakteri

yang berasosiasi dengan spons terhadap larva Artemia salina serta analisis

keragaman DNA yang berperan dalam sintesis senyawa bioaktif. Uji toksisitas

dilakukan dengan metode BSLT yang menghasilkan nilai LC50 sebesar 117.1

µg/mL sampai 620 µg/mL. Fraksionasi ekstrak etil asetat isolat SAB E-35, SAB

E-38 dan SAB E-40 menggunakan teknik kromatografi lapis tipis preparatif

(KLTP) menghasilkan fraksi dengan nilai LC50 terbaik yaitu 116.7 µg/mL. Fraksi

38-E dari isolat SAB E-38 menunjukkan peningkatan nilai toksisitas dari ekstrak

etil asetatnya, yaitu dari 138.6 µg/mL menjadi 116.7 µg/mL. Isolat SAB E-35,

SAB E-38 dan SAB E-40 memiliki gen penyandi domain KS dari PKS dan

domain A dari NRPS dengan homologi 47% hingga 100%. SAB E-40 memiliki

homologi yang rendah dan diduga berpotensi sebagai penghasil senyawa bioaktif

baru.

Kata kunci: bakteri yang berasosiasi dengan spons, NRPS, PKS, toksisitas

ABSTRACT

MOHAMMAD FADHILLAH. Toxicity of Sponge-Associated Bacteria

Bioactive Compounds Extract and Analysis of DNA that play role in its

Biosynthesis. Supervised by ARIS TRI WAHYUDI and DUDI TOHIR.

Sponges are organisms that produced many bioactive compounds and live

symbiotically with many microorganisms. Symbiont microorganisms act as

producers of bioactive compounds for sponge self-defense. This study aims to test

the toxicity of the ethyl acetate extract sponge-associated bacteria against Artemia

salina larvae and diversity analysis of DNA that play a role in the synthesis of

bioactive compounds. BSLT was used as toxicity assay method and obtained LC50

values ranged from 117.1 µg/mL to 620 µg/mL. Fractionation of the ethyl acetate

extract for isolates SAB E-35, SAB E-38 and SAB E-40 using preparative thin

layer chromatography technique (PTLC) yielded fraction with the best LC50 value

116.7 µg/mL. Fraction 38-E of isolate SAB E-38 showed increase in LC50 value

from its etyl acetat extract 138.6 µg/mL to 116.7 µg/mL. Isolates SAB E-35, SAB

E-38, and SAB E-40 has gene that encoded the KS domain of PKS and A domain

of NRPS with homology percentage from 47% to 100%. SAB E-40 has low

homology and expected as potential producer of new bioactive compounds.

Keywords: NRPS, PKS, sponge-associated bacteria, toxicity

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains

pada

Departemen Biologi

TOKSISITAS EKSTRAK SENYAWA BIOAKTIF DARI

BAKTERI YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS

DAN ANALISIS DNA YANG BERPERAN

DALAM BIOSINTESISNYA

MOHAMMAD FADHILLAH

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

Judul Skripsi : Toksisitas Ekstrak Senyawa Bioaktif dari Bakteri yang Berasosiasi

dengan Spons dan Analisis DNA yang Berperan dalam

Biosintesisnya

Nama : Mohammad Fadhillah

NIM : G34090094

Disetujui oleh

Prof Dr Aris Tri Wahyudi, M Si

Pembimbing I

Diketahui oleh

Dr Iman Rusmana, M Si

Ketua Departemen

Tanggal Lulus:

Drs Dudi Tohir, M S

Pembimbing II

PRAKATA

Puji dan rasa syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala

karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih

pada penelitian ini adalah Toksisitas Ekstrak Senyawa Bioaktif dari Bakteri yang

Berasosiasi dengan Spons dan Analisis DNA yang Berperan dalam

Biosintesisnya.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof Dr Aris Tri Wahyudi, M Si dan

Drs Dudi Tohir, MS selaku dosen pembimbing dan Puji Rianti, M Si selaku dosen

penguji yang telah memberikan arahan dan bimbingannya dalam penyelesaian

karya ilmiah ini. Penulis juga mengucapkan rasa terima kasih kepada Pak Eman,

Pak Sabur, Issanto, S Si, Effendi, M Si, Rahayu Wangsa Putrie, M Si, dan Annisa

Wulan Agus Utami, S Si yang telah banyak membantu dalam pengerjaan dan juga

memberikan saran serta masukan untuk penelitian ini. Ungkapan terima kasih juga

penulis sampaikan kepada Ayah, Ibu, dan seluruh keluarga atas dukungannya baik

secara moril maupun materil selama penyusunan skripsi ini.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Februari 2014

Mohammad Fadhillah

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL viii

DAFTAR GAMBAR viii

DAFTAR LAMPIRAN viii

PENDAHULUAN 1

Latar Belakang 1

Tujuan Penelitian 2

METODE 2

Bahan 2

Alat 2

Prosedur 2

HASIL DAN PEMBAHASAN 4

Ekstraksi Senyawa Bioaktif dan Toksisitasnya 4

Toksisitas Fraksi 6

Amplifikasi Domain KS dan Domain A 7

Analisis Bioinformatika 9

SIMPULAN DAN SARAN 12

Simpulan 12

Saran 12

DAFTAR PUSTAKA 12

LAMPIRAN 17

RIWAYAT HIDUP 21

DAFTAR TABEL

1 Nilai LC50 ekstrak etil asetat bakteri yang berasosiasi dengan spons 4 2 Nilai LC50 fraksi ekstrak etil asetat bakteri yang berasosiasi dengan

spons 7 3 Persentase homologi sekuen gen penyandi domain A 9 4 Persentase homologi sekuen gen penyandi domain KS 9

DAFTAR GAMBAR

1 Fraksionasi ekstrak bakteri SAB E-38 menggunakan kromatografi

lapis tipis preparatif (KLTP) 6

2 Elektroforesis gel agarose 1% domain KS dan domain A yang

diamplifikasi dari genom isolat SAB E-35, SAB E-38 dan SAB E-40 8

3 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen asam amino domain A

(adenilation) 10

4 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen asam amino domain KS

(ketosintase) 11

DAFTAR LAMPIRAN

1 Perhitungan LC50 isolat SAB E-40 17

2 Komposisi medium sea water complete (SWC) 1000 mL 18

3 Sekuen parsial domain KS dan A 18

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Spons (Filum : Porifera) merupakan organisme penghasil banyak senyawa

bioaktif yang hidupnya bersimbiosis erat dengan banyak mikroorganisme. Wang

(2006) melaporkan bahwa spons merupakan inang bagi banyak mikroorganisme

dari golongan arkaea, bakteri, fungi, aktinomiset, alga hijau biru, dan mikroalga

yang dapat mencapai 40-60% dari biomassa total pada beberapa spons tertentu.

Mikroorganisme yang berasosisasi dengan spons memiliki beberapa peran

meliputi penyedia nutrien tertentu, menstabilkan rangka spons, memproses limbah

metabolisme, dan memproduksi metabolit sekunder (Hentschel et al. 2002).

Beberapa mikoorganisme yang diisolasi dari spons dan hewan laut lain dilaporkan

memproduksi senyawa bioaktif yang sama dengan inangnya. Senyawa bioaktif

yang dihasilkan oleh mikroorganisme simbion sebagai salah satu bentuk

pertahanan bagi hewan invertebrata laut yang tidak memiliki pertahanan secara

fisik (Berdy 2005). Saat ini, kemampuan memproduksi metabolit sekuder yang

bersifat bioaktif dari mikroorganisme yang berasosiasi dengan spons mulai

banyak dipelajari karena berpotensi untuk bidang biomedis dan farmasi sebagai

antiviral, antitumor, antimikrob, dan aktivitas sitotoksik.

Lautan merupakan sumber banyak senyawa-senyawa bioaktif yang

bermanfaat dalam bidang medis dan farmasi. Salah satu senyawa bioaktif yang

berpotensi sebagai antikanker diisolasi dari ekosisitem laut antara lain peptida

pendek linear atau siklik, depsipeptida, poliketida, dan steroid (Simmon et al.

2005). Sebagian besar senyawa tersebut diisolasi dari hewan invertebrata laut

misalnya spons, tunicata, bryozoa, dan moluska. Di samping itu, mikroorganisme

simbion hewan invertebrata laut juga berpotensi sebagai penghasil senyawa-

senyawa antikanker. Beberapa penelitian yang melaporkan mikroorganisme

simbion memiliki kemampuan sebagai penghasil senyawa antikanker antara lain

bakteri yang berasosiasi dengan spons Thonella swinhoei (Piel et al. 2004) dan

Pseudomonas piscida dari spons Hymeniacidon perleve (Zheng et al. 2006).

