Toxoplasma, Pneumocystis, Trichomonas, Leptospira – co mají společné?

Seminář ku příležitosti 105. výročí narození a 40. výročí úmrtí prof. Otto Jírovce

Společnost pro epidemiologii a mikrobiologii ČLS JEP a

Česká parazitologická společnost www.parazitologie.cz

Lékařský dům 3. dubna 2012 Koordinátor: RNDr. Libor Mikeš, PhD.

Společnost pro epidemiologii a mikrobiologii ČLS JEP a

Česká parazitologická společnost

pořádají odborný seminář na téma

Toxoplasma, Pneumocystis, Trichomonas, Leptospira – co mají společné? Seminář ku příležitosti 105. výročí narození a 40. výročí úmrtí prof. Otto

Jírovce

dne 3. dubna 2012 ve 13:30 hodin

ve velké posluchárně Lékařského domu ČLS JEP, Sokolská 31, Praha 2

Program:

Doc. RNDr. Josef Chalupský, CSc. (Katedra parazitologie PřF UK v Praze): Osobnost profesora Jírovce Toxoplasma v dobách Jírovcových

RNDr. Petr Kodym, CSc. (SZÚ Praha): Toxoplasma od profesora Jírovce po současnost Prof. RNDr. Jiří Vávra, DrSc. (PaÚ AVČR a Katedra parazitologie PřF JU České Budějovice): Od intersticální plasmocytární pneumonie a Pneumocystis carinii k Pneumocystis jirovecii pneumonii RNDr. Eva Nohýnková, PhD. (Klinika infekčních a tropických nemocí 1. LF UK v Praze a FN Na Bulovce): Pneumocystis – možnosti a úskalí diagnostiky Přestávka s občerstvením (cca 15:00-15:30) MVDr. Zuzana Čermáková, PhD. (Ústav klinické mikrobiologie FN a LF UK v Praze Hradec Králové): Leptospiry, leptospirózy – pokroky v diagnostice Prof. RNDr. Jaroslav Kulda, CSc. (Katedra parazitologie PřF UK v Praze): Trichomonas vaginalis: přínos profesora Jírovce a jeho následovníků RNDr. Ivan Čepička, PhD. (Katedra zoologie PřF UK v Praze): Trichomonády v respiračním traktu člověka Předpokládané zakončení semináře v cca 16:45. Koordinátor semináře a editor sborníku: RNDr. Libor Mikeš, PhD. (Katedra parazitologie PřF UK v Praze a ČPS) © Česká parazitologická společnost Seminář má charakter postgraduálního vzdělávání a je garantován ČLK jako akce kontinuálního vzdělávání. Seminář bude ohodnocen kredity ČLS, KVVOPZ ČR a Společností SML - obor mikrobiologický laborant – účastníci obdrží potvrzení o účasti.

1

2

OSOBNOST PROFESORA JÍROVCE, TOXOPLASMA V DOBÁCH

JÍROVCOVÝCH Doc. RNDr. Josef Chalupský, CSc. (Katedra parazitologie PřF UK v Praze)

e-mail: chalupsk@natur.cuni.cz

Přednáška byla pojata jako bezprostřední, osobní zavzpomínání na profesora Otto

Jírovce. Jak to umožnilo dlouholeté pobývání v jeho blízkosti. Nelze z ní tedy zde pořídit nějaký

souhrn.

Nicméně alespoň něco. Vyzdvižena byla Jírovcova jedinečná zásluha na poválečném

vybudování zcela nového, samostatného oboru - parazitologie. De novo, a to nejen po stránce

odborné a vědecké, ale též vlastního a promyšleného vybudování podoby pracoviště. Protože

parazitologie byla tehdy zaměřena především směrem k humánní medicině, zřízena byla

vyšetřovací a diagnostická laboratoř hojně navštěvovaná pacienty a parazitologie si získala záhy

zasloužené renomé v lékařské veřejnosti. Vzniklo tak zárodečné líhniště budoucích parazitologů.

Což přetrvává. Vždyť na lékařské fakultě se parazitologie dodnes nepřednáší.

Připomenuto bylo Jírovcovo zaujetí a zápal pro obor a poznání vůbec. Bylo mu to

vrozené. Nikdy jsme jej neviděli lelkovat. Mohl tím být pro nás vzorem. Ale také i v něčem

jiném. Byl nefalšovaným ctitelem lidské rovnosti. Za všech okolností vždy světlým bodem,

kolem kterého se vše otáčelo.

Protože je o něm dnes zejména pro mladší známo málo, uvádíme jeho hlavní životopisná

data. Otto Jírovec se narodil 31. ledna 1907 v Praze. Maturoval v roce 1924 na vinohradském

gymnáziu. V r. 1929 skončil doktorátem studium na Přírodovědecké fakultě UK prací o

trypanosomách bez kinetoplastu. V letech 1925-29 byl již demonstrátorem na zoologickém

ústavu PřFUK a 1930-32 tam působil jako nehonorovaný asistent. Rok potom učil na

břeclavském gymnáziu, ale v r. 1933 se po smrti doc. Hahna vrátil na uvolněné místo do Prahy.

V r. 1938 se stal docentem s habilitační prací o mikrosporidiích a r. 1948 profesorem. V roce

1952 se stal členem korespondentem ČSAV a r. 1955 akademikem. V roce 1953 dostal společně

s plzeňským patologem doc. Vaňkem státní cenu za odhalení původce intersticiální pneumonie

kojenců Pneumocystis carinii. Zveřejnil 278 vědeckých prací a 250 populárních článků. Dále 11

knih. Asi první je jeho populární spolu s manželkou vydaná „Parasiti člověka“. Nejznámější jsou

„Zoologická technika“ (vyšla ve třech vydáních), „Parasitologie pro lékaře“ (dvě vydání česká a

jedno německé), „Parasitologie pro zvěrolékaře“ a ve spoluautorství „Protozoologie“ a obrazový

atlas „Život pod drobnohledem“ (vydaný též ve čtyřech světových jazycích - úplný soupis jeho

prací lze nalézt ve Věstníku Čs. zoologické společnosti 36, 300, 1972). Otto Jírovec zemřel 7.

března 1972.

3

Portrét p. prof. Otto Jírovce

Někdy na přelomu čtyřicátých a padesátých let se narodilo na Karlově dítko, které bylo

postiženo tím věhlasným hydrocefalem. Ascitickou tekutinu v neurocraniu mělo plnou

tachyzoitů Toxoplasma gondii. Podařilo se je přeočkovat na myšky a vznikl tak domácí kmen,

který byl na nich po desítky let na parazitologii udržován. Umožnilo to podle Frenkelova vzoru

(1948) vyrábět u nás z vlastních zdrojů testovací látku „Toxoplasmin“. Tzv. intradermálním

testem (IDT) tu byli vyšetřováni pacienti, přicházející s podezřením, že by příčinou jejich potíží

mohla být toxoplamosa . Ale nejen v Praze. Zásluhou Jírovcovou a Jindřicha Jíry vzniklo opět

vyhlášené pracoviště, které později dovolilo přejít na diagnostiku imunofluorescenční. Výsledky

IDT v jeden čas naznačovaly možnou souvislost mezi toxoplasmosou a mongoloidismem.

4

TOXOPLASMA OD PROFESORA JÍROVCE PO SOUČASNOST RNDr. Petr Kodym, CSc.

(Národní referenční laboratoř pro toxoplasmózu, CEM, Státní zdravotní ústav, Praha)

email: petr.kodym@szu.cz

Profesor Otto Jírovec (1907-1972), český světově významný průkopník parazitologie, se

toxoplasmózou zabýval od roku 1954. S četnými spolupracovníky vydal o této infekci na 50

publikací.

V Jírovcově čase byla Toxoplasma gondii tajuplným parazitem. Velice dobře bylo známo

stadium tachyzoitů, které se dařilo kultivovat na myších, jakož i tkáňové cysty s bradyzoity.

Nebylo pochyb o tom, že Toxoplasma gondii může být nebezpečným lidským patogenem. První

známý případ kongenitální a současně i oční toxoplasmózy popsal Janků (1923), od 50. let se

vědělo, že toxoplasma způsobuje lymfadenopatie. Byla zaznamenána široká plejáda hostitelů,

stále však nebyl znám kompletní životní cyklus a nebylo jasné, jak se infikují lidé. Bylo zjevné,

že tkáňové cysty objevené například ve vepřovém mase nejsou všechno. Jírovec (1960) píše:

„Jakou cestou se tento velký počet lidí infikuje toxoplasmami, není dosud exaktně známo;

připouští se většinou perorální, intranasální, vzácněji intrakonjunktivální a perkutánní infekce“.

Vše se vyjasnilo až na sklonku života profesora Jírovce: roli kočky jakožto definitivního

hostitele odhalil Hutchinson (1965) a teprve Dubey, Miller a Frenkel (1970) popsali stadium

oocysty.

Navzdory těmto poměrně vážným mezerám ve znalostech o biologii Toxoplasma gondii

fungovala poměrně dobře diagnostika a terapie humánní toxoplasmózy. Například v plodové

vodě bylo možné prokázat toxoplasmy isolačním pokusem na laboratorním zvířeti. Základem

laboratorní diagnostiky však byly titrační sérologické metody – především Sabinův-Feldmanův

„dye test“ (SFT), který, ačkoliv jej provádí už jen pár vybraných laboratoří, dodnes platí za zlatý

standard stanovení antitoxoplasmických protilátek a z titru SFT se odvozují mezinárodní

jednotky IgG. Vyjádřením titrů SFT, NIFR a KFR se dá obsah protilátek v séru kvantifikovat

mnohem lépe než v moderních jednobodových testech, což umožňuje sledovat dynamiku

protilátek a i poměrně dobře určovat fázi infekce bez znalosti obsahu antitoxoplasmických IgM

či IgA nebo bez stanovení avidity IgG. Sérologické testy jsou základem diagnostiky

toxoplasmózy i v současnosti. Nejoblíbenější metoda profesora Jírovce – intradermální test – se

vzhledem k obtížné kvantifikovatelnosti hodí k diagnostice akutní toxoplasmózy méně; jelikož je

však založen na buněčné imunitě, má vynikající předpoklady stát se ideální metodou pro

vyšetřování populace v rámci epidemiologických studií. Vzhledem k tomu, že Ústav sér a

očkovacích látek byl z důvodu údajné potenciální rizikovosti nucen zastavit výrobu antigenu -

toxoplasminu - na přelomu 80. a 90. let minulého století, intradermální test pro své studie již

5

nikdo nepoužije. Porovnání diagnostických testů v časech profesora Jírovce a v současnosti

přináší tabulka 1.

Tab. 1: Základní testy používané k diagnostice toxoplasmózy v minulosti a současnosti

Diagnostický test Používán od

V časech prof. Jírovce V 21. století

Isolace toxoplasem na laboratorní myši

1966 Používána Používána v NRL

PCR – stanovení DNA Toxoplasma gondii

1990 nebyla Metoda přímého průkazu T. gondii v plodové vodě

Kožní (intradermální) test (IDT)

1948 Hlavní test specifické buněčné imunity

Není povolen

Sabinův-Feldmanův „dye test“ (SFT)

1948 Základní sérologický test

„Zlatý standard“, v ČR se momentálně neprovádí

Komplementfixační reakce (KFR)

1942 Základní sérologický test

Základní sérologický test

Nepřímá imunofluo-rescenční reakce (NIFR)

1961 Používána Používána

ELISA IgG cca. 1980 Nebyla Základní sérologický test

ELISA IgM

cca. 1988 Nebyla Základní sérologický test

Test avidity IgG

1991 Nebyl Významný u těhotných žen

V oblasti terapie toxoplasmózy nenastala od časů profesora Jírovce žádná významná

změna. Dosud nebyl do klinické praxe zaveden žádný lék, který by byl proti tachyzoitům

účinnější než kombinace pyrimethaminu a sulphadiazinu, preparát účinný proti bradyzoitům se

dosud marně hledá.

