Toxikologie für Chemiker

Teil 1

Jan G. Hengstler

IfADo - Leibniz Research Centre for Working Environment and Human Factors Ardeystraße 67

D-44139 Dortmund

Einleitung: Alert-Strukturen Welche Substanz ist gefährlich, was können Sie „schlucken“?

OO

O

O

O

OMe

H

H

8

9

2

3

6a

9a

OO

O

O

O

OMe

H

H

8

9

2

3

6a

9a

Bay-Region an polycyclischem aromatischem Kohlenwasserstoff

OO

O

O

O

OMe

H

H

8

9

2

3

6a

9a

Bay-Region an polycyclischem aromatischem Kohlenwasserstoff

Aromatisches Amin

OO

O

O

O

OMe

H

H

8

9

2

3

6a

9a

Bay-Region an polycyclischem aromatischem Kohlenwasserstoff

Aromatisches Amin Chlor-

kohlenstoff

OO

O

O

O

OMe

H

H

8

9

2

3

6a

9a

Bay-Region an polycyclischem aromatischem Kohlenwasserstoff

Aromatisches Amin Chlor-

kohlenstoff

Nicht konjugierte gut zugängliche Doppelbindung im Ringsystem

OO

O

O

O

OMe

H

H

8

9

2

3

6a

9a

Bay-Region an polycyclischem aromatischem Kohlenwasserstoff

Aromatisches Amin Chlor-

kohlenstoff

Nicht konjugierte gut zugängliche Doppelbindung im Ringsystem

S-Thalidomid

Reduzierte Expression von Adhäsionsrezeptoren im Embryo

S-Thalidomid

Reduzierte Expression von Adhäsionsrezeptoren im Embryo

Schwere Mißbildungen im Embryo Teratogen

Toxikologie Definition: Lehre von den schädlichen Wirkungen chemischer Stoffe auf lebende Organismen Aufgabe: Untersuchung von möglichen Schadwirkungen durch chemische Stoffe auf Lebewesen Ziel: Das Risiko chemischer Stoffe auf die Gesundheit von Mensch und Tier abzuschätzen, um Gefahren abzuwenden

Fremdstoffmetabolismus

Teil 1

Mausleber von kaudal, Copyright: Marc Brulport

Procarcinogen

Genotoxic carcinogen

DNA damage

DNA mutations

Multistep process of oncogene activation and tumor suppressor inactivation

Tumor

Multistep Process of Carcinogenesis

Metabolic activation

Proliferation

Proliferation

Proliferation

Threshold mechanisms

Metabolic inactivation

DNA repair

Cell cycle arrest

Apoptosis

Apoptosis

Control by immune system

Procarcinogen

Genotoxic carcinogen

DNA damage

DNA mutations

Multistep process of oncogene activation and tumor suppressor inactivation

Tumor

Multistep Process of Carcinogenesis

Metabolic activation

Proliferation

Proliferation

Proliferation

Threshold mechanisms

Metabolic inactivation

DNA repair

Cell cycle arrest

Apoptosis

Apoptosis

Control by immune system

• Nahrungs-bestandteile Oxygenierte Konjugierte• Umweltgifte Intermediate Produkte• Arzneistoffe

DNA-BindungOxidativer Stress

Mutationen

Krebs

Ausscheidung

Phase IPhase II

Cytochrom P450 • CYP1A2 • CYP2C19 • CYP2B6 • CYP2D6 • CYP2E1 • CYP3A4 • CYP2C9 • CYP3A5

Konjugation • UDP-Glucuronosyltransferasen • Glutathiontransferasen • Sulfotransferasen • N-Acetyltransferasen

Prinzip des Fremdstoffmetabolismus

Phase-1-Enzyme

• Cytochrom-P450-abhängige Monooxygenasen (CYP) • Flavin-abhängige Monooxygenasen(FMO) • Monoaminoxidasen (MAO) • Cyclooxygenasen (COX) • Dihydrodioldehydrogenasen • DT-Diaphorase (NQOR) • Alkohol- und Aldehyd-dehydrogenasen (ADH, ALDH) • Epoxidhydrolasen

Phase-2-Enzyme: Transferasen • Glutathiontransferasen (GST) • UDP-Glucuronosyltransferasen (UGT) • Sulfotransferasen (SULT) • Acetyltransferasen (NAT) • Methyltransferasen (MT)

Phase-3-Enzyme: Membrantransporter • OATC • MDR • MRP

English Deutsch

Absorption Aufnahme

Distribution Verteilung

Metabolism Verstoffwechselung

Excretion Ausscheidung

ADME

Phase-1-Enzyme

• Cytochrom-P450-abhängige Monooxygenasen (CYP) • Flavin-abhängige Monooxygenasen(FMO) • Monoaminoxidasen (MAO) • Cyclooxygenasen (COX) • Dihydrodioldehydrogenasen • DT-Diaphorase (NQOR) • Alkohol- und Aldehyd-dehydrogenasen (ADH, ALDH)