Keragaman senyawa bioaktif yang dihasilkan mikroorganisme yang

berasosiasi dengan spons dapat dipelajari salah satunya melalui pendekatan

biologi molekuler (Taylor et al. 2007). Pendekatan biologi molekuler mampu

mengisolasi gen yang menyandikan biosintesis suatu senyawa bioaktif dan

menganalisisnya secara bioinformatik sebagai informasi tambahan dalam

penentuan jenis senyawa bioaktif yang dihasilkan (Zhang et al. 2005). Enzim

peptida sintase nonribosom (NRPS) dan poliketida sintase (PKS) adalah enzim

multidomain yang terlibat dalam biosintesis senyawa bioaktif dari golongan

peptida nonribosom dan poliketida pada banyak bakteri, cendawan, dan tanaman.

Kedua kelompok metabolit sekunder tersebut banyak yang bermanfaat dalam

dunia medis dan farmasi (Cane dan Walsh 1999).

Bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. dalam penelitian ini

diisolasi oleh Abubakar et al. (2011). Beberapa isolat dilaporkan menunjukkan

aktivitas antimikrob terhadap beberapa strain patogen manusia. Selanjutnya, Putra

(2012) juga menelaah isolat-isolat terbaik tersebut meliputi, konsentrasi hambat

minimum dan aktivitas antimikrob ekstrak etil asetatnya serta bioautografi

2

terhadap beberapa bakteri patogen manusia. Isolat-isolat tersebut diberikan kode

yaitu sponge-associated bacteria (SAB) antara lain, SAB E-8, SAB E-35, SAB E-

38, SAB E-40, dan SAB S-43.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan menguji toksisitas ekstrak kasar senyawa bioaktif

dan hasil fraksionasi dari bakteri yang berasosiasi dengan spons serta analisis

sekuens DNA yang berperan dalam biosintesis senyawa tersebut.

METODE

Bahan

Bahan yang digunakan adalah isolat-isolat terbaik dari bakteri yang

berasosiasi dengan spons Jaspis sp., yaitu SAB E-8, SAB E-35, SAB E-38, SAB

E-40 dan SAB S-43 (Putra 2012) serta telur Artemia salina. Medium yang

digunakan yaitu sea water complete (SWC) dan air laut (Lampiran 2). Pelarut

yang digunakan untuk ekstraksi adalah etil asetat.

Alat

Alat laboratorium yang digunakan adalah peralatan mikrobiologi pada

umumnya, Silica gel 60 GF254 Merck, peralatan KLT Preparatif, Laminar Air

Flow Cabinet (Jouan, Prancis), autoklaf, hot plate, dan rotary evaporator

Prosedur

Ekstraksi Senyawa Bioaktif

Isolat bakteri yang digunakan dikulturkan dalam media 1000 mL cair

(Lampiran 2). Kultur diinkubasi pada mesin penggoyang (100 rpm, 30 0C) selama

tiga hari, kemudian ditambahkan etil asetat 1000 mL dan diaduk selama 2 jam.

Lapisan etil asetat pada bagian atas kultur dipisahkan dan kemudian dipekatkan

dengan rotary evaporator untuk mendapatkan ekstrak kasar. Ekstrak kasar yang

didapatkan disimpan pada suhu 5 0C hingga digunakan pada penelitian

selanjutnya (Müller et al. 2004).

Uji Toksisitas menggunakan Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)

Uji BSLT dilakukan terhadap larva A.salina. Penetasan A.salina dilakukan

dengan cara memasukkan setengah sendok teh telur ke dalam sistem alat penetas,

aerator dan sumber cahaya. Telur diaerasi dengan kuat selama 24-36 jam

kemudian. Larva yang digunakan untuk uji toksisitas adalah larva aktif yang

berada di daerah yang diberi cahaya. Sebanyak 20 larva dimasukkan dalam tabung

uji dan kemudian ekstrak senyawa bioaktif ditambahkan hingga mencapai

konsentrasi akhir yaitu, 10 µg/mL, 100 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL, 750

µg/mL dan kontrol. Setelah 24 jam jumlah larva yang hidup pada setiap

3

konsentrasi dihitung dan dibandingkan dengan kontrol. Persentase kematian larva

dihitung dengan rumus :

e i e i e i

Nilai kematian organisme uji 50% (LC50) ditentukan dengan menggunakan kurva

hubungan antara logaritma konsentrasi ekstrak (x) dan nilai probit dari persentase

kematian larva udang (y) (Lampiran 1). Analisis probit yang digunakan

berdasarkan dari metode Finney dan Stevens (1948).

Fraksionasi Ekstrak Kasar

Ekstrak kasar yang difraksionasi dipilih berdasarkan nilai LC50 ekstrak

kasar terbaik. Fraksionasi dilakukan dengan kromatografi lapis tipis preparatif

(KLTP). Bubuk silica gel dilarutkan dengan akuades dan dibuat menjadi lapisan

tipis pada pelat kaca berukuran 20×20 cm. Selanjutnya, ekstrak kasar yang sudah

diencerkan dengan etil asetat diteteskan memanjang pada pelat kaca. Kemudian

pelat dimasukkan ke dalam kotak kromatografi yang berisi eluen n-butanol:etil

asetat 3:7 (Putra 2012) yang telah dijenuhkan selama satu jam. Setelah senyawa

bergerak sampai garis batas atas, pelat dikeluarkan dan dikeringkan. Komponen-

komponen senyawa yang terpisah menjadi beberapa fraksi yang berbentuk pita di

sepanjang pelat, kemudian dilihat dan ditandai di bawah sinar UV (Zheng et al.

2005). Fraksi-fraksi yang terpisah kemudian diambil dan dikelompokkan. Setelah

itu kumpulan fraksi tersebut dilarutkan dengan metanol. Fraksi yang telah

telarutkan dengan metanol kemudian disaring untuk memisahkan fraksi senyawa

dari silica gel. Fraksi dipekatkan kembali dengan rotary evaporator untuk diuji

kembali toksisitasnya menggunakan larva A.salina menggunakan uji BSLT.

Isolasi DNA Genom

Bakteri dikulturkan pada media SWC selama 24 jam. Sebanyak 1.5 mL

kultur disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 10 menit. DNA genom diisolasi

dengan mengikuti metode CTAB (Sambrook dan Russell 2001).

Amplifikasi gen PKS (Domain KS) dan NRPS (Domain A)

Reaksi PCR untuk mengamplifikasi gen penyandi domain KS dari PKS

dan domain A dari NRPS dilakukan dengan metode Schirmer et al. (2005). Reaksi

PCR dilakukan sebanyak 35 siklus dengan masing-masing tahap yaitu

predenaturasi selama 1 menit dan denaturasi selama 5 menit pada suhu 94 ºC,

annealing pada 50 ºC selama 1 menit, polimerisasi pada 72 ºC selama 1 menit,

dan postPCR dilakukan pada suhu 72 ºC selama 10 menit. Visualisasi amplikon

dilakukan dengan elektroforesis pada agarose 1% (b/v). Isolat yang mempunyai

gen penyandi domain ketosintase (KS) menunjukkan terbentuknya pita pada

ukuran di sekitar 700 pb, sedangkan domain adenilation (A) berukuran 1000 pb.

Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi domain KS adalah forward: 5’-

CSATGGAYCCSCARCARCGSVT-3’ reverse : 5’-GTSCCSGTSCCRTGSSC-

YTCSAC-3’ d se ue p i e spesifi u u d i A y i u forward : 5’-

AARDSIGGIGSIGSITAYBICC-3’reverse : 5’-CKRWAICCICKIAIYTTIA-

4

YYTG-3’(Schi e et al. 2005). Selanjutnya, hasil amplifikasi disekuen

menggunakan jasa 1st BASE DNA Sequencing Services.

Analisis Bioinformatika

Sekuen DNA yang didapat (Lampiran 3), kemudian disejajarkan dengan

sekuen yang ada di Genbank (NCBI) menggunakan program BlastX sehingga

didapatkan beberapa sekuen lain yang memiliki kemiripan terdekat. Setelah itu,

sekuen DNA diterjemahkan ke dalam runutan protein menggunakan ExPASY

Molecular Biology untuk membuat pohon filogenetik. Pohon filogenetik dibuat

dengan perangkat lunak Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) versi

5.0 (Tamura et al. 2011).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Ekstraksi Senyawa Bioaktif dan Toksisitasnya

Uji toksisitas terhadap larva udang merupakan salah satu metode uji

bioaktif pada penelitian senyawa bahan alam. BSLT merupakan uji pendahuluan

dan digunakan untuk penapisan aktivitas antikanker serta sebagai alternatif

metode yang murah untuk uji toksisitas (Hamburger dan Hostettmann 1991).