Vedle problémů diagnostiky považoval profesor Jírovec za důležitou otázku „jaké jsou

účinky chronické respektive klinicky bezpříznakové toxoplasmové infekce na zdravotní stav

člověka?“ Zaujala jej především i dnes aktuální problematika možné souvislosti toxoplasmózy

se vznikem psychiatrických nemocí, která se koneckonců vzhledem k lokalizaci cyst

Toxoplasma gondii v mozku sama nabízí. Jeho studie provedená na celkem 1 683 pacientech

psychiatrických léčeben v Dobřanech, Pezinku, Havlíčkově Brodě a Praze-Bohnicích má dodnes

zásadní výpovědní hodnotu, v současnosti se ztěží může někomu podařit takto rozsáhlý soubor

vyšetřit. Do studie byly zařazeny osoby se schizofrenními (954) a maniodepresivními (48)

6

psychózami, involučně depresivními stavy (103), různými psychózami a narkomaniemi (53),

oligofrenií (235), psychopatiemi (93), epilepsií (152) a lues CNS (56). Prevalence toxoplasmózy,

s výjimkou maniodepresivních psychóz (pouhých 27%) a involučně depresivních stavů (53%)

kolísala mezi 42,7 % (epilepsie) a 47,1 % (psychózy a narkomanie). Autoři odstranili vliv

možného bias jako je věk či délka pobytu v léčebně. Závěr je jednoznačný: „Jsme proto toho

názoru, že toxoplasmóza při etiologii různých psychických onemocnění nehraje prakticky

žádnou roli. U jednotlivých onemocnění jsme našli přibližně stejná nebo velmi podobná čísla

pozitivity jako Kozar, ta však odpovídají normě promořenosti našeho obyvatelstva“ (Jírovec,

1971 A).

Zajímavá otázka zní: bylo v časech profesora Jírovce u nás více toxoplasmózy? Studie

provedená IDT v průběhu 8 let na úctyhodných 15 972 občanech Československa vykázala

prevalenci 37,7% (Jírovec, 1971 B). To je více, než nám vyšlo z posledních sérologických

přehledů (90. léta 20. století), ale méně, než se v soudobých pramenech uvádělo pro Vídeň nebo

Francii. Autor však uvádí, že čísla mohou být zvýšena výběrem testovaných osob, z nichž

většina pochází z venkovských oblastí. Prevalence výrazně stoupá s věkem: zatímco v kategorii

do 5 let je jen 4,6%, do 10 let 14,4% a do 15 let 20,7%, je ve věku 16-20 let 30,5%, 21-30 let

36,5% a 31-40 let 51,2 % positivních. S ještě vyšším věkem již prevalence příliš nenarůstá: 41-

50 let 54,5%, 51-60 let 56 % a přes 60 let 51,6%. Na odlišnostech v prevalenci může mít vliv i

odlišná citlivost diagnostických testů - tehdejšího IDT a dnešního KFR. Jedině nové vyšetření

větších souborů běžné populace by mohlo ukázat, zda toxoplasmózy skutečně ubývá; to je však

v současnosti velice těžko proveditelné.

A co se změnilo od dob prof. Jírovce v parazitologii jakožto oboru? Vedle metod výzkumu i

mnoho dalších věcí, snad ještě zásadnějších. Například špičkového vědce formátu profesora

Jírovce zajímala v první řadě diagnostika (mnoho jeho prací je věnováno metodice IDT a dalších

testů), klinika a terapie sledované infekce, byl v neustálém kontaktu s praxí. Dnes je to bohužel

jinak. „Vědečtí“ a „praktičtí“ parazitologové se od sebe neustále vzdalují a čím dál tím méně

nacházejí společnou řeč.

Dnešního čtenáře Jírovcových prací asi překvapí, že jsou většinou v němčině. Obzvláště

v německé a rakouské literatuře jsou také hojně citovány.

A jakožto pracovník Státního zdravotního ústavu (SZÚ) si na závěr neodpustím drobnou

poznámku: je známo, že v době Protektorátu, kdy byly zavřeny české vysoké školy, se profesor

Otto Jírovec uchýlil do SZÚ, kde pracoval až do osvobození Prahy. Jeho pozdějším

pokračovatelem v SZÚ byl parazitolog Dr. O. Havlík a přes něj již vede přímá linie ke vzniku

Národní referenční laboratoře pro toxoplasmózu.

7

LITERATURA

Dubey, J.P.: Miller, N.L: Frenkel, J.K.(1970): Characterization of the new fecal form of

Toxoplasma gondii. J. Parasitol. 56:447

Hutchinson, W.M (1965): Experimental transmission of Toxoplasma gondii. Nature 206 :961

Janků J. (1923) Pathogenesa a pathologická anatomie tak nazvaného vrozeného kolobomu žluté

skvrny v oku normálně velkém a mikrophthalmickém s nálezem parasitů v sítnici. Časopis

lékařův českých 62 (39):1021-1027; 62 (40):1054-1059; 62 (41):1081-1085; 62 (42):1111-1115;

62 (43) 1138-1144.

Jírovec, O (1960): Parasitologie für Ärzte. VEB Gustav Fischer Verlag, Jena, 684 pp.

Jírovec, O (1971 A): Toxoplasminteste bei Patienten in vier psychiatrischen Heilanstalten. In:

Kirchoff, H., Langer, H.: Toxoplasmose. Praktische Fragen und Ergebnisse. Stuttgart, Georg

Thieme Verlag, : 14-16

Jírovec, O (1971 B): Resultate des Toxoplasmintestes bei sog. Normaler Bevölkerung der

Tschechoslowakei. In: Kirchoff, H., Langer, H.: Toxoplasmose. Praktische Fragen und

Ergebnisse. Stuttgart, Georg Thieme Verlag, : 10-11

OD INTERSTICÁLNÍ PLASMOCYTÁRNÍ PNEUMONIE A

PNEUMOCYSTIS CARINII K PNEUMOCYSTIS JIROVECII PNEUMONII Prof. RNDr. Jiří Vávra, DrSc.

(Parazitologický ústav, Biologické centrum AVČR, České Budějovice a Katedra parazitologie

Přírodovědecké fakulty Jihočeské Univerzity, České Budějovice)

e-mail: vavra@paru.cas.cz

Souhrn

Pneumocystis spp. (PNC) (s velkou řadou hostitelsky specifických druhů) je kvasinka

(Fungi: Ascomycota), kolonizující povrch pneumocytů typu I, které vystýlají plicní alveoly

savců. Výskyt těchto kvasinek v plicích savců je zcela běžný a mimo dosud 5 řádně taxonomicky

popsaných druhů jich zřejmě existují v jednotlivých savčích hostitelích stovky či tisíce. Lidské

infekce jsou působeny druhem Pneumocystis jirovecii Frenkel, 1976 (PJ), jehož je člověk

jediným hostitelem. Druhové jméno parazita připomíná zásadní úlohu profesora Otto Jírovce

((1907-1972) a jeho spolupracovníků v rozpoznání, že pneumocystis je častým a závažným

parazitem člověka (1951/1952) vyvolávající specifický typ pneumonie (intersticiální

plasmocytární pneumonie), dnes známý jako “pneumocystis jirovecii peumonie” nebo

8

pneumocystová pneumonie – PNP. Záludnost infekce tímto patogenem spočívá v tom, že

pneumocysty žijící v alveolu se chovají jako neškodní komenzálové, pokud jsou kontrolovány

imunitním systéme hostitele, ale v případě selhání hostitelské imunity dojde k masivnímu

namnožení organizmu v plicních alveolech hostitele, jejich zaplnění s až fatálními následky.

Závislost výskytu Pneumocystis jirovecii pneumonie na imunodeficitu hostitele definuje PNP

jako “immunodeficiency-dependent disease” – IDD.

Historie objevu

Organizmus byl objeven náhodou v r. 1909 brazilským parazitologem Carlos Chagasem

v plicích morčat uměle nakažených Trypanosoma cruzi, původcem jihoamerické Chagasovy

choroby. Carlos Chagas nalezl v plicích morčat drobná kulovitá cystická stadia (5 µm) s osmi

jádry, která mylně zařadil do vývojového cyklu trypanosomy. Tato stadia, o nichž dnes víme, že

to jsou askospory Pneumocystis, pak sehrála klíčovou roli při další identifikaci organizmu.

Chagasovo přesvědčení, že tato cystická stadia patří k americké trypanosomatóze posílilo to, že

je v r. 1911 nalezl v plicích člověka zemřelého na Chagasovu chorobu. Později bylo to, co

Chagas popsal, nalezeno v plicích krys, ale bez nákazy T. cruzi (Carini 1910). A další nález

téhož v plicích divokých potkanů v Paříži vedl konečně k uznání samostatnosti organizmu a jeho

popisu jako Pneumocystis carini Delanoe et Delanoe, 1912. V roce 1942 byl organizmus nalezen

v patologickém materiálu plic několika lidí a zvířat v Holandsku (van der Meer a Brugg).

Holandští patologové nalezený organizmus správně určili jako Pneumocystis, nerozeznali ale

jeho patologický potenciál a bohužel, díky probíhající světové válce, jejich nález nevzbudil

patřičnou odezvu.

Je to teprve publikace přednosty Šiklova Ústavu patologie Lékařské fakulty UK v Plzni,

prof. Josefa Vaňka z roku 1951, oznamující nález Pneumocystis v alveolárním exudátu

zemřelých dětí, která zahajuje dodnes trvající periodu celosvětového zájmu o tohoto kolonizátora

savčích plic a příležitostného patogena. Otto Jírovec, profesor parazitologie Přírodovědecké

fakulty UK v Praze, vstupuje do historie pneumocystis tím, že identifikuje organizmus na

patologickém materiálu prof. Vaňka jako Pneumocystis carinii a v další spolupráci s ním a s

pediatrem Lukešem tito autoři identifikují v r. 1952 Pneumocystis jako původce epidemicky se

vyskytujícího onemocnění kojenců (“nedonošenců a oslabených dětí”) známého klinikům a

patologům jako intersticiální plasmocytární pneumonie. Toto onemocnění se vyskytovalo v

Evropě ve stovkách až tisícovkách případů přibližně mezi léty 1920 a 1960, vrcholilo v létech

1955-59. Dnes přetrvává v izolovaných případech a drobných nosokomálních epidemiích,

nikoliv však jen u kojenců, ale v populaci obecně. Jeho původce a patologické agens nebyl až do

objevu Vaňka a Jírovce identifikován.

9

Onemocnění má relativně vyhraněný klinický projev (horečka, suchý kašel, rychlý nástup

dyspnoe a hypoxie) a charakeristický patologický nález (infiltrace plicních alveol “pěnovitou

hmotou” = masa pneumocyst, mezi kterými se vyskytují cystovitá eliptická či kulatá stadia s 8mi

jádry). Je další zásluhou Vaňka a Jírovce, že identifikovali přítomnost Pneumocystis ve

fotografiích doprovázejících původní popis intersticiální plasmocytární pneumonie jako

patologické jednotky (Ammich 1938, Benecke 1938) a tak definitivně potvrdili, že se jedná o

pneumocystózu. Impakt publikací Vaňka, Jírovce a Lukeše identifikující Pneumocystis jako

etiologické agens kojenecké plasmocytární pneumonie byl obrovský: jen v prvé dekádě

následující objev Pneumocystis jako lidského patogena bylo publikováno ve střední Evropě 111

prací věnovaných Pneumocystis. Zvýšil se zájem lékařské veřejnosti o toto onemocnění (během

4 let se na území Československa bylo zaznamenáno kolem 2000 případů kojenecké

intersticiální pneumonie). V databázi prof. Jírovce představují publikace věnované

Pneumocystis celou pětinu, v současnosti vychází ročně kolem 500-700 prací věnovaných

nejrůznějším aspektům PNC a PNP (databáze SCOPUS). Pneumocystis je dnes nejběžnějším

oportunistickým patogenem lidí s imunodeficitem (HIV, hematologické malignity, stav po

orgánových transplantacích, nádorová onemocnění, immunosupresivní terapie, terapie

antimetabolity a j.) a je organizmem citlivě signalizující stav imunitní nedostatečnosti.

Co ve stručnosti víme o PNC dnes, po 60ti letech co se ukázalo, že to je to potencíálně závažný

patogen, nejen lidí ale savců obecně?

