Embed Size (px)
Citation preview
ESTUDI EMBRIoLÒGIC
DELS EFECTES DE
L’ETANOL EN EL PEIX
ZEBRA
GEorgina Camps paradell
TUTOR: ÀLEX LÒPEZ-DURAN lòpez
2n Batxillerat
Escola GarbÍ
Vull dedicar el meu Treball de Recerca al
meu pare, en Jordi, que des del cel em guia
“No es poden deduir veritats amb cadenes de demostracions, s’han
d’experimentar”
Saint-Exupéry: “El Petit Príncep”
5
INDEX
1. INTRODUCCIÓ _____________________________________________________ 7
1.1. Motivacions _________________________________________________________ 7
1.2. Metodologia ________________________________________________________ 7
1.3. Objectius ___________________________________________________________ 8
1.4. Hipòtesis ___________________________________________________________ 8
2. PEIX ZEBRA ______________________________________________________ 10
2.1. Descripció i característiques generals ____________________________________ 10
2.2. Desenvolupament embrionari _________________________________________ 14
3. ESTUDIS ANTERIORS _______________________________________________ 24
3.1. Peix zebra com model d’investigació ____________________________________ 24
3.2. L’etanol com tòxic ___________________________________________________ 27
4. DISSENY EXPERIMENTAL ___________________________________________ 33
4.1. Variables d’Anàlisi ___________________________________________________ 33
4.2. Protocol d’experimentació ____________________________________________ 34
5. ESTABLIMENT DE LES CONDICIONS D’ESTABULACIÓ. _____________________ 39
5.1. Materials. __________________________________________________________ 39
5.2. Obtenció del peix zebra _______________________________________________ 41
5.3. Disposició dels tancs de peixos _________________________________________ 43
5.4. Condicions de estabulació i manegament ________________________________ 47
6. REPRODUCCIÓ DELS PEIXOS _________________________________________ 61
7. ESTUDI DE L’ALTERACIÓ DEL DESENVOLUPAMENT EMBRIONARI ___________ 68
7.1. Obtenció dels embrions ______________________________________________ 68
7.2. Seguiment del protocol _______________________________________________ 71
7.3. Observacions de les Variables d’anàlisi __________________________________ 74
8. ANÀLISI I DISCUSSIÓ DELS RESULTATS _________________________________ 87
8.1. Malformacions ______________________________________________________ 87
8.2. Retard de Desenvolupament __________________________________________ 89
8.3. Mortalitat __________________________________________________________ 90
8.4. Eclosió ____________________________________________________________ 91
8.5. Moviment _________________________________________________________ 91
9. CONCLUSIONS ____________________________________________________ 92
6
9.1. Validació general del mètode experimental ______________________________ 92
9.2. Validació de les hipòtesis _____________________________________________ 93
9.3. Validació del peix zebra com model d’experimentació ______________________ 94
9.4. Dificultats pràctiques _________________________________________________ 95
9.5. Errors de procediment i lliçons apreses __________________________________ 96
9.6. Properes passes _____________________________________________________ 97
10. BIBLIOGRAFIA __________________________________________________ 98
11. WEBGRAFIA ___________________________________________________ 100
12. AGRAÏMENTS__________________________________________________ 101
ANNEX ____________________________________________________________ 102
Annex 1 Glossari _________________________________________________________ 103
Annex 2. Etapes del desenvolupament embrionari del peix zebra __________________ 105
Annex 3. Numeració d’etapes del desenvolupament embrionari del peix zebra _______ 108
Annex 4 Comparació d’anomalies morfològiques _______________________________ 110
7
1. INTRODUCCIÓ
1.1. Motivacions
Aquest treball l’he escollit per diverses raons. En primer lloc perquè m’interessa la
Biologia, he escollit la branca de Ciències de la Salut del Batxillerat i vull fer un treball
de tipus experimental relacionat amb aquest camp. En segon lloc perquè m’interessa
especialment la Biologia marina i vull aprofitar la oportunitat de treballar amb peixos,
encara que siguin d’aigua dolça. En tercer lloc perquè el tema d’aquest treball em
permetrà conèixer els efectes d’un tòxic present en la nostra forma de vida habitual.
Finalment perquè penso que una de les característiques principals del peix zebra, la
seva capacitat per ser emprat com model d’experimentació per estudiar la Síndrome
d’Alcoholisme Fetal en els humans, és molt útil per intentar comprendre i intentar
resoldre un problema greu que afecta a moltes persones.
Fotografia 1: Observant un grup d’anàlisi en el laboratori(G.Camps)
1.2. Metodologia
El treball l’he estructurat en dues parts. Una primer part d’anàlisi teòrica i una segona
part d’anàlisi experimental. Això respon a l’aplicació de la metodologia científica:
plantejament del problema, formulació d’hipòtesis, experimentació ,resultats i
conclusions.
A la part d’anàlisi teòrica he estudiat els següents aspectes:
8
- En primer lloc una anàlisi teòrica de les característiques del peix zebra, incloent
la descripció del seu habitat natural, les seves característiques, els seus costums
- A continuació he revisat el desenvolupament embrionari del peix zebra per
identificar les diferents etapes del seu desenvolupament i definir a quines és
més efectiu realitzar les observacions.
- Per acabar he estudiat la utilització del peix zebra com model d’experimentació
i les característiques i efectes en la salut humana del tòxic escollit, l’etanol
La part d’experimentació inclou els següents blocs:
- Definició del disseny experimental, en el que he identificat quines son les
variables d’anàlisi i he definit com realitzar l’experiment.
- Establiment de les condicions d’estabulació, en el que he concretat tot el que
cal fer per tenir els peixos zebra en condicions òptimes per la reproducció i el
que cal fer per a que es reprodueixin.
- L’experiment pròpiament dit, en el que he analitzat l’alteració del
desenvolupament embrionari provocat per l’etanol.
1.3. Objectius
L’objectiu de l’experiment era realitzar una comparació dosi depenent dels efectes de
l’alcohol en funció de les concentracions ,30, 100 i 300 mM, sobre el creixement i la
maduració dels embrions del peix zebra. Al llarg de l’experimentació he observat les
etapes de desenvolupament dels peixos en els medis amb concentracions creixents
d’etanol i també en un grup de peixos control no sotmesos als efectes de l’etanol, i
recolliré les dades.
1.4. Hipòtesis
Aquest treball pretén estudiar els efectes de l’etanol en els embrions de peix zebra
segons cinc hipòtesis:
H1 En augmentar la concentració d’etanol en el medi en que es desenvolupen els
embrions de peix zebra s’incrementa la seva taxa de mortalitat.
H2 En augmentar la concentració d’etanol en el medi en que es desenvolupen els
9
Taula 1 : taula d’hipòtesis
Deducció: Suposem que el desenvolupament dels peixos zebra es veu afectat per la
concentració d’etanol; llavors si augmentem la concentració hauran d’augmentar els
efectes negatius. Possibles efectes dosi/depenents de l’etanol en el desenvolupament
embrionari.
Variable independent la concentració d’etanol
Variables dependents taxa de mortalitat, taxa d’anormalitats
morfològiques en l’embrió , taxa
d’anormalitats en el moviment dels
embrions, taxa d’eclosió , taxa del retard
en el desenvolupament embrionari.
Variables controlades temperatura de l’aigua, pH de l’aigua,
llum ambiental, soroll ambiental.
Taula 2 : taula de variables
embrions de peix zebra s’incrementa la seva taxa d’anormalitats morfològiques
Amplada del cap : en les concentracions més altes es disminueix
l’amplada del cap.
Distància entre la vora interior dels ulls : en augmentar la concentració
d’etanol es disminueix la distància entre la vora interior dels ulls.
H3 En augmentar la concentració d’etanol en el medi en que es desenvolupen els
embrions de peix zebra s’incrementa la seva taxa d’anormalitats en el
moviment
H4 En augmentar la concentració d’etanol en el medi en que es desenvolupen els
embrions de peix zebra s’incrementa el retard en el seu desenvolupament
embrionari
H5 En augmentar la concentració d’etanol en el medi en que es desenvolupen els
embrions de peix zebra es disminueix seva la taxa d’eclosió.
10
2. PEIX ZEBRA
2.1. Descripció i característiques generals
Descripció
Entendre el comportament i la biologia dels animals d’experimentació és fonamental
per millorar el seu benestar i la qualitat de la recerca. Els següents apartats donen
informació de l’anatomia, fisiologia i comportament del peix zebra que cal tenir en
compte al dissenyar l’experiment i les condicions del laboratori.
Característiques de l’espècie.
Taxonomia
Danio rerio, (anteriorment Brachydanio rerio), és una de les aproximadament 45 espècies de Danio que existeixen .
Són part de la família dels ciprínids que inclou carpes i peixos petits.
Aparença
El peix zebra pren el seu nom de les ratlles en el lateral del cos, les quals s'estenen a l'aleta anal i en els radis de l'aleta cabal de la cua. Tenen cinc ratlles alternant blau i negre que contenen dos tipus diferents de cèl·lules pigmentàries, melanòfors i iridiòfors. També tenen ratlles platejades i grogues que contenen xantòfors i iridòfors.
El peix zebra adapta els seus nivells de pigmentació per barrejar-se amb el fons com una resposta de camuflatge.
Com tots els peixos petits, el peix zebra té una sola aleta dorsal i no té aleta adiposa.
Presenten dimorfisme sexual. Les femelles madures reproductivament tenen un abdomen més ple a causa dels ous en desenvolupament en els ovaris. Els mascles són generalment més prims i de color més fosc que les femelles, i tenen una coloració més groga en l'aleta anal.
Normalment mesuren menys de 5 cm de llargària.
Fotografia 2: peix zebra a l’aquari de l’escola (G.Camps )
11
Activitat
Presenten un patró circadiari robust d'activitat diürna i descans nocturn, que és un
estat que es diu que té similituds importants amb el son dels mamífers.
Quan el peix zebra pren consciència d'una amenaça real o percebuda, les conductes
que apareixen poden ser: augmentar la cohesió del banc de peixos; natació agitada o
congelació en el substrat; disminució de la taxa d'alimentació; augment de
l'agressivitat.
Esperança de vida
En el laboratori, el peix zebra té una vida útil màxima registrada de 5 anys i mig,
malgrat que la mitjana és d’uns 3 anys i mig.
En els laboratoris, aquests animals es conserven durant un període de 18 mesos a
dos anys, perquè les altres edats es consideren de menor valor reproductiu.
En la naturalesa, hi ha poca evidència que els individus sobrevisquin més d'un any o
dos. Això pot ser a causa de la depredació o dels paràsits.
Sentits (general)
El peix zebra té tots els sentits: vista, oïda, tacte, gust, olfacte i equilibri.
Oïda
No posseeixen oïda externa o mitjana, però tenen una oïda interna bastant típica dels
vertebrats que, juntament amb els senyals visuals, s'utilitza per mantenir l'equilibri.
Tenen quatre petits ossos (ossets de Weber) que connecten la bufeta natatòria amb
l’oïda interna que milloren l'audició. Aquesta és una característica dels peixos
Ostariofisis - que també es coneixen com a "especialistes d'audició. Aquests peixos
poden ser sensibles a un rang de freqüències entre 100 Hz i 5000 Hz.
Olfacte
El peix zebra utilitza senyals olfactoris per distingir entre parents i no parents.
Mostren una preferència per associar-se amb els familiars durant l'etapa juvenil i
larval primerenca, però això canvia, i la preferència pels no parents, arriba una
vegada que aconsegueixen la maduresa sexual.
Vista
El sistema visual del peix zebra és semblant al de la resta de vertebrats.
12
El comportament visual apareix molt aviat i l’agudesa
visual sembla millorar amb l’edat.
La retina és dúplex, consta de dos bastons que recolzen la
visió en baixos nivells de llum i cèl·lules de con que
recolzen la visió en la llum brillant i la percepció del color.
Posició sistèmica
La distribució geogràfica del peix zebra encara no està del tot clara. Alguns estudis proposen
que el seu habitat natural està al sud-est asiàtic, entre Pakistan a l’oest i Myanmar a l’est, i
entre Nepal al nord i l’estat indi de Karnataka al sud, però no està completament comprovat.
Els peixos zebra es poden trobar a zones d’aigua de moviment lent, com bassals, estanys,
sèquies o camps d’arròs, de
manera que sembla que és més
una espècie de planícies d’al·luvió
que una espècie realment fluvial.
Els estudis de camp han trobat
exemplars de peix zebra en els
llocs que tenen fons de llim i
vegetació, amb aigua poc
profunda i relativament clara en la
q qual semblen ocupar la totalitat
de la columna vertical d'aigua. Fotografia 4 :Habitat natural del peix zebra.(Reed 2010)
Comportament de Grup
En la naturalesa aquests peixos s'han observat en petits bancs de 2 a 30 individus.
S'ha proposat que les ratlles són un senyal de pertinença al grup en els peixos Danio.
La preferència per un patró de ratlles determinat es més apresa que innata. Els
individus prefereixen ajuntar-se a bancs de peixos amb el mateix patró de ratlles que
el banc on han crescut.
Fotografia 3: ull del pix zebra adult.(G.Camps)
13
Fotografia 5 :Grup de peixos zebra a l’aquari (G. Camps)
Dieta i alimentació
El peix zebra és omnívor. La seva dieta natural consisteix principalment de
zooplàncton i insectes, tot i que també s’ha trobat en l'anàlisi del contingut intestinal
altres nutrients com fitoplàncton, algues filamentoses, espores i ous d'invertebrats,
escates de peix, aràcnids, detritus, sorra i fang.
L’opinió més estesa és que aquests peixos s'alimenten essencialment a la columna
d'aigua, però també n’hi ha que s'alimenten a la superfície i al fons.
Els peixos zebra no tenen les dents a la mandíbula, i en el seu lloc tenen faríngies com
els taurons, amb fileres de dents que molen els aliments a la part posterior de la gola.
Aquestes dents estan normalment fusionats a un os faringi modificat de l'arc
branquial més posterior.
Reproducció
El peix zebra es reprodueixen per difusió alliberant òvuls i espermatozoides en un
núvol sobre el substrat.
Les femelles llencen directament els ous sobre un substrat nu, però quan es
proporciona un lloc artificial per la posta, com una caixa de plàstic plena de grava, el
fan servir preferentment.
Una femella generalment produeix al voltant de 100 ous transparents en una sola
posta (encara que aquest nombre pot variar entre uns pocs ous a més de 1.000). No
hi ha cura parental dels fills després de la col·locació.
Els ous tenen un diàmetre d'aproximadament 1,0-1,5 mm.
A diferència de moltes altres espècies de peixos, el peix zebra no requereix un canvi
estacional en la durada del dia per portar-los a un estat de reproducció. Quan es
manté en condicions de laboratori, el peix zebra pot ser encoratjat per reproduir-se
14
durant tot l'any. Les femelles ponen els ous cada dia, cada dos dies o cada tres dies,
alliberant tots els òvuls madurs en un interval d’una hora aproximadament.
Alguns peixos zebra mascle són territorials durant l'aparellament i un sol mascle pot
tractar agressivament de controlar l'accés dels seus rivals a un lloc de posta i l'accés a
les femelles.
Les femelles es creu que són capaces de distingir entre els sexes sobre la base de la
forma del cos per si sol, i semblen mostrar una preferència pels mascles amb un cos
més gran.
No obstant això, la mida del cos masculí no sembla correlacionar-se amb la mida de la
niuada d'ous posats per les femelles. De fet, la preferència de les femelles pot ser
anul·lada ja que els mascles dominants no permeten que les femelles tinguin accés a
altres mascles.
El comportament d'aparellament de peix zebra sembla estar influenciat per
l'exposició dels companys d'aparellament entre sí durant les 24 hores abans que
comenci la posta (a l'alba).
El festeig al peix zebra implica la natació masculina ràpidament en les proximitats de
la femella, sovint tocant els seus flancs amb el seu musell, envoltant-la molt a prop,
mentre que tracta de conduir-la a un lloc de posta. Un cop al lloc de posta, el mascle
neda al costat de la femella, en estret contacte, però lleugerament darrere d'ella, de
vegades oscil·lant el seu cos amb amplitud alta i baixa. Tant els mascles territorials
com els no territorials mostren el mateix comportament de festeig, però mentre que
s'han observat mascles no territorials perseguint femelles a tot l'aquari, els mascles
territorials limiten les seves activitats una distància d'uns pocs llargs del cos des dels
llocs de posta i a allunyar altres mascles quan tracten d'acostar-se.
2.2. Desenvolupament embrionari
2.2.1. Introducció
El desenvolupament dels vertebrats es pot reduir a grans trets en tres fases (Pettering
et al 2013):
15
A Fase inicial de divisions cel·lulars ràpides.
B Establiment dels tres eixos del cos.
C Desenvolupament dels òrgans i sistemes.
Taula 3 : Fases generals
Les divisions cel·lulars ràpides tenen lloc les primeres 2-3 hores post-fertilització (pH),
amb la primera divisió cel·lular al voltant de 0,5 hpf1 i les divisions posteriors cada 15
minuts aproximadament.
Des de 3 hpf fins 10 hpf es desenvolupen els tres eixos del cos: anterior-posterior,
esquerra-dreta i dorsal-ventral.
El cicle de vida del peix zebra es pot dividir en les següents etapes (Reed 2010):
o 0-72 hores després de la fertilització - embrions
o 72 hores a 13 dies després de la fertilització - larves primerenques
o 14 dies a 29 dies després de la fertilització - larves mitjanes
o 30 dies a 3 o 4 mesos - juvenils
o Quan arriben a la maduresa sexual - adults.