Hasil uji BSLT untuk ekstrak etil asetat bakteri yang digunakan menunjukkan

hasil yang beragam seperti tersaji pada Tabel 1. Nilai LC50 yang didapatkan

berkisar antara 117.1 µg/mL sampai 620 µg/mL. Menurut Meyer et al. (1982),

suatu ekstrak dianggap sangat toksik bila memiliki nilai LC50 di bawah 30 µg/mL,

dianggap toksik bila memiliki nilai LC50 30–1000 µg/mL dan dianggap tidak

toksik bila nilai LC50 di atas 1000 µg/mL. Semua ekstrak etil asetat dari isolat

bakteri yang digunakan bersifat toksik. Ekstrak etil asetat dengan nilai LC50

terbaik yaitu dari isolat SAB E-35, SAB E-38, dan SAB-E 40 selanjutnya

dilakukan fraksionasi dan uji BSLT lanjutan.

Tabel 1 Nilai LC50 ekstrak etil asetat bakteri yang berasosiasi dengan spons

Kode Isolat Rendemen (% b/v) LC50 (µg/mL)

SAB E-8 0.01 620

SAB E-35 0.02 117.1

SAB E-38 0.02 138.6

SAB E-40 0.01 244.4

SAB S-43 0.02 457

Nilai LC50 adalah nilai rata-rata 3 kali ulangan menggunakan larva A. salina (nauplii).

Ekstrak bakteri yang didapatkan disajikan dalam hasil perhitungan

rendemen (% b/v) pada Tabel 1. Data tersebut memperlihatkan jumlah ekstrak

yang didapatkan dari hasil ekstraksi kultur cair bakteri yang berasosiasi dengan

5

spons. Hasil ekstraksi dengan eluen etil asetat 1000 mL dapat menghasilkan 0.1-

0.2 gram. Pada ekstraksi langsung jaringan spons, ekstrak yang diperoleh dapat

mencapai 150 gram dari 2 kg spons Jaspis sp. (Tang et al. 2012), 80 gram dari

500 gram spons Jaspis splendes (Ebada et al. 2009). Spons yang digunakan dalam

penelitian tersebut diisolasi langsung dari laut. Ekstraksi langsung dari spons

memang lebih banyak menghasilkan ekstrak namun sangat membahayakan

kelestarian spons tersebut. Solusi permasalahan tersebut antara lain isolasi

mikroorganisme yang berasosiasi dengan spons dan budi daya spons. Budi daya

spons ternyata memiliki kelemahan yaitu waktu pertumbuhan yang lama untuk

pemanenan ukuran komersial spons yaitu 800 gram selama 2-3 tahun (MacMillan

1999). Oleh karena itu, salah satu cara yang ramah lingkungan adalah dengan

mencari potensi senyawa bioaktif dari bakteri yang berasosiasi dengan spons.

Larva A. salina digunakan sebagai hewan uji karena sifatnya yang peka

terhadap bahan uji, waktu siklus hidup yang cepat, mudah dibiakkan dan harganya

yang murah. Sifat peka A. salina disebabkan oleh keadaan membran kulitnya yang

sangat tipis sehingga memungkinkan terjadinya difusi zat dari lingkungan yang

mempengaruhi metabolisme dalam tubuhnya (Meyer et al.1982). Larva A. salina

yang digunakan sebagai hewan uji BSLT yang berumur 24 jam karena

pembelahan A. salina pada rentang waktu 0-24 jam mengalami pembelahan sel

yang cepat seperti pembelahan sel kanker (Anderson et al. 1991). Beberapa hal

yang menentukan keakuratan nilai toksisitas yang didapatkan antara lain, suhu

inkubasi telur dan suhu air laut, umur larva yang digunakan, dan salinitas air laut

yang digunakan (Sargeloos et al. 1978).

Uji BSLT masih relevan dalam penapisan senyawa yang bersifat sitotoksik

dan dibuktikan berkorelasi positif dengan hasil uji sitotoksik pada sel kanker

(Carballo et al. 2002). Fajarningsih et al. (2006) melaporkan adanya kenaikan

nilai toksisitas ekstrak metanol spons Crella papilata dari 19.99 µg/mL terhadap

A. salina menjadi 7.6 µg/mL terhadap sel kanker HeLa. Peningkatan nilai

toksisitas juga mungkin dapat terjadi untuk ekstrak etil asetat dari bakteri yang

digunakan pada penelitian ini. Nilai toksisitas terbaik yang didapatkan dari SAB

E-35 yaitu sebesar 117.1 µg/mL. Penelitian lain yang menggunakan ekstrak

langsung spons Petrosia sp. dari Bunaken seperti Astuti et al. (2003)

menghasilkan LC50 bervariasi antara 48.15 µg/mL sampai 445.7 µg/mL.

Pengembangan senyawa bioaktif yang berasal dari spons mengalami hambatan

karena memerlukan biomassa spons yang besar untuk mengekstraksi senyawa

bioaktif dalam aplikasinya di bidang medis (Proksch et al. 2002). Bakteri yang

berasosiasi dengan spons yang menghasilkan senyawa bioaktif diharapkan dapat

dijadikan sebagai alternatif untuk permasalahan tersebut.

Spons laut hidup bersimbiosis dengan mikroorganisme seperti golongan

arkaea, bakteri, fungi, aktinomiset, alga hijau biru, dan mikroalga (Zhang et al.

2005) yang dapat mencapai hingga 40-60% biomassa tubuhnya (Wang 2006).

Beberapa penelitian melaporkan keterlibatan mikroorganisme simbion dari

beberapa bahan alam yang awalnya diisolasi dari spons inangnya karena beberapa

mikroorganisme yang diisolasi dari spons menghasilkan senyawa yang sama

dengan hasil isolasi langsung dari spons. Micrococcus sp. memproduksi

diketopiperazines yang awalnya dilaporkan dari spons Tedania ignis. Bakteri

simbion yang lain, Vibrio sp. menghasilkan brominated biphenyl ethers yang

awalnya diisolasi dari spons Dysidea sp. Selain itu, bakteri Vibrio sp. lainnya

6

memproduksi andrimid peptida anti-Bacillus yang awalnya ditemukan dalam

ekstrak spons Hytella sp. (Lee et al. 2001).

Toksisitas Fraksi

Tiga isolat yang memiliki nilai LC50 terendah difraksionasi menggunakan

metode kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) yaitu, SAB E-35, SAB E-38

dan SAB E-40 (Gambar 1). Ekstrak etil asetat SAB E-35, SAB E-38 dan SAB E-

40 berturut-turut menghasilkan 5, 5, dan 6 fraksi (Tabel 2). Semua fraksi tersebut

kemudian diuji toksisitas kembali dengan metode BSLT. Fraksi dari SAB E-35

dan SAB E-40 menghasilkan nilai LC50 yang lebih besar dibandingkan nilai LC50

ekstrak etil asetatnya. Nilai LC50 ekstrak etil asetat SAB E-35 adalah 117.15

µg/mL sedangkan nilai LC50 fraksi-fraksinya yaitu, 630 µg/mL, 1148.15 µg/mL

dan 3981.07 µg/mL. Selain itu, nilai LC50 ekstrak etil asetat SAB E-40 adalah

244.4 µg/mL sedangkan nilai LC50 fraksi-fraksinya yaitu, 562 µg/mL, 1047.01

µg/mL dan 1202.3 µg/mL. Setiap isolat memiliki fraksi aktif dengan nilai LC50

yang lebih besar dibandingkan ekstrak etil asetatnya, kecuali fraksi 38-E. Satu

fraksi dari SAB E-38 yang melebihi keaktifan ekstrak etil asetatnya yaitu 38-E

dengan nilai LC50 116.7 µg/mL sedangkan nilai ekstrak etil asetatnya 138.6

µg/mL.

(a) (b)

Gambar 1 Fraksionasi ekstrak bakteri SAB E-38 menggunakan kromatografi lapis

tipis preparatif (KLTP) (a) Hasil fraksionasi di bawah sinar UV λ 254

nm (b) Ilustrasi hasil fraksionasi di bawah sinar UV λ 254 nm

Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu metode pemisahan

sederhana yang berguna untuk memisahkan campuran sehingga diperoleh

senyawa dalam jumlah banyak. Kromatografi preparatif dipakai untuk

memperoleh komponen campuran dalam jumlah yang memadai sehingga

komponen itu dapat dicirikan lebih lengkap atau dipakai pada reaksi berikutnya.