Systematická příslušnost

Původně byla Pneumocystis považována za protozoon a byla řazena do blízkosti kokcidií

(Aragao 1913, Chagas 1913). O příslušnosti k prvokům nepochyboval ani Otto Jírovec a tento

názor se naposled objevuje v jeho Lékařské parazitologii vydané v r. 1977. Ovšem, ihned po

identifikaci Pneumocystis jako lidského patogena, řada mykologů (Csillag, Giese) vyslovila

názor, že PNC je příslušník říše hub, Fungi. Zprvu, byl tento názor podporován málo závažnými

argumenty (barvicí vlastnosti PNC v histologickém materiálu, skutečnost, že v plicích se běžně

vyskytují vdechnuté kvasinky). Později byl názor, že PNC je houbový organizmus podpořen

zjištěním, že cystická stadia PNC jsou ultrastrukturálně identická s asky (vřecky) kvasinek

(Vávra a Kučera 1970). Molekulární biologie přinesla definitivní rozsudek. Fylogeneze rRNA

genů, sekvenční analýza mitochondriálních genů, disjunkce genů thymidylát syntázy a

dihydrofolát reduktázy, přítomnost houbám specifického elongačního faktoru EF-3 a j. (Edman a

spol. 1989, Stringer et al. 1989 a řada dalších autorů) jasně potvrzuje, že PNC je kvasinka. Její

dnešní taxonomické zařazení je následující: rod Pneumocystis, čeleď Pneumocystidaceae, řád

Pneumocystidales, třída Pneumocystidomycetes, podkmen Taphrinomycotina (to jsou primitivní

ascomycety, pravděpodobně jejich bazální skupina), kmen Ascomycota, říše Fungi.

10

Pneumocystis tak patří mezi vřeckovýtrusné houby a její nejbližší příbuzná je běžná,

volně žijící kvasinka Schizosaccharomyces pombe. Přesto, jak je uvedeno dále, PNC nemá stadia

mimo savčí organizmus. Baterie molekulárně biologických a biochemických důkazů, že PNC je

kvasinka vybavená životním cyklem zahrnujícím meiosu a tvorbu askospor, je dnes

nezpochybnitelná. Na druhé straně, detailní výzkum tohoto organizmu přináší důkazy i o

některých specifických vlastnostech PNC, zřejmě reflektujících parazitární způsob života. Tou

nejdůležitější je přítomnost cholesterolu jako lipidické složky buněčných membrán na rozdíl od

ergosterolu, typické buněčné komponentě hub. Tato vlastnost zakládá rezistenci PNC na

antimykotika inhibující biosyntézu ergosterolu. Vegetativní buňky pnumocyst v elektronovém

mikroskopu se příliš nepodobají kvasinkám, mají nepravidelný tvar, tenkou stěnu, která vybíhá v

množství výběžků splétajících se navzájem a s výběžky membrán pneumocytů. Tato schopnost

tvořit kompaktní kolonie, dovoluje pneumocystám zaplnit vzdušný prostor alveolu.

Jedna či více PNC, kolik druhů?

Mimo krysy (potkany) a člověka je PNC nalézána běžně v plicích prakticky všech savců

včetně některých jejich primitivních forem (např. klokani). Až do r. 1976 byly všechny nálezy

označovány jako Pneumocystis carinii z prostého důvodu, že morfologický obraz organizmu ve

světelném a elektronovém mikroskopu neposkytuje možnost spolehlivě rozlišit PNC z

jednotlivých hostitelů. V roce 1976 americký patolog J.K. Frenkel snesl řadu argumentů pro

odlišnost krysí a lidské PNC (antigenní odlišnost, klinický průběh onemocnění, morfologické

odlišnosti) a lidskou formu PNC označil jako Pneumocystis jiroveci a to v uznání zásluh Otto

Jírovce. Popis z roku 1976 byl proveden podle Mezinárodních pravidel zoologické nomenklatury

(ICZN) (jiroveci s jedním i), popis byl v r. 1999 inovován dle pravidel botanické nomenklatury

(ICBN). Dle tohoto kódu je správný název organizmu Pneumocystis jirovecii Frenkel, 1976

(jiroveci, dvě ii). V literatuře se ovšem stále ještě objevuje i P. jiroveci, což je chybné.

Sekvenční analýza řady genů dovoluje srovnání PNC z různých hostitelů. Ukazuje se, že

PNC z jednotlivých hostitelů jsou hostitelsky přísně specifické druhy s řadou vnitřních genotypů.

To znamená, že potenciálně existují stovky druhů PNC, protože jeden hostitel může být

nositelem i několika, pro hostitelský druh specifických pneumocyst. Plicní alveoly jednoho

druhu hostitele mohou být tedy kolonizovány několika molekulárně biologicky dobře

podpořenými druhy PNC a to dokonce současně. Při této kohabitaci však nedochází k výměně

genetického materiálu. V souladu s pravidly taxonomie bylo zatím popsáno 5 druhů PNC: P.

carinii a P. wakefialdiae v potkanech, P. jirovecii v člověku, P. murina v laboratorních

hlodavcích, P. oryctolagi v králících. Řada dalších PNC figuruje v literatuře jako druhy bez

řádného popisu (např. P. soricina z rejsků, P. equina z koňů, nebo jsou zmiňovány v literatuře

jako tzv. speciální formy, např. P. carinii f. sp. mustelae z fretky, P.carinii f.sp. suis z prasete.

11

Jsou to rozhodně dobré druhy, jen čekající na řádný popis. PNC je evidentně soubor

fylogeneticky starých organizmů, které se vyvíjely společně se svými hostiteli a jsou k ním

extrémně úzce adaptovány. To je také zřejmě důvodem, proč se zatím nepodařila dlouhodobá

kultivace PNC v umělém mediu a proč imunosuprimovaný potkan či mladý králík těsně po

odstavu (který spontánně prodělává krátkou episodu pneumocystózy) jsou vlastně jedinými

laboratorními modely pneumocystózy.

Specifický savčí oportunista – existují volně žijící stadia?

Molekulárně biologické metody umožňují nalézat PNC volně v přírodě, kde její DNA je

nalézána na vzduchových filtrech nebo ve vodě. To a systematická příslušnost PNC k volně

žijícím kvasinkám zavdalo podnět ke spekulacím, že PNC má někde v přírodě další část

životního cyklu. Recentní analýzy proteomu však ukazují, že PNC má nápadně chudou výbavu

enzymů pro syntézu aminokyselin (pouze 2! ve srovnání s minimálně 54 enzymy volně žijící S.

pombe) a že tedy musí získávat aminokyseliny z prostředí plicního alveolu. S největší

pravděpodobností tedy PNC může existovat pouze jako intraalveolární oportunista (Hauser a

spol. 2010). PNC je rovněž závislá na získávání hostitelského cholesterolu a velkých množství S-

adenosyl methioninu (AdoMet).

Životní cyklus

Zahrnuje binární dělení, sexuální cyklus zahrnující kopulaci dvou haploidních buněk

(PNC exprimují sexuální feromon) s následující meiózou (navozující opět haploidní stav) během

tvorby spory (asku) s 8mi haploidními askosporami uvnitř. Askospory jsou pak vykašlávány a

zprostředkují vzdušnou cestou infekci nového hostitele. V plicích se PNC zřejmě šíří z alveolu

do alveolu prostřednictvím tvorby biofilmu z agregovaných buněk a vyloučené extracelulární

matrix. Stěna asků, kterými životní cyklus kulminuje, obsahuje beta-1,3-D-glukan jako základní

strukturální polysacharid. Ten hraje důležitou úlohu v zánětlivé reakci organizmu vyvolané PNC

a hladina sérových protilátek proti tomuto glukanu se dá využít jako perspektivní diagnostická

metoda reflektující množství PNC v plicích.

Ačkoliv přítomnost sérových protilátek v populaci je vysoká (sérologická pozitivita dětí

vůči P. jirovecii dosahuje ve věku 2-3 roky 70-90%), vše nasvědčuje tomu, že PNC je v plicích

imunokompetentních hostitelů (včetně člověka) přítomna jen přechodně, v podobě občasných,

krátkodobých infekcí. Trvalejší kolonizace je pak vždy známkou hostitelského imunodeficitu.

Extrapulmonární pneumocystóza

Ačkoliv je PNC v podstatě parazit lokalizovaný v dutině plicního alveolu, ojediněle jsou

nalézána drobná a izolovaná ložiska PNC v mimoplicní lokalizaci. Histologická zjištění pak

12

podporuje molekulárně biologická detekce PNC ve tkáních imunosuprimovaných potkanů: v

případě silných nákaz v plicích může PNC diseminovat do různých dalších orgánů (játra,

ledviny, slezina, mezenteriální mízní uzliny) (Golab 2009). Z klinického hlediska jsou ale tyto

lokalizace pravděpodobně bezvýznamné.

Antigenní variabilita

K významným zjištěním patří to, že PNC je schopna měnit povrchové antigeny svých

buněk. Buňky PNC jsou pokryty glykoproteinem A (=MSG – „major surface glycoprotein“),

který hraje roli v přichycení PNC k buňkám hostitele. U krysí P. carinii zahrnuje genová rodina

MSG asi kolem 70-80 genů exprimovaných jednotlivě z expresního místa blízko

chromozomových telomer. Tyto geny kódují izoformy povrchového proteinu MSG

(exprimována je vždy jen jedna izofoma MSG); tím se zvyšuje fenotypová variabilita, což

pravděpodobně pomáhá úniku před imunitní reakcí hostitele. Podobné geny jsou i u dalších

druhů PNC, včetně P. jirovecii. Tento systém antigenního převleku se podobá tomu, co používají

africké trypanosomy pro dlouhodobé přežívání v hostiteli - s tím rozdílem, že repertoár

genových variant je u PNC nepoměrně nižší ( u P. carini asi 73 variantních genů oproti až

tisícům u T. brucei). Díky genetické rekombinaci však množství povrchových antigenních

variant PNC podstatně vzrůstá. Antigenní variabilita umožnující částečný únik před reakcí

imunitního systému hostitele může mít zásadní význam pro krátkodobé přežívání organizmu

v hostiteli, dokončení životního cyklu a vytvoření stadií pro přenos na nového hostitele.

Závěr

Co je tedy PNC? Je to komenzál savčích plic, oportunista využívající poklesu

hostitelských obranných reakcí (specificky poklesu CD4+ lymfocytů pod 200/mm3), je to

patogen? PNC má za různých okolností daných specifickými podmínkami v hostiteli všechny

tyto vlastnosti. Americký patolog Frenkel, který popsal P. jirovecii, navrhl, aby tímto

organizmem působená pneumonie, v literatuře dnes bežně označovaná jako P. jirovecii

pneumonie, byla specificky označena jako tzv. IDD choroba („immunodeficiency dependent

disease“). Tedy choroba postihující jedince s buď nedozrálým imunitním systémem, nebo

se sekundárním imunodeficitem. To nejlépe vystihuje podstatu PNP . Vrátíme-li se pod tímto

aspektem k epidemii dětské pneumocystózy, která probíhala v Evropě od r. 1920 do přibližně

1960, a jejíž zkoumání Otto Jírovcem a jeho spolupracovníky otevřelo cestu k tomu, co známe o

PNC dnes, naskýtá se otázka: co bylo podstatou imunodeficitu či nevyzrálosti imunitního

systému tisíců onemocnělých dětí v oné době? Není úplně jisté, že to byl důsledek podvýživy

během války, PNC probíhala i v zemích kde tomu jistě tak nebylo (Švýcarsko). Byly to speciální

podmínky v pediatrických zařízeních té doby a způsoby zacházení s kojenci (proteinová

13

podvýživa, nahromadění jedinců vnímavých k nákaze, špatné hygienické podmínky mohou vést

k endemii dětské pneumocystózy – Shiraz, Iran- in Frenkel 1999)? Jako zajímavost uveďme, že

američtí pediatři se domnívají, že v Evropě tehdy proběhla epidemie neznámého retrovirového

onemocnění, která predisponovala děti pro rozvoj PNP. Epidemiologická data tomu nasvědčují,

chybí jedině důkaz, že takový virus skutečně existoval (Goldman A.S. et al. 2005. What Caused

the Epidemics of Pneumocystis Pneumonia in European Premature Infants in the Mid-20th

Century? Pediatrics 115, 725-736).