Però la rapidesa amb la que un individu es desenvolupa es pot veure afectada tant per
factors genètics com ambientals. En condicions estàndard els canvis més significatius
són els següents:
L’estructura bàsica del cos de l'animal es desenvolupa dins de les primeres 24
hpf.
Acabades de sortir de la closca (3 dpf2), les larves primerenques, són en gran
part inactives i no floten, resten immòbils en el fons, tot i que ocasionalment
s’observen moviments de la cua.
A 5 dpf, les larves floten i són capaces de nedar de forma contínua i mantenir la
seva posició dins de l'aigua. Les larves s’impulsen bategant la cua.
Després dels primers tres mesos després de l'eclosió, el creixement comença a
disminuir i s'aproxima a zero a prop dels 18 mesos.
1 hpf: hores post fertilització
2 dpf: dies post fertilització
16
2.2.2. Etapes del desenvolupament
En el peix zebra, el desenvolupament embrionari es porta a terme en tres dies separat
en set períodes (ZFIN 2014):
Per poder entendre millor les descripcions de les etapes i fer servir un vocabulari precís
he fet un petit glossari específic de desenvolupament embrionari, que exposo a
l’annex 1. Inicialment havia previst incloure només les etapes que tenia previst
observar. Però quan he definit la variable d’anàlisi “Retard de desenvolupament”
(veure capítol de Disseny Experimental) m’he adonat que em calia poder identificar
visualment totes les etapes intermèdies, i per tant he inclòs el llistat i una imatge de
totes.
zigot divisió blàstula gàtrula
segmentació faríngula eclosió
ETAPA
1. Zigot
2. Escissió
3. Blàstula
4. Gàstrula
5. Segmentació
6. faríngula
7. Eclosió
Taula 4 : períodes del desenvolupament embrionari
17
A la taula annex 2 es pot veure totes les etapes del desenvolupament de danio rerio,
incloses les de creixement fora de l’ou.
En el gràfic 1 es pot veure el creixement de la longitud de l’embrió en mil·límetres en
funció del temps, a una temperatura de 28,5 ºC. No es produeix cap canvi significatiu
en la longitud durant les primeres 16 hores . El redreçament del cap i la cua produeix
un allargament entre les 16 i les 32 hores. L’allargament degut al creixement té lloc en
la resta d’etapes.
A continuació descriuré breument tots els períodes i em centraré en els que he
observat: des de gàstrula (6 hores) fins l’eclosió (72 hores). Dins de cada període
descric l’etapa que he observat, i també incloc les imatges de la resta d’etapes per
poder identificar-les al fer l’anàlisi del retard de desenvolupament.
PERIODE ZIGOT (0-3/4 h)
L’ou acabat de fertilitzar està en el període zigot fins que es produeix la primera
escissió ,uns 40 min més tard de la fertilització. El zigot és d’uns 0,7 mm de diàmetre
en el moment de la fecundació. Es considera una sola etapa, però com tenen lloc
molts canvis es podria subdividir en diverses subetapes.
Gràfica 1 : creixement del la longitud del embrió en funció del temps (Kimmel 1,995)
18
PERIODE D’ESCISSIÓ (0,7 A 2.2 H)
Després de la primera escissió les cèl·lules o blastòmers es divideixen a intervals d’uns
15 minuts. Les sis escissions que comprenen aquest període tenen lloc freqüentment
amb orientacions regulars de manera que es pot veure quants blastòmers estan
presents i la seva disposició.
BLÀSTULA (2 ¼ H a 5 ¼ h)
És el període en el que els blastodiscs comencen a semblar boles. L’epibòlia comença a
la part final de la blàstula i és l’aprimament i escampament del blastodisc per sobre del
vitel de la cèl·lula. Eventualment al final del període gàstrula el vitel queda
completament engolit.
GÀSTRULA (5 ¼ h – 10,33 h)
Aquesta fase es caracteritza per la continuació de l’epibòlia i la producció de les
primeres capes germinals i l’eix embrionari
Les etapes que he observat són :
Fotografia 6 : Etapes del periode gàstrula. (ZFIN 2014)
19
- 6 hores (escut): en aquesta etapa es pot veure l’escut
embrionari i l’anell de germinació (imatges D i E).
L’epibòlia es manté al 50 % fins el final de l’etapa, quan es
pot considerar que més de la meitat del rovell ha quedat
cobert pel blastoderm. L’escut embrionari donarà lloc al
costat dorsal del peix. La fletxa a E (vista polar) indica
l’escut embrionari. En aquesta etapa es poden identificar per primer cop els
eixos Antero-Posterior i Dorsal-Ventral.
- 10 hores (capoll): l’epibòlia arriba al 100%, ja que el blastoderm
cobreix completament el rovell. En aquesta etapa apareix com
una inflor al final de l’eix axial que és el capoll de la cua (fletxa a
la imatge L). Es pot apreciar també un engruiximent a prop del
pol, on es formarà el cap.
SEGMENTACIÓ (10,33 h – 22 h)
A aquesta fase es desenvolupen els somites i es fan visibles els rudiments dels òrgans
primaris i la cua, la cua es fa més prominent i l’embrió s’allarga. Podríem anomenar
aquest període el "període de brot de cua", perquè el brot de cua apareix en l'extrem
cabal de l'eix de creixement. De fet, com el creixement de la cua es tan prominent, es
pot determinar l’etapa del desenvolupament simplement observant la forma general
de l'embrió. A més, com la cua s'estén, la longitud total del cos de l'embrió augmenta
molt ràpidament de manera que la longitud és un índex bastant útil per identificar
l’etapa després d'aproximadament 15 hores. Els somites apareixen de forma
seqüencial en el tronc i la cua i donen la forma més clara d’identificar cada etapa:
Figura 1 : representació de l’escut (Kimmel 1995)
Figura 2 : representació del capoll.(Kimmel 1995)
20
FARÍNGULA (24-48 H)
Al començament d’aquest període l'eix del cos comença a redreçar-se i el cap es
redreça i s’aixeca dorsalment. L’embrió té un notocordi ben desenvolupat. El sistema
nerviós és buit i està expandit en sentit antero-posterior i el cervell té 5 lòbuls. Aquesta
fase es caracteritza pel creixement dels arcs faríngics i és el període de
desenvolupament en el que es pot comparar més fàcilment la morfologia d’embrions
de diversos vertebrats: es desenvolupen set arcs faríngics.
- Es desenvolupen set arcs faríngics.
- Les aletes pectorals comencen a desenvolupar-se.
- El sistema circulatori es desenvolupa i el cor batega per primera vegada
- La sang comença a circular a través d'un circuit tancat de canals
- Apareix sensibilitat tàctil i es produeixen moviments descoordinats
(ZFIN 2014)
21
Les etapes d’aquest període són
Prim-5 24 h LE = 1.9 mm; pigmentació inicial, batec del cor
Prim-15 30 h LE = 2.5 mm; primer reflex de tacte, retina pigmentada
Prim-25 36 h LE = 2.7 mm; mobilitat inicial, pigmentació de la cua
High-pec 42 h LE = 2.9 mm; rudiments d’aleta pectoral
Les etapes que he observat són:
- 24 h : hi ha uns 30 somites, 13 dels quals a la cua. El plec de l’aleta central
és clarament reconeixible. El cor és visible per primer cop com un tub en
forma de con a l’interior del cervell. Comença a bategar sense un ritme
aparent i el batec es pot interrompre. Es marca el relleu corresponent al
cervell. S’observen contraccions laterals que involucren el cap i la cua.
- 33 h: La pigmentació és important als ulls, però encara és prou clara per visualitzar
les cèl·lules no pigmentades de la retina. La cavitat del pericardi encara no s’ha
inflat de manera clara. La circulació de la sang és forta. El cor passa a ser un tub
lleugerament doblegat. Els episodis espontanis d’activitat motora disminueixen
clarament, fins una freqüència de menys d’un per minut.
A: prim-5 (24 H)
B,C: prim-12 (28 h)
D,E: prim-20 (33 h)
F: prim 25 (36 h)
G: prim 25 (36 h
H,I: high-pec (42 h)
Fotografia 8 : etapes pariode faríngula.(ZFIN 2014)
Figura 3 : embrió en les 24 hpf (Kimmel 1995)
Figura 4 :embrió en les 33 hpf (Kimmel 1995)
G: prim 25 (36 h
H,I: high-pec (42 h)
D,E: prim-20 (33 h)
F: prim 25 (36 h)
22
ECLOSIÓ (48-72 h)
Durant aquest període l’embrió continua creixent al mateix ritme que a les etapes
anteriors. El temps d'incubació no és útil com un índex de l’etapa de desenvolupament
per al peix zebra, en contrast amb alguns altres tipus d'embrions, perquè els individus
dins d'un únic desenvolupament poden sortir de l’ou de forma esporàdica durant tot el
tercer dia de desenvolupament (a temperatura normal), i de tant en tant més tard.
Independentment de si un embrió ha sortit de l’ou o no, el seu desenvolupament
progressa a cada hora, i en general els individus que han eclosionat abans no estan
més avançats que els que encara estan als seus ous. Per conveni s’anomena als
individus d’aquest període "embrions" fins al final del tercer dia, i després, "larves",
independentment de si han eclosionat o no
- Es desenvolupen els sistemes dels òrgans primaris i comença el desenvolupament
del cartílag.
- Les aletes pectorals esdevenen allargades amb la fulla plana, encara en
desenvolupament.
- Es desenvolupen les mandíbules i brànquies, i també les aletes pectorals.
- Es desenvolupen placodes olfactòries a la part anterior de l’ull.
- Les cèl·lules ciliades es diferencien.
- Al començament del període la boca és petita, està entreoberta i està en una
posició mig-ventral, entre els ulls. Però a les darreres 12 hores la boca es mou en
sentit anterior i sobresurt cap endavant més enllà dels ulls ben oberta.
- Es pot veure el primer os visible al peix zebra, el cleithrum, entre els dos primers
miòtoms.
- Apareixen els rudiments de brànquies
Les etapes d’aquest període són:
Long-pec 48 h LE = 3.1 mm; brots d’aleta pectoral allargats
Pec-fin 60 h LE = 3.3 mm; fulles d’aleta pectoral
23
L’etapa que he observat és:
- 48 h (long pec): la longitud és d’uns 3.1 mm. Els capolls de les aletes
pectorals s’han allargat, tot i que encara no tenen la forma d’aleta. El cor
batega vigorosament. El tronc i la cua. La bola del rovell es veu igual que el
cap en una vista lateral, però si es mira a una vista dorsal la bola encara és
lleugerament més gran que el cap. Les franges de melanòfors estan ben
definides i densament poblades. El cor batega amb força i la circulació és
forta a la majoria de parts del tronc i la cua. Els embrions que han sortit de
l’ou, quan descansen comencen a adoptar una posició amb la cara dorsal a la
part de dalt.
PERÍODE LARVAL (72 h a 30 d)
- La transició des de boca sobresortida té lloc el dia 30 al 44
- L’aleta pectoral continua el seu desenvolupament i els òrgans interns esdevenen
més complexos.
- S’infla la bufeta natatòria.
A,B: etapa long-pec (48 h) C,D: etapa pec-fin (60 h) Barra d’escala: 250 µm
Figura 5 : long pec
(48 h) (Kimmel 1995)
Fotografia 9: etapes periode d’eclosió (ZFIN 2014)
24
Boca sobresortida 72 h 3.5 mm longitud total cos
dia 4 96 h 3.7 mm longitud total cos
dia 5 120 h 3.9 mm longitud total cos; 6 dents
dia 6 144 h 4.2 mm longitud total cos
dies 7-13 168 h 4.5 mm longitud total cos; 8 dents
dies 14-20 14 d 6.2 mm longitud total cos; 10 dents
dies 21-29 21 d 7.8 mm longitud total cos
En aquest període no cal posar les imatge de totes les etapes perquè només observaré
la primera etapa i si hi ha retard, correspondrà a etapes del període anterior. L’etapa
que he observat és:
72 h: la boca està completament oberta i sobresurt per
sota dels ulls. La fulla de l’aleta pectoral continua creixent,
fins cobrir casi del tot la bola del ou. Les brànquies son
visibles. En una vista lateral al microscopi es pot apreciar la
llargada completa del tracte intestinal, sota la faringe. La
melanina s’acumula sobre l’embrió de la bufeta natatòria
enfosquint aquesta zona. El to groguenc de la part dorsal
augmenta, de manera que el to del tronc coincideix amb el
del cap. La circulació esdevé més complexa amb el
desenvolupament dels filaments de les brànquies.
3. ESTUDIS ANTERIORS
3.1. Peix zebra com model d’investigació
Característiques generals
El peix zebra (Danio rerio) és un bon model per l’anàlisi del desenvolupament dels
vertebrats. És fàcil de trobar i els seus embrions presenten diverses característiques
que el fan molt útil per estudiar-lo:
- Es desenvolupen fora del cos de la mare
Fotografia 10 :període larval a les
72 hores. Barra d’escala: 250 µm
(ZFIN 2014)
Figura 6 : embrió en les 72 hpf (Kimmel 1995)
25
- Es reprodueixen en grans quantitats
- Tenen un desenvolupament sincronitzat a cada posta d’ous.
- Són òpticament transparents.
- Es desenvolupen ràpidament
- Els embrions de peix zebra serveixen com model per substituir animals adults.
Una sola posta dona prou ous per fer diversos experiments, això elimina els problemes
de tenir diferències genètiques significatives que poden aparèixer entre postes
diferents. La transparència dels embrions i el fet que tots es desenvolupen de forma
sincronitzada permeten observar fàcilment les diferències provocades per condicions
ambientals amb un microscopi de dissecció. Com que l’eclosió dels ous té lloc al cap de
48 a 72 hores després de la fertilització i esdevenen alevins amb capacitat natatòria al
cap de 4 o 5 dies, es pot realitzar l’estudi del desenvolupament en blocs d’una
setmana.
Embrions de peix zebra com model per estudiar els efectes de l’etanol
Després de revisar la utilitat del peix zebra per fer estudis de toxicitat aguda, em
plantejo si també serveixen per estudiar els efectes de l’etanol en els humans. En la
bibliografia hi ha diversos articles que tracten el tema.
Hi ha treballs que analitzen la utilització dels embrions de peix zebra per estudiar
l’efecte de diversos tòxics aplicats directament al medi de desenvolupament, com
Meyer (2009) o Ciccolini (2013). Aquests treballs sintetitzen l’efecte observat
mitjançant experimentació. Altres articles, com Coors et al (2011), analitzen la
utilització dels embrions com model per predir l’efecte de productes biocides presents
a l’entorn, com els productes de conservació de la fusta (anti- corc).
L’article Shaukat Al et al (2011) analitza si és possible utilitzar els embrions de peix
zebra com model d’experimentació per estudiar els efecte de l’etanol en el
desenvolupament dels humans. La conclusió és que sí que és possible.
Els efectes de l’etanol als humans que es poden veure a la síndrome d’alcoholisme
fetal (FAS) es poden dividir a grans trets en: retard del creixement, malformacions
morfològiques (especialment defectes craniofacials) i defectes del sistema nerviós
26
central. Els defectes craniofacials més comuns són anormalitats dels ulls com la
microftàlmia, així com diversos defectes que s’han interpretat com anormalitats del
primer o segon arc faríngic, com problemes d’audició o malformacions de les orelles o
llavi superior prim.
No tots els fills de mares alcohòliques presenten tots els símptomes, i fins i tot n’hi ha
que no en tenen cap (resiliència a l’alcohol). Això suggereix que hi ha factors
ambientals i genètics que poden fer que el fetus sigui vulnerable o resistent a la
toxicitat de l’alcohol i que alguns teixits, òrgans o sistemes són més vulnerables que
altres, en funció de la dosi, durada i temps d’exposició a l’alcohol.
Per estudiar els mecanismes del FAS en els mamífers s’ha desenvolupat molts models i
s’ha arribat a la conclusió que les cèl·lules de les crestes neurals que poblen el primer i
segon arc faríngic i el conducte de sortida del cor són molt sensibles a l’exposició de
l’alcohol. Però no han permès conèixer quin és el període crític per l’exposició a
l’alcohol durant la maduració de l’embrió donada la dificultat d’experimentar amb els
embrions quan estan a l’úter matern.
El model del peix zebra ha ajudat a resoldre els problemes d’identificació de les etapes
crítiques perquè permet estudiar els processos del desenvolupament de forma no
invasiva: degut a la seva transparència, els embrions i les larves es poden analitzar amb
el microscopi a temps real; d’altra banda els embrions tenen mobilitat des d’etapes
primerenques del desenvolupament, el que permet analitzar el seu comportament en
presència d’etanol de manera visual.
Els efectes identificats a estudis previs amb embrions de peix zebra són: retard en el
desenvolupament, edema de pericardi i el sac vitel·lí, reducció de la mida del cos,
defectes a l’esquelet branquial, desenvolupament anormal dels ulls, defectes cognitius
i mortalitat més elevada. Com que aquests defectes coincideixen en bona part amb els
de la síndrome FAS humana, es demostra que el peix zebra és un bon model per
estudiar els efectes de l’etanol.
La majoria dels estudis de toxicitat de l’etanol al peix zebra han fet servir una exposició
crònica, sovint diverses hores al dia. Això fa difícil identificar etapes crítiques del
27
desenvolupament sensibles als efectes de l’etanol. Com el peix zebra es desenvolupa
tan ràpidament, sobre tot a les primeres etapes, cal una exposició curta per a que
l’embrió estigui a la mateixa etapa durant tot el període. (Shaukat et al 2011) fan servir
una tècnica innovadora basada en polsos curts d’exposició a l’etanol. Això els permet
identificar de forma clara els efectes de l’etanol sobre una població homogènia. En el
meu treball no he fet servir aquesta tècnica perquè és molt complexa i requereix
equipament especialitzat, però els resultats m’han servit com a base de comparació.