Pemisahan preparatif merupakan hal yang biasa dalam bidang kimia, biologi,

farmasi dan kedokteran (Gritter et al. 1991). Pada penelitian ini, dilakukan teknik

KLTP untuk mendapatkan fraksi dalam jumlah banyak untuk digunakan pada uji

Fraksi 38-E

Fraksi 38-D

Fraksi 38-C

Fraksi 38-B

Fraksi 38-A

Penetesan

ekstrak

7

selanjutnya. Nilai LC50 fraksi jika dibandingkan dengan ekstrak etil asetatnya

yang menurun seperti pada beberapa fraksi SAB E-35 dan SAB E-40 diduga

karena kemampuan toksisitasnya merupakan gabungan dari fraksi-fraksi yang

terpisah pada saat KLTP. Krisyuninda (2012) juga menemukan fraksi hasil

pemisahan KLTP yang tidak toksik dari ekstrak spons Callyspongia. Sp. Fraksi

yang tidak toksik adalah fraksi alkaloid yang memiliki nilai LC50 2012.5 µg/mL

dan fraksi steroid dengan nilai LC50 1821.05 µg/mL.

Tabel 2 Nilai LC50 Fraksi ekstrak etil asetat bakteri yang berasosiasi dengan spons

Kode Isolat LC50 (µg/mL)

Ekstrak Etil asetat Kode Fraksi LC50 (µg/mL)

117.1

35-A 3981.1

35-B -

SAB E-35 35-C -

35-D 1148.2

35-E 630

138.6

38-A -

38-B -

SAB E-38 38-C 707.9

38-D 933.2

38-E 116.7

244.4

40-A -

40-B -

SAB E-40 40-C -

40-D 1047.1

40-E 1202.3

40-F 562

Nilai LC50 adalah nilai rata-rata 3 kali ulangan menggunakan larva A. salina (nauplii)

- : tidak ada larva A. Salina yang mati setelah 24 jam perlakuan

Amplifikasi Domain KS dan Domain A

Karakteristik lain bakteri yang berpotensi penghasil senyawa bioaktif

adalah adanya gen yang menyandikan enzim poliketida sintase (PKS) dan peptida

nonribosom sitetase (NRPS). PKS dan NRPS adalah dua jenis enzim yang terlibat

dalam sintesis bahan alam pada banyak bakteri, cendawan, dan tanaman (Cane et

al. 1998; Moffit dan Neilan 2003). Kedua enzim tersebut berperan dalam sintesis

banyak senyawa bioaktif seperti antibiotik, toksin, siderophore, dan

immunosuppressant. Enzim tersebut memiliki ukuran yang besar sekitar 200

sampai 2000 kDa sebagai enzim mutifungsional yang memiki modul-modul

dalam membuat suatu senyawa. Beberapa produk poliketida dan peptida

nonribosom dalam dunia medis antara lain, antibakteri vancomycin dan

erythromycin, immunosuppressant cyclosporin dan rapamycin, serta antitumor

bleomycin dan epothilone. Penggunaan domain KS dan A dalam studi keragaman

gen PKS dan NRPS disebabkan domain ketosintase (KS) dan domain adenilasi

8

(A) merupakan domain yang ada dalam tiap modul dan memperlihatkan derajat

konservasi yang tinggi di antara domain lainnya (Moffitt dan Neilan 2003).

Hasil amplifikasi gen penyandi domain A dan domain KS pada isolat SAB

E-35, SAB E-38 dan SAB E-40 menunjukkan semua isolat memiliki gen penyandi

kedua domain tersebut (Gambar 2). Keberadaan kedua gen tersebut dalam satu

isolat menimbulkan dugaan bahwa kedua gen tersebut membentuk kompleks

hibrid atau gabungan antara PKS-NRPS dalam memproduksi senyawa bioaktif

seperti yang ditemukan pada biosintesis senyawa antikanker bleomycin pada

Streptomyces (Shen et al. 2001). Zhang et al. (2009) juga menemukan gen PKS

dan NRPS dalam beberapa isolat bakteri yang berasosiasi dengan spons dari laut

Cina Selatan dan menduga adanya kluster gen hibrid NRPS-PKS pada bakteri

tersebut. Selain itu, adanya hibrid NRPS-PKS juga dilaporkan pada

Pseudoalteromonas sp. yang diisolasi dari spons Hymeniciadon perleve (Zhu et

al. 2009). Meskipun kebanyakan bakteri yang berasosiasi dengan spons memiliki

gen penyandi PKS dan NRPS namun pada beberapa kasus ditemukan hanya

memiliki PKS atau NRPS saja atau tidak memiliki keduanya. .

Gambar 2 Elektroforesis gel agarose 1% domain KS dan domain A yang

diamplifikasi dari genom isolat SAB E-35, SAB E-38 dan SAB E-

40

Enzim PKS dan NRPS disusun oleh tiga domain utama yaitu dua domain

berfungsi sebagai katalitik dan satu domain sebagai pembawa (carrier). Domain

utama pada PKS antara lain, ketosintase (KS), acyl tranferase (AT), dan acyl

carrier protein (ACP) sedangkan pada NRPS kondensasi (C), adenilasi (A), dan

peptidyl carrier protein (PCP) (Cane dan Walsh 1999). Hibrid antara PKS dan

NRPS terjadi apabila ditemukan domain PKS atau NRPS dalam satu jalur

biosintesis yang sama dalam memproduksi senyawa bahan alam yang sama baik

poliketida maupun peptida nonribosom. Produk sistem hibrid PKS-NRPS antara

lain, pada sintesis antibiotik rapamicin (12 PKS modul dan 1 NRPS modul)

(Aparicio et al. 1996) dan sintesis yersiniabactin (3 NRPS modul dan 1 PKS

modul) (Gehring et al. 1998). Adanya hibrid PKS-NRPS ini sangat menarik

karena akan menambah variasi kombinasi modul biosintesis dalam menghasilkan

Domain KS

~ 700 pb

Domain A

~1000 pb

35 38 40 35 38 40 M

9

berbagai senyawa bioaktif karena jumlah dan jenis modul pada PKS maupun

NRPS menentukan variasi struktur peptida dan poliketida yang dihasilkannya.

Analisis Bioinformatika

Analisis BLAST terhadap sekuen parsial gen penyandi domain KS dan

domain A memiliki persentase homologi yang berbeda seperti ditunjukkan pada

Tabel 3 dan Tabel 4. Beberapa sekuen memiliki tingkat homologi yang tinggi

dengan sekuen referensi di basis data NCBI seperti kemiripan sekuens domain KS

isolat SAB E-38 dan SAB E-35 berturut-turut 100% dan 97% pada sekuen yang

sama dengan enzim peptida sintetase Bacillus subtilis. Tingkat homologi pada

sekuen domain A SAB E-35 juga memiliki kemiripan yang tinggi dengan sekuen

hibrid NRPS/PKS dari Bacillus subtilis subsp.subtilis str BSP1 sebesar 99%

sedangkan kemiripan sekuen SAB E-38 sebesar 84% dengan enzim beta-keto asil

sintase dari Paenibacillus mucilaginosus. Sekuen gen penyandi domain A dan KS

dari isolat SAB E-40 memiliki kemiripan yang rendah yaitu berturut-turut 54%

dan 47%. Tingkat kemiripan yang rendah tersebut menunjukkan kemungkinan

besar senyawa bioaktif yang diproduksi adalah baru.