Doplňkové informace

Pneumocystis Genome Project at http://pgp.cchmc.org/

Cushion, M.T., Stringer, J.R. Stealth and Opportunism: Alternative lifestyles of species in the

fungal genus Pneumocystis. (2010) Annual Review of Microbiology, 64, pp. 431-452.

Cushion, M.T., Collins, M.S, Linke, M.J. Biofilm formation by Pneumocystis spp. (2009)

Eukaryotic Cell, 8 (2), pp. 197-206.

Finkelman, M.A. Pneumocystis jirovecii infection: Cell wall (1→3)-β-D-glucan biology and

diagnostic utility. (2010) Critical Reviews in Microbiology, 36 (4), pp. 271-281.

Frenkel J.J. Pneumocystis pneumonia, an Immunodeficiency-Dependent Disease (IDD): A

Critical Historical Overview. (1999). J.Eukaryot. Microbiol. 46(5), 89S-92S

Vaněk, J. (1951). Atypická intersticiální pneumonie dětí, vyvolaná Pneumocystis carinii. Čas.

Lék. Čes. 90, 1121-1124.

Vaněk, J., Jírovec, O. (1952). Parasitaere Pneumonie, „Interstitielle“ Plasmazellenpneumonie

der Fruehgeborenen verursacht durch Pneumocystis carinii. Zbl. Bakt. Abt. I. Orig. 158, 120-

127.

Vaněk, J., Jírovec, O., Lukeš, J. (1953). Interstitial Plasma Cell Pneumonia in Infants.

Annales Pediatrici 188, 120-127.

van der Meer MG, Brug SL. 1942. Infection a Pneumocystis chez l’homme et chez les

animaux. Ann. Soc. Belge Med. Trop. 22:301–9

14

PNEUMOCYSTIS – MOŽNOSTI A ÚSKALÍ DIAGNOSTIKY

RNDr. Eva Nohýnková, PhD., Mgr. Ivana Zicklerová (Oddělení tropické medicíny Nemocnice Na Bulovce a 1. LF UK v Praze)

e-mail: enohy@lf1.cuni.cz

Odhalení Pneumocystis jirovecii (původně carinii) jako původce atypické plazmocytární

intersticiální pneumonie kojenců, která mezi roky 1920 – 1960 byla v Evropě zodpovědná za 20-

30% úmrtnost dětí v kojeneckém věku, patří mezi nejvýznamnější objevy prof. Otto Jírovce.

V současné době tvoří kojenci pouze velmi malý segment pacientů s pneumocystovou

pneumonií. Klinicky manifestní nákaza P. jirovecii však zůstává celosvětově závažným

onemocněním imunokompromitovaných osob.

Klasifikace pneumocystové pneumonie

Pneumocystová pneumonie (Pjp) je oportunní nákaza epidemiologicky řazená do

specifické skupiny pneumonií u imunokompromitovaných osob (pneumonia in

immunocompromised hosts - PIIH). Obecně je pneumonie akutní zánětlivé onemocnění, které

postihuje respirační bronchioly, alveoly a plicní intersticium (viz slovníček). Podle rozložení

zánětlivé reakce v plicní tkáni patří Pjp mezi intersticiální pneumonie: zánětlivý exudát se

nachází v plicním intersticiu. Hustý, nehnisavý zánětlivý infiltrát lokalizovaný

v interalveolárních septech je tvořen lymfocyty a plasmocyty: odtud zařazení mezi

lymfoplasmocytární pneumonie. Pro Pjp je charakteristické zaplnění alveolů surfaktantem

navázaným na pneumocysty adherující k výstelce alveolů. Tím je snížena kapacita alveolu pro

výměnu plynů.

Historie pneumocystové pneumonie a skladba pacientů

Epidemie atypické intersticiální pneumonie kojenců, později popsané díky průkazu

původce jako pneumocystová (Vaněk a Jírovec, 1952), začala plíživě sporadickými případy

v Německu v letech 1920-1940, postupně postihla několik tisíc dětí v řadě evropských zemí

včetně Československa a kulminovala mezi roky 1955-1959. Rizikovým faktorem byla nízká

porodní váha. Na začátku 60. let došlo k náhlému a rychlému ústupu počtu případů u dětí a

v následujících letech byla Pjp považovaná za velmi vzácnou infekci, která souvisí s imunitní

nedostatečností: ojedinělé případy se vyskytovaly sporadicky většinou u dospělých pacientů

s nádorovým onemocněním krve.

Na počátku 80. let - v souvislosti s nástupem pandemie nákazy virem lidské imunitní

nedostatečnosti (HIV) - se situace zásadně mění. Dochází ke strmému nárůstu počtu případů Pjp,

která se stává hlavní infekční komplikací osob nakažených virem HIV. V té době a v letech

následujících je pneumocystová pneumonie v popředí příčin úmrtí pacientů s AIDS. Ke změně

15

dochází koncem 80. let, kdy se jako součást péče o HIV+ pacienty zavádí v rozvinutých zemích

profylaktické podávání léků proti nákaze P. jirovecii. To vede o 10 let později k prvnímu

výraznějšímu snížení počtu případů Pjp v této skupině nemocných. Další snížení nastává ke

konci 90. let po zavedení vysoce účinné antiretrovirové léčby (highly active anti-retroviral

treatment - HAART), která brání poklesu pomocných CD4+ T lymfocytů pod kritickou hladinu,

při níž se manifestují oportunní infekce (200 buněk/µl krve). Avšak i přes významnou redukci

počtu případů během poslední dekády zůstává pneumocystová pneumonie závažnou oportunní

infekcí HIV+ osob. Na její aktuálnosti se ale stále častěji podílejí pacienti, kteří nejsou nakaženi

virem HIV, ale kterým jsou dlouhodobě podávány léky tlumící imunitu (imunosupresiva) buď

jako součást léčby základního onemocnění nebo jako součást předtransplantační přípravy a

posttransplantační péče (Reid et al. 2011; Striuk et al. 2011). Spektrum imunosupresivních léků a

jejich aplikace neustále roste. K pacientům se zvýšeným rizikem pneumocystové pneumonie

jsou tak v současnosti řazeni příjemci solidních orgánů, zejména ledvin a srdce, příjemci kostní

dřeně, pacienti s nádorovými onemocněními krve, především lymfoproliferativními, a

s některými typy solidních tumorů. Do této rizikové skupiny patří rovněž pacienti se

systémovými autoimunitními onemocněními. Důkazem je skladba nemocných s Pjp potvrzenou

průkazem P. jirovecii v naší laboratoři (Tab. 1). Ze 147 pacientů téměř 84% byli

imunokompromitovaní nemocní s neinfekčním základním onemocněním. Zatímco u HIV+ osob

koreluje riziko rozvoje Pjp s poklesem počtu CD4+ T lymfocytů, u jiných typů imunodeficitu

jakýkoliv laboratorní korelát chybí.

Tab. 1. Pacienti s pneumocystovou pneumonií podle skupinových diagnóz základní nemoci a)

Název skupiny Kód b) Počet pacientů Převažující základní onemocnění Infekční a parazitární nemoci A-B 24 HIV c) Novotvary C-D 55 lymfom, leukémie, myelom Nemoci krve a imunity D 9 aplastická anémie, SCID d)

Nemoci endokrinní a metabolické E 2 Nemoci oběhové soustavy I 7 ischemická choroba, (transplantace srdce) Nemoci dýchací soustavy J 28 e) Nemoci trávicí soustavy K 2 jaterní selhání Nemoci svalové a kosterní soustavy M 6 systémový lupus erythematosus,

Wegenerova granulomatóza Nemoci močové a pohlavní soustavy N 14 selhání ledvin, (transplantace ledvin)

a) tabulka zahrnuje údaje Oddělení tropické medicíny Fakultní nemocnice Na Bulovce a 1. LF UK z období XII. 2002 – III. 2012 b) skupinový kód podle Mezinárodní klasifikace nemocí c) 23 pacientů HIV+ (16 s nově zjištěnou HIV nákazou) d) vrozený těžký kombinovaný imunodeficit T a B lymfocytů (severe combined immunodeficiency) e) uveden je počet pacientů, u kterých není známa základní diagnóza

Historie laboratorní diagnostiky pneumocystové pneumonie

Laboratorní diagnostika pneumocystové pneumonie je založena na přímém průkazu

původce v plicních sekretech nebo tkáních. Během epidemie dětské intersticiální pneumonie, do

začátku 60. let minulého století, bylo hlavní diagnostickou metodou histologické vyšetření plicní

16

tkáně odebrané post mortem. K mikroskopickému průkazu Pneumocystis v sekčním materiálu

sloužila řada barvících technik (např. impregnace dle Grocotta prokazující cysty, Gomoriho

trichrom aj. Obr. 1), které se používají doposud. Od poloviny šedesátých let, kdy došlo

k výraznému poklesu incidence Pjp, byly sporadické případy diagnostikovány již intra vitam

díky pokroku v bronchoskopii, který umožnil omezený odběr materiálu z dolních cest dýchacích

za života pacienta. Základní diagnostickou metodou pro průkaz původce zůstala mikroskopie.

Od 80. let se stala rutinní bronchoskopickou technikou bronchoalveolární laváž (BAL)

(Hunninghake et al. 1979). Frakcionovaný výplach periferní oblasti dýchacích cest 100-200 ml

teplého fyziologického roztoku umožňuje postupnou aspirací získat 50-100 ml bronchoalveolární

tekutiny (BAT), která obsahuje materiál přímo z míst patologického působení pneumocyst

(Střičková, Kolaříková 2004). BAT byla zprvu, a je stále, používána k mikroskopickému

průkazu P. jirovecii. Od 90. let, kdy doktorka Wakefieldová zavedla PCR do diagnostiky Pjp

(Wakefield et al. 1990), i jako materiál pro izolaci DNA. Přes vysokou citlivost vyšetření BAT

pro průkaz P. jirovecii (uvádí se až 100%) její odběr není možný u všech pacientů s podezřením

na Pjp, neboť se jedná o invazivní zákrok. Jako alternativa k BAL byl zaveden odběr

indukovaného sputa (Turner et al. 2003).

Současné možnosti laboratorní diagnostiky pneumocystové pneumonie

Základem diagnostiky Pjp je odběr materiálu na základě podezření vysloveného na

podkladě klinického obrazu a zobrazovacího vyšetření. Laboratorní diagnostika Pjp je založena

na přímém průkazu původce. Nepřímý průkaz sérových protilátek se neprovádí. Pro přímý

záchyt P. jirovecii jsou používány obě výše zmiňované metody (1) mikroskopie a/nebo (2) PCR.

Všeobecně akceptovaný diagnostický algoritmus ale neexistuje.

Mikroskopický průkaz a jeho úskalí

Tradiční mikroskopické metody, které jsou založeny na morfologické identifikaci

vývojových stádií pneumocyst po obarvení (pro identifikaci cyst lze použít stříbření dle

Grocotta, Gram-Weigertovo barvení či barvení toluidinovou modří, pro identifikaci trofických

stádií se používá barvení dle Giemsa-Romanowski) jsou vysoce specifické, avšak jejich citlivost

jednoznačně závisí na druhu vyšetřovaného materiálu a kvalitě jeho odběru. Pro mikroskopický

průkaz lze použít sputum, indukované sputum (obojí po solubilizaci), tracheální aspirát a BAT.

Záchytností se ale liší: od nejvyšší v bronchoalveolární tekutině (80 – 95%; stav pacienta nemusí

umožnit odběr) po nejnižší v neindukovaném sputu (~ 25%) (neplatí absolutně). Toto omezení

neřeší ani metody založené na nepřímé imunofluorescenci s použitím specifické protilátky (např.

komerční kit Monofluo fy Bio-Rad), jejichž výhoda spočívá ve snadnějším nalezení pneumocyst

na preparátě. Nevýhodou je, že prokazují pouze cysty P. jirovecii a neumožňují případný nález

17

jiných patogenů. Výsledek mikroskopického vyšetření může být rovněž negativně ovlivněn

profylaktickým podáváním kotrimoxazolu nebo zahájením terapie před odběrem materiálu na

vyšetření. Negativní výsledek mikroskopického vyšetření proto nevylučuje pneumocystovou

pneumonii.