3.2. L’etanol com tòxic
L'alcohol etílic o etanol, és una substància de fórmula CH3CH2OH o C2H6O, que s'ha
utilitzat habitualment en moltes cultures. Hi ha una gran varietat de begudes
alcohòliques, que s'obtenen habitualment per fermentació de productes vegetals.
Algunes de les més esteses són el vi i la cervesa.
És un líquid incolor i inflamable amb un punt d'ebullició de 78 °C. Es barreja amb aigua
en qualsevol proporció i dóna una barreja azeotròpica amb un contingut
d'aproximada-ment el 96 % d'etanol.
La fermentació del sucre en etanol fou una de les primeres reaccions orgàniques
emprades per la humanitat. Els efectes intoxicants del consum d'etanol han estat
coneguts des de fa mil·lennis. Avui en dia també es produeix etanol per un ús industrial
a partir de subproductes de la refinació del petroli.
L'etanol és un líquid volàtil i incolor que té un olor intens molt característic. Quan es
crema produeix una flama blava sense fum que no sempre és visible a la llum normal.
Les propietats físiques d'etanol es deriven principalment de la presència del seu grup
hidroxil i la brevetat de la seva cadena de carboni. L'etanol del grup hidroxil és capaç
de participar en la vinculació de l'hidrogen, que el converteix en més viscós i menys
volàtil que altres compostos orgànics polars d'un pes molecular semblant.
28
L'etanol és un dissolvent versàtil, miscible amb aigua i amb molts dissolvents orgànics,
inclosos els d'àcid acètic, acetona, benzè, el tetraclorur de carboni, cloroform,
dietilèter, etilenglicol, glicerol, nitrometà, piridina, i toluè. També és miscible amb
hidrocarburs alifàtics lleugers, com el pentà i l'hexà, i amb clorurs alifàtics com ara el
tri cloroetà i tetracloroetilè.
La miscibilitat de l'etanol amb l'aigua contrasta amb la d'alcohols de cadena més llarga,
amb cinc o més àtoms de carboni; la barreja amb l'aigua disminueix de manera
dràstica quan el nombre de carbonis augmenta.[La barreja d'etanol amb alcans es
limita als alcans per sobre l'undecanè, les barreges al dodecanè, i els alcans mostren
una major franja de mescla per sota d'una determinada temperatura (aprox. 13 °C per
al dodecanè). En la miscibilitat la franja tendeix a ser més àmplia amb alcans majors i la
temperatura necessària per aconseguir la miscibilitat completa augmenta.
Les mescles d'etanol i aigua tenen menys volum que la suma dels seus components
individuals en les fraccions donades. Mesclant volums iguals d'etanol i aigua dóna com
a resultat només 1,92 volums de mescla.[9][13] La barreja d'etanol i aigua és
exotèrmica. A 298 K fins aprox. 777 J/mol estan en llibertat]
L'etanol i l'aigua formen una mescla azeotròpica a aprox. 89% mol-mol d'etanol i 11%
d'aigua,[15] o una barreja de volum del 96% d'etanol i un 4% d'aigua, a pressió normal,
i a T = 351 K. Aquesta mescla azeotròpica depèn molt estretament de la temperatura i
la pressió existent, i s'esvaeix en temperatures per sota dels 303 K.[16]
Efectes de l’etanol en la salut humana
De vegades, quan es parla de drogues només es pensa en la cocaïna i l’heroïna, però
no en l’alcohol, que és la droga més consumida i acceptada socialment. El consum
excessiu i habitual d’alcohol perjudica el fetge i el pàncrees, causa gastritis i úlceres
d’estómac, desnutrició i trastorns al sistema nerviós. Pot augmentar el risc de tenir
lesions, agreujar problemes físics, psíquics i socials, i pot perjudicar les relacions
familiars i laborals. A més, pels mecanismes de tolerància i neuroadaptació cerebral,
aquest consum pot derivar a mitjà i llarg terme en dependència de l’alcohol o
alcoholisme. Per evitar l’aparició de problemes associats al consum d’alcohol es
29
recomana en general beure’n menys i sempre per sota dels nivells considerats de risc
(SISO 2009).
L’alcohol és la substància addictiva més consumida a Europa, per davant de cap altra
droga, i a la qual s’atribueixen una de cada vuit morts en persones de 15 a 64 anys
(SISO 2009). Els europeus beuen al voltant de 12,5 litres d’alcohol pur per càpita a
l’any, més del doble de la mitjana mundial que se situa actualment en 6,1 litres.
Pel que fa a la repercussió de l’alcohol en l’economia europea, els costos associats a un
consum de risc suposen cada any uns 300 euros per càpita. Els fons públics han de
cobrir, entre d’altres, les despeses que suposa el tractament de 250 problemes de
salut relacionats amb aquesta substància, com poden ser la dependència a l’alcohol, el
càncer i altres malalties del fetge. També cal tenir en compte les despeses que
l’alcohol ocasiona en el sistema judicial, sobretot pel que fa a causes motivades per
violència interpersonal i delictes contra la salut pública com la conducció sota els
efectes de l’alcohol. Igualment, repercuteix amb costos que es deriven de la
rehabilitació de persones i l’ajut social a les famílies afectades i de les pèrdues
ocasionades per una menor productivitat.
Els efectes clínics de l’etanol en la salut humana són els següents (SISO 2009):
A CURT TERMINI
En contra del què es pensa, l’alcohol no és un estimulant del sistema nerviós central,
sinó que és un depressor, doncs, a la sensació inicial d’eufòria li segueix un estat de
somnolència amb visió borrosa, falta de coordinació muscular, augment del temps de
resposta, disminució de la capacitar de comprendre i atendre i pèrdua del control
emocional.
Si el consum és excessiu produeix acidesa d’estómac, vòmits, diarrea, baixa la
temperatura corporal, mal de cap i si les dosis han estat molt elevades poden produir
coma i en alguns casos la mort.
A LLARG TERMINI
Si el consum és crònic se l’anomena alcoholisme:
30
Les manifestacions apareixen després d’un període de consum més o menys llarg i
quan la quantitat de begudes alcohòliques que es prenen diàriament dóna a
l’organisme una quantitat d’alcohol superior a un centímetre cúbic per quilo de pes
cada vint-i-quatre hores. Al començament de la intoxicació no existeix dependència ,
després, mica a mica, la dependència ve quan la tassa d’alcohol sanguini baixa, i la
necessitat de beure es converteix en una necessitat tant psíquica com física.
L’alcoholisme crònic comporta els següents símptomes:
· Alteració de la personalitat, es desentén del treball, es torna gelós, irritable, violent.
· Alteració mental: trastorns de memòria, fals records, desorientació més o menys
important.
Els òrgans que més se’n ressenten són:
· El cervell: Provoca una degeneració del cervell
· La sang: Anèmia i disminució de les defenses de la sang
· El cor: Alteracions cardíaques
· El fetge: Hepatitis i cirrosis al fetge
· El pàncreas: Degeneració i inflamació del pàncreas
En les dones embarassades pot donar lloc al síndrome alcohòlic-fetal que es
caracteritza per malformacions i baix coeficient mental del bebè.
L’alcohol es el responsable de la cinquena part dels pacients amb trastorns mentals
ingressats en centres psiquiàtrics.
Efectes esperats de l’alcohol
Abans de definir les variables d’anàlisi he buscat a la bibliografia els resultats d’altres
treballs d’experimentació per identificar quins són els efectes més habituals i com es
poden detectar. Per a fer-ho, he revisat publicacions de diversos nivells científics, des
de batxillerat fins publicacions post-doctorals. Evidentment quan més alt es el nivell
més fiables són els resultats, però també són més difícils de reproduir perquè són molt
tècnics i requereixen material molt especialitzat. Tot i que aquests articles de més
31
nivell no els entenc en la seva totalitat, les conclusions que presenten són clares i
serveixen de guia.
A nivell general presenten els següents resultats:
1) Ciccolini (2013) compara els efectes de l’etanol, la cafeïna i el lleixiu i s’explica
que:
a. La taxa de supervivència amb l’etanol és pràcticament constant, només
per la concentració més alta (300 mM) s’observa una caiguda del 30%
(de 10 a 7 embrions vius) al cap de 96 hores.
b. A diferència d’altres tòxics, la taxa de mortalitat amb etanol roman
pràcticament constant en funció de la concentració. Això es deu a que
els efectes de l’alcohol amb aquestes concentracions es manifesten en
forma de mutacions anòmales, que a llarg termini provocarien la mort
del peix però no en el període estudiat.
c. La taxa de mutació dels embrions exposats a l’alcohol va ser la més alta
dels tres tòxics. Els nivells de mutació van superar el 90% amb quasi tots
els embrions amb algun signe de mutació. La mutació més sorprenent
que van trobar va ser un peix amb dos caps. El segon cap no era
funcional i el primer casi no era operatiu.
2) Pittz (2013) realitza assajos amb etanol amb plaques de petri amb 10 embrions
cadascuna i concentracions 30, 100 i 300 mM. Les conclusions generals són que
l’etanol no va augmentar la taxa de mortalitat, però a les concentracions més
altes quasi tots els embrions van eclosionar prematurament, es movien molt
lentament i no responien a l’estimulació física.
3) Beczkiewicz (2013) estudia els efectes de l‘etanol a concentracions del 3% ,10%
i 30 % . Segons les seves conclusions, l’etanol retarda les etapes del
desenvolupament. Les primeres 24 hores no s’observa diferències significatives
amb el grup de control . En els embrions de les solucions del 3% i el 10%, a 48
32
hpf s’observa un retard d’una etapa i a 72 hpf un retard de 3 etapes respecte el
grup de control. En els embrions de la solució del el 30%, a 48 hpf s’observa un
retard d’una etapa i a 72 hpf un retard de 5 etapes respecte el grup de control.
4) Brenet (2012) és una tesi doctoral que analitza l’efecte de l’etanol en
concentracions 100 , 200 , 300 i 400 mM a les primeres etapes del
desenvolupament i les seves conseqüències en les estructures cranio-facials i a
parts del sistema nerviós. Apart de l’estudi dels embrions de peix zebra aquest
treball és interesant perquè fa servir el peix zebra com model d’investigació de
la Síndrome d’Alcoholisme Fetal (FAS en anglès) en els humans per explicar les
malformacions més corrents que causa aquesta síndrome:
Fotografia 11 : Efectes a les persones (síndrome FAS) (Brenet 2012)
L’anàlisi de les deformacions dels embrions de peix zebra es realitza a 24 hpf, 48 hpf i 5
dpf (dies). Per analitzar les deformacions es mesura a 24 hpf i 48 hpf l’amplada del
cap, la distància entre la vora interior dels ulls i la llargada (de cap a cua) de l’embrió.
Per fer-ho, s’anestesia els embrions, es fa una foto al microscopi i es processa la
imatge amb un programa informàtica especialitzat. Els resultats obtinguts són:
- A 24 hpf: els embrions de 100 mM no presenten malformacions significatives.
Els embrions de 200 mM tenen alguna deformació (edema de pericardi). Els de
300 mM són més petits, tenen les cues corbades o agarrotades i els somites
tenen formes irregulars. Els de 400 mM tenen les deformacions més
accentuades, amb el cap molt més petit.
33
- A 48 hpf es mantenen els mateixos patrons de malformacions. Les
malformacions més corrents són edema de pericardi, malformacions axials,
ciclopia parcial (tenir un sol ull) i ciclopia total.
- Respecte la taxa de mortalitat, no s’aprecien diferències significatives amb el
grup de control excepte per el grup de 400 mM, en el que a 5 dpf el 57% dels
embrions havien mort.
En aquest treball es fa referència a un article que es considera una de les referències
importants en aquest camp (Reimers et al 2004) en el que mitjançant una
experimentació molt àmplia es van calcula les concentracions d’etanol que provoquen
efectes significatius. Aquests resultats són els següents:
- La concentració que causa una mortalitat del 50% en els embrions després
d’una exposició de 48 hores: 380.5 mM
- La concentració eficaç per causar 50% malformacions: 251,2 mM per a les
malformacions axials; 148,5 mM per l'edema pericàrdic, i 158,6 mM de retard
en el desenvolupament.
4. DISSENY EXPERIMENTAL
4.1. Variables d’Anàlisi
A partir de la informació anterior he definit les variables d’anàlisi tenint en compte, a
més, els següents criteris:
- Les variables han de ser de tipus numèric per poder fer càlculs amb les dades i
obtenir resultats objectius.
- No puc fer servir variables que necessitin equipament molt especialitzat per la
seva observació, s’han de poder mesurar amb l’equipament disponible al
laboratori de l’escola.
34
- No puc fer servir programes informàtics molt especialitzats per al tractament
de les imatges obtingudes al microscopi, pel seu elevat preu i dificultat
d’obtenció.
- No puc fer servir variables d’anàlisi que necessitin un coneixement especialitzat
per entendre el seu significat.
Aplicant aquests criteris, les variables d’anàlisi proposades són les següents:
1. Amplada del cap: distància en µm entre els dos extrems del cap més allunyats
units per una perpendicular a l’eix axial.
2. Distància entre la vora interior dels ulls: distància en µm entre dos punts de la
vora interior dels ulls més propers units per una perpendicular a l’eix axial.
3. Retard de desenvolupament: retard entre l’etapa de desenvolupament
embrionari teòrica en el temps que es realitza l’observació i l’etapa de
desenvolupament observada. A l’apartat Protocol d’Observació explico com
l’he calculat.
4. Taxa de supervivència: nombre d’embrions vius respecte el total, en tant per
cent, en el temps en que es realitza l’observació.
5. Taxa d’eclosió: nombre d’embrions que han sortit de l’ou respecte el total , en
tant per cent, en el temps en que es realitza l’observació.
Inicialment també havia previst incloure variables d’anàlisi del moviment, però per a
fer-ho de manera quantificable calia un equipament molt especialitzat (microscopi
acoblat a un equipament de gravació amb un software específic) que només està a
l’abast de les universitats o empreses farmacèutiques. En el seu lloc, vaig realitzar
diverses gravacions de vídeo al microscopi que després vaig analitzar de manera
subjectiva.
4.2. Protocol d’experimentació
En aquest treball intentaré validar les hipòtesis de treball mitjançant l’experimentació
al laboratori. L’experiment consisteix en obtenir embrions de peix zebra per veure les
35
alteracions que genera l’alcohol sobre el desenvolupament embrionari. Per
aconseguir-ho cal tenir una població controlada de peixos zebra estabulats a un aquari,
aconseguir la seva reproducció, i estudiar els efectes del tòxic afegint-lo en diferents
concentracions sobre els embrions als grups d’estudi.
Cal tenir en compte els següents aspectes:
- Laboratori: l’experiment l’he realitzat al laboratori de l’Escola Garbí d’Esplugues de
Llobregat. He tingut accés diari de dilluns a divendres. Durant el període
d’establiment del règim d’estabulació, els migdies anava cada dia per netejar la
peixera, alimentar-los i fer el seguiment corresponent .A l’hora de realitzar
l’experiment el vaig fer després d’acabar el període lectiu de l’escola en el
laboratori durant l’última setmana de Juny i les 2 primeres setmanes del mes de
Juliol. Per fer les últimes observacions, que coincidien en dissabte i diumenge, vaig
consultar amb el Director de l’escola la possibilitat d’anar al laboratori el cap de
setmana, i com això no era possible llavors li vaig demanar si podia emportar-me
un microscopi per poder fer les observacions que faltaven a casa meva. Em va
donar permís i d’aquesta manera vaig poder realitzar les observacions previstes de
les fases del creixement dels embrions .
- Aquari: vaig instal·lar una peixera amb llum pròpia i un temporitzador per simular
les condicions del medi natural. També incorporava un calefactor i un termòstat
per mantenir l’aigua a una temperatura constant equivalent a la del seu medi
natural. L’aquari me’l va deixar el meu oncle veterinari i el vaig instal·lar a l’Escola
el dia 22 d’Abril .
- Condicions d’estabulació: L’ambient va ser controlat. El més important és que el
soroll ambiental havia de ser uniforme, la temperatura de l’aigua constant a 28 ºC
i el pH bàsic i molt estable. Per tant, vaig buscar un lloc a l’escola que permetés
tranquil·litat i fos aïllat . També vaig controlar l’alimentació amb un pinso que em
va aconseguir el Sr. Juan Ramos del PRBB i per els dies abans de la reproducció vaig
preparar al laboratori un altre aliment ideal per la reproducció anomenat Artèmia
(aquest aliment me’l va proporcionar el Parc de Recerca Biomèdica de Barcelona,
PRBB )
36
- Els peixos zebra: en vaig comprar 30 en la proporció mascles/femelles 1/3, que
segons la bibliografia és la més adequada per tenir el màxim rendiment en la
reproducció.
- Aclimatació: un cop instal·lada la peixera amb els peixos vaig esperar sis setmanes
per a que els peixos s’aclimatessin i no tinguessin estrès ambiental, a fi de tenir les
condicions òptimes per la reproducció.
- Condicions de reproducció/Aparellatge necessari: vaig simular les condicions de
reproducció del seu medi natural. Per això vaig construir una paridora en forma de
caixa que per la seva forma facilita la reproducció i la recol·lecció dels ous. Aquests
ous es dipositaven a plaques de Petri que per indicació del Sr. Ramos vaig deixar a
temperatura ambient perquè al ser estiu ja era suficient. Com la última observació
estava prevista a les 72 hores dpf, no va caldre aplicar la normativa europea per al
tractament d’animals vius per experimentació, ja que els peixos zebra han de tenir
7 dies per poder considerar animals d’experimentació.