Tabel 3 Persentase homologi sekuen gen penyandi domain A

Isolat

Bakteri Kemiripan Id/Sim

a (%) E-value Score No. Akses

SAB E-35 Peptide synthetase

[Bacillus subtilis] 97/97 6e-170 456 WP017696132.1

SAB E-38 Peptide synthetase

[Bacillus subtilis] 100/100 0.0 649 WP017696132.1

SAB E-40

Nonribosomal

peptide synthetase

adenilation domain

[Nostoc punctiforme

PCC 73102]

58/77 1e-116 352 AAW55330.1

aId : Identity; Sim : Similarity

Tabel 4 Persentase homologi sekuen gen penyandi domain KS

Isolat

Bakteri Kemiripan Id/Sim

a (%) E-value Score No. Akses

SAB E-35

Hybrid NRPS/PKS

[Bacillus subtilis

subsp.subtilis str

BSP1]

99/98 2e-146 457 YP007209580.1

SAB E-38

Beta-ketoacyl

synthase

[Paenibacillus

mucilaginosus]

84/92 1e-118 380 YP004643575.1

SAB E-40

Polyketida synthase

[Bacillus

amyloliquefaciens]

47/54 5e-24 76.6 WP003154089.1

aId : Identity; Sim : Similarity

10

Genus Bacillus banyak merupakan penghasil senyawa metabolit

antimikrob dan sitotoksik. Awalnya genus ini sering ditemukan di darat namun

juga dilaporkan diisolasi dari bentos laut dan karang lunak (Kapley et al. 2007)

dan spons laut (Hentschel et al. 2001). Paenibacillus adalah genus yang

dipisahkan dari Bacillus sejak tahun 1997 yang juga banyak mendiami relung

ekologi (Saha et al. 2005), menghasilkan antibiotik (Li et al. 2007), hampir

setengah genus ini mempunyai kemampuan antibakteri dan antifungi yang

berspektrum luas (Lorentz et al. 2006). Antibiotik yang dihasilkan oleh genus

Paenibacillus disusun oleh peptida pendek serta ditemukan gen penyandi PKS

dan NRPS (Wu et al. 2011). Beberapa genus sianobakteri atau alga hijau biru juga

dilaporkan penghasil senyawa bioaktif antara lain Microcystis, Anabaena, Nostoc,

dan Oscillatoria (Namikoshi dan Rinehart 1996). Salah satu senyawa bioaktif asal

alga hijau biru yang telah banyak dipelajari adalah hepatotoksin seperti,

mikrosistin. Mikrosistin merupakan toksin yang disusun heptapeptida siklik yang

tidak disintesis di ribosom melainkan oleh enzim peptida sintetase tersendiri atau

NRPS (Neilan et al. 1999).

Gambar 3 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen asam amino domain A (adenilation)

yang dikonstruksi dengan metode Neighbor-Joining. (Keterangan: Angka

0,1 pada bagian atas pohon menunjukkan skala jarak kekerabatan (distance

scale) antar profil isolat bakteri. Angka pada nodus adalah nilai bootstrap

dengan 1000 ulangan).

Hasil konstruksi pohon filogenetik domain KS dan A dapat menunjukkan

kekerabatan antar isolat SAB E-35, SAB E-38 dan SAB E-40 dengan beberapa

sekuen referensi terdekat hasil analisis BLAST (Gambar 3). Sekuen domain A

SAB E-35 dan SAB E-38 berkerabat dekat sekuen domain A dan KS dari Bacillus

subtilis dan terdapat dalam satu clade yang sama. Sementara itu, SAB E-40

Bacillus subtilis BSn5

Bacillus subtilis

Bacillus subtilis str. 168

Bacillus subtilis QB928

Bacillus sp. EGD-AK10

SAB E 35

SAB E 38

Bacillus subtilis1

Bacillus vallismortis

Bacillus subtilis str.W23

Streptomyces sp. ATCC 700974

SAB E 40

Cyanothece sp. PCC 7424

Nostoc punctiforme PCC 73102

Anabaena variabilis ATCC 2941390

82

100

100

55

61

17

54

37

65

0.1

11

berada di clade yang lain dengan kelompok alga hijau biru. Pada pohon

filogenetik domain KS, SAB E-38 berkerabat dengan Paenibacillus mucilagenous

dan bakteri laut yang tidak dapat dikulturkan. Sekuens domain KS SAB E-35

berkerabat dengan beberapa sekuen Bacillus subtilis sedangkan domain KS SAB-

40 terpisah (Gambar 4).

Sekuen domain A dari NRPS SAB E-35 dan SAB E-38 memiliki

homologi yang tinggi dengan sekuen peptida sintetase dan juga surfaktin sintetase

dari Bacillus subtilis. Peptida sintetase (peptide synthetase) merupakan protein

multifungsional nonribosom yang mensintesis peptida dengan berat molekul yang

kecil dan berasal dari mikroba. Antibiotik dari genus Bacillus banyak terdiri atas

polipeptida yang disintesis oleh enzim peptida sintetase nonribosom atau NRPS

salah satunya surfaktin (Edward dan Arnold 1977 ; Nakano et al. 1988). Surfaktin

merupakan antibiotik lipopeptida yang dihasilkan oleh Bacillus subtilis. Surfaktin

juga merupakan biosurfaktan yang dapat menurunkan tegangan permukaan air

dari 72 ke 27 mN/m dan berpotensi untuk diaplikasikan dalam industri seperti

industri makanan, farmasi, kosmetik dan bioremediasi limbah oli (Desai dan

Banat 1997).

Gambar 4 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen asam amino domain KS (ketosintase)

yang dikonstruksi dengan metode Neighbor-Joining. (Keterangan: Angka

0,2 pada bagian atas pohon menunjukkan skala jarak kekerabatan (distance

scale) antar profil isolat bakteri Angka pada nodus adalah nilai bootstrap

dengan 1000 ulangan).

Bacillus subtilis subsp. subtilis 6051-HGW

polyketide synthase L Bacillus subtilis

Bacillus subtilis PY79

Bacillus subtilis

SAB E 35

Bacillus subtilis subsp. subtilis str. BSP1

Bacillus amyloliquefaciens IT-45

Bacillus amyloliquefaciens

Bacillus amyloliquefaciens CAU B946

Bacillus amyloliquefaciens Y2

Bacillus amyloliquefaciens YAU B9601-Y2

SAB E 40

Streptomyces maritimus

SAB E 38

Paenibacillus mucilaginosusK02

uncultured marine cyanobacterium

Leptolyngbya mycoidea LEGE 06118

Oscillatoria sp. CCAP 1459/26100

96

85

100

69

65

46

50

87

81

100

62

62

0.2

12

Sekuen domain A SAB E-40 dan sekuen domain KS SAB E-38 berada

dalam satu clade dengan sekuen dari sioanobakteri. Sianobakteri juga merupakan

kelompok yang banyak diteliti sebagai penghasil senyawa bioaktif seperti

antikanker, antibakteri, antifungi serta inhibitor protease (Moore 1996). Banyak

senyawa bioaktif yang dihasilkan termasuk ke dalam golongan peptida atau

makrolid dan alkaloid dan sintesis oleh PKS dan atau NRPS (Kehr et al. 2011).

Penelitian keragaman gen penghasil senyawa bioaktif terutama PKS dan NRPS

juga telah banyak dilakukan. Banyak ditemukan kasus hibrid PKS-NRPS dalam

sintesis senyawa bioaktif seperti, Nostopicin dari genus Nostoc dan barbamide

dari genus Lyngbya (Fewer et al. 2011; Chang et al. 2002).

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Ekstrak etil asetat isolat SAB E-8, SAB E-35, SAB E-38, SAB E-40, dan

SAB S-43 bersifat toksik berdasarkan nilai LC50 yang berkisar antara 117.1

µg/mL sampai 620 µg/mL. Fraksi 38-E dari isolat SAB E-38 menunjukkan

peningkatan nilai toksisitas dari ekstrak etil asetatnya yaitu dari 138.6 µg/mL

menjadi 116.7 µg/mL. Isolat-isolat SAB E-35, SAB E-38, dan SAB E-40

diketahui memiliki gen penyandi domain A untuk enzim NRPS dan gen penyandi

domain KS untuk enzim PKS. Berdasarkan analisis bioinformatika untuk gen

penyandi domain A dan KS, SAB E-35 dan SAB E-38 memiliki homologi yang

cukup tinggi dengan sekuen referensi yaitu antara 84% sampai 100% sementara

SAB E 40 memiliki homologi yang rendah yaitu 54% dan 47% dan sberpotensi

sebagai penghasil senyawa bioaktif baru.

Saran

Nilai LC50 pada uji BSLT dipengaruhi oleh ketepatan pembuatan

konsentrasi larutan uji dan umur larva A.salina yang digunakan. Oleh karena itu,

perlu dilakukan pembuatan larutan uji yang tepat dan digunakan larva A.salina

yang berumur 36-48 jam.

DAFTAR PUSTAKA

Abubakar H, Wahyudi AT, Yuhana M. 2011. Skrining bakteri yang berasosiasi

dengan spons Jaspis sp. sebagai penghasil senyawa antimikroba. Ilmu

kelautan. 16:35-40.

Anderson JE, Goetz CM, McLaughlin JL, Suffness M. 1991. A blind comparison

of simple bench-top bioassay and human tumour cell cytotoxicities as

antitumor prescreens. Phytochem Anal. 2:107-111.

Aparicio JF, Molnár I, Schwecke T, König A, Haydock SF, Khaw LE, Staunton

J, Leadlay PF. 1996. Organization of the biosynthetic gene cluster for

13

rapamycin in Streptomyces hygroscopicus: analysis of the enzymatic

domains in the modular polyketide synthase. Gene. 169:9-16.