Průkaz pomocí PCR a jeho úskalí

Od roku 1990 se PCR jako diagnostická metoda pro průkaz Pjp rychle rozšířila. Jako

výchozí materiál lze použít sputum, indukované sputum, výplach dutiny ústní kloktáním

fyziologického roztoku (oral wash), tracheální aspirát, hrudní punktát, hrudní výpotek, výplach

bronchů, BAT, případně materiál získaný z kanyly. Přestože chybí konsensus, pro izolaci DNA

je obvykle používán komerční kit fy QIAGEN (QIAmp DNA Kit). Amplifikován je obvykle, ale

ne vždy, gen pro mtLSU rRNA. Značná variabilita je ve vlastním uspořádání reakce.

V současnosti je diagnostickými laboratořemi ve světě i u nás používána řada modifikací, často

typu in-house, počínajíc jednokrokovou kvalitativní PCR až po kvantitativní real-time PCR. Při

srovnání PCR a mikroskopie vychází PCR v jakémkoliv uspořádání jako citlivější metoda.

Na našem pracovišti jsme v letech 2002 až 2012 vyšetřili materiál na průkaz

pneumocystové pneumonie celkem od 1727 pacientů. Ve všech případech šlo o

imunokompromitované nemocné s důvodným podezřením na Pjp na základě klinického obrazu a

rentgenového nálezu. U 147 pacientů byla metodou jednokrokové PCR prokázána nákaza P.

jirovecii, ale pouze u 61 (41.5%) byla nákaza současně prokázána i mikroskopicky. Tato často

uváděná diskrepance může mít řadu příčin od falešné pozitivity PCR po nízkou citlivost

vyšetřovaného materiálu. Minimálně se ukazuje, na základě srovnání, že profylaktické podávání

kotrimoxazolu mikroskopický záchyt negativně ovlivňuje. Rovněž je zřejmé, že mikroskopické a

PCR vyšetření je třeba provádět souběžně u každého pacienta.

Kdo laboratorní diagnostiku pneumocystové pneumonie v ČR provádí

Současná situace je poměrně nepřehledná. Mikroskopická vyšetření provádějí některá

mikrobiologická pracoviště, zejména velkých a fakultních nemocnic (po zařazení Pneumocystis

mezi houby častěji mykologické než parazitologické laboratoře), některá z nich včetně PCR.

Vyšetření pouze pomocí PCR provádějí některé molekulárně biologické laboratoře. Žádný

ucelený přehled ale není k dispozici.

Literatura

-Carmona E, Limper AH (2011). Update on the diagnosis and treatment of Pneumocystis

pneumonia. Ther Adv Respir Dis 5:41-59

18

-Hunninghake GW, Gadek JE, Kawanami O, Ferrans VJ, Cyst RG (1979). Inflammatory and

immune processes in the human lung in health and disease: evaluation by bronchoalveolar

lavage. Am J Pathol 97:149-206

-Khot PD, Fredricks DN (2009). PCR-based diagnosis of human fungal infections. Expert Rev

Anti Infect Ther 7:1201-1221

-Reid AB, Chen SCA, Worth LJ (2011). Pneumocystis jirovecii pneumonia in non-HIV-infected

patiens: new risks and diagnostic tools. Curr Opin Infect Dis 24:534-544

-Struijk GH, Gijsen AF, Yong SL, Zwinderman AH, Geerlings SE, Lettinga KD, van Donselaar-

van der Pant KA, ten Berge IJ, Bemelman FJ (2011). Risk of Pneumocystis jiroveci pneumonia

in patiens long after renal transplantation. Nephrol Dial Transplant 26:3391-

-Střičková J, Kolaříková R (2004). Standardní postup při provádění bronchoalveolární laváže

(BAL) a vyšetřování bronchoalveolární tekutiny (BAT). Stud Pneumol Phtiseol 64:235-239

T-urner D, Schwarz Y, Yust I (2003). Induced sputum for diagnosing Pneumocystis carinii

pneumonia in HIV patiens: new data, new issues. Eur Respir J 21:204-208

-Wakefield AE, Pixley FJ, Banerji S, Sinclair K, Miller RF, Moxon ER et al. (1990). Detection

of Pneumocystis carinii with DNA amplification. The Lancet 336:451-453

Slovníček

Respirační bronchioly – terminální větve bronchiálního stromu, z nichž odstupují alveoly

Alveoly (plicní sklípky) - tenkostěnné váčky velikosti 200 µm. Alveolární výstelka (respirační

epitel) se skládá ze 2 typů buněk: (1) ploché, velmi tenké (25 nm) membranózní pneumocyty I.

typu tvoří 97% výstelky, (2) ovoidní pneumocyty II. typu přítomné solitérně ve výstelce

produkují surfaktant; proliferují a diferencují se na pneumocyty I. typu (obnova výstelky)

Plicní intersticium – vazivo zevně od alveolů mezi bazální membránou alveolární výstelky a

bazální membránou plicních endotelií

Surfaktant – vazký komplexní sekret složený z lipidů a proteinů, syntetizovaný pneumocyty II.

typu a sekretovaný do lumen alveolů

19

LEPTOSPIRY, LEPTOSPIRÓZY – POKROKY V DIAGNOSTICE MVDr. Zuzana Čermáková, Ph.D., Mgr. Petra Kučerová, Mgr. Ota Pavliš

(Ústav klinické mikrobiologie, UK v Praze, LF a FN v Hradci Králové,

Centrum biologické ochrany Těchonín, ÚVZÚ Praha)

e-mail: cermakovaz@fnhk.cz

Leptospiróza je celosvětově rozšířená zoonóza s prevalencí 0,1-100/100 000 obyvatel.

Výskyt je výrazně vyšší v oblastech s teplým a vlhkým klimatem, ale i v Evropě se onemocnění

vyskytuje. V České republice je uváděna prevalence 0,4/100 000; předpokládá se, že je ve

skutečnosti o něco vyšší. Na vyšší výskyt leptospirózy mají vliv především dva fenomény –

povodně a přemnožení hlodavců, ojedinělé případy zaznamenáváme po rizikovém chování. Po

povodních bývají i v Evropě a občas také v České republice vyšší lokální výskyty leptospirózy.

Počet vyšetřených pacientů a incidence leptospirózy v jednotlivých letech (2002-2009) v krajích:

Královéhradecký (HK), Pardubický (PA) a část kraje Vysočina (počet obyvatel cca 1 115 000):

Rok

Počet vyšetřených

pacientů

Počet pozitivních pacientů

Incidence (počet případů na 100 000 obyvatel)

2002 1 012 21 1,83 (povodně v ČR) 2003 773 11 0,96

2004 681 9 0,78

2005 763 25 2,17 (lokální povodně – HK, PA) 2006 523 6 0,52

2007 408 9 0,78

2008 285 2 0,17

2009 368 6 0,52

celkem 4813 89 -

K přenosu onemocnění dochází obvykle kontaktem s močí rezervoárových zvířat

(hlodavci, hmyzožravci, drobní savci, domácí zvířata) a k rizikovým aktivitám patří např.vodní

sporty, práce v povodněmi postiženém území, práce, při kterých dochází ke kontaktu

s rezervoárovými zvířaty nebo jejich exkrementy (úklid sklepů, práce v zemědělství) atd.

Inkubační doba onemocnění je obvykle 1- 4 týdny a klinické příznaky se pohybují od

mírných „chřipkovitých“, jako jsou bolesti hlavy, únava a zvýšená teplota, až po těžkou

hepatorenální insuficienci, která může být spojena s pneumonií až respiračním selháváním.

20

Soubor pacientů s prokázanou leptospirózou – klinické příznaky dle ošetřujících lékařů:

Klinické příznaky % Horečka 91,6

Bolesti hlavy 69,4 Jaterní léze 58,3

Déletrvající zvýšená teplota 38,8 Bolesti svalů 44,4

Bolesti kloubů 47,2 Nausea, zvracení, průjem 47,2 Alterace mentálního stavu 33,3

Renální příznaky 41,6 Respirační symptomy 30,5

Meningeální symptomy 30,5 Hepatorenálním selhávání 22,2

Krvácivost 13,9 Hepatosplenomegálie 13,9

Icterus 16,7 Kardiální příznaky 13,9

Oligurie 16,7 Urtikárie 5,6

Konjuncitivitida, světloplachost 13,9 Uveitis 8,3

Možnosti laboratorní diagnostiky 1. nepřímá diagnostika 1.1. nepřímá diagnostika – průkaz protilátek metodou (MAL, MAT)

Za „zlatý standard“ je v laboratorní diagnostice leptospir nepřímými metodami

považován mikroaglutinační test (MAL, MAT) s živými laboratorními kmeny leptospir.

Vzhledem ke skutečnosti, že detekovatelné množství protilátek je infikovaným hostitelem

tvořeno asi po 7 -10 dnech, je tento test velmi vhodný k následnému konfirmačnímu vyšetření a

určení sérovaru, ovšem v diagnostice akutního onemocnění hraje zanedbatelnou úlohu.

Principem je hodinová až dvouhodinová inkubace živých laboratorních kmenů s naředěným

sérem susp.pacienta. Odečet je prováděn mikroskopicky v temném poli – zpravidla hodnocen +

až +++, za viditelnou reakci je považována aglutinace více než 30% bakteriálních buněk

v zorném poli. Za pozitivní titr je považováno ředění 1:400 a více.

Z výše uvedených informací vidíme, že úloha MAT v diagnostice akutní formy

onemocnění byla vždy problematická, neboť nejenže protilátková odpověď nemocného hostitele

nastupuje po typickém „diagnostickém okně“, ale také hranice titru 1:400 je pro účel diagnostiky

21

akutní fáze diskutabilní, protože onemocnění i reakce se vyvíjejí a čím časnější přesnou

diagnostiku provedeme, tím nižší je sice titr, ale podstatně je větší benefit pro pacienta.

1.2. nepřímá diagnostika – EIA test (Serion)

K dispozici je v různých zemích několik EIA testů (Německo – Serion, Indie – Panbio…)

Díky podpoře grantového oddělení Armády České Republiky (AČR) jsme v rámci projektu

POV 907 980 – „Leptospiróza“ – vyhodnocení rizika a nové možnosti detekce, testovali EIA

soupravu firmy Serion na 1598 vzorcích krevních sér příslušníků AČR a pacientů. EIA souprava

detekuje IgM a IgG protilátky, ale je založena na detekci rodově specifických protilátek (antigen

L.biflexa), protože existuje velké množství patogenních sérovarů a je obtížné EIA test připravit.

Zřejmě vzhledem k této skutečnosti má nízkou specificitu a pro diagnostiku akutní formy

leptospirózy i konfirmační vyšetření je dle našeho názoru prakticky nepoužitelná.

V následující tabulce je uveden soubor testovaných sér od 45 pacientů FN Hradec Králové, na

kterém jsme rovněž soupravu vyzkoušeli a v tabulce č. 2 senzitivita, specificita, pozitivní

prediktivní hodnota a negativní prediktivní hodnota v naší studii a srovnání s dalšími autory.