- Grup de Control: Grup d’embrions als quals no vaig afegir cap tòxic i el vaig fer
servir com referència de les diferents fases del desenvolupament embrionari.
- Grups d’Estudi: vaig fer servir tres grups d’embrions, els vaig afegir etanol en
diferents concentracions. Cada grup els vaig posar a una placa de Petri diferent
amb uns 125 mL de solució i un nombre variable d’embrions vius, depenent del
nombre total d’embrions vius obtinguts en la reproducció.
- Addició del tòxic (etanol) en diferents proporcions: prèviament vaig preparar la
dissolució en tres concentracions diferents, 30, 100 i 300 mM i la vaig afegir als
diferents grups d’estudi 30 minuts després de la fecundació.
- Protocol d’experimentació:
- Col·locar els peixos seleccionats en el tanc de la reproducció.
- Alimentar els peixos seleccionats per la reproducció amb artèmia.
- Posar l’aigua del tanc a 29 graus .
- Inclinar el tanc de reproducció i treure la separació entre els dos
peixos.( 15 h abans de l’inici de l’observació )
- Preparar les diferents dissolucions amb les concentracions : 30, 100 i
300 mM.
37
- Esperar la posta d’ous.
- Retirar els ous i repartir-los entre les plaques de petri amb les diferents
concentracions i la del grup control.
- Observació i contrast de les hipòtesis ,en els instants de temps definits
al protocol d’observacions.
- Per fer l’estudi de les anormalitats morfològiques he fet servir una
càmera fotogràfica amb l’objectiu acoblat a l’ocular del microscopi. Per
l’estudi de les anormalitats del moviment he filmat diversos vídeos amb
el telèfon mòbil també acoblat a l’ocular.
- Protocol d’observacions: a l’experiment vaig estudiar els efectes en els embrions
abans de que arribin a larves, per tant vaig fer observacions a les etapes més
significatives del seu desenvolupament i amb una diferenciació visual el més clara
possible respecte l’etapa anterior. Els punts d’observació que vaig fixar van ser els
següent:
- Per cada grup, anàlisi de l’afectació: com l’alcohol és un tòxic per al sistema
nerviós vaig analitzar els seus efectes mitjançant l’observació de les anormalitats
morfològiques i els moviments dels embrions. També vaig comptabilitzar la taxa de
supervivència i la taxa d’eclosió. Les anormalitats les vaig estudiar amb les variables
d’anàlisi definides a l’apartat anterior. Per fer-ho vaig fer servir els següents
mètodes:
N hpf dia hora
1 6 dij 15
2 10 dij 19
3 23 div 8
4 33 div 18
5 48 diss 9
6 72 diu 9
Taula 6 : punts d’observació
38
- Fotografies digitals guardades a l’ordinador de forma estructurada per
identificar el moment en que s’han realitzat.
- Vídeos digitals guardats a l’ordinador de manera estructurada per saber el
moment en que s’han realitzat.
- Taules Excel amb les observacions anotades de forma seqüencial amb l’hora
de la seva realització, i utilització de magnituds relatives per identificar els
percentatges de les variables dependents (% de mortalitat ,% d’una
anomalia determinada, etc. )
- Anàlisi de les dades i conclusions: vaig analitzar les dades recollides a cada fase del
desenvolupament i les vaig comparar amb les del grup de control i amb la
literatura de referència. He analitzat si les hipòtesis depenen de la concentració i si
no es compleixen per algunes concentracions determinades. Per al tractament de
les dades numèriques he fet el següent:
o Enregistrar els valors absoluts observats per a cada
concentració i etapa observada i calcular les mitjanes
aritmètiques acotades, és dir, traient els valors que eren molt
diferents de la resta.
o Calcular les diferències relatives en tant per cent de les mitjanes
dels grups contaminats amb etanol respecte el grup de control.
- Eines específiques d’anàlisi: per analitzar algunes variables he fet servir algunes
eines específiques:
- Taula de les etapes de desenvolupament numerada: a fi d’avaluar el
retard de desenvolupament he construït una taula a partir de la que es
dona a (http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html) afegint un número
seqüencial per a cada etapa o subetapa en la que hi ha canvis
morfològics. D’aquesta forma el retard de desenvolupament es pot
calcula de forma molt senzilla:
o Retard en etapes = Nº Etapa teòrica – Nº Etapa observada
39
o Retard en temps = Temps (hpf) corresponent a l’etapa teòrica –
Temps (hpf) corresponent a l’etapa observada.
En el annex 3 incloc una taula amb els punts d’observacions
realitzades subratllats en groc:
- Programa de mesura sobre pantalla d’ordinador: com vaig realitzar
moltes fotografies al microscopi, per mesurar les distàncies vaig
considerar que el més pràctic seria emprar algun programari que
permetés mesurar directament a la pantalla de l’ordinador. Després
d’informar-me a diversos blocs vaig seleccionar el programa MB-Ruler.
És un programa que per la utilització personal i acadèmica és gratuït i
permet mesurar de forma molt senzilla les distàncies i els angles.
5. ESTABLIMENT DE LES CONDICIONS D’ESTABULACIÓ.
5.1. Materials.
1. Aquari: Marca Aquatlantis, model Aquadream 100
Característiques: Capacitat: 115 Litres, Mides:
100x30x45 cm, Il·luminació: T8-25W, Filtres
2. Escalfador: model Tetratech
3. Bomba d’aigua:
la bomba que portava l’aquari es va espatllar i vaig haver de substituir-la. Vaig
comprar-la a la mateixa botiga que em van vendre els peixos:
Fotografia 13 : escalfador (G.Camps)
Fotografia 12: aquari(G.Camps)
40
4. Oxigenador:
5. Kit del nitrogen
6. 1 ampolla per cada Grup de Solucions d'etanol (30, 100, 300 mM d'etanol)
7. 1 vas de precipitats per cada grup d'embrions morts i per l'eliminació de líquids
8. Plaques de Petri per les diferents mostres (mida 90mm)
9. Diverses pipetes d’un sol us
10. Lupa binocular/Microscopi
11. Tub aspirador de neteja de la peixera(sifó)
12. Sobres de preparat Artèmia alimentici i aliment sec
13. Dispositiu-Caixa per la reproducció
14. 1 telèfon mòbil smartphone
15. 1 càmera fotogràfica compacta amb objectiu
Pressupost
20 peixos x 1,9 = 38 €
10 peixos x 1,5 = 15 €
1 bomba d’aigua: 16 €
1 temporitzador: 11 €
Càrrega inicial d’aigua: 16 garrafes de 8l + 1 €/u = 16 €
Manteniment aigua: 4 garrafes de 8l per setmana* 1 €/u* 10 setmanes: 40 €
Total.......................................................................................................... 136 €
Fotografia 14 : Instal·lació de la bomba Fotografia 15: Bomba nova (G.Camps)
F(GCCCCampsCCamps
41
A més, he tingut la sort de que el meu oncle veterinari m’ha deixat l’aquari que té
un preu d’uns 150 €.
5.2. Obtenció del peix zebra
Els peixos s’han d’obtenir en un mínim de 6 setmanes d’antelació de l’experiment, és
necessari perquè cal que els peixos s’aclimatin a la peixera i estiguin còmodes . Com
havia previst realitzar l’experimentació a l’acabar el curs, les primeres setmanes de
juliol, la tercera setmana de maig vaig anar a comprar-los.
Trobar els peixos zebra adults i amb capacitat de reproducció en el temps que
necessitava no va ser senzill. Vaig haver de contactar amb totes les botigues
especialitzades de Barcelona. Més avall dono les dades. A continuació comento alguns
dels llocs que vaig contactar.
En primer lloc vaig anar a una botiga força gran que em va recomanar el Sr. Juan
Ramos, que es diu Hobbypeix que està a la Gran Via. Allà els peixos zebra Danio Rerio
que tenien eren massa petits i em van dir que trigarien un 2 o 3 mesos a ser
sexualment madurs. En tenien uns altres que ja eren
madurs d’una altra varietat , el Danio Frankei també
conegut com danio lleopard. Però com no tenia la
seguretat de que el model d‘experimentació i el
desenvolupament embrionari fossin els mateixos que els
del Danio Rerio no els vaig comprar.
Fotografia 16 : Danio Frankei (lleopard) (Seriouslyfish 2014)
També vaig anar a una botiga del carrer Tallers, que es diu Dauer Acuarios. Allà tampoc
en tenien i em van dir que era molt difícil que els trobés madurs perquè tots
s’importaven des del Sud-est asiàtic quan encara eren immadurs i a les botigues els
venien així. Em van dir que només en trobaria si alguna persona que hagués desmuntat
un aquari els tornés a la botiga. També em van avisar que no em podia fiar de la mida
42
dels peixos perquè a vegades els feien créixer de mida per vendre’ls millor però no
eren madurs sexualment.
A Furious Fish només tenien peixos d’aigua salada.
Un altre lloc que vaig intentar anar era una botiga del carrer Ciutat de Granada. Aquest
lloc també me’l va recomanar el Sr. Juan Ramos, però allà em van dir que nomes
venien a majoristes per tant no me’ls podien vendre a mi.
Després de trucar a totes les botigues de la llista finalment la llista es va reduir a dos
possibles proveïdors: Floraqua del carrer València i Sirio Acuarios del carrer Sicília. A
Floraqua vaig tenir la sort de que el propietari és un biòleg que coneixia al Sr. Juan
Ramos, sabia exactament el que necessitava i tenia una partida per entregar a la
Universitat Autònoma de la que en podia separar uns 20. Com l’aquari
d’experimentació és bastant gran i el Sr. Ramos em va dir que els peixos zebra
necessitaven “trobar-se” per tenir un entorn òptim de desenvolupament vaig demanar
a Sirio si en tenien més. Allà no en tenien però quan li vaig explicar la meva necessitat
la propietària va ser molt amable i va buscar per tots els majoristes fins que en va
trobar 10 més.
D’aquesta forma vaig aconseguir tenir un població de 30 peixos zebra, suficient per la
mida de l’aquari. Totes aquestes gestions van trigar una setmana, és dir que si no ho
hagués aconseguit no hauria pogut fer l’experimentació al juliol.
Llista de botigues contactades:
Hobby Peix
www.hobbypeix.com 932 658 200
Dauer Acuarios
www.daueracuarios.com - 933 18 22 41 - 7
Floraqua Acuarios
www.floraqua.es - 934 54 05 81
Mon Animal 3
www.monanimal3.es - 932 10 80 55
Furious Fish Barcelona
www.furiousfish.es - 934 59 15 49
Sirio Acuarios
www.sirioacuarios.com - 933 47 03 07 - 3
AQA Espai Aquaris Naturals
www.aqaespai.com - 935 39 96 90 - 3
Hiper Exotic Zoo
www.hiperexoticzoo.com - 932 25 07 87 - Más
43
5.3. Disposició dels tancs de peixos
5.3.1. Il·luminació i fotoperíode
La il·luminació és un aspecte molt important de cara a garantir unes condicions
d’estabulació el més properes possible al seu medi natural. Això és fonamental per
tenir èxit en la reproducció. De la recerca bibliogràfica que he realitzat he vist que per
tenir unes condicions òptimes els peixos zebra necessiten un període constant
d’il·luminació (fotoperíode) i de foscor des d’un temps previ de 6 setmanes i durant tot
l’experiment.
L’aparició de la llum després del període de foscor activa el comportament
reproductor (Reed et al 2010). D’altra banda, també s’ha comprovat que les larves que
han crescut en ambients de llum constant presenten dèficits severs d’agudesa visual,
encara que recuperen la capacitat normal un cop es restaura el fotoperíode estàndard.
També s’ha comprovat que si es manté els embrions en foscor constant es retarda
notablement el seu desenvolupament, fins el punt que no s’observa l’eclosió de l’ou
fins al cap de 7 dies.
A la literatura es dona uns valors estàndard de 14 hores de fotoperíode i 10 hores de
foscor. Tanmateix l’habitat natural d’aquests peixos és a zones subtropicals del Sud-est
asiàtic, com Myanmar, on els períodes de llum varien des d’unes 10 ¾ hores al solstici
d’hivern fins unes 13 ½ hores al solstici d’estiu. Per tant, valors del fotoperíode dins
d’aquest interval també haurien de ser vàlids. En conseqüència he adoptat un valor de
12 hores de llum, de les 7:00 fins les 19:00. D’aquesta forma s’aconsegueix un equilibri
entre una major activitat metabòlica i un interval de descans semblant al del medi
natural.
La il·luminació l’he fet amb un llum fluorescent inclòs a l’aquari i el fotoperíode l’he
programat en el temporitzador que comento a l’apartat de materials.
44
5.3.2. Temperatura
Els peixos zebra són animals poiquiloterms, el que vol dir que els seus processos
metabòlics estan regulats per la temperatura. Especialment el sistema immunitari, que
es veu afectat per canvis de 5ºC en la temperatura del medi (Ramos 2011).
Segons la bibliografia (Reed 2010, ZFIN 2014) la temperatura òptima per al creixement
i l’estabulació dels peixos zebra és de 28,5 º C, tot i que els embrions poden sobreviure
entre les temperatures de 24 i 33 ºC.
En el meu cas he escalfat l’aigua de l’aquari a una temperatura constant de 28 ºC
mitjançant l’escalfador inclòs a l’aquari. Abans de la posta d’ous he apujat la
temperatura mig grau fins a 28,5 ºC.
5.3.3. Aigua
El peix zebra pot semblar que s’acostuma al seu entorn i, com a tal, aparentment pot
habituar-se a certes vibracions, per exemple la bomba de l’aquari. Però també poden
reaccionar amb intensitat als sorolls forts i sobtats o a noves vibracions. Per tant s'han
de prendre mesures per evitar aquest tipus de trastorns. Idealment, qualsevol equip
que generi sorolls o vibracions discontinues no s'ha de mantenir a la mateixa habitació
on hi ha els peixos (Reed et al 2010)
També s'ha suggerit que la posta d’ous d’aquests peixos es pot veure afectada si
l’entorn és molt sorollós o si hi ha una gran quantitat de moviment proper.
Per aconseguir un ambient lliure de sorolls i vibracions he instal·lat l’aquari a
l’habitació annexa al laboratori de l’escola, on hi ha materials diversos, que està aïllada
per una porta. L’aquari l’he instal·lat al terra, amb l’ajuda del Sr. Pere de Manteniment,
damunt uns suports de fusta que l’han fixat.
45
5.3.4. Densitat de la població
Mantenir els peixos zebra en condicions d’amuntegament perjudica el seu benestar.
Els individus adults estabulats en condicions d’elevada densitat de població s’ha
observat que presenten un increment de fins 4 vegades el nivell normal de cortisol
(hormona associada al estres) i una disminució significativa de la producció d’ous
(Reed et al 2010). El grau de desenvolupament també es veu afectat, s’ha observat que
és més lent en els entorns d’elevada densitat de població.
A la literatura hi ha molta dispersió en els valors recomanats que van entre 5 peixos
per litre d’aigua per manteniment d’adults fins 2 peixos en 1,5 litres d’aigua en període
de reproducció. Agafant aquest últim valor, com en el meu experiment he fet servir 30
peixos, caldria un volum mínim de 30/2*1,5 = 22,5 l. Com l’aquari que he fet servir és
de 100 litres, compleix àmpliament les recomanacions.
Un altre aspecte a tenir en compte (Ramos 2011) és que són animals gregaris i
prefereixen estar amb altres animals del mateix fenotip amb els que han estat criats.
Això s’aconsegueix comprant simultàniament tots els peixos del mateix
subministrador. En el meu cas això no va ser possible pels problemes que explico a
l’apartat Obtenció del peix zebra, però ho vaig mitigar deixant que convisquessin junts
durant un període llarg.
5.3.5. Introducció dels peixos zebra en la peixera després del transport
És important mesurar la diferència de temperatura entre l’aigua del transport i la de
l’aquari .Si la diferencia supera els 4 graus és imprescindible fer una aclimatació lenta
de la temperatura , perquè sinó hi hauria un risc elevat per els peixos.
Per tant s’ha de fer una aclimatació. Per ajudar als peixos a fer-la és convenient baixar
una mica la temperatura de la peixera abans de l’arribada dels peixos , apagar la llum
de l’aquari durant la fase d’aclimatació i per últim també es recomana no donar-los de
menjar fins el dia següent. A continuació explico el procediment que s’ha de seguir per
fer una correcta aclimatació dels peixos.
46
1. Mesurar la temperatura de l’aigua del transport.
Determinar la diferència de temperatura entre l’aigua del transport i l’aigua de
l’aquari.
2. Ajust de la temperatura amb la bossa tancada
Si la diferència de temperatura és major dels 4
graus s’ha de deixar la bossa flotar una estona a
l’aquari de manera que s’iguali la temperatura
de l’aigua de la bossa de transport amb la del
aquari.
3. Adaptació de l’aigua amb la bossa oberta.
Un cop la diferència de temperatura és menor
els 4 graus ,s’ha d’obrir la bossa de transport i
posar la mateixa quantitat de l’aigua de l’aquari
en la bossa dels peixos que la que tenia de aigua
de transport . Agafar un recipient omplir-lo de
aigua de la peixera i abocar-la en la bossa de
transport , i repetir aquest procediment aproximadament uns 3
cops fins que la temperatura de la bossa i la de
l’aquari siguin les mateix
4. Introduir els peixos amb cura a l’aquari amb
ajuda de una reixeta.