Astuti P, Alam G, Wahyuono S. 2003. Bioactivity screening of sponges collected

from Bunaken, Manado by brine shrimp lethality test agains Artemia

salina Leach. Majalah Farmasi Indonesia. 14:238-243.

Berdy J. 2005. Bioactive microbial metabolites. J Antibiot. 58:1-26.

Cane DE, Walsh CT, Khosla C. 1998. Harnessing the biosynthetic code:

combinations, permutations, and mutations. Science. 282:63-68.

Cane DE, Walsh CT. 1999. This parallel and convergent universes of poliketide

synthetase and nonribosomal peptide synthetase. Chem Biol. 6:319-325.

Carballo JL, Hernandez-Inda ZL, Perez P, Gravalos MD. 2002. A comparison

between two brine shrimp assay to detect in vitro cytotoxicity in marine

natural product (methodology article). BMC Biotechnol. 2:1-5.

Chang Z, Flatt P, Gerwick WH, Nguyen VA, Willis CL, Sherman DH. 2002. The

barbamide biosynthetic gene cluster : a novel marine cyanobacterial

system of mixed polyketide synthase (PKS)-nonribosomal peptide

synthetase (NRPS) origin involving an unusual trichloroleucyl strater

unit. Gene. 296:235-247.

Desai JD, Banat IM. 1997. Microbial production of surfactants and their

commercial potential. Microbiol Mol Biol. 61:47-64.

Ebada SS, Wray V, Voogd NJ, Deng Z, Lin W, Proksch P. 2009. Two new

jaspamide derivatives from the marine sponge Jaspis splendes. Mar

Drugs.7:435-444.

Edward K, Arnold LD. 1977. The peptide antibiotics of Bacillus : chemistry,

biogenesis and possible functions. Bacteriol Rev. 41(2):449-474.

Fajarningsih ND, Januar HI, Nursid M, Wikanta T. 2006. Potensi antitumor

ekstrak spons Crella papilata asal taman nasional laut Kepulauan

Seribu. J Pascapanen dan Bioteknologi Kelaiutan dan Perikanan. 1(1):

35-42.

Fewer DP, Osterholm J, Rouhiainen L, Jokela J, Wahlsten M, Sivonen K. 2011.

Nostophycin biosynthesis is directed by a hybrid PKS-NRPS in the

toxic cuanobacterium Nostoc sp. 152. J Appl Environ Microbiol.

77(22):8034-8040.

Finney DJ, Stevens WL. 1948. A table for the calculation of working probits and

weights in probit analysis. Biometrika. 35:191-201.

Gehring AM, Mori I, Perry RD, Walsh CT. 1998. The nonribosomal peptide

synthetase HMWP2 forms a thiazoline ring during biogenesis of

yersiniabactin, an iron-chelating virulence factor of Yersinia pestis.

Biochemistry. 37:11637-11650.

Gritter RJ, Bobbit JM, Schwarting AE. 1991. Pengantar Kromatografi.

Padmawinata K, penerjemah. Bandung (ID): Penerbit ITB.

Hamburger M, Hostettmann. 1991. Bioactivity in plant: the link between

phytochemistry and medicine. Phytochemistry. 12:3864-3874.

Hentschel U, Schimid M, Wagner M, Fieseler L, Gernert C, Hacker J. 2001.

Marine sponges as microbial fermenters. FEMS Microbiol Ecol.

55:167–177.

14

Hentschel U, Hopke J, Horn M, Friedrich AB, Wagner M, Hacker J, Moore BS.

2002. Molecular evidence for a uniform microbial community in

sponges from different oceans. Appl Environ Microbiol. 68:4431-4440.

Kapley A, Siddiqui S, Misra K, Ahmad SM, Purohitp HJ. 2007. Preliminary

analysis of bacterial diversity associated with the porites coral from the

Arabian sea. World J Microbiol Biotechnol. 23:923-930.

Kehr JC, Picchi DG, Dittmann E. 2011. Natural product biosynthesis in

cyanobacteria : a treasure trove of unique enzymes. Beilstein J Org

Chem. 7:1622-1635.

Krisyunda MP. 2012. Uji toksisitas fraksi spons Callyspongia sp. dengan metode

brine shrimp test (BST) dari Pasir Putih Situbondo [skripsi]. Surabaya

(ID): Institut Teknologi Sepuluh Nopember.

Lee YK, Lee J, Lee HK. 2001. Microbial symbiosis in marine sponges. J

Microbiol. 39:254-264.

Li J, Beatty PK, Shah S, Jensen SE. 2007. Use of PCR-targeted metagenesis to

distrupt production of fusaricidin-type antifungal antibiotics in

Paenibacillus polymyxa. App Environ Microbiol. 73: 3480-3489.

Lorentz RH, Artico S, Silveira AB, Einsfeld A, Carcao G. 2006. Evaluation of

antimicrobial activity in Paenibacillus spp. starins isolated from natural

environmental. Lett Appl Microbiol. 43:541-547.

MacMillan SM. 1999. Starting A Succesful Commercial Sponge Aquaculture

Farm. Hawaii (US): CTSA Publication.

Meyer N, Ferrigni NR, Putnam JE. 1982. Brine shrimp: a convenient general

bioassay for active plant constituents. Planta Med. 45:31-32.

Moffitt MC, Neilan BA. 2003. Evolutionary affiliations within the superfamily of

ketosynthases reflect complex pathway associations. J. Mol.

Evol. 56:446-457.

Moore RE. 1996. Cyclic peptides and depsipeptides from cyanobateria : a review.

J Ind Microbiol. 16:782-792.

Müller WEG, Grebenjuk VA, Thakur NL, Thakur AN, Batel R. 2004. Oxygen-

controlled bacterial growth in the sponge Suberites domuncula: toward

a molecular understanding of the symbiotic relationships between

sponge and bacteria. Appl Environ Microbiol. 70:2332-2341.

Nakano MM, Marahiel MA, Zuber P. 1988. Identification of genetic locus

required for biosynthesis of the lipopeptide antibiotic surfactin in

Bacillus subtilis. J Bacteriol. 170(12):56-62.

Namikoshi M, Rinehart KL. 1996. Bioactive compound produced by

cyanobacteria. J Industrial Microbiol. 17:373-384.

Neilan BA, Dittmann E, Rouhiainen L, Bass RA, Schaub V, Sivonen K, Borner T.

1999. Nonribosomal peptide synthesis and toxigenicity of

cyanobacteria. J Bacteriol. 181(13):4089.

Piel J, Hui D, Wen G, Butzke D, Platzer M, Fusetani N, Matsunaga S. 2004.

Antitumor polyketide biosynthesis by uncultivated bacterial simbiont of

the marine sponge Thonella swinhoei. Proc Natl Acad Sci. 101:16222-

16227.

Proksch P, Edrada RA, Ebel R. 2002. Drugs from the sea : current status and

microbial implications. Appl Microbiol Biotechnol. 59:125-134.

15

Putra I. 2012. Ekstraksi dan bioaktivitas senyawa antimikrob dari bakteri yang

berasosiasi dengan spons Jaspis sp. [skripsi]. Bogor (ID): Institut

Pertanian Bogor.

Saha P, Modal AK, Mayilraj S. Krishnamurthi S, Bhattacharya A, Chakrabarti T.

2005. Paenibacillus assamensis sp. nov. A novel bacterium isolated

from a warm spring in Assam India. Int J Syst Evol Microbiol. 55:2577-

2581.

Sambrook W, Russel DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Ed

ke-3. New York (US): Gold Spring Harbor Laboratory.

Sargeloos P, Van Der Wielen CR, Persoone G. 1978. The use Artemia nauplii for

toxicity test - a critical analysis. Ecotoxicol and Environ Safety. 2:249-

255.

Schirmer A, Gadkari R, Reeves CD, Ibrahim F, DeLong EF, Hutchinson CR.

2005. Metagenomic analysis reveals diverse polyketide synthase gene

cluster in microorganisme associated with the marine sponge

Discodermia dissoluta. Appl Environ Microbiol. 71:4840-4849.

Shen B, L. Du, C. Sanchez, D.J. Edwards, M. Chen, and J.M. Murrell. 2001. The

biosynthetic gene cluster for the anticancer drug bleomycin from

Streptomyces verticillus ATCC15003 as a model for hybrid peptide–

polyketide natural product biosynthesis. J Industrial Microbiology and

Biotechnology. 27:378-385.

Simmons TL, Andrianasolo E, McPhail K. 2005. Marine natural products as

anticancer drugs. Mol Cancer Ther. 4:333-342.

Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. 2011. MEGA5 :

Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood,

Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Mol Biol

and Evol. 28:2731-2739.