Pro testování uvedených parametrů jsme použili soubor sér s MAT a klinicky konfirmovanou

leptospirózou, negativní séra, 5 krevních sér od pacientů s infekcí Treponema pallidum, séra

pacientů se sérologicky a klinicky konfirmovanou boreliózou a deset sér s protilátkami proti

některým infekčním agens (a pacientů se sclerosis multiplex), u nichž bývají zkřížené reakce

v EIA testech na průkaz protilátek proti boréliím:

22

Číslo pacienta

v souboru Pohlaví Věk

Výsledky klinické a sérologické konfirmace

Další sérologicky prokázané

infekce

Výsledek MAT patogenní leptospiry

Výsledek MAT L. biflexa Patoc

Výsledek ELISA IgM

Výsledek ELISA IgG

1. ♂ 40 Leptospira + - Pozitivní 1 : 800 pozitivní Pozitivní Pozitivní 2. ♂ 28 Leptospira + - Pozitivní 1 : 200 hraniční Pozitivní Pozitivní 3 ♂ 62 Leptospira + - Pozitivní 1 : 200 hraniční Pozitivní Pozitivní 4. ♂ 66 Leptospira + - Pozitivní 1 : 400 pozitivní Pozitivní Pozitivní 5. ♂ 48 Leptospira + - Pozitivní 1 : 800 pozitivní Pozitivní Pozitivní 6. ♂ 50 Leptospira + CMV + Pozitivní 1 : 400 pozitivní Pozitivní Pozitivní 7. ♂ 60 Leptospira + HBS AB + Pozitivní 1 : 400 pozitivní Pozitivní Pozitivní 8. ♂ 25 Leptospira + - Pozitivní 1 : 200 hraniční Pozitivní Pozitivní 9. ♂ 53 Leptospira + - Hraniční 1 : 200 hraniční Pozitivní Pozitivní

10. ♂ 32 Leptospira + - Pozitivní 1 : 400 pozitivní Pozitivní Pozitivní 11. ♂ 56 Leptospira - - Negativní Negativní Negativní Pozitivní 12. ♂ 22 Leptospira - - Negativní Nd Negativní Negativní 13. ♂ 21 Leptospira - CMV + Negativní Nd Negativní Negativní 14. ♂ 37 Leptospira - - Negativní Nd Negativní Negativní 15. ♂ 43 Leptospira - - Negativní Nd Negativní Negativní 16. ♀ 35 Leptospira - - Negativní Negativní Negativní Pozitivní 17. ♀ 19 Leptospira - - Negativní Negativní Negativní Pozitivní 18. ♂ 75 Leptospira - - Negativní Negativní Negativní Pozitivní 19. ♀ 50 Leptospira - - Negativní Nd Negativní Negativní 20. ♀ 54 Leptospira - - Negativní Negativní Pozitivní Negativní 21 ♂ 25 Tr. Pallium + - Negativní Negativní Negativní Pozitivní 22. ♂ 28 Tr. Pallium + - Negativní 1 : 200 hraniční Negativní Pozitivní 23 ♂ 45 Tr. Pallium + - Negativní Nd Negativní Negativní 24. ♂ 32 Tr. Pallium + - Negativní Negativní Negativní Pozitivní 25. ♂ 36 Tr. Pallium + - Negativní Nd Negativní Negativní 26. ♂ 82 Borellia + - Negativní Negativní Negativní Pozitivní

23

Číslo pacienta souboru

Pohlaví Věk Výsledky klinické a

sérologické konfirmace

Další sérologicky prokázané

Infekce

Výsledek MAT patogenní leptospiry

Výsledek MAT L. biflexa Patoc

Výsledek ELISA IgM

Výsledek ELISA IgG

27. ♀ 45 Borrelia + - Negativní Negativní Negativní Pozitivní 28. ♀ 40 Borellia + - Negativní Negativní Negativní Pozitivní 29. ♂ 66 Borellia + Negativní Negativní Negativní Pozitivní 30. ♂ 48 Borellia + KEG + Negativní Nd Negativní Negativní 31. ♀ 41 Borellia + - Negativní Nd Negativní Negativní 32. ♀ 50 Borellia + - Negativní Nd Negativní Negativní 33. ♂ 44 Borellia + - Negativní 1 : 200 Negativní Pozitivní 34. ♀ 50 Borellia + HAVG Negativní Negativní Negativní Pozitivní 35. ♀ 66 Borellia + - Negativní Negativní Negativní Pozitivní 36. ♂ 61 CMV +, HSV + VCAG, VZVG Negativní Nd Negativní Negativní 37. ♀ 59 RS + - Negativní Nd Negativní Negativní 38. ♂ 44 CMV + Chlamydia + Negativní Nd Negativní Negativní 39. ♀ 42 RS + - Negativní 1 : 100 Pozitivní Negativní 40. ♀ 35 CMV + HSVG Negativní Nd Pozitivní Negativní 41. ♂ 21 HSV+, VZV+ Negativní Nd Negativní Negativní 42. ♂ 28 Chlamydia + VCAG Negativní Nd Negativní Negativní 43. ♀ 18 CMV + VCAG Negativní Negativní Pozitivní Negativní 44. ♀ 59 Chlamydia + BBG Negativní Negativní Negativní Pozitivní 45. ♀ 50 Chlamydia + BBG Negativní Negativní Negativní Pozitivní

Vysvětlivky: BBG - IgG protilátky proti borréliím VCAG- IgG protilátky proti viru varicelly CMV - cytomegalovirus VZVG- IgG protilátky proti varicella zoster viru HAVG - IgG protilátky proti viru hepatitidy A Nd - nevyšetřeno HBS AB- protilátky proti australskému antigenu HSVG - IgG protilátky proti herpes simplex viru KEG - IgG protilátky proti viru klíšťové encefalitidy RS - roztroušená skleróza

24

Porovnání výsledků diagnostické senzitivity, specificity, PPV, NPV soupravy SERION ELISA

classic IgM/IgG s dalšími studiemi:

2. přímý průkaz původce

2.1. kultivační průkaz – tekutá média, polotuhá média, kultivace je zdlouhavá (generační čas

v hodinách), nesterilní biologický materiál (moč) přerůstají rychle se množící bakterie… metoda je

zastaralá tam, kde je možné využít PCR.

2.2. – mikroskopie v temném poli – rovněž se již nepoužívá, pokud je k dispozici průkaz DNA.

2.3. průkaz DNA patogenních leptospir metodou PCR

Na našem pracovišti (pracovištích) jsou k dispozici prakticky 2 typy průkazu DNA patogenních

leptospir:

A) Průkaz DNA patogenních leptospir ve dvou standardních PCR reakcích. První PCR (In-house) je

pro průkaz 7 genetických druhů patogenních leptospir, primery G1/G2 (z oblasti genu SecY) a pro

průkaz DNA L.kirschneri (L. grippotyphosa) je nutné použít druhou PCR s odlišnými primery B64-

1/ B64-2 (oblast genu pro chromosom 9).

Využíváme již osm let, mez detekce cca 2,5 – 10 leptospir, konfirmační vyšetření metodou MAT –

dourčení infikujícího sérovaru z epidemiologických důvodů.

B) Průkaz DNA patogenních leptospir PCR metodou – detekce genu lipL32, kódujícího povrchový

lipoprotein LipL32, který je přítomen pouze u patogenních leptospir.

Real time PCR (In-house), používáme od roku 2010, mez detekce 2,5 – 10 bakterií.

V rámci projektu AČR POV 907 980 jsme měli možnost vyšetřit 267 laboratorních kmenů

(odpovídá 260 sérotypů) patogenních a nepatogenních leptospir ze sbírky Royal Tropical Institute,

WHO/FAO/OIE and National Collaborating Centre for Reference and Resaerch on Leptospirosis,

Meibergdreef 39, 1105 AZ Amsterdam, The Netherlands.

Naše studie (2011) Honarmand a kol. (2010) Panwala a kol. (2011)

Effler a kol. (2002)

IgM (%) IgG (%) IgM (%) IgG (%) IgM (%) IgM (%)

Senzitivita 100,0 100,0 100 84,0 96,2 43

Specificita 88,6 54,3 43,0 77,0 88,1 98

PPV 71,4 38,5 37,0 55,0 88,4 86

NPV 100,0 100,0 100,0 94,0 96,7 85

25

Testování potvrdilo možnost využití nově zavedené PCR diagnostiky (Real time PCR

pro LipL32 gen) patogenních leptospir v laboratorní praxi – kmeny certifikované Institutem jako

patogenní byly PCR pozitivní a kmeny certifikované jako nepatogenní byly uvedenou metodou

negativní.

Metodu jsme zavedli do rutinního laboratorního provozu v dubnu 2010 a do prosince

roku 2011 bylo vyšetřeno 216 pacientů s podezřením na akutní leptospirózu, z toho bylo 8 osob

vyhodnoceno jako pozitivní (3,70%).

Praktické využití PCR metod pro diagnostiku leptospirózy je velmi citlivé na preanalytickou fázi

vyšetření:

2.4. Doporučení k odběru biologických materiálů

Leptospira je bakterie dobře citlivá na většinu antibiotik a proto po zahájení

účinné antibiotické terapie relativně rychle mizí pozitivita v PCR, neboť bakterie se

rozpadají a imunitní systém likviduje jejich zbytky, včetně DNA. Je nutné odebírat

vzorky biologických materiálů co nejdříve po vyslovení podezření na leptospirózu,

nejlépe před započetím antibiotické terapie, popř. do 24 – maximálně do 48 hodin

po jejím zahájení (po 48 hodinách však signál v PCR může být negativní, ačkoliv

v organismu leptospiróza probíhá, nejdéle bývá pozitivní reakce z moči).

2.6. Časová posloupnost odběrů biologických vzorků:

I) V prvních dnech odebíráme především nesrážlivou krev (EDTA, citrát).

NIKDY NE heparin (inhibuje PCR reakci)!!!.

II) Ve druhém týdnu (cca 5-7 dní od počátku klinických příznaků) odebíráme

pokud možno moč i nesrážlivou krev (EDTA, citrát).

Při meningeálních příznacích lze vyšetřit DNA patogenních leptospir

z likvoru.

III) Po více než 7-10 dnech od počátku klinických příznaků (bez účinné ATB

terapie) pak lze prokázat DNA patogenních leptospir především v moči.

IV) Dle našich zkušeností při ATB terapii přetrvává pozitivní nález

nejdéle v moči – cca 48 hodin.

2.7. Uchování biologického materiálu:

3) Materiál (nesrážlivá krev, plazma, moč, likvor) je nutno uchovávat v chladničce, při 4

°C, a pokud možno do 24 hodin dopravit na pracoviště, kde je prováděno vyšetřování

vzorků metodou PCR nebo provést izolaci DNA.

26

4) Uhynulá zvířata – orgány ze zvířat (především ledviny) lze vyšetřovat, ovšem je

zapotřebí, aby materiál byl odebrán čerstvý – do několika hodin po úhynu, neboť

bakterie rodu leptospira jsou velmi citlivé na změny pH ( především ke kyselému

pH), a rychle v kadáverech hynou a rozkládají se.

Literatura

1. Gravekamp C., Van de Kemp H., Franzen M., Carrington D., Schoone G.J., Van Eys G.J.,

et al., Detection of Seven of Pathogenic Leptospires by PCR Using Two Sets of Primers, J.

Gen. Microbiol., 1993, 139, 1691-1700

2. Levett P.N., Morey R.E., Galloway R.L., Turner D.E., Steigerwalt A.G., Mayer L.W.,

Detection of pathogenic leptospires by real-time quantitative PCR, J. Med. Microbiol., 2005, 54,

45-49

Práce byly podporovány projektem obranného výzkumu AČR:

POV 907 980 – „Leptospiróza“ – vyhodnocení rizika a nové možnosti detekce.

TRICHOMONAS VAGINALIS: PŘÍNOS PROFESORA JÍROVCE A JEHO

NÁSLEDOVNÍKŮ Prof. RNDr. Jaroslav Kulda, CSc. (Katedra parazitologie PřF UK v Praze)

e-mail: kulda@natur.cuni.cz

Jednou z oblastí, kde poznatky profesora Jírovce dosáhly mezinárodního významu, je i

výzkum původce urogenitální trichomonózy, prvoka Trichomonas vaginalis. Touto

problematikou se zabýval v období 1939-1956. Jeho výzkum byl zaměřen na druhovou identitu

původce poševní trichomonózy, jeho patogenitu, způsob přenosu a dynamiku infekce, klasifikaci

mikrobních obrazů poševních a lokální chemoterapii trichomonózy. Výsledky, kterých na tomto

poli spolu se svými spolupracovníky dosáhl, byly pak shrnuty v konfrontaci s poznatky z jiných

laboratoří v kritickém review, které publikoval společně s dr. M. Petrů v Advances of

Parasitology v roce 1968 (Vol. 9:117-188).

Přestože pařížský anatom A.F. Donné roku 1836 nalezl a popsal druh Trichomonas

vaginalis v poševním výtoku ženy trpící zánětem pochvy a Höhne roku 1916 formálně stanovil

27

trichomonádovou kolpitis jako klinickou jednotku, přetrvávaly kontraverze o patogenitě a zvláště

o přenosu této infekce až do padesátých let minulého století. Pověry o možnosti získat tuto

infekci při koupání, o možnosti přenosu infekce pomocí rezistentních stádií (cyst) nebo o

zanesení střevních trichomonád do vagíny dlouhodobě přežívaly v podvědomí lékařů i v odborné

literatuře.