5. Tirar l’aigua de transport. Un cop fet tot el
procediment ja es pot tirar l’agua del transport
Figura 7: correspodència amb el punt 1 ( G.Camps )
Figura 8: correspodència amb el punt 2 ( G.Camps )
Figura 9: correspodència amb el punt 3 ( G.Camps )
Figura 10: correspodència amb el punt 4 ( G.Camps )
47
.
5.4. Condicions de estabulació i manegament
5.4.1. Aigua
L’aigua és un component molt important
per el manteniment del peix zebra. En el
meu experiment he fet servir sempre
l’aigua mineral natural .És important que
Fotografia 24 :Anàlisi química Fotografia 25 : Etiqueta de l’aigua
Fotografia 17 : Fase 1 (Mesurar la temperatura de l’aigua del transport)
Fotografies 18 i 19 : Fase 2 ( Ajust de la temperatura amb la bossa tancada )
Fotografies 20 i 21 : Fase 3 (Adaptació de l’aigua amb la bossa oberta)
Fotografies 22 i 23 : Fase 4 (Introduir els peixos amb cura a l’aquari amb ajuda d’una reixeta ) Fotografies :G.Camps
48
tingui un nivell baix de minerals en l’aigua .
És important portar un seguiment dels diferents paràmetres de l’aigua
com poden ser el PH ,la conductivitat , i els compostos nitrogenats. És
molt important mantenir estables aquets paràmetres per evitar que es
produeixin danys interns al peix zebra .Per tant un cop a la setmana cal
mirar el pH i la conductivitat. Per als peixos, el pH de l'aigua està
relacionat amb la necessitat de mantenir un equilibri àcid-base en la
seva sang. En aquest cas es mantindrà un pH de 7,2 perquè el NH3 que
es trobi dissolt en l'aigua i el qual és tòxic, reaccioni amb els H + per
donar NH +4 que és inofensiu per als peixos. és el pH que s’ha de
mantenir sempre al voltant del 7,4 .Però alguns dels subministraments municipals
d’aigua s’eleven a 8,0 o més per reduir la lixiviació de coure ,etc. dels tubs.
Un altre paràmetre que cal mesurar és la conductivitat que és una mesura que indica
la quantitat de sals dissoltes en el medi. Aquest paràmetre només el vaig mesurar el
principi de tot en el laboratori de Juan Ramos per controlar que l’aigua que posava a la
peixera tenia una conductivitat bona .A l’escola no ho vaig poder mesurar perquè no
tenim cap instrument de mesura que ho permeti.
La concentració de nitrats, nitrits i amoni també s’ha d’anar controlant amb l'ajuda
d'uns kits comercials. Per a això es necessitarà una pipeta Pasteur per peixera i un
recipient per cada mostra d'aigua que es vol fer reaccionar. És molt important
mantenir en tot moment condicions d'higiene perquè podria variar els resultats .
A continuació explicaré perquè es tant important i en que varien els compostos
nitrogenats:
CICLE DEL NITROGEN A LA PEIXERA
Els peixos s’alimenten entre altres coses per proteïnes ,existeixen uns
microorganismes que contenen enzims proteases i peptidases ,les quals actuen a
Fotografia 26 : phmetre ( valor obtingut en un anàlisi de l’aigua )- G.Camps
49
través un procés anomenat hidròlisi , trencant enllaços peptídics i donant com a
resultat els seus components elementals, els aminoàcids. Aquests es poden separar en
el grup amino, això origina l’alliberament de l’amoníac (Patak 1999) . L’amoníac és la
primera substància que es forma en el cicle del nitrogen y és la més tòxica per la
majoria dels peixos. En la natura això no té conseqüències perquè el volum de l’aigua
per un peix és molt elevat i els productes de rebuig queden molt diluïts . En canvi, en
les peixeres en poques hores l’amoníac pot arribar a nivells tòxics. L’amoníac que
trobem en la nostra peixera es pot trobar de dues formes : com amoníac (NH 3 ) i com a
ió amoni (NH4+).La proporció d’un o de l’altre dependrà sobretot del pH i també però
amb menys grau de la temperatura. El nivell d’amoníac ha de ser 0 mg /l o ppm als
0,001 ppm . A una concentració de 0,25 mg/l ja podrien morir peixos abans dels 3 dies.
L’amoníac pot tenir augments temporals causats per : la addició de gran quantitat de
peixos a la vegada, la sobrealimentació, la falta de filtre o de manteniment, etc.
Per solucionar aquest problema hi ha un cicle, que anomenem el cicle del nitrogen. El
cicle del nitrogen és un procés biològic que converteix l’amoníac en un altre compost
de nitrogen relativament menys tòxic per els peixos. Aquest cicle el controlen unes
bacteris: l’espècie de les nitrosomones i el nitrobàcter .
Primer les Nitrosomones converteixen l’amoníac (NH3) en nitrits (NO2 ).
2 NH3 + 3 O2 = 2 HNO2 + 2 H2O
Figura 11 : esquema del procediment del cicle del nitrogen ( Il·lustració feta amb el Notablity G.Camps )
50
Aquest no té la toxicitat de l’amoníac , però resulta perjudicial per la salut dels peixos.
Els afecta sobretot a la hemoglobina impedint la seva oxigenació . Des de l’exterior
podem observar aquest problema pels seus símptomes, com la disminució de la seva
activitat normal , el peix deixa de menjar , i finalment mor. El nivell òptim pels nitrits és
de 0 mg/l o ppm però es pot acceptar fins els 0,1 ppm.
En la segona fase intervenen bacteris de l’espècie dels Nitrobacter que converteixen
aquests nitrits en nitrats (NO3).
HNO2 + ½ O2 + HNO3
Com a resultat d’aquest procés els nitrats començaran a acumular-se lentament en la
peixera. És important no deixar que aquesta concentració s’elevi , perquè igualment
que sigui molt menys tòxic que l’amoníac o el nitrit , la seva acumulació pot portar
conseqüències al llarg del temps a la salut en general, la criança i la reproducció dels
peixos.
El més convenient seria mantenir els nitrats per sota de 50 mg/l o ppm tot i que el més
òptim seria no sobrepassar els 25 mg/l.
Gràfica 2 : cicle del nitrogen (Patak 1999)
En gràfica 2 es pot observar els nivells de cada molècula durant aquest procés cíclic. Al
principi els nivells d’amoníac pujaran i desprès baixarà el seu nivell quan comencin a
treballar els nitrosomes, primers bacteris nitrificants .Els altres bacteris nitrificants no
51
començaran a actuar fins que no hi hagin una quantitat significativa dels nitrats ,per
tant a mesura que els primers bacteris van convertint l’amoníac els nivells de nitrits es
dispararan . Quan els bacteris formadors dels nitrats se’n facin càrrec , els nivells de
nitrits baixaran, i els nivells dels nitrats augmentaran .Els nitrats seran els que nosaltres
anirem traient en fer el canvi d’aigua. L’aigua peixera haurà completat el cicle.
En una peixera abans de posar els peixos s’ha d’establir en l’aigua tot un món
biològicament actiu , per assegurar-se que la seva vida allà és saludable. El cicle
explicat anteriorment es forma a la nostra peixera de manera natural però no es
desenvolupa immediatament , si no que necessita un temps per establir-se .El procés
de colonització dels bacteris es produeix sense cap tipus d’intervenció més que una
font de matèria orgànica. Una vegada s’ha omplert la peixera i s’han posat a funcionar
els filtres ,s’ha de posar una mica d’amoníac (afegint menjar de peix, per exemple) per
començar el cicle ,perquè la quantitat que pot tenir l’aigua es escassa. Es necessari un
temps de unes 5- 6 setmanes aproximadament per assegurar que la peixera té la carga
biològica completa, d’aquesta manera estarem constituint un ambient molt més
saludable i habitable per els peixos.
En el cas del meu aquari, per reduir el temps de la formació d’aquest cicle vaig
introduir els bacteris ja formats que em va donar el senyor Juan Ramos del PRBB.I vaig
deixar uns 15 dies per a que aquests bacteris fessin el cicle a la peixera. Els bacteris els
vaig mantenir durant un dia en un recipient on en el fons hi havia una sorra molt fina
on estaven enganxats els bacteris. El recipient s’havia d’oxigenar amb un oxigenador
que el que feia era fer ascendir
sorra fina del fons ,de manera
que es moguessin els bacteris
en el recipient. El dia següent
ho vaig introduir a la peixera .Li
vaig posar una petita quantitat
del pinso de peix per a que
formes amoníac i comences el
Fotografia 27 : aquari ciclat ( G.Camps )
52
cicle dels nitrats.
L’Aigua
PROTOCOL D’ANÀLISI DE L’AIGUA :
Material:
Figura 28 : material necessari per fer l’anàlisi de l’aigua ( G.Camps )
NH3 / NH 4
L’amoníac és un nutrient que conté nitrogen i hidrogen. La seva fórmula
química és NH3 en el seu estat sense ionitzar i NH4 + en la forma ionitzada. la suma
de NH3 i NH4 + constitueix l'amoníac que es mesura analíticament en l'aigua. Un nivell
elevat d’amoníac indica que la vida dels bacteris en el filtre està alterada i no s’ha
desenvolupat bé. Especialment perillós resulta l’amoníac ( NH3) que s’origina a partir
del ( NH 4) quan el PH sobrepassa el valor
de 7. Nivells d’amoníac de més de 0,02
mg/ l són a llarg termini nocius per les
brànquies dels peixos. Per això a més de
mesurar l’ NH4 també s’ha de mesurar el
PH . Per això, per evitar que l’aigua es
degradi en excés cal canviar un cop a la
setmana un quart de la peixera.
Fotografia 29 : material per el test NH3 / NH 4 ( G.Camps )
53
Procediment : (agitar els reactius abans d’utilitzar-los)
NH4 Valor de pH
7 7,5 8 8,5 9
0,5mg/l 0,003 0,009 0,03 0,08 0,18
1 mg/l 0,006 0,02 0,05 0,15 0,36 Contingut
de NH3 en
mg/l
2 mg/l 0,01 0,03 0,11 0,30 O,72
5 mg/l 0,03 0,09 0,27 0,75 1,80
10 mg/l 0,06 0,17 0,53 1,51 3,60
Taula 6 : resultats de l’amoníac , de més correcte ( vermell clar ) al més incorrecte ( vermell intens)
1. Aclarir la cubeta diverses vegades
amb l’aigua de la peixera .A
continuació l’emplenem fins la
marca de 10ml . Secar la cubeta per
la part exterior .
2. Afegir 6 gotes del reactiu 1 i moure la cubeta fins que el
líquid s’hagi dissolt bé.
3. Afegir 6 gotes del reactiu 2 i tornar a moure la cubeta .
4. Afegir 6 gotes del reactiu 3 i agitar la proveta de la
mateixa manera.
5. Esperar 5 min i despres comparar els colors amb la plantilla. Colocar la proveta sobre la escala de
colors i observar-ho per sobre per veure quin color de la mostra correspon amb un color de la
escala.
6. Netejar bé tot el material utilitzat.
RESULTAT
54
El Nitrit
L’ NH 2 apareix a la peixera com a producte
intermedi de la descomposició dels excrements. És
menys perillosa que l’amoníac però a grans
quantitats també ho pot ser. El nitrit es forma a
partir de l’amoníac , i els bacteris d’un filtre amb un
bon funcionament el converteixen en nitrats. Per
aquest motiu la proporció de nitrit també s’ha de
comprovar, seguint aquest procediment :
Taula 7 : resultats dels nitrits , de més incorrecte ( vermell clar ) al més correcte ( verd )
NO2 Descripció i mesures
5,0 mg/l Aquesta quantitat és tòxica en aquest cas
s’hauria de canviar parcialment l’aigua
2,o mg/l Perillosa ,realitzar un canvi de l’aigua.
1,0 mg/l Perjudicial
0,5 mg/l Innocu
0,0 mg/l Bona
1. Aclarir la cubeta amb l’aigua que
volem analitzar , seguidament
emplenar-la fins els 5ml. Secar la
cubeta per la part exterior.
2. Afegir 5 gotes del reactiu 1 y 5 gotes
del reactiu 2
3. Agitar la cubeta lleugerament fins
que el líquid estigui ben repartit
4. Al cap de 5 minuts s’ha de comparar els color.
Per fer-ho, s’ha de col·locar la cubeta sobre
l’escala i observar per sobre a quin color
s’assembla més.
5. Netejar tot el material. Fotografia 30 : RESULTAT ( G.Camps )
Fotografia 29 : material per el test NH 2
(G.Camps )
55
Nitrat
1. Netejar la cubeta i emplenar-la fins els 10 ml,
fer el mateix que en els altres casos.
2. Aplicar 6 gotes del reactiu 1 y seguidament
agitar. Fer el mateix amb el reactiu 2.
3. Utilitzant la cullera dosificadora ( vermella )
,afegir una cullerada del reactiu 3.
4. Tancar la cubeta amb la tapa i barrejar amb
força durant 15 segons.
5. Obrir la cubeta i afegir 6 gotes del reactiu 4 .A
continuació cal esperar 5 minuts.
6. Per últim fer el mateix que els dos altres casos per saber la quantitat de nitrat.
Si trobem que hi ha nitrat en la mostra d’aigua és un bon senyal ja que vol dir que el
cicle del nitrogen a la peixera funciona. Aquest nitrat és el que disminueixo la seva
quantitat quan extrec un quart de l’aigua de la peixera un cop per setmana. El NO3 és
el component final del cicle i és molt menys tòxic que el amoníac.
Si trobem que hi ha nitrat en la mostra d’aigua és una bona senyal ja que vol dir que el
cicle del nitrogen a la peixera funciona. Aquest nitrat és el que disminueixo la quantitat
quan extrec un quart de l’aigua un cop per setmana. El NH3 és el component final del
cicle i és molt menys tòxic que el amoníac.
Fotografia 32 : RESULTAT (G.Camps )
Fotografia 31 : pas del procediment correspondent amb el punt 1 (G.Camps )
56
5.4.2. Alimentació i nutrició
A l'hora de alimentar es tindrà en compte que són organismes als quals els agrada
caçar el seu propi menjar i que a més solen empassar sencera. En el seu àmbit natural
són depredadors tant de larves d'insectes com d'altres organismes que habiten prop
de plantes submergides en les ribes dels rius. Fins i tot són peixos carnívors que
mengen els seus propis ous després de la fresa. Això pot resultar un inconvenient a
l'hora de reproduir-los en captivitat.
La boca situada en una posició superior només els permet menjar aliments que
estiguin per sobre d'ells. Un cop aquest menjar baixi, serà difícil que puguin arribar a
atrapar-la, per això haurem d'evitar donar-los menjar quan hi hagi algun corrent
perquè aquesta no baixi de forma ràpida impedint que els peixos puguin atrapar-la, és
a dir, de treure el subministrament d'aire quan se'ls vagi a donar de menjar o donar-
los-hi en una zona de l’aquari on no toqui l’aire.
Els requeriments nutricionals no es coneixen molt bé, per això s'han pres com a model
els coneixements sobre la nutrició d'altres peixos que poden ser aplicats als del peix
zebra.
La dieta constarà de dos tipus de menjar, una és el menjar viva i l'altra el menjar
processada. La dieta visqui inclou algunes espècies de zooplàncton, en aquest cas
s'utilitzaran larves de Artèmia salina . En canvi, la dieta processada s'utilitzarà per
reemplaçar la dieta viva i estarà preparada amb materials biològics; es podrà trobar en
forma d'escates o en forma de grànuls. En el meu cas he fet servir en forma de grànuls,
es tracta d'una alimentació comercial utilitzada en qualsevol aquari típic. Emprar
aliment comercial implica una sèrie d'avantatges com ara un major estalvi del temps i
de l'economia, mantenir un major control en els estats nutricionals i reduir l'entrada
de patògens i toxines. Encara que també tindrà inconvenients ja que no se sap amb
claredat la nutrició del peix zebra, de manera que no se sabrà si amb l'alimentació
processada estem actuant de manera efectiva en el seu requeriment nutricional.
57
Artèmia
.
L’artèmia és un petit crustaci marí que, curiosament, gairebé no ha evolucionat des del
Triàsic. Per tant, són els branquiòpodes més primitius ,i tal com s’indica al seu ordre (
anostracis ) no tenen closca . Es caracteritzen per la seva capacitat d’adaptació a l’alta
salinitat, raó per la qual han tingut pocs depredadors naturals i han pogut mantenir-se
com a espècie fins al dia d’avui. Viuen a rius o a llacs d’aigua salada (com el Mar Caspi),
mai la trobarem als oceans. Pot viure en salines artificials o en basses salades naturals
no marines i per tant, també es pot criar amb molta facilitat. És un crustaci molt actiu
.Presenten gran capacitat de colonització , generen grans
poblacions en un temps curt. Els peixos i les larves d’insecte
són els seus depredadors principals, però, donat que els
seus hàbits són estranys i irregulars, no acostumen a
coincidir amb els depredadors. Hi ha moltes espècies
diferents dins del grup de les artèmies, com ara l’artèmia
franciscana, la monica, la tibetana, etc. (Falcó 2010).
Nosaltres estudiarem l’artèmia salina.
L’artèmia té un cicle vital molt característic que l’ha permès
sobreviure a través dels mil·lennis. Els seus ous són metabòlicament inactius, i poden
romandre en aquest estat estàtic durant anys, fins i tot sense oxigen i amb
temperatures inferiors a zero. Quan les característiques del medi són propícies, els ous
eclosionen i neixen les larves. De mitja, les artèmies tenen un cicle vital d’un any.
Fitxa sistemàtica
• Tipus: Artròpode.
• Superclasse: mandibulats
• Classe: Crustaci.