Cytochrom P450: Phylogenetischer Baum

vor 250-400 Mio Jahren

Diversity of xenobiotic metabolising enzymes

Diversity of CYP isoenzymes

some 200-400 million years ago

360 million years of amphibians, 300 million years of reptiles,

200 million years of mammals

„Animal plant warfare“ Co-evolution of plants producing phytotoxins and animals responding with new detoxification enzymes

Spatial-temporal model of 10 days regeneration after CCl4 administration

Cytochrom P450: Nomenklatur Beispiel:

CYP3A4

Familie > 40 %

Unterfamilie > 55 %

Isoenzym Übereinstimmung der Aminosäure- sequenz

Rückschlüsse auf die Evolution; Beispiel 1:

CYP1A1 Ratte CYP1A1 Mensch CYP1A1 Ratte CYP1A2 Ratte CYP1A1 Mensch CYP1A2 Mensch

Übereinstimmung der Aminosäuresequenz

79,5 % 68,0 % 71,1 %

Die CYP1A1 Isoform ist entstanden bevor es zur phylogenetischen Trennung der Spezies Mensch und Ratte kam

Rückschlüsse auf die Evolution, Beispiel 2:

CYP2C8 Mensch CYP2C9 Mensch CYP2C18 Mensch CYP2C19 Mensch Vergleich der CYP2C Isoformen Mensch versus Ratte

Übereinstimmung der Aminosäuresequenz

77-91 %

< 77 %

Erst erfolgte die phylogenetischen Trennung der Spezies Mensch und Ratte. Danach kam es in jeder Spezies separat zur Bildung weiterer Isoformen.

RH R O H O 2

NADPH +

+ H 2 O + NADP +

CY P

Glucuronidierung

Acetylierung

Sulfatierung

Reaktionsschema von Cytochrom P450

Etc.

Enzymatischer Mechanismus: - Transfer eines Sauerstoffatoms aus molekularem Sauerstoff auf ein Akzeptormolekül - Das zweite Sauerstoffatom wird unter Verbrauch von NADPH zu Wasser reduziert - Resultat meist: Epoxidierung, Hydroxylierung, Desalkylierung

Cytchrom P450

Beispiel: Oxidation von Chrysen

Substrat: Chrysen

Produkt: Epoxid

Aus: Arand und Oesch, Fremdstoffmetabolismus, In: Marquardt, Schäfer

(i) Das Eisen im Hämin liegt mit einem Fe3+ im aktiven Zentrum vor → geringe Tendenz zur Bindung von Sauerstoff (ii) Chrysen bindet im aktiven Zentrum. → Hämin-Eisen geht von einer low-spin in eine high-spin Form über → Dies erleichtert die Reduktion von Fe3+ zu Fe2+.

Die NADP-abhängige Cytochrom-P450-Reduktase reduziert das Hämin zum Häm [erste ein-Elektronen-Reduktion]

Hämin

Häm

Das Elektron wird von der Cytochrom- P450-Reduktase geliefert

Molekularer Sauerstoff bindet an das Häm

Übertragung eines weiteren Elektrons von der Cytochrom-P450- Reduktase → Aktivierung des Komplexes →hochreaktiver Komplex [zweite ein-Elektronen-Reduktion]

- Spaltung der O-O-Bindung - Anlagerung von zwei Protonen - Wasserabspaltung

- Das verbliebene Sauerstoffatom wird auf das Substrat übertragen

- Freisetzung des Produkts

Beispiel: Oxidation von Chrysen

Substrat: Chrysen

Produkt: Epoxid

Aus: Arand und Oesch, Fremdstoffmetabolismus, In: Marquardt, Schäfer

OO

O

O

O

OMe

H

HAFB1

8

9

2

3

6a

9a

OO

O

O

O

OMe

OH

H AFM1

OO

O

OO

OMe

H

H

OH

AFQ1

OO

O

O

O

OMe

H

H

O

AFB1-exo-8,9-oxide

OO

O

O

O

OMe

H

H

O

AFB1-endo-8,9-oxide

Beispiel Nr. 1: Phase I Metabolismus von Aflatoxin B1

Die Folgen: DNA-Addukte

3‘ | T C G A | 5‘

5‘ | A G C T | 3‘

3‘ | T A G A | 5‘

5‘ | A G C T | 3‘

3‘ | T A G A | 5‘

5‘ | A T C T | 3‘

3‘ | T C G A | 5‘

3‘ | T C G A | 5‘

5‘ | A G C T | 3‘

3‘ | T C A A | 5‘

5‘ | A G T T | 3‘

Second replication

First replication Second

replication

G→T Transversion

C→T Transition

DNA with AFB1 adduct

5‘ | A G T | 3‘

C

5‘ | A G T | 3‘

C

3‘ | T C A A | 5‘

From: Hengstler, Bogdanffy, Bolt and Oesch, Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2003;43:485-520