Tang S, Xu R, Lin W, Duan H. 2012. Jaspiferin A and B: two new secondary

metabolites from the south China sea sponge Jaspis stellifera. Rec Nat

Prod. 6:398-401.

Taylor MW, Radax R, Steger D, Wagner M. 2007. Sponge-associated

microorganisms: evolution, ecology. Microbiol Mol Biol Rev. 71:295-

347.

Wang G. 2006. Diversity and biotechnological potential of the spons-associated

microbial consortia. J Ind Microbiol Biotechnol. 33:545-551.

Wu X, Qian C, Fang H, Wen Y, Zhou J, Zhan Z, Ding R, Li O, Gao H. 2011.

Paenimacrolidin, a novel macrolide antiviotic from Paenibacillus sp.

F6-B70 active against methicillin-resistant Staphyloccus aureus. J

Microbial Biotechnol. 4(4):491-502.

Zhang L, An R, Wang J, Sun N, Zhang S, Hu J, Kuai J. 2005. Exploring novel

bioactive compounds from marine microbes. Current Opinion in

Microbiol. 8:276-281.

Zhang W, Li Z, Miao X, Zhang F. 2009. The screening of antimicrobial bacteria

with diverse novel nonribosomal peptide synthetase (NRPS) genes from

South China Sea sponges. J Mar Biotechnol. 11:346-355.

Zheng L, H Chen, X Han, X Yan. 2005. Antimicrobial screening and

activecompound isolation from marine bacterium NJ6-3-1 associated

16

with the sponge Hymeniacidon perleve. World J Microbiol Biotechnol.

21:201-206.

Zheng L, Yan X, Han X, Chen H, Lin W, Lee FS, Wang X. 2006. Identification of

norharman as the cytotoxic compound produced by the sponge

(Hymeniacidon perleve)-associated marine bacterium Pseudomonas

piscida and its apoptotic effect on cancer cells. Biotechnol Appl

Biochem. 44:135-142.

Zhu, Peng, Zheng Y, You Y, Yan X, Shao J. 2009. Molecular phylogeny and

modular structure of hybrid NRPS/PKS gene fragment of

Pseudoalteromonas sp. NJ6-3-2 isolated from marine sponge

Hymeniciadon perleve. J Microbiol Biotechnol. 19(3):229-237.

17

Lampiran 1 Perhitungan LC50 isolat SAB E-40

Perhitungan LC50 :

y = 3.2203x-2,6905

5= 3.2203x-2,6905

x = 2.3881 10x = 244,4

LC50 = 244.4 µg/mL

y = 3.2203x - 2,6905

R² = 0.9231

0

1

2

3

4

5

6

7

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Mo

rta

lita

s P

rob

it

Log 10 Konsentrasi

Konsentrasi

(µg/mL)

Log

Konsentrasi Ulangan

Larva

A.salina

Larva

mati

%

Mortalitas Probit

Rata-

rata

Probit

-

1 20 0 0

0 2 20 0 0

3 20 0 0

1

1 20 0 0

0 10 2 20 0 0 0

3 20 0 0

2

1 20 8 40

4.61 100 2 20 7 35 35

3 20 5 30

2.39

1 20 15 80

5.61 250 2 20 18 90 73.3

3 20 10 50

2.69

1 20 18 90

5.71 500 2 20 13 65 76.7

3 20 15 75

2.87

1 20 18 90

5.88 750 2 20 16 80 81.67

3 20 15 75

18

Lampiran 2 Komposisi medium sea water complete (SWC) 1000 mL

Pepton 5 gram

Yeast Extract 1 gram

Gliserol 3 mL

Bacto Agar 15 gram (untuk media padat)