• Subclasse:Branquiòpodes
• Ordre: Anostracis.
• Família: Artemids
• Gènere: Artemia
• Espècie: salina
Fotografia 34 : diferències entre les artèmies femelles i els mascles . (Falcó 2010)
Fotografia 33 : aspecte de l’artèmiia adulta (Acuariofilia 2014)
58
S’alimenten d’algues planctòniques en estat natural, tot i que en captivitat poden
alimentar-se també de llevat o farina (Domènech 2006).
Manteniment i cria
La cria d’aquests organismes és relativament senzilla:
Material necessari :
Muntatge
Preparació del recipient: ha de ser fosc menys en una ratlla on
entrarà la llum .L’artèmia es guia per la llum , per tant quan ja
hagi eclosionat l’artèmia s’acumularà en aquesta franja de llum
que hi haurà en el recipient ,d’aquesta manera serà més fàcil
agafar-la .
Preparació de l’aigua salada : utilitzar aigua mineral i afegir –hi sal marina amb la
proporció següent: 35 grams de sal marina per cada litre d’aigua. En el meu cas el
recipient era de 5 l per tant seguint la proporció li tocaria 175 grams de sal.
Fotografies G.Camps
2 .Peso la sal per obtenir 175 grams , després la introdueixo el
recipient per formar la dissolució .
1. Introdueixo 5 l
d’aigua mineral
1- Aquari
2- Ous d’artèmia(vigilar que no
estiguin caducats).
4- Sal marina.
6- Escalfador (per si hi ha grans
variacions de temperatura).
7- Termòmetre(millor adhesiu).
9- Aigua
Fotografia 35 : resultat del recipient fet a mà ( G.Camps )
59
La temperatura ideal per a la cria d’artèmies oscil·la entre els 25–30°C.Es pot
posar un termoscalfador i un termòmetre .
Per aconseguir una bona aeració es
posa un tub de plàstic connectar al
compressor, però sense pedra
difusora.
Per últim posar 1 gram d’ous
d’artèmia en el recipient.
Un cop ja està tot el muntatge fet s’ha d’esperar l’eclosió dels ous entre 24 – 30 h .
Figura 11 : procediment de l’eclosió dels ous d’artèmia. Sorgeloos 1986
artèmia
Com es pot veure en la figura 11 , el quist es comença a hidratar i si les condicions són les
adequades es produeix la represa del desenvolupament de l'embrió. Els quists segueixen absorbint
aigua fins que passades una 15 h s'obren i es produeix l'alliberament del nauplio encara embolicat
en la seva membrana d'eclosió
Fotografia 37: recipient de l’artèmia amb aeració , amb un termòmetre i un termoscalfador (G.Camps )
Fotografia 36 : tirant els ous d’artèmia en l’aigua salada (G.Camps )
Fotografia 38 : procediment d’ eclosió ( G.Camps )
60
Fotografia 38 : procediment d’ eclosió ( G.Camps )
5.4.3. Neteja i manteniment
És important fer una neteja de la peixera amb regularitat perquè no només s’acumulen
nitrats en el medi , sinó que també s’acumulen sals procedents de l’alimentació dels
peixos , a través dels seus excrements i també per la descomposició del menjar. La
brutícia y el creixement d’algues és evident en els costats de l’aquari.
Per tan, s’ha de reemplaçar l’aigua un cop a la setmana .També cal un filtre biològic
que elimina i transforma els residus tòxics .El filtre biològic és molt important per el
cicle del nitrogen ja que es on s’instal·len les bactèries ( bactèries nitrificants
anomenades nitrosomes i nitrobàcter ) aquest filtre no cal netejar-lo però de tant en
tant s’ha de comprovar que tot funcioni correctament. En el meu aquari a part
d’aquest filtre en vaig posar un altre a causa de les seves dimensions , però aquest
filtre era de carboni actiu aquest només absorbeix y reté amb la finalitat de netejar-la
.Aquest filtre si que s’ha d’anar netejant i treure tots els residus absorbits . Igualment,
cada dia s’ha de netejar amb un sifó l’aigua del fons del tanc per tal d’eliminar
l’aliment no consumit i els residus.
61
6. REPRODUCCIÓ DELS PEIXOS
La reproducció es veu molt influenciada per factors externs com el tipus d'alimentació
o la il·luminació. La reproducció es produeix a primeres hores del matí. L'alimentació
ha d'estar basada en menjar viu en el meu cas vaig utilitzar l’artèmia, ja que tenen una
proporció de nutrients més grans que el menjar preparat i els proporciona una major
aportació d'energia.
En el seu medi natural el creuament el realitzen en els recessos d'aigua que queden en
els marges de les llacunes, aquesta zona normalment és poc profunda i amb abundant
vegetació. Els ous fecundats cauran al substrat i quedaran tapats per les plantes,
d'aquesta manera els seus progenitors no podran menjar-se'ls. Per a l'expulsió d'ous i
la seva posterior fecundació.
Tardarà 1 o 2 hores , el mascle colpeja la cua de la femella amb el cap, mentre aquesta
intenta escapar ,com a conseqüència la femella expulsa centenars d’ous i gràcies a les
substàncies que es dispersen en l’aigua , el mascle expulsa els seus espermatozoides i
finalment aquets fecundaran els òvuls donant lloc els ous.
En captivitat, per a la posada primer caldrà seleccionar els mascles i femelles. Les
millors femelles seran aquelles que tinguin l'abdomen més ample, ja que això indicarà
que està ben alimentada i proveïda d'ous. El mascle seleccionat serà gran i amb bona
aparença.
Les postes es faran un cop per setmana per deixar descansar els peixos. La peixera en
què els tenim estarà dividida transversalment perquè el mascles i femella no es trobin,
així estaran sota control perquè només es reprodueixin quan es vulgui i també perquè
els hi doni més ganes de coneixes .A l’hora d’agafar una femella i un mascle en la
peixera gran és complicat ja que es mouen en rapidesa i es camuflen en el grup ,per
tant, cal tenir ben clares les distincions de tots dos sexes per facilitar el procés ja que
s’ha de tenir molt en compte per la creació d’un tanc d’aparellament.Com que el sexe
masculí i el femení són molt similars, sovint és difícil distingir-los .Però hi ha una sèrie
de característiques que permet diferenciar-los :
62
La forma del cos típic d'un peix zebra mascle és molt prim en comparació amb la de la
femella perquè els mascles presenten un ventre pla (5) i tenen unes ratlles blaves més
fosques. A la part inferior tenen una taca d’un to grogós. En general semblen més de
color daurat o de color groc al costat ventral del seu cos (4) Els mascles normalment
tendeixen a ser molt més actius que el peix zebra femella
Les femelles es caracteritzen per un ventre blanc i protuberant (1) .Tenen un to
blavós–blanc i unes ratlles platejades entre les ratlles blaves(3) Les femelles tendeixen
a moure’s una mica més lent que els mascles. En comparació amb els mascles
presenten una coloració més clara i normalment tenen un cos més gran .
A vegades trobem peixos zebra que no podem identificar el seu sexe perquè no
presenten cap de les característiques anteriors. En aquets casos es millor no utilitzar
aquests peixos.
Fotografia 40 : determinació del mascle i la femella en l’aquari (G.Camps )
Mascle Femella
femella
mascle
Fotografia 39 : diferències entre el mascle i la femella ( G.Camps )
63
A més, el control de la qualitat de l'aigua és molt més exhaustiu. El dia abans de la
posada només vaig donar de menjar artèmia perquè tinguessin més energia. Per el
creuament vaig utilitzar una peixera creada artesanalment més petita denominada
"paridora". Les seves característiques simulen a un sistema natural ja que la peixera
està lleugerament inclinada perquè es generi una zona amb menys aigua que aparenta
ser la vora d'un llac. Per inclinar la paridora només cal inclinar l’envàs 2 on hi ha la
reixeta sobre l’envàs 1.El tanc de creuament també es pot complementar amb unes
quantes bales que simulen les pedres de la vora del llac, permeten als peixos tenir més
llocs estrets on posar-se, el que fomenta la reproducció.
Com es pot veure a la fotografia la peixera té dos envasos, un més petit amb una
reixeta a la base perquè caiguin els ous en el segon envàs, que és més gran i és on es
dipositen els ous. Aquesta divisió no permet el pas dels adults al fons de la peixera i
evita el risc de ser devorats pel seus progenitors. També hi ha una segona divisió
transversal que divideix en dos la paridora durant el període de foscor , en un costat es
col·loca el mascle i en l’altre la femella.
5
4
Reixeta
Vidre de
divisió
ENVÀS 2 ENVÀS 1
Paridora
Fotografia 41: parts de la paridora (G.Camps)
64
Les paridores no cal comprar-les ja que es poden fer artesanalment ,en el meu cas vaig
fer dos paridores manualment i en l’última reproducció vaig utilitzar també 3 tancs
addicionals de creuament com el de la fotografia anterior. Per fer el tanc de
reproducció vaig seguir el següent procediment:
1. Vaig tallar un tros d’una reixeta amb
un calibre adient perquè hi
poguessin passar els ous i la vaig
posar a la base del tupper petit.
Fotografia 42 : parts de la paridora artesanal (G.Camps )
vidre de
separació
Fotografia 43 : procediment per fer la paridora artesanal (G.Camps)
65
Les petites peixeres han d'estar ben desinfectades, per això una vegada les vaig
utilitzar les vaig rentar molt bé amb sabó, i després les vaig impregnar amb aigua
oxigenada, i les vaig deixar assecar fins a la següent posada.
Els peixos els vaig col·locar als tancs de creuament el dia abans de la posta ,i la
paridora tenia la mateixa aigua que utilitzava per omplir la peixera gran on estaven la
resta del peixos. Tot el procediment de selecció de parelles el vaig realitzar a darrera
hora de la tarda (al voltant de les 18 hores) de manera que un cop col·locats els peixos
als tancs de reproducció els vaig tapar amb un plàstic negre per simular la nit i que
estiguessin a punt per posar els ous el dia següent a primera hora del matí.
El matí del dia de creuament es retira el vidre que els divideix transversalment i es
deixen una hora o dues perquè es reprodueixin . Un cop acabat el procés es retornen
els dos peixos a la seva peixera d’origen . En el meu cas ho vaig fer immediatament
després d’enretirar el plàstic negre que els cobria durant la nit, a la mateixa hora del
matí (7:00) en que tenia programada l’encesa de la il·luminació de l’aquari. Per a poder
fer-ho vaig haver de coordinar l’entrada a l’escola amb el Sr. Pedro de Manteniment.
Tot aquest procediment el vaig executar tres vegades, ja que vaig intentar fer 3
reproduccions:
- La primera reproducció la vaig fer per validar el procediment i agafar
experiència en tot el protocol de l’experiment sense afegir l’etanol. En aquesta
reproducció vaig triar només una parella que es va reproduir amb èxit.
- La segona reproducció no va donar resultat ja que els peixos triats no es van
reproduir. En aquest cas també vaig fer servir només una parella, però per
raons que desconec no es va reproduir. Totes les variables de control
(temperatura, llum, alimentació, etc.) eren les mateixes però no van fructificar.
- La tercera reproducció va ser la que vaig fer l’experiment definitiu . En aquest
cas vaig seleccionar cinc parelles, de les que es va reproduir només una.
66
f. Preparació de les solucions d’etanol
Les solucions d’etanol les vaig preparar prèviament a l’experimentació fent servir els
següents materials:
Característiques de l’Etanol
- Fórmula: C2H6O
- Massa molecular (g/mol): 46,07
- Densitat (g/cm3) 0,789
Càlcul dels cm3 d'etanol que cal afegir al dissolvent.
La fórmula és:
V = (C/1000)*(46,07/0,789)*D
V: volum d'etanol
C: concentració d'etanol en mM
D: volum de dissolvent (aigua) en litres
I els resultats:
300 mM 100 mM
Aigua 491 ml 497 ml
Etanol 8,8 ml 2,9 ml
Solució 500 ml 500 ml
En el cas de les concentració de 100 mM i de 300mM vaig seguir aquest procediment
per realitzar les dissolucions ,la diferència es que en la concentració de 100 mM hi
havia 491ml de diluent i 8,8 ml d’etanol ,en canvi, en la concentració de 300 mM el
diluent tenia un volum 497 ml i 2,9 ml d’etanol :
Etanol
4 plaques de Petri
per les tres
concentracions
(30,100,300 ) i el
control amb
l’etiquetatge
corresponent
2 pipetes graduades 3 vasos de precipitats Aigua destil·lada
Etanol
Fotografia 44 : 4 plaques de pertri per les 3 concentracions i el control (G.Camps )
Fotografia 45 d’etanol (G.Camps )
67
En la concentració més petita de 30 mM vaig aplicar un altra mètode ja que era poc
precís fer aquesta dissolució amb els instruments de mesura que tenia a disposició.
Llavors vaig utilitzar la dissolució de 300 mM :
300mM · V i = 30 mM · 500 ml V i = 50 ml
Per realitzar aquesta dissolució vaig agafar 50 ml del vas de precipitats de 300 mM
amb una pipeta i els vaig posar en
un altre vas de precipitats ,després
vaig afegir-hi aigua fins arribar els
500 ml de volum final .I d’aquesta
manera vaig obtenir una dissolució
d’aigua amb etanol concentrat en 30
mM .
3. Continuant amb la preparació de la
concentració de 100mM ,vaig agafar
amb una altra pipeta 2,9 ml d’etanol (
calculat anteriorment ) i els vaig
dipositar a un vas de precipitats. Vaig
posar primer el solut perquè quan
després afegeixes el diluent es fa més
homogènia la dissolució.
1. Per últim vaig afegir els 497 ml
d’aigua en el vas de precipitats i
vaig barrejar la mescla amb una
vareta de vidre fins que va quedar
ben homogènia
2. En el cas de la concentració de 100
mM, vaig mesurar 497 ml d’aigua
en una proveta ,i per cer més
exactes vaig acabar d’enrasar amb
una pipeta.
C i · V i = C f · V
f
Figura 12 : procediment de la preparació de la dissolució (G.Camps )
68
7. ESTUDI DE L’ALTERACIÓ DEL DESENVOLUPAMENT EMBRIONARI
7.1. Obtenció dels embrions
El cap d’una hora o dues, en funció de quan observar que la parella de peixos paren de
fregar-se vaig treure els peixos del tanc de creuament i els vaig tornar a la seva peixera
d’origen. Vaig treure el recipient 1 i amb una pipeta vaig intentar anar agafant els ous
.Havia de tenir en conte que en el recipient 2 hi havien ous , escates ,i excrements. Per
tant, primer vaig fer una primera selecció per aconseguir els ous .
Fotografia 46 : Primera selección dels ous ( G.Camps )
Ous aconseguits
Recipient 1 Recipient 2
Pipeta amb
diàmetre
exacte a la
dels ous
Fotografia 47 : Resum il·lustrat del procediment d’obtenció dels ous (G.Camps)
69
Un cop ja tenia seleccionats tots els ous vaig tindre que fer una segona selecció ja que
en tot el conjunt d’ous havia ous no fecundats ,ous fecundats , ous morts o trencats , i
ous vius .Per tant vaig fer una altre divisió amb una pipeta igual a l’anterior , en dos
diferents vidres de rellotge , en un vaig posar tots els ous bons i en condicions i en
l’altre vidre hi vaig posar els morts ,els no fecundats o trencats, etc. Les fletxes negres
indiquen els ous correctes i les fletxes negres indiquen els ous que no vaig agafar per
l’experiment.
1. Els ous fèrtils normalment són més
simètrics . Sense el microscopi tenen un
aspecte transparent.
2. El embrions morts es pot observar grans
masses fosques dins de l’ou. Sense el
microscopi s’identifiquen per un color
més blanquinós.
3. Els embrions trencats ,són aquells que
s’han fet mal bé en la recollida amb la
pipeta o en algun altre procés
4. Ous no fecundats, són ous que en ser
expulsats per la femella cap
espermatozoide del mascle els ha
fecundat.
Fotografia 48. Tipus d’embrions ( G. Camps )
70
Sense mirar-los des del microscopi també es pot fer una prèvia identificació :
Quan ja tenia els embrions separats en els dos vidres de rellotge amb els seleccionats i
l’altre amb els que no servien, vaig fer una tercera separació sobre els seleccionats.
Vaig dividir aquets en 4 vidres de rellotge i a cada un tenia que haver-hi el mateix
nombre d’embrions. Aquest pas el vaig fer per després posar-los en les plaques de
Petri amb les concentracions corresponents a la vegada.
Embrió viu
Embrió mort
excrements
Vidre de rellotge 4
Vidre de rellotge 3
Vidre de rellotge 1
Vidre de
rellotge 2
Fotografia 51 : Observació amb microscopi dels embrions (G.Camps )
Fotografia 49 : selección dels ous sense microscopi (G.Camps)
Fotografia 50 : tercera seecció dels ous enels 4 vidres de rellotge per les 3 concentracions i el control (G.Camps)
71
Per últim vaig introduir els ous de cada vidre de rellotge en cada una de les
concentracions tan ràpid com em va ser possible per a que el temps inicial fos
semblant per totes les concentracions.
El nombre d’embrions obtingut a les tres reproduccions que vaig realitzar va ser:
- Primera reproducció: 62 ous, dels quals 34 fecundats seleccionats i 28
rebutjats entre morts i no fecundats.
- Segona reproducció: cap, perquè no es van reproduir.
- Tercera reproducció: 90 ous, dels quals 80 fecundats i 10 rebutjats entre morts
i no fecundats.