V letech 1939-42, kdy po zavření českých vysokých škol pracoval prof. Jírovec ve

Státním zdravotním ústavu, publikoval ve spolupráci s gynekology a mikrobiology několik prací,

které podaly přesvědčivé důkazy o identitě druhu Trichomonas vaginalis a jeho odlišnosti od

dalších trichonád nalézaných ve střevě (Pentatrichomonas hominis) nebo ústní dutině člověka

(Trichomonas tenax). Ukázal také, že trichomonády nevytvářejí rezistentní cysty umožňující

dlouhodobé přežívání v nepříznivých podmínkách a že sexuální styk je přirozenou a za

normálních podmínek jedinou cestou infekce. Společně s profesorem Peterem a dalšími

gynekology pak sledovali výskyt trichomonád u různých věkových skupin žen a ve vztahu

k estrogenizaci poševní sliznice. Sledovali dále dynamiku trichomonádové infekce a ukázali, že

po akutní fázi zpravidla přechází do fáze chronické až latentní, nedochází však k její spontánní

eliminaci a může pod vlivem různých podmětů exacerbovat. Společně s Peterem a Málkem pak

navrhli klasifikaci mikrobních poševních obrazů (I-VI), která umožňuje orientační morfologické

posouzení stavu poševní sliznice a biocenózy ve vztahu k infekčním agens (1947-1950). Toto

hodnocení bere v úvahu množství a typ epitelových buněk, množství leukocytů, přítomnost nebo

nepřítomnost Döderleinova laktobacila nebo jiných bakterií a morfologicky identifikovatelných

patogénů (Trichomonas, Candida). Tato klasifikace v kombinaci s kultivačním vyšetřením a

specifickými diagnostickými testy se používá dodnes.

Peter a Jírovec také navrhli kombinované lokální léčivo proti poševní trichomonóze

(1946,1947) obsahující složky bakteriostatické (sulfathiazol), trichomonocidní (carbazon nebo

jodchinoliny), mykocidní (kyselina boritá) a laktózu pro stimulaci Döderleinova lactobacila. Na

tomto základě vyrábělo účinné léky několik firem pod názvy Triflocid, Fluocid (Spofa), Viozol

(Ciba), Tricolpon (Organon) aj., které byly v klinickém použití až do zavedení metronidazolu a

dalších 5-nitroimidazolů vhodných k perorální léčbě po roce 1960.

V roce 1952 založil profesor Jírovec laboratoř klinické parazitologie Fakultní nemocnice

I, která byla po dlouhou dobu v areálu parazitologického pracoviště PřF UK. Diagnostika

trichomonózy byla nedílnou součástí této laboratoře a prováděla se v ní i ambulantní vyšetření a

odběry materiálu od pacientek s podezřením na trichomonózu nebo vaginální mykózy.

Přítomnost této laboratoře tak stimulovala parazitology dalších generací k výzkumu

trichomonád.

V letech 1962-1965 jsem pracoval jako postgraduální student („vědecký aspirant“)

v Protozoologické laboratoři ČSAV založené profesorem Jírovcem. Tato laboratoř byla posléze

28

začleněna pod jiným vedením do Parazitologického ústavu ČSAV, profesor Jírovec však zůstal

mým školitelem. Tématem mé disertační práce byla srovnávací studie o trichomonádách se

zvláštním zřetelem na druhy patogenní pro lidi a zvířata, včetně Trichomonas vaginalis. Zabýval

jsem se kultivačními technikami, axenizací a klonováním kultur a jejich kryoprezervací, což byla

v té době novinka. Podstatnou částí disertace bylo i testování virulence izolátů trichomonád na

myších a tkáňových kulturách. V roce 1966 mi nabídl profesor B. M. Honigberg, známý

americký protozoolog a znalec trichomonád, postdoktorské stipendium v jeho laboratoři na

Universitě státu Massachusetts. Vzhledem k příznivému období v předjaří „Pražského jara“ bylo

mi povoleno nabídku přijmout a v roce 1967 do USA vycestovat. Hlavní náplní mé práce v USA

bylo studium virulence trichomonád a jejich interakce s buněčnými kulturami.

Po návratu v roce 1969 mi nabídl profesor Jírovec místo v Zoologickém ústavu

Přírodovědecké fakulty, jehož byl tehdy ředitelem. Tuto nabídku jsem bez váhání přijal a stal

jsem se tak jeho posledním asistentem, bohužel jen na krátkou dobu, protože v roce 1972 zemřel.

Krátce po návratu z USA jsem zamýšlel pokračovat ve studiu patogenity Trichomonas vaginalis

a jako základ tohoto výzkumu jsme společně s mými tehdejšími studentkami (H. Nedvědová a

M. Dohnalová) a ve spolupráci s Laboratoří klinické parazitologie (dr. M. Vojtěchovská, dr. E.

Kunzová) a 1. gynekologickou klinikou (dr. M. Zavadil, dr. I. Karásková) Fakultní nemocnice I

testovali soubor čerstvých izolátů T. vaginalis různými virulenčními testy na myších a

porovnávali tyto výsledky s klinickým nálezem a histopatologickým vyšetřením biopsie

z děložního hrdla pacientek. Tyto výsledky byly později doplněny pokusy na tkáňových

kulturách a elektronovou mikroskopií trichomonád z experimentálních infekcí, které potvrdili

ameboidní transformaci trichomonád po kontaktu s hostitelskou tkání. Soubor 25

charakterizovaných kmenů trichomonád z této studie je uložen v kryobance katedry parazitologie

PřF UK a předpokládám, že ještě poslouží k dalšímu výzkumu patogenity trichomonád.

Hlavní směr výzkumu trichomonád na PřF UK se však obrátil jiným směrem. Na začátku

sedmdesátých let minulého století jsme se sblížili s biochemiky Jiřím a Apolenou

Čerkasovovými a společně s našimi studenty jsme se vydali na vzrušující cestu objevování a

biochemické charakterizace nových buněčných organel trichomonád, hydrogenosomů. Při této

práci postupně vznikala neformální skupina, sdružující studenty dvou různých kateder,

fyziologie a parazitologie a stipendisty z Parazitologického ústavu ČSAV, která se stala

základem dnešní Laboratoře biochemické a molekulární parazitologie. Prioritním výsledkem této

éry bylo zjištění, že hlavní metabolická dráha hydrogenosomů produkuje ATP a přispívá tak k

energetické bilanci buňky. Jako model pro tyto biochemické experimenty jsme používali

především druh Tritrichomonas foetus, původce bovinní trichomonózy. K T. vaginalis jsme se

však vrátili v souvislosti se studiem rezistence k metronidazolu. Ukázalo se totiž, že účinek

metronidazolu na trichomonády je aktivován v hydrogenosomech, kde působí jako preferenční

29

akceptor elektronů generovaných při metabolismu pyruvátu nebo malátu, jejichž přenos na nitro-

skupinu léčiva vede k uvolňování cytotoxických radikálů. Potlačení nebo odpojení

hydrogenosomálního metabolismu tak vede k navození rezistence k 5-nitroimidazolovým

léčivům. V letech 1988 až 2002 jsme uveřejnili řadu publikací zaměřených na biochemické

vlastnosti rezistentních kmenů, rozdíly mezi aerobním a anaerobním typem rezistence, navození

rezistence in vitro a monitorování změn, které vývoj rezistence provázejí i na standardizaci testů

pro detekci rezistence klinických izolátů T. vaginalis.

Studium trichomonád na PřF UK pokračuje i v současnosti. Členové týmu Laboratoře

molekulární a biochemické parazitologie, kterou dnes vede prof. Jan Tachezy, se podíleli na

genomovém projektu Trichomonas vaginalis a využívají poznatků tohoto projektu k hlubšímu

pochopení molekulárních zákonitostí funkce buňky trichomonád. Tradice výzkumu iniciovaného

profesorem Jírovcem tedy žije i v postgenomické éře.

TRICHOMONÁDY V RESPIRAČNÍM TRAKTU ČLOVĚKA RNDr. Ivan Čepička, PhD. (Katedra zoologie PřF UK v Praze)

e-mail: cepicka@natur.cuni.cz

Co jsou trichomonády

Trichomonády (kmen Parabasalia) jsou významná skupina bičíkatých prvoků. Většina

z přibližně 450 dosud popsaných druhů trichomonád jsou kooperativní symbionti termitů,

několik desítek druhů žije jako střevní komenzálové obratlovců. Je známo i několik volně

žijících druhů. Pouze několik zástupců trichomonád je patogenních pro člověka a domácí zvířata,

obvykle jsou to druhy, které unikly ze střeva do jiných orgánů. Většina druhů trichomonád

včetně všech druhů nalezených v člověku netvoří cysty ani jiná odolná stádia a trofozoiti ve

volném prostředí poměrně rychle umírají. Pro přenos mezi hostiteli je proto obvykle důležitý

blízký kontakt.

Lidské trichomonády

Nepočítáme-li nálezy v plicích a pleurální dutině (viz dále), bylo u člověka nalezeno pět

druhů trichomonád. Nejznámějším a nejvýznamnějším druhem je parazit urogenitálního traktu

Trichomonas vaginalis způsobující lidskou urogenitální trichomonózu. Mezi lidmi se přenáší

téměř výhradně pohlavním stykem. Příbuzný druh T. tenax žije v ústní dutině. Jeho význam pro

30

člověka je nejasný, pravděpodobně půjde o komenzála. Častěji se vyskytuje u osob se sníženou

zubní hygienou a u pacientů s chronickou periodontitidou. Mezi lidmi se přenáší slinami.

Z lidského tlustého střeva byly popsány tři druhy trichomonád. Trichomitus fecalis nemá žádný

význam, protože byl nalezen pouze jednou a není o něm téměř nic známo. Pentatrichomonas

hominis je pravděpodobně komenzál a kromě člověka se vyskytuje v tlustém střevu celé řady

dalších savců. Konečně Dientamoeba fragilis je zvláštní měňavkovitá trichomonáda, která

ztratila bičíky. Pro lidi je patogenní a způsobuje průjmovitá onemocnění. Přenos střevních

trichomonád se děje fekálně-orální cestou, u D. fragilis se spekuluje i o roli roupa dětského.

Nálezy trichomonád v lidském respiračním traktu

Ačkoli dolní cesty dýchací nejsou typickým místem výskytu trichomonád, během

posledních zhruba padesáti let byla publikována pestrá sbírka několika desítek nálezů

trichomonád v plicích a hrudním empyému. Dříve byly tyto nálezy celkem logicky přisuzovány

druhu Trichomonas tenax žijícímu normálně v ústní dutině. S rozvojem diagnostiky se však

ukázalo, že trichomonády izolované z lidských dolních cest dýchacích náleží nejméně do sedmi

druhů. Kromě Trichomonas tenax se jedná o Trichomonas vaginalis, Pentatrichomonas hominis,

Tetratrichomonas gallinarum, Tetratrichomonas sp. „LP“, Tritrichomonas foetus a Lophomonas

blattarum. Nálezy těchto druhů byly poměrně nečekané, protože se o většině z nich dříve

soudilo, že se jimi člověk nemůže vůbec nakazit. Smejkalová et al. (2012) však zjistili, že

primáti, mezi které člověk patří, ve svém tlustém střevu hostí široké spektrum střevních

trichomonád jiných živočichů.

O druhu Trichomonas vaginalis se dlouho soudilo, že nemůže dlouhodobě přežívat mimo

urogenitální trakt. Dnes je však známo více jak deset případů nákazy dýchacího traktu člověka

(viz Carter a Whithaus 2008). Jak již bylo zmíněno, Pentatrichomonas hominis je střevní

komenzál člověka a dalších savců včetně hospodářských zvířat, člověk se tedy s infekcí může

běžně setkat. Nákaza respiračního traktu druhem P. hominis je však velmi vzácná, např.

Jongwutiwes et al. (2000) našli tento druh v pleurální efuzi. Tetratrichomonas gallinarum je

běžný střevní komenzál ptáků včetně drůbeže. Všechny známé případy lidské nákazy tímto

druhem pocházejí z Estonska a byly izolovány z ústní dutiny nebo průdušek (Kutisova et al.