Folgen von DNA-Addukten: Mutationen

Procarcinogen

Genotoxic carcinogen

DNA damage

DNA mutations

Multistep process of oncogene activation and tumor suppressor inactivation

Tumor

Multistep Process of Carcinogenesis

Metabolic activation

Proliferation

Proliferation

Proliferation

Threshold mechanisms

Metabolic inactivation

DNA repair

Cell cycle arrest

Apoptosis

Apoptosis

Control by immune system

Tumors

mEHP45 0

P45 0

DNA-ADDUCTS

GST P1Conjugates (Detoxification)

DMBA

Beispiel Nr. 2: Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA)

aus: Buters, Arand, Maser

aus: H. Foth, Metabolismus von PAKs

Beispiel Nr. 3: Metabolismus von Benzo[a]pyren

aus: H. Foth, Metabolismus von PAKs

Folgen der metabolischen Aktivierung von Benzo[a]pyren

Bildung von DNA-Addukten, zum Beispiel an der exocyclischen

Aminogruppe des Guanins

Fehler bei der Synthese neuer DNA

Mutationen

Aktivierung von Onkogenen Inaktivierung von

Tumorsuppressorgenen

DNA-Addukte

Beispiel Nr. 4: Metabolismus von Trichlorethylen

Merkmale: Cytochrom P450

- N = 50-60

- Hauptexpressionsorgan: Leber

- Extrahepatisches Vorkommen: Lunge, Darm, Niere, etc.

- langsames Enzym

- Breite Substratspezifizität

Enzym Organ Substratbeispiel

CYP1A1 Lunge, Leber, alle Organen

PAK

CYP1A2 Leber Aromatische und heterozyklische Amine

CYP2A6 Leber Diethylnitrosamin

CYP2B6 Leber Cyclophosphamid

CYP2D6 Leber Bufuralol, Spartein, Debrisoquin

CYP2E1 Leber, Niere, Darm, Leukozyten

Kleine Moleküle: Ethanol, Paracetamol,

CYP3A4 Leber, Darm Aflatoxin, viele Verbindungen

Cytochrom P450: die wichtigsten Isoformen

Phase 2 Enzyme

GST Glutathiontransferasen SULT Sulfotransferasen NAT Acetyltransferasen UGTP Glucuronosyltransferasen

R-CH2-X R-CH2-SG GSH

Glutathion-S-Transferasen

X=OH, Cl, NO2 und Peroxide Zellkonzentration GSH: ca. 5 mM Schützt vor oxidativem Stress GSSH Cytosolisch

GST-A GST-M GST-P GST-T Microsomale GST

Beispiel Nr. 1: Methyliodid

CH3I + GSH → CH3 – SG + HI

Glutathion (GSH)

Beispiel Nr. 2: Dichlornitrobenzol

?

Beispiel Nr. 2: Dichlornitrobenzol

Beispiel Nr. 3: Benzylchlorid

?

Beispiel Nr. 3: Benzylchlorid

Beispiel Nr. 4: 1,2-Epoxyethylbenzol

?

Beispiel Nr. 4: 1,2-Epoxyethylbenzol

Sulfotransferasen

R-XH R-X-S03-

SULT

PAPS1 PAP

XH = OH, SH, NH2

OH

SULT O-SO3

-

Phenol

Sulfonyl- gruppe

PAPS: 3‘-Phosphoadenosin-5‘phosphat

UDP-Glucuronosyltransferases

Characteristics: - Low affinity, high capacity - consequences: usually detoxification

→ O-Glucuronide, N-Glucuronide, C-Glucuronide, S-Glucuronide

UDP glucuronic acid

glucuronide

substrate

Chinonimin

Beispiel: Paracetamol - Entgiftung der Muttersubstanz durch Glucuronidierung oder Sulfatierung - Kleinkinder haben weniger UDP-Gucuronosyltransferase → Höhere Empfindlichkeit gegenüber Paracetamol

Bindung an Proteine

Konjugation mit Glutathion

Hepatotoxizität Entgiftung

H OH

Therapie der Vergiftung mit Paracetamol: N-Acetylcystein

Cystein

OH

Therapie der Vergiftung mit Paracetamol: N-Acetylcystein

N-Acetyl- Cystein

Zur Therapie nimmt man N-Acetylcystein und nicht Cystein – Warum?

Acetyl-Transferasen AcCoA+AT AT-AC + CoA AT-AC + AXH AX-AC + AT-H A= Akzeptor AT= Acetyltransferase X= N oder H Ac= Acetyl

CH3COO-

Kofaktoren

Phase 3

Spatial-temporal model of 10 days regeneration after CCl4 administration

ZO-1 EGF Dapi

Collagen Sandwich (CS) Soft-gel collagen