7.2. Seguiment del protocol
Dilluns 30/6/14. Preparació de l’Artèmia
- Objectiu: preparar l’aliment especial per la reproducció
- Realització: segons protocol (veure apartat vii. Alimentació i
nutrició)
- Resultat: correcte
Dimecres 3/7/14: reproducció de prova
- Objectiu: validar tot el procediment experimental amb el grup de
control
- Nº de parelles reproductores: 1
- Alimentació amb Artèmia: sí
- Hora inici reproducció: 07:00
- Temps fins posta d’ous: 50 minuts
- Nº d’ous obtingut:
- Nº d’ous fecundats:
- Observacions realitzades: segons protocol, a 6, 10, 24, 33, 48 i 72 hpf
- Creixement: l’esperat
- Anormalitats: cap
- Supervivència e 72 hpf: 100%
72
- Imatges obtingudes: veure Annex amb les fotos
Dilluns 7/7/14: intent de reproducció per fer l’assaig amb etanol
- Objectiu: realitzar l’experiment amb un grup de control i tres grups
contaminats amb metanol
- Nº de parelles reproductores: 1
- Alimentació amb Artèmia: sí
- Hora inici reproducció: 07:00
- Temps fins posta d’ous: espero 3 hores i no s’aconsegueix
- Nº d’ous obtingut: 0
- Nº d’ous fecundats: 0
- Observacions realitzades: cap observació
Dimarts 8/7/14: intent de reproducció per fer l’assaig amb etanol
- Objectiu: realitzar l’experiment amb un grup de control i tres grups
contaminats amb metanol
- Correccions efectuades: genero un nou tanc de reproducció
- Nº de parelles reproductores: 2
- Alimentació amb Artèmia: sí
- Hora inici reproducció: 07:00
- Temps fins posta d’ous: espero 3 hores i no s’aconsegueix
- Nº d’ous obtingut: 0
- Nº d’ous fecundats: 0
- Observacions realitzades: cap
Dimecres 9/7/14: intent de reproducció per fer l’assaig amb etanol
- Objectiu: realitzar l’experiment amb un grup de control i tres grups
contaminats amb metanol
73
- Correccions efectuades: genero un nou tanc de reproducció
- Nº de parelles reproductores: 3
- Alimentació amb Artèmia: sí
- Hora inici reproducció: 07:00
- Temps fins posta d’ous: espero 3 hores i no s’aconsegueix
- Nº d’ous obtingut: 0
- Nº d’ous fecundats: 0
- Observacions realitzades: cap
Dimecres 9/7/14, 14:30: reunió amb Sr. Juan Ramos del PRBB
- Objectiu: revisar procediment seguit i materials emprats per detectar
possibles errors.
- Resultat: tot és correcte però la natura no es pot forçar
- Proposta: augmentar el nombre de parelles reproductores. El Sr. Ramos
em deixa 2 tancs de reproducció fets per ell.
-
Dijous 10/7/14, 14:30: intent de reproducció per fer l’assaig amb etanol:
- Objectiu: realitzar l’experiment amb un grup de control i tres grups
contaminats amb metanol
- Correccions efectuades: faig servir dos tancs de reproducció addicionals
- Nº de parelles reproductores: 5
- Alimentació amb Artèmia: sí
- Hora inici reproducció: 07:00
- Temps fins posta d’ous: 1 hora
- Nº d’ous obtingut:
- Nº d’ous fecundats:
- Observacions realitzades: segons protocol, a 6, 10, 24, 33, 48 i 72 hpf
- Creixement: s’observa retard (veure apartat c. Observacions de les
variables d’anàlisi)
74
- Anormalitats: s’observa anormalitats (veure apartat c. Observacions
de les variables d’anàlisi)
- Supervivència a 72 hpf: s’observa mortalitat (veure apartat c.
Observacions de les variables d’anàlisi)
- Imatges obtingudes: veure Annex amb les fotos
7.3. Observacions de les Variables d’anàlisi
7.3.1. Amplada del cap
a) Dades numèriques
control HPF FOTO AUGMENTS Dist.Aparent
(mm)
Dist.real (µm)
25 3443 160 52,05 325
3444 160 52,83 330
328
48 3679 64 27,07 423
3689 64 27,71 433
3683 64 26,73 418
425
72 3780 64 30,54 477
3778 64 29,62 463
470
Taula 7. Amplada del cap grup control.
30mM HPF FOTO AUGMENTS Dist.Aparent
(mm)
Dist.real (µm) Dif/control
25 3435 160 59,17 370
3420 160 55,66 348
3411 64 22,07 345
48 354 8,05%
3729 64 26,02 407
3727 64 24,39 381
394 -7,24%
72 3813 64 28,52 446 -5,18%
Taula 8. Amplada del cap grup 30 mM.
75
100mM
HPF FOTO AUGMENTS
Dist.Aparent
(mm) Dist.real (µm) Dif/control
25
3391 160 39,94 250
3433 64 22,77 356
3397 64 19,33 302
3447 160 48,53 303
Mitjana 320 -2,26%
48
3738 64 23,02 360
3743 160 52,35 327
3746 160 64,24 402
3749 64 24,19 378
367 -13,66%
72
3807 64 28,79 450
3809 64 32,69 511
3811 64 25,52 399
453 -3,58%
Taula 9. Amplada del cap grup 100 mM.
Taula 10. Amplada del cap grup 300 mM
300mM HPF FOTO AUGMENTS Dist.Aparent (mm) Dist.real (µm) Dif/control
25 retard en el desenvolupament .
48 3705 64 19,77 309
3697 64 23,93 374
3702 64 20,79 325
3708 64 19,89 311
330 -22,36%
72 3801 64 23,74 371
3802 64 24,50 383
3805 64 24,74 387
3806 64 20,83 325
366 -22,03%
76
b) Gràfiques resum
Gràfica 3. Valors mitjans amplada del cap
Gràfica 4. Diferència percentual valors mitjans amplada del cap
-25,00%
-20,00%
-15,00%
-10,00%
-5,00%
0,00%
5,00%
10,00%
25 48 72
%
HPF
Dif. percentual del'amplada del cap respecte control
30 mM
100 mM
300 mM
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
25 48 72
Dis
t.re
al (
µm
)
HPF
Amplada del Cap
Control
30mM
100 mM
300 mM
77
7.3.2. Distància entre vora interior dels ulls
a) Dades numèriques
CONTROL HPF FOTO AUGMENTS Dist.Aparent
(mm)
Dist.real (µm)
25 3444 160 13,73 85,80
48
3679 64 5,45 85,11
3689 64 5,27 82,34
3683 64 5,05 78,97
82,14
72
3780 64 6,03 94,26
3778 64 5,08 79,40
86,83
Taula 11. Distància entre els ulls. Grup control.
30 mM
HPF FOTO AUGMENTS Dist.Aparent (mm) Dist.real (µm)
Dif/control
25
3435 160 13,35 83,41
3420 160 13,84 86,50
84,96 -0,98%
48
3729 64 5,52 86,31
3727 64 5,20 81,21
83,76 1,97%
72
3813 64 5,25 82,05
160 14,15 88,44
85,24 -1,83%
Taula 12. Distància entre els ulls. Grup 30 mM.
100mM
HPF FOTO AUGMENTS
Dist.Aparent
(mm)
Dist.real
(µm) Dif/control
25
3390 64 6,50 101,59
3447 160 11,78 73,65
87,62 2,12%
48
3738 64 6,35 99,21
3743 160 14,97 93,56
3746 160 8,53 53,32
82,03 -0,14%
72 3807 64 4,57 71,36
78
3809 64 6,04 94,44
3811 64 5,71 89,23
85,01 -2,10%
Taula 13. Distància entre els ulls. Grup 100 mM.
Taula 14. Distància entre els ulls. Grup 300 mM.
b) Gràfiques resum
Gràfica 5. Valors mitjans de distància entre els ulls
65,00
70,00
75,00
80,00
85,00
90,00
25 48 72
Dis
t.re
al (
µm
)
HPF
Distància entre la vora interior dels ulls
Control
30 mM
100 mM
300 mM
300mM
HPF FOTO AUGMENTS
Dist.Aparent
(mm)
Dist.real
(µm) Dif/control
25
retard en el desenvolupament .
48
3705 64 4,11 64,17
3702 160 13,35 83,46
3708 160 12,44 77,73
75,12 -8,55%
72
3801 64 4,71 73,60
3802 64 5,80 90,66
3805 64 4,79 74,86
79,70 -8,21%
79
Gràfica 6. Diferència percentual valors mitjans distancia entre els ulls
7.3.3. Retard de Desenvolupament
a) Dades numèriques
Taula 15. Retard de desenvolupament. Grup Control.
30mM HPF FOTO AUGMENTS
Etapa
teòrica Etapa real
Retard
Etapes
Retard Temps
(h)
6 3263 64 19 19 0 0,00
10 __ 64 22 22 0 0,00
24 3410 64 29 26 3 8,00
36 3624 64 31 30 1 6,00
48 3733 64 33 32 1 6,00
72 3812 64 35 34 1 12,00
Mitjana acotada 1,5 8,0
Taula 16. Retard de desenvolupament. Grup 30 mM.
-10,00%
-8,00%
-6,00%
-4,00%
-2,00%
0,00%
2,00%
4,00%
25 48 72
%
HPF
Dif. percentual de distància entre ulls respecte control
100 mM
300 mM
30 mM
control HPF FOTO AUGMENTS Etapa teòrica Etapa real Retard Etapes Retard Temps
6 3276 160 19 19 0 0,00
10 3313 64 22 22 0 0,00
24 3380 64 29 29 0 0,00
36 3675 64 31 31 0 0,00
48 3686 64 33 33 0 0,00
72 3771 64 35 35 0 0,00
80
Taula 17. Retard de desenvolupament. Grup 100 mM.
Taula 18. Retard de desenvolupament. Grup 300 mM.
Taula 19. Resum del retard de desenvolupament en hores.
Taula 20. Resum del retard de desenvolupament en nombre d’etapes
100mM HPF FOTO AUGMENTS
Etapa
teòrica Etapa real
Retard
Etapes
Retard Temps
(h)
6 3256 64 19 19 0 0,00
10 3313 64 22 22 0 0,00
24 3392 64 29 27 2 5,00
36 3567 64 31 29 2 12,00
48 3752 64 33 31 2 12,00
72 3809 64 35 33 2 24,00
Mitjana acotada 2,0 13,3
300mM HPF FOTO AUGMENTS
Etapa
teòrica Etapa real
Retard
Etapes
Retard Temps
(h)
6 3249 64 19 18 1 0,34
10 3339 64 22 20 2 2,00
24 3384 64 29 24 5 10,00
36 3559 64 31 27 4 17,00
48 3691 64 33 30 3 18,00
72 3787 64 35 32 3 24,00
Mitjana acotada 3,0 17,3
6hpf 10hpf 24hpf 36hpf 48hpf 72hpf
control 0,00 0,00 8,00 6,00 6,00 12,00
30 Mm 0,00 0,00 5,00 12,00 12,00 24,00
100 Mm 0,00 0,00 2,00 2,00 2,00 2,00
300 Mm 0,34 2,00 10,00 17,00 18,00 24,00
6hpf 10hpf 24hpf 36hpf 48hpf 72hpf
control 0 0 0 0 0 0
30 Mm 0 0 3 1 1 1
100 Mm 0 0 2 2 2 2
300 Mm 1 2 5 4 3 3
81
b) Gràfiques resum
Gràfica 7. Retard de desenvolupament en nombre d’etapes
Gràfica 8. Retard de desenvolupament en hores
0
1
2
3
4
5
6
6hpf 10hpf 24hpf 36hpf 48hpf 72hpf
reta
rd e
tap
es
hpf
Retard de desenvolupament
control
30 mM
100 mM
300 mM
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
6hpf 10hpf 24hpf 36hpf 48hpf 72hpf
reta
rd t
em
ps
(h)
hpf
Retard de desenvolupament
Control
30 mM
100 mM
300 mM
82
7.3.4. Taxa de supervivència
a) Dades numèriques
6hpf 10hpf 23hpf 33hpf 48hpf 72hpf
concentració
Nº placa
Nº embrions a la placa
morts
vius
morts
vius
morts
vius
morts
vius
morts
vius
morts
vius
control 1 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20
30 2 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 1 19
100 3 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 1 19
300 4 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 6 14
Taula 21. Taxa de supervivència en valors absoluts
6hpf 10hpf 23hpf 33hpf 48hpf 72hpf
concentraci
ó
Nº
plac
a
Nº
embrion
s a la
placa
mort
s
viu
s
mort
s
viu
s
mort
s
viu
s
mort
s
viu
s
mort
s
viu
s
mort
s
viu
s
control 1 0 100 0 100 0 100 0 100 0 100 0 100
30 2 0 100 0 100 0 100 0 100 0 100 5 95
100 3 0 100 0 100 0 100 0 100 0 100 5 95
300 4 0 100 0 100 0 100 0 100 0 100 30 70
Taula 22. Taxa de supervivència en percentatge
b) Gràfiques resum
Gràfica 9. Taxa de supervivència dels quatre grups en valors absoluts
0 5 10 15 20 25
morts
vius
morts
vius
morts
vius
morts
vius
morts
vius
morts
vius
6h
pf
10
hp
f23
hp
f33
hp
f4
8h
pf
72
hp
f
nombre d'embrions
hp
f
Taxa de supervivència ( valors absoluts ) :
300mM100mM
83
Gràfica 10. Taxa de supervivència dels quatre grups en tant per cent
7.3.5. Taxa d’eclosió
a) Valors numèrics
72hpf
concentració Nº placa Nº
embrion
s a la
placa
sortits
No
sortits
control 1 20 0
30 2 19 1
100 3 17 3
300 4 6 14
Taula 23. Taxa d’eclosió dels quatre grups en valors absoluts
72hpf
concentració Nº placa Nº
embrions
a la placa
sortits No
sortits
control 1 100 0
30 2 95 5
100 3 85 15
300 4 30 70
Taula 24. Taxa d’eclosió dels quatre grups en percentatge
0 20 40 60 80 100 120
morts
morts
morts
morts
vius
morts
6h
p f1
0h
pf
23
hp
f3
3h
pf
48
hp
f7
2h
pf
%
hp
f
taxa de supervivència en tant per cent
300 mM
100 mM
30 mM
control
84
b) Gràfiques resum
Gràfica 11. Taxa d’eclosió dels quatre grups en tant per cent
Gràfica 12. Taxa d’eclosió dels quatre grups en percentatge
0 5 10 15 20 25
sortits
No sortits
72
hp
f
nombre d'embrions
hp
f
Taxa d'eclosió ( valors absoluts ) :
300mM
100mM
0 50 100 150
sortits
No sortits
72
hp
f
nombre d'embrions
hp
f
Taxa d'eclosió en tant per cent:
300mM
100mM
85
7.3.6. Moviment
control HPF VIDEO Embrió
Num.
Moviments Tipus Mitjana
6 N,A. N,A. N,A. N,A. N,A.
10 N.A. N,A. N,A. N,A. N,A.
24 IMG 3370 A 5 mov. cua 4,7
IMG 3371 A 4 mov. cua
B 5 mov. cua
IMG 3375 A 4 mov. cua
B 7 mov. cua
IMG 3377 A 3 mov. cua
33 IMG3640 A 0
0,3
IMG3669 A 0
IMG3676 A 1 mov. cua
48 IMG3684 A 1 natació 0,5
IMG3688 A 0
72 IMG3781 A 1 natació 1,0
Taula 25. Nombre de moviment dels embrions en 40 seg. Grup Control.
30mM HPF VIDEO Embrió
Num.
Moviment
s Tipus
Mitjana
6 N,A. N,A. N,A. N,A. N,A.
10 N.A. N,A. N,A. N,A. N,A.
24 IMG3436 A 5 mov. cua 5,0
IMG3440 A 5 mov. cua
IMG3440 B 5 mov. cua
33 IMG3631 A 3 mov. cua 1,5
B 0
48 IMG3737 A 0
0,0
72 IMG3815 A 1 natació 0,5
IMG3817 A 0
Taula 26. Nombre de moviments dels embrions. Grup 30 mM
86
100mM HPF VIDEO Embrió
Num.
Moviment
s Tipus Mitjana
6 N,A. N,A. N,A. N,A. N,A.
10 N.A. N.A. N.A. N,A. N,A.
24 IMG3396 A 6 Mov. Cua 6,0
B 6 Mov. Cua
33 IMG3568 A 1 Mov. Cua 1,5
IMG3586 A 2 Mov. Cua
48 IMG3754 A 0
0,0
72 IMG3827 A 1 Natació 1,0
Taula 27. Nombre de moviments dels embrions. Grup 100 mM
300mM HPF VIDEO Embrió
Num.
Moviment
s Tipus Mitjana
6 N,A. N,A. N,A. N,A. N,A.
10 N.A. N.A. N.A. N,A. N,A.
24 N.A. N.A. N.A. N,A. N,A.
33 N.A. N.A. N.A. N,A. N,A.
48 IMG3702 A 6 Mov. Cua 3,3
IMG3708 A 3 Mov. Cua
B 1 Mov. Cua
72 (*)
Taula 28. Nombre de moviments dels embrions. Grup 300 mM
(*): el fitxer amb el vídeo que vaig filmar es va corrompre al passar-lo a l'ordinador i no
l'he pogut recuperar
A l’annex 4 es poden veure algunes de les imatges de les observacions on es pot veure
la diferencia entre les concentracions.
87
8. ANÀLISI I DISCUSSIÓ DELS RESULTATS
8.1. Malformacions
Aquest apartat l’he analitzat mesurant les distàncies definides al Disseny Experimental.