Air laut 750 mL

Aquades 250 mL

Lampiran 3 Sekuen parsial domain KS dan A

>SAB_35_PKS

ACCCGGCCCAACACCACTCGCGGTGCTGCTGGACGATTGAGGATGCGG

GCTATACGCCAAAGACGTTGGCGAAGCCTAAAGGACGAAATAAAAGG

CAGCATGTAGGAGTTTTTGCCGGTGTCATGCACAAGGATTATACATTA

GTCGGAGCTGAAGAAGCATCAGCAGAAAACGTGTTTCCTCTCTCGCTC

AACTATGCGCAAATCGCCAACCGTGTTTCTTACTTTTGTAATTTCCACG

GTCCGAGTATGGCTGTCGATACGGTATGTTCATCCTCTTTGACCGCAGT

GCACTTGGCGTTGGAAAGCATACGTCACGGTGAGTGCGATGTTGCGTT

AGCAGGCGGAGTGAACCTGTCTTTGCACCCGAATAAATATATGACATA

CGGGGTCTGGGATATGTTTTCCACTGACGGGCACTGCCGTACGTTTGG

AAAGGATGGGGACGGTTATGTGCCTGCCGAGGGTATAGGCGCGGTTTT

ATTAAAGCCTTTGCGCCAGGCGGAGAAAGACGGAGATCGCATTTATGC

AGTTATTAAAGGAAGTGCTGTGAATCATGTGGGCACTGTAAGCGGCAT

TTCAGTGCCGAGCCCTGTTTCTCAAGCTGATCTGATTGAGACATGCTTG

GAGAAAACGGGAATCGACCCGCGGACGAACAGTTATGTCGAAGCCCA

CGGCACAGGCACAGAAA

>SAB_35_NRPS

ACCCTCCCAATTTCGATTGTTCATCTGGAGCCAGCGCGCCACGTCCCCG

GTCCGGTACATGCGATCGCCCGGCACGAATGGATCTTGTAAAAACTTC

TCTTCCGTTAATTCAGGCAAATGCAAATAGCCTCGGGCCACACCGTCT

CCCGCGATATAAAGCTCACCCGCCACGCCTTCAGGCTGCAGCCGGCCT

TTTTGATCCAAAATATATAAGCGGTTATTCCCCAGCGCTTTCCCGATCG

GCACATACGCGTGATTGAACTGCATTCTCAGGGATAACCGGATGAACA

GACGCGTCAACGCACGTTTCAGTCGGCCCGTACACATTAGTCAAACGC

GGCGCTGTGCCGGCTTCTTTAAACAGCTTCAGCAGCTTGTCCGCAACA

ACAGATGACAGGCCTTCTCCTCCGATCAGCATGTGCTTCAGTTTTAGGC

CTTCAAAATCGCCCGCTGCTGCCAGCATTTGCAAATGAGCCGGTGTTC

CATCCGTCGCCTCAATGCTGTTTCTCCGATAATATGTAGCAAGGGCGG

TCCCGTTCGTCACTGTTTTCTTCGGTACGATATAAAGGGTTTGTCCCAA

AAGAAGCGACGCGAAGATCTGCTTCACTGACGCATCAAAGTGGAACG

19

GCGCAAGCAATGCCATCCGCAGGGTTTGGCTGCCGCTTTGGTAAATCG

TCTGCTGCAGAGATTCAACCAAATGATGAACCTGGCGATGCTCGATCA

TAACGCCTTTCGGACGTCCGGTTGTTCCCGATGTGTAAATAATGTAGG

CAAGATTCCGCGCGTTTACATCAGCCTCCGTCATATCGTCTGCACCTTC

CGCAATTGCCTGATCTAAGTCAATCAGCTCAGCATCGGCTTCAGGCGC

TGCAACCTTCGATTCAGTCAGGATGAAGTCCGCCCCGCAGTCCTCCAA

AATATATTGAATCCGCTCTGCAGGAAAAACCCGGATCAATCGGGACGT

AAGCCCCCGCCGCCAAA

>SAB_38_PKS

TGGGAAGTGTTAGAGACTGCTGGGTATGATCCAGAAAAATATCTTGGG

CGTATCGGTGTATACGCTGGTGTATTTTCTAGTACGTATCTGTTTAATT

TATACAGCAATCCAAGTCTTTATCATTCAGTAGGAGAACTAAATATTC

GCCATGGGAATGAAAAGGATTATTTGGCTACTCGGGTATCATATAAAT

TAAATCTTAAAGGACCAAGCGTGAGTGTACAGACTTCTTGCTCTACGT

CTCTTGTTGCTGTTCACTTTGCAGTCCAGAACTTATTAAGTGGTGAATG

TGACATGGCAATCGCTGGTGGGGTGTCAATTATCACACCTCAAAAGAC

GGGATACATGTATCAAGAAGGTGGCGTTCTATCACCAGATGGACATTG

TCGTCCTTTCGATGCGAAAGCAAAGGGTACAATTTTTGGTAACGGAGT

AGGGGCTGTTGTACTTAAGCGACTAGAAGATGCTCGCAAAGATGGTGA

CACTATCTTTGCTGTTATTAAAGGAAGCGCAGTTAATAACGATGGTGC

AGACAAAGTTGGATTCACTGCACCGAGTGTCAATGGTCAAGCTGAAGT

AATCGCTGATGCGATGGCTATGGCGGAAGTCGATCCATTCACGGTAG

>SAB_38_NRPS

CTGGGATCGCCTCCGTTATTCGATTGTTCATCTGGAGCCAGCGCACCAC

GTCTCCGGTCCGGTACATGCGATCGCCCGGCACGAATGGATCTTGTAA

AAACTTCTCTTCCGTTAATTCAGGCAAATGTAAATAGCCTCGGCCCAC

ACCGTCTCCCGCGATATAAAGCTCGCCCGCCACGCCTTCAGGCTGCAG

CCGGCCTTTTTGATCCAAAATATATAAGCGGTTATTCCCCAGCGCTTTC

CCGATCGGCACATACGCTGATTGAACTGCATTCTCAGGGATAACCGGA

TGAACAGACGCGTCAACGCATGTTTCAGTCGGCCCGTACACATTGGTC

AACCGCGGCGCTGTGCCGGCTTCTTTAAACAGCTTGAGCAGCTTGTCC

GCAACAACAGATGACAGGCCTTCTCCTCCGATCAGCATGTGCTTCAGT

TTTAGGCCTTCAAAATCGCCCGCTGCTACCAGCATTTGCAAATGAGCC

GGTGTTCCATCCGTCGCCTCAATGCTGTTTCTCCGATAATATGCAGCAA

GGGCGGCCCCGTTCGTCACAGTTTTCTTCGGTACGATATAAAGGGTTT

GTCCCAAAAGAAGCGACGCGAAGATCTGCTTCACTGACGCATCGAAGT

GGAACGGCGCAAGCAATGCCATCCGCAGGGTTTGGCTGCCGCTTTGAT

AAATCGTCTGCTGCAGAGATTCAACCAAATGATGAACCTGGCGATGCT

CGATCATAACTCCTTTCGGGCGTCCGGTTGTTCCCGATGTATAAATAAT

20

GTAGGCAAGGTTCCGTGCGTTCACATCTGCATTCAGGCTTTCTTCTGCA

CCTTCTGCAATTGCCTGATCTAAGTCAATCAGCTCAGCATCGGCTTCAG

GTGCCGCAACCTTCGATTCAGTCAGGATGAAGTCCGCCCCGCAGTCCT

CCAAAATATATTGAATGCGCTCAGCAGGAAAACCCGGATCAATCGGG

ACATACGCCCCCACCCGCAAAA

>SAB_40_PKS

CAATTNNGNCTTCGGAATAAGCCTGAGTATCTAGACTGCCTTATGACT

TCTGCTTGTGCAGCGGATTCGGGAGGTAATTCCGCTGCTTTCCCGACGT

GATCATGCGCTTCCTTTATGACGGCGTAAATGCGGCTCCGTCTTGACG

GCGTCTCTCAGACGTTTGACCCCGACGGCCCGACCACTTTCCCCGGAA

ACAAACCGTCCCCCGTTTGATCCAACTGAGGGGATCCGGCGGTCGGTG

ACATGCTTTCCTACTTTTCTGACGATGGAAAAAAATCCGGGGTGGATT

GACTGATTCCCCCCTCCGGCAAGGGCATTTTCAATTTCTTCGTCCCGAA

TGCCTTAAATGGCCAAAGAATGGGTGGCAAAGGACTGGAAACTGCTG

GTATCAACCGGAATGCTCGGCCCTTGAAATTCACAATAATAGGGACAC

TCTGTTGGGAATGAGCGAATAATTATTGCCCACCGCAAATGGACCTGC

TTTCTGTTGTTGTTCAATGGCCTGTAAAGAATCGTCGTTATACATGACA

CCTGCGCATAAGTCGATGGGATGTAGTTACTCTCCTTTATATCCCGCAT

CTTCAAGCGCTTTCCATGATTCTTCCATCAACACCCAGTGTGGCTCATT

CCATCACACGCCTGCTAAGATTCCATCGCA

>SAB_40_NRPS

ATGTCATGTATACGTCAGGCTCAACGGGACTGCCTAAAGGAGTAAGTA

TTGTTAACCGCGGTGTGATTCGGCTGGTGAAGGAGACTGATTATGCGG

TATTTGATGAGAATCAAACGTTTCTGCAATTAGCTTCTGCCGCTTTTGA

CGCTTCTACCTTCGAGATCTGGGGCTGTTTATTGAATGGGGGATGTCTG

GCTATAATGCCTCCGGGAATACCGACGGCTGATGATATTGCAGAAGCT

GTAAAAAAATATAACATTACGACTCTTTGGCTGACGGCCGGTTTATTTT

CTCTAGTAGTTGATCAGCAGTTAGAATCATTAAAAGGGCTTCAGCAAT

TATTGGTAGGCGGAGATGTGGTTTCCGTTCCGCATGTTCAAAAAGTAT

TAGCACTTGGAAAGGTACAAGTAATTAACGGATATGGGCCGACAGAG

GGAACGACCTTTACCTGTTGTTTCCCGGTCCCTCATGATTGGAAAGGC

AGTACGCTTCCTATAGGGAGGCCTATTTCTGGTACAGAAATATTCATTT

TAGATTCGCAATTAAAACCGGTAGCGCCTGGTATTCCTGGTGAGCTGT

TTATTGGCGGAGATGGGCTGGCGCGAGAGTATTGGCGACGGCCTGATT

TAACGAAGGAACGGTTTATATCACACCCTTTCAATAATGATCCTTCAG

CACGTCTTTATAAAACAGGAGACTTAGTGCGTTATTTAGAAAATGGCG

ATGTGGAGTTTATCGG

21

RIWAYAT HIDUP

Pe u is di hi d i p s g S hi i S ’ d d Rid y i Ni gsih di

Bangka Belitung, 13 Juni 1992. Penulis merupakan anak ke-2 dari tiga

bersaudara. Penulis menempuh pendidikan menengah atas di SMA Negeri 1

Kelapa Kampit, Belitung Timur dan lulus pada tahun 2009 kemudian melanjutkan

kuliah di IPB melalui jalur Beasiswa Utusan Daerah, Kabupaten Belitung Timur.

Selama menempuh perkuliahan di IPB, penulis menjadi asisten mata kuliah

Botani Umum Sarjana tahun ajaran 2011/2012 dan Diploma IPB pada tahun

ajaran 2012/2013, serta mata kuliah Pengantar Genetika Molekuler tahun ajaran

2012/2013. Pengalaman keorganisasian penulis antara lain sebagai Ketua Biro

Kesekretariatan BEM TPB IPB Keluarga 46 2009/2010, Staf Departemen Syiar

dan Sains Serambi Ruhiyah Mahasiswa FMIPA (SerumG) 2011/2012, Ketua

Departemen Class Rohis Management SerumG 2012/2013, serta Ketua

Departemen Politik Luar Negeri Kesatuan Aksi Mahasiswa Muslim Indonesia

(KAMMI) Komisariat IPB. Penulis juga aktif dalam berbagai kepanitiaan

kegiatan kemahasiswaan seperti, Pesta Sains Nasional Lomba Cepat Tepat

Biologi 2011 dan Festival Ilmuwan Muslim 2011 dan 2012. Penulis pernah

e u egi s udi p g de g pi “Ke e g d Pe i u

R y p Te es i d A b e di Hu Pe didi Gu u g W ”. Pe u is

melaksanakan kegiatan praktik lapangan di PT. Steelindo Wahana Perkasa dengan

judul “Pe ge d i H d Pe y i T Ke p S i PT. S ee i d

W h Pe s ”.

Penulis juga aktif dalam kegiatan lomba keilmiahan tingkat nasional

maupun internasional. Beberapa prestasi yang pernah diraih antara lain, delegasi

IPB dalam seleksi Olimpiade Nasional MIPA tingkat wilayah Jawa Barat 2011,

kompetisi biologi sintetik tingkat Asia atau International Genetically Engineered

Machine Competition (iGEM) 2012 di Hong Kong University of Science and

Technology serta Finalis Pekan Ilmiah Mahasiswa Nasional di Universitas

Muhammadiyah Yogyakarta ke-25 pada tahun 2012. Selain itu, penulis juga

terpilih sebagai delegasi pemuda Provinsi Kep. Bangka Belitung dalam

Pertukaran Pemuda Indonesia Cina 2013 yang diselenggarakan Kementerian

Pemuda dan Olah Raga Republik Indonesia dan All China Youth Federation,

Cina.