2005). Dosud nepopsaný druh Tetratrichomonas sp. „LP“ byl nalezen v hrudním empyému

jediné pacientky (Mantini et al. 2009). O tomto druhu není známo téměř nic, ani to, od kterých

hostitelů se člověk může nakazit. Tritrichomonas foetus je veterinárně významný původce

bovinní urogenitální trichomonózy. Kromě urogenitálního traktu skotu se vyskytuje v trávicím

traktu a nosní dutině (!) prasat a v posledních letech se ukazuje, že je to běžný střevní parazit

koček způsobující průjmovité onemocnění. Tento druh byl jednou nalezen v plicích pacientky

s pneumocystovou pneumonií (Duboucher et al. 2006a). Druh Lophomonas blattarum je

31

specializovaný symbiont zadního střeva švábů. I přesto byl opakovaně nalezen ve sputu

astmatických a imunosuprimovaných pacientů (viz Martínez-Girón a Doganci 2010).

Způsob infekce

Ačkoli o vstupu trichomonád do dolních cest dýchacích můžeme pouze spekulovat, je

velmi pravděpodobné, že obvykle je nejprve infikována ústní dutina. Do dolních cest dýchacích

se trichomonády nejsnáze dostanou vdechnutím orofaryngeálního sekretu. Hematogenní

diseminace z jiných orgánů je u druhů nalezených v člověku nepravděpodobná, zdokumentován

byl příklad pravděpodobného rozsevu Pentatrichomonas hominis ze subfrenického a jaterního

abscesu do hrudní dutiny (Hersh 1985).

Protože Trichomonas tenax se přirozeně vyskytuje v ústní dutině, nákaza je dlouhodobá a

je to celosvětově rozšířený a poměrně běžný organismus, je to logicky i nejčastější trichomonáda

nalézaná v lidských plicích. Trichomonády druhu T. vaginalis se do ústní dutiny dostane

prostřednictvím orálně-genitálního styku, novorozenci se nakazí od matky při porodu, obzvláště

v případech předčasné ruptury amnia (viz Carter a Whithaus 2008). Způsob nákazy ostatními

druhy trichomonád nalezených v lidských plicích je nejistý. Všechno to jsou komenzálové

zadního střeva různých živočichů, lze tedy očekávat fekálně-orální přenos s následnou

kolonizací ústní dutiny. Dolní cesty dýchací mohou být zřejmě infikovány i přímo, vdechnutím

částeček fekálií obsahujících trofozoity. U druhu Pentatrichomonas hominis, který jediný

z těchto druhů je znám i z lidského tlustého střeva, lze uvažovat i o orálně-análním přenosu,

podobně jako např. u Giardia intestinalis nebo Cryptosporidium parvum. U lidských nákaz

druhem Tetratrichomonas gallinarum byl hledán zdroj infekce u různých druhů drůbeže, bylo

však zjištěno, že lidské izoláty představují samostatné genotypy a zdroj infekce nebyl

identifikován (Cepicka et al. 2005).

Patologie

Role trichomonád v respiračních onemocněních je dosud zcela neznámá. Přitom mohou

být trichomonády poměrně běžné v plicích nebo pleurální dutině pacientů s různě závažnými

respiračními chorobami. Duboucher et al. (2007a, b) našli trichomonády u 60 % pacientů

trpících pneumocystovou pneumonií (u těžkých infekcí byla prevalence trichomonád dokonce

100 %) a u 30 % pacientů s ARDS (syndrom akutní dechové tísně dospělých). Protože jsou

trichomonády mikroaerofilní, je vznik mikrooxického prostředí v postižených plicích kritickou

podmínkou pro možnost infekce. Stejně důležitá pro přežívání a množení trichomonád v plicích

a pleurální dutině je přítomnost bakterií, kterými se trichomonády živí. Zdá se tedy, že ve většině

případů jsou trichomonády spíše oportunisti kolonizující již oslabené plíce. Podobně, většina

nálezů trichomonád v pleurální efuzi (od roku 1966 zdokumentováno na 17 pacientech) byla

32

z pacientů oslabených nádorovými onemocněními, imunosupresivní terapií nebo alkoholismem

(viz Leterrier et al 2012). Není jisté, zda jsou trichomonády schopné zhoršovat stav pacienta

popř. zpomalovat zotavení, např. mechanismem tvorby lézí.

Diagnostika

Základní diagnostickou metodou pro výskyt trichomonád v respiračním traktu člověka je

mikroskopické vyšetření tekutin (bronchoalveolární tekutina, sputum, pleurální výpotek).

Trofozoiti trichomonád jsou pohybliví a dobře patrní již v nativním preparátu. Přitom je potřeba

dávat pozor na záměnu s uvolněnými buňkami obrveného epitelu (viz Martínez-Girón et al.

2011; Qiang et al. 2011). Buňky druhu Trichomonas tenax však v plicích procházejí améboidní

transformací, kdy ztratí bičíky a další struktury typické pro trichomonády a adherují k epitelu

(Duboucher et al. 2006b). Protože buňky druhu Trichomonas vaginalis procházejí obdobnou

transformací v prostředí urogenitálního traktu, lze očekávat, že se podobně chovají i v prostředí

plic. V nativních preparátech proto nemusí být pohyb trofozoitů patrný. Vhodná jsou různá

barvení, nejčastěji se používá barvení dle May-Grünwald-Giemsa, kdy lze oválná jádra

trichomonád poměrně dobře odlišit od jader buněk hostitele. Pomocí této metody však prakticky

není možná spolehlivá determinace přítomných trichomonád. I když jednotlivé druhy

trichomonád (včetně blízce příbuzných Trichomonas vaginalis a Trichomonas tenax) lze od sebe

při vhodném barvení morfologicky dobře odlišit, v současné době to zvládne pouze několik

specialistů. Byly vyvinuty i imunohistochemické a FISH metody (Duboucher et al. 2007) pro

detekci trichomonád, ty však dosud nejsou příliš rozšířené a vzhledem k obrovskému spektru

nepříbuzných trichomonád infikujících lidský respirační trakt je jejich použití problematické.

V úvahu přicházejí i kultivační metody, ale jejich použití je opět limitováno faktem, že se

jednotlivé druhy trichomonád liší kultivačními nároky. Nejlepší diagnostická metoda je založena

na PCR a sekvenční analýze ITS regionu nebo SSU rDNA, pomocí které lze nejenom potvrdit

přítomnost i malého počtu buněk trichomonád ve vzorku, ale lze také přesně určit zjištěné

trichomonády (např. Jongwutiwes et al. 2000; Cepicka et al. 2006). Je navíc natolik univerzální,

že do budoucna zaručuje i identifikaci druhů, které dosud nebyly v člověku nalezeny. Problém

je, že tato metoda dosud nebyla plošně zavedena.

I když se nálezy trichomonád v lidském respiračním traktu rychle množí, je zjevné, že

většina infekcí projde nepovšimnuta. Přestože je patogenní potenciál plicních trichomonád dosud

nejasný, měla by být jejich diferenciální diagnostika zvažována u pacientů trpících závažnými

respiračními onemocněními a pacienti pozitivní na trichomonády by měli být přeléčeni.

33

Terapie

Lékem první volby při léčení plicních infekcí trichomonádami je metronidazol nebo

tinidazol (viz Martínez-Gíron et al. 2008). Z terapeutického hlediska nezáleží na konkrétním

druhu trichomonády, všechny druhy jsou citlivé na obě látky. I když dosud nebyly hlášeny

případy rezistence plicních trichomonád na metronidazol, jsou známy rezistentní kmeny druhu

Trichomonas vaginalis izolované z urogenitálního traktu. Pacientky nakažené rezistentními

kmeny se podařilo vyléčit buď zvýšenou dávkou metronidazolu, anebo změnou terapie na

ornidazol nebo tinidazol (viz Kulda 2002; Bachmann et al. 2011). Jiné léčebné postupy

nepřinesly jednoznačné výsledky.

Literatura

Bachmann LH, Hobbs MM, Seña AC, Sobel DJ, Schwebke JR, krieger JN, McClelland RS,

Workowski KA (2011) Trichomonas vaginalis genital infections: progress and

challenges. Clin Infect Dis 53: S160-S172

Carter JE, Whithaus KC (2008) Neonatal respiratory tract involvement by Trichomonas

vaginalis: a case report and review of the literature. Am J Trop Med Hyg 78: 17-19

Cepicka I, Kutišová K, Tachezy J, Kulda J, Flegr J (2005) Cryptic species within the

Tetratrichomonas gallinarum species complex revealed by molecular polymorphism.

Veter Parasitol 128: 11-21

Cepicka I, Hampl V, Kulda J, Flegr J (2006) New evolutionary lineages, unexpected diversity,

and host specificity in the parabasalid genus Tetratrichomonas. Mol Phylogenet Evol 39:

542-551

Duboucher C, Caby S, Dufernez F, Chabé M, Gantois N, Delgado-Viscogliosi P, Billy C, Barré

E, Torabi E, Capron M, Pierce RJ, Dei-Cas E, Viscogliosi E (2006a) Molecular

identification of Tritrichomonas foetus-like organisms as coinfecting agents of human

Pneumocystis pneumonia. J Clin Microbiol 44: 1165-1168.

Duboucher C, Caby S, Pierce RJ, Capron M, Dei-Cas E, Viscogliosi E (2006b) Trichomonads as

superinfecting agents in Pneumocystis pneumonia and acute respiratory distress

syndrome. J Eukaryot Microbiol 53: S95-S97

Duboucher C, Boggia R, Morel G, Capron M, Pierce RJ, Dei-Cas E, Viscogliosi E (2007a)

Pneumocystis pneumonia: immunosuppression, Pneumocystis jirovecii…and the thir

man. Nat Rev Microbiol 5: 966

Duboucher C, Barbier C, Beltramini A, Rona M, Ricome JL, Morel G, Capron M, Pierce RJ,

Dei-Cas E, Viscogliosi E (2007b) Pulmonary superinfection by trichomonads in the

course of acute respiratory distress syndrome. Lung 185: 295-301

Hersh SM (1985) Pulmonary trichomoniasis and Trichomonas tenax. J. Med Microbiol 20: 1-10

34

Kulda J (2002) Rezistence Trichomonas vaginalis k metronidazolu a její význam. In: Kulda J,

Pazdiora E (Eds.) Trichomonóza. Sborník pro Seminář v Lékařském domě České

lékařské společnosti Jana Evangelisty Purkyně. Pp. 16-17

Kutisova K, Kulda J, Cepicka I, Flegr J, Koudela B, Teras J, Tachezy J (2005)

Tetratrichomonads from the oral cavity and respiratory tract of humans. Parasitology

131: 309-319

Jongwutiwes S, Silachamroon U, Putaporntip C (2000) Pentatrichomonas hominis in empyema

thoracis. Trans R Soc Trop Med Hyg 94: 185-186

Leterrier M, Morio F, Renard B, Poirier AS, Miegeville M, Chambreuil G (2012) Trichomonads

in pleural effusion: case report, literature review and utility of PCR for species

identification. New Microbiol 35: 83-87

Mantini C, Souppart L, Noël C, Duong TH, Mornet M, Carroger G, Dupont P, Masseret E,

Goustille J, Capron M, Duboucher C, Dei-Cas E, Viscogliosi E (2009) Molecular

characterization of a new Tetratrichomonas species in a patient with empyema. J Clin

Microbiol 47: 2336-2339

Martínez-Gíron R, Esteban JG, Ribas A, Doganci L (2008) Protozoa in respiratory pathology: a

review. Eur Respir J 32: 1354-1370

Martínez-Girón R, Doganci L (2010) Lophomonas blattarum: a bronchopulmonary pathogen.

Acta Cytol 54: 1050-1051

Martínez-Girón R, van Woerden HC, Doganci L (2011) Lophomonas misidentification in

bronchoalveolar lavages. Intern Med 50: 2721

Qiang H, Xiuju C, Jianghua C (2011) Authors reply to Lophomonas misidentification in

bronchoalveolar lavages. Intern Med 50: 2723

Smejkalová P, Petrželková KJ, Pomajbíková K, Modrý D, Čepička I (2012) Extensive diversity

of intestinal trichomonads of non-human primates. Parasitology 139: 92-102

35