Al revisar les fotografies m’he adonat que per poder disposar d’imatges clares del cap
amb prou nitidesa per poder mesurar calia esperar a l’etapa 25 hpf, per tant de les 6
etapes d’observació només he obtingut imatges vàlides a 24 hpf, 48 hpf i 72 hpf
Amplada del cap
He observat el següent:
24 hpf: els grups de 30 mM i 100 mM no presenten una tendència clara
respecte al grup de control (veure Taula A3, 24 hpf, Annex 4). El grup de 30 mM
té una desviació de +8,05 % mentre que el grup de 100mM la té de -2,26%. En
canvi per al grup de 300 mM no es possible realitzar mesures degut a que el
retard en el desenvolupament fa que el cap no es vegi prou definit a les
imatges com per prendre mesures amb un mínim de precisió.
48 hpf: s’observa una tendència clara en els tres grups cap una disminució de
l’amplada del cap respecte al grup de control (veure Taula A3, 48 hpf, Annex 4).
Així el grup 30 mM presenta una diferència de -7,24%, el de 100 mM de -
13,66% i el de 300 mM de -22,36 %.
72 hpf: es manté la tendència en els tres grups de disminució de l’amplada del
cap respecte el grup de control (veure Taula A3, 72 hpf, Annex 4). El grup de 30
mM té una desviació de -5,18%, el de 100 mM la té de -3,58 % i el de 300 mM
de -22,03%. Es de destacar que s’observa una diferència clara entre els dos
primers grups, que presenten desviacions més petites que a l’etapa anterior i
de valors iguals o inferior al 5% i el tercer, que presenta una desviació
semblant a la de l’etapa anterior del 22%.
88
Distància entre la vora interior dels ulls
He observat unes tendències semblants a l’amplada del cap, però menys marcades
24 hpf: els grups de 30 mM i 100 mM no presenten una tendència clara
respecte al grup de control. El grup de 30 mM té una desviació de -0,98 %
mentre que el grup de 100mM la té de +2,12%. Per al grup de 300 mM tampoc
no es possible realitzar mesures degut a que el retard en el desenvolupament
fa que el cap no es vegi prou definit a les imatges com per prendre mesures
amb un mínim de precisió
48 hpf: : els grups de 30 mM i 100 mM no presenten una tendència clara
respecte al grup de control. Així el grup 30 mM presenta una diferència de
1,97% i el de 100 mM de -0,14%. Ell de 300 mM presenta una diferència
negativa clara de valor –8,55 %.
72 hpf: s’observa una tendència clara en els tres grups de disminució de
l’amplada del cap respecte el grup de control. El grup de 30 mM té una
desviació de –1,83%, el de 100 mM la té de -2,10 % i el de 300 mM de -8,21%.
Discussió
Els resultats observats son coherents amb els que he trobat a la bibliografia,
principalment amb els articles que donen dades concretes de malformacions (Brenet
2012 i Reimers et al 2004).
La disminució de les dues variables d’anàlisi estudiades en aquest apartat respecte els
valors de referència del grup de control és un índex de malformacions, i també de
retard de desenvolupament. En l’estudi de les fotografies del grup de 300 mM que he
realitzat també he identificat algunes malformacions aparents, com per exemple
embrions amb la cua plegada o el que semblava un edema de pericardi comparant-lo
amb les imatges publicades a (Brenet 2012) (veure Taula A4, Annex 4) .
89
Els resultats obtinguts també són coherents amb les publicacions de referència en el
fet que per les concentracions més baixes (30 i 100 mM) les desviacions no es
presenten de forma clara des de 48 hpf o fins i tot 72 hpf, mentre que d’altra banda el
grup de 300 mM presenta malformacions clares des de 48 hpf. Això és coherent amb
els estudis de referència, Brenet 2012 i Reimers et al 2004, en els que es diu que els
grups de concentració més elevada tenen el cap molt més petit i que a partir de 250
mM la meitat dels embrions presenten malformacions.
8.2. Retard de Desenvolupament
El retard de desenvolupament s’ha manifestat molt clarament a tots els grups de
concentració. El resum de les observacions és el següent:
Grup control: no he observat cap retard respecte el desenvolupament teòric.
Grup 30 mM: el primer retard apareix a 24 hpf i és de 3 etapes o 8 hores. A 36 i
48 hpf el retard és d’1 etapa o 6 hores, i a 72 hpf el retard és d’1 etapa o 12
hores.
Grup 100 mM: el primer retard apareix a 24 hpf i és de 2 etapes o 5 hores. A
36 i 48 hpf el retard és de 2 etapes o 12 hores, i a 72 hpf el retard és de 2
etapes o 24 hores-
Grup 300 mM: aquest grup presenta retard des de la primera observació el
primer retard apareix a 6 hpf i és d’una etapa o 0,34 hores. A les etapes
successives el retard és variable en nombre d’etapes però sempre és creixent si
es compta en temps, fins arribar a un retard de 3 etapes o 24 hores a 72 hpf.
Discussió
Els resultats que he observat també son coherents en línies generals amb els que he
trobat a la bibliografia, encara que hi ha algunes diferències.
90
Per exemple a Beczkiewicz (2013) es diu que no s’ha observat dins les primeres 24
hores, mentre que a les meves observacions el retard apareix abans (6 hpf) per al grup
de 300 mM
Els resultats obtinguts també són coherents amb les publicacions de referència
malformacions (Reimers et al 2004) en el fet que per les concentracions més baixes (30
i 100 mM) el retard en el desenvolupament apareix de forma clara a partir
concentracions de més de 150 mM.
8.3. Mortalitat
Les observacions que he realitzat indiquen que la taxa de supervivència no depèn de
la concentració d’etanol durant les primeres 48 hores. Concretament el 100% dels
embrions de cada grup han arribat vius a 48 hpf, és a dir una taxa de mortalitat del
0%.
En canvi a 72 hpf, els grups de 30 i 100 mM presenten una taxa de mortalitat no nul·la
tot i que baixa, del 5%, mentre que el grup de 300 mM té una taxa de mortalitat
significativa, del 30%. Això s’aprecia de forma clara per l’enfosquiment de l’embrió
(veure Taula A3, Annex 4, 72 hpf, 300 mM)
Discussió
Aquestes observacions coincideixen força amb tots els treballs que he revisat, no
només els de referència. La taxa de mortalitat no presenta diferències respecte el grup
control fins el tercer dia. En aquest punt (72 hpf) s’aprecia una clara diferència entre
els grups de concentració més baixa (30 i 100 mM) i el de concentració més alta (300
mM).
Aquesta dada també és consistent amb l’estudi de referència (Reimers et al 2004) que
indica que una concentració de 380,5 mM provoca el 50% de mortalitat a 48 hpf. En el
meu estudi la concentració més elevada ha estat de 300 mM i la taxa de mortalitat
observada ha estat del 30% a 72 hpf.
91
8.4. Eclosió
El comportament observat d’aquesta variable és el que ha demostrat ser més
depenent de la concentració d’etanol. Les observacions les he realitzat el tercer dia (72
hpf), temps en el que segons el desenvolupament embrionari estàndard haurien
d’haver sortit tots els embrions de l’ou.
El grup de control ha seguit el desenvolupament teòric, amb una taxa d’eclosió del
100%.
Els grups contaminats han presentat taxes d’eclosió que disminueixen a mesura que
augmenta la concentració: 95% , 85% i 30% per 30, 100 i 300 mM respectivament.
Un cop més és de destacar que el grup de 300 mM presenta un comportament
diferenciat respecte els altres dos: mentre que entre 30 i 100 mM la taxa d’eclosió
disminueix un 11%, entre 100 i 300 ( increment percentual de concentració semblant),
la taxa d’eclosió disminueix un 65%.
Discussió
L’aparició de taxes d’eclosió més petites que el grup de control és coherent amb les
observacions de les altres variables d’anàlisi i reforça la idea que l’etanol provoca
retard en el desenvolupament.
El fet que el grup de 300 mM tingui una taxa d’eclosió molt inferior a la dels altres dos
grups contaminats també és consistent amb la bibliografia que he consultat.
Concretament a Reimers et al (2004) es dona la concentració d’uns 160 mM com el
valor frontera que provoca retard clar en el desenvolupament.
8.5. Moviment
Tal com he comentat al capítol de disseny experimental, encara que en el projecte
inicial havia previst calcular taxes d’ anormalitat del moviment, quan he revisat la
literatura he vist que per poder quantificar aquesta variable cal un equipament molt
92
especialitzat (microscopis especials, càmeres adaptades, software d’anàlisi) que està
fora del meu abast. Per tant he fet una anàlisi qualitativa a partir dels vídeos que he
pogut filmar amb el telèfon mòbil acoblat al microscopi de l’escola.
Com no he pogut mesurar desplaçaments ni velocitats, per intentar fer l’anàlisi el més
objectiva possible he comptat els moviments dels embrions en un període de temps
donat de 40 segons, per a cada etapa del desenvolupament observada.
Discussió
Les conclusions d’aquesta anàlisi són:
- 24 hpf: al augmentar la concentració d’etanol entre el grup de control i els de
30 i 100 mM s’incrementa el nombre de moviments, tot i que no d’una manera
molt clara (4,7, 5 i 6) moviments. El grup de 300 mM no presenta moviments
degut al retard de desenvolupament.
- 33 hpf: es manté la tendència, amb valors mitjans de 0,3, 1,5 i 1,5 per als grups
control, 30 mM i 100 mM. El de 300 mM encara no presenta moviments.
- 48 hpf: en els grups control, 30 i 100 mM les observacions no són significatives
perquè com els embrions ja han sortit de l’ou, quan fan un moviment és de
natació i surten fora del camp de visió. En tot cas, a l’únic que he observat
moviments és al de control. El de 300 mM té una mitjana de 3,3 moviments,
encara dins l’ou.
- 72 hpf: es manté la tendència de l’observació anterior, amb 1 o cap moviment
observat.
9. CONCLUSIONS
9.1. Validació general del mètode experimental
En aquest treball he aplicat el mètode experimental en totes les seves passes, des de la
definició d’hipòtesis fins al contrast d’aquestes. La conclusió principal en aquest
aspecte és que he comprovat de primera mà la utilitat del mètode per estructurar el
que vull demostrar i obtenir els resultats. No ha estat fàcil, com comento a l’apartat de
dificultats pràctiques, i m’he adonat que per a que un treball experimental sigui útil
93
s’ha de seguir cada pas amb molt rigor i que no n’hi ha prou amb definir a grans trets el
que es vol fer. Hi ha molts petits detalls que si no es tenen en compte o no es fan bé
poden marcar la diferència entre l’èxit i el fracàs.
Quant als valors que he observat en les variables d’anàlisi, tal com explico al capítol
d’Anàlisi i discussió de resultats, són totalment coherents amb els que es dona a la
bibliografia de referència, principalment Brenet (2012), Reimers et al 2004 i Shaukat
et al (2011) . Això em permet afirmar que l’experimentació ha estat ben realitzada i
que he validat no només el mètode sinó també els resultats.
9.2. Validació de les hipòtesis
L’experimentació m’ha permès verificar la validesa de les cinc hipòtesis:
H1 En augmentar la concentració d’etanol
en el medi en que es desenvolupen els
embrions de peix zebra s’incrementa la
seva taxa de mortalitat.
La taxa de mortalitat augmenta
de forma significativa a partir de
72 hpf directament proporcional
amb la concentració d’etanol.
H2 En augmentar la concentració d’etanol
en el medi en que es desenvolupen els
embrions de peix zebra s’incrementa la
seva taxa d’anormalitats morfològiques:
Amplada del cap : en les
concentracions més altes es
disminueix l’amplada del cap.
Distància entre la vora interior
dels ulls : en augmentar la
concentració d’etanol es
disminueix la distància entre la
vora interior dels ulls.
L’amplada del cap i la distància
entre els ulls disminueixen de
forma significativa partir de 48
hpf inversament proporcionals a
la concentració d’etanol.
H3 En augmentar la concentració d’etanol
en el medi en que es desenvolupen els
embrions de peix zebra s’incrementa la
El nombre de moviments
observats en els grups amb
etanol és superior als del grup
94
9.3. Validació del peix zebra com model d’experimentació
Els resultats que he obtingut en les variables d’anàlisi són semblants als que segons
m’ha informat el Sr. Ramos del PRBB es considera com un article de referència de
model d’experimentació (Shaukat et al 2011). Això em permet dir que mitjançant la
meva experimentació he comprovat els següents conceptes:
- El peix zebra és un model d’experimentació vàlid per estudiar els efectes de
l’etanol en el desenvolupament embrionari dels Vertebrats en general, i dels
humans en particular.
- Les malformacions i canvis de comportament observats són semblants als que
s’observa en les persones que han estat exposades a l’etanol durant el seu
desenvolupament embrionari. Això em permet establir comparacions amb la
Síndrome d’Alcoholisme Fetal humana, és dir he provat que les malformacions
dels peixos zebra son anàlogues a les dels humans en els cassos que he pogut
analitzar:
seva taxa d’anormalitats en el moviment.
dels embrions.
control durant les etapes
anteriors a l’eclosió.
H4 En augmentar la concentració d’etanol
en el medi en que es desenvolupen els
embrions de peix zebra s’incrementa el
retard en el seu desenvolupament
embrionari.
El retard de desenvolupament
respecte el grup control
s’observa a tots els grups amb
etanol. El temps en hpf en que
es manifesta el retard és
inversament proporcional a la
concentració d’etanol.
H5 En augmentar la concentració d’etanol
en el medi en que es desenvolupen els
embrions de peix zebra es disminueix la
seva taxa d’eclosió.
La taxa d’eclosió a 72 hpf dels
grups amb etanol és inferior a la
del grup control i inversament
proporcional a la concentració
d’etanol.
95
HUMANS Peix ZEBRA
Cap petit Amplada del cap inferior a la del control
Desenvolupament anormal dels ulls Distància entre els ulls inferior a la del control
Mortalitat més elevada Taxa de mortalitat creixent
Problemes de comportament Moviment més lent, associat a
Taula 8. Comparació de malformacions per SAF
9.4. Dificultats pràctiques
Primer de tot vaig tenir força dificultat per trobar els peixos zebra ja que a totes les
botigues venien les cries i jo els necessitava ja quasi madurs per poder fer la
reproducció. Aquest va ser un obstacle que no m’esperava i em va baixar bastant la
moral però finalment amb ajuda en vaig aconseguir els suficients i va ser molt
satisfactori.
Una altre dificultat que jo diria que va ser la més important de totes va ser agafar el
mascle i la femella ja que a la teoria distingir-los sembla bastant fàcil però quan estàs
davant l’aquari aquests peixos neden molt ràpid i es camuflen entre ells i resulta
bastant difícil agafar un mascle i una femella. Al final aquest pas és el que hi estava
més estona, alguns cops dues hores.
Quan vaig obtenir els ous va ser una gran alegria, però els primers cops em va resultar
bastant complicat seleccionar un per un cada ou amb el microscopi i una pipeta , ja
que són molt petits i transparents. També els tenia que comptar perquè a les 4
mostres hi hagués el mateix nombre de peixos, aquesta també va ser una feina bastant
entretinguda.
En aquest treball he tingut molta col·laboració per temes logístics ja que per exemple
portar la peixera fins l’escola i buscar-li un lloc adequat va tenir les seves dificultats ,
però gràcies al Director de l’Escola, el Sr. Jordi Carmona, al tutor del treball, el Sr. Àlex
López-Duran i al Sr Pedro de Manteniment va ser possible. També necessitava l’accés a
l’edifici diàriament, però com això no era possible els caps de setmana vaig poder-ho
arreglar de manera que els cap de setmana no els hi calgués manteniment . A l’hora de
96
les observacions també les vaig haver d’adaptar a l’horari en que l’escola estava
oberta. Com que depenia molt del dia en que aconseguia la reproducció, els dies
d’observació també eren variables i en l’ultima reproducció com que es van creuar el
dijous i les observacions eren fins les 72 h vaig haver d’emportar-me el cap de setmana
un microscopi del Laboratori a casa meva.
En algun moment sí que em vaig sentir estancada quan no em va sortir la segona
reproducció i veia que no tenia temps per altres compromisos i per el tancament de
l’escola , però finalment es van reproduir dijous.
Per mantenir els peixos em va caldre molta constància ja que havia d’anar tots els dies
d’escola al laboratori a donar-los-hi menjar i fer-hi manteniment (neteja, canvis
d’aigua, control, ...), i quan se’m va fer més complicat anar-hi és quan tenia les
pràctiques d’empresa, però finalment me’n vaig sortir amb ajuda de familiars i
membres de l’escola.
9.5. Errors de procediment i lliçons apreses
a) Començar el treball abans: m’he adonat que començar després de Setmana
Santa va ser massa just. Per poc no puc acabar l’experimentació abans de que
tanquessin l’escola a l’estiu. Cal preveure un temps important per la instal·lació
de l’aquari, l’adquisició dels peixos i l’establiment de les condicions
d’estabulació òptimes. També crec que és convenient preveure un temps
addicional per aconseguir la reproducció i comptar que és possible que triguin
en reproduir-se. En resum penso que hauria hagut de començar 1 mes abans
del que ho he fet. Això té l’inconvenient de que part del treball coincidiria amb
el període d’exàmens finals, però crec que en conjunt hauria estat més segur
fer-ho així.
b) Fer servir un aquari més petit: l’aquari que he fet servir és de 115 litres, de 100
cm de llargada, i l’he fet servir perquè me’l ha deixat un oncle meu que és
veterinari, sense haver de pagar. Evidentment això abarateix el pressupost de
l’experiment però ha resultat una dificultat important a l’hora de separar els
97
mascles i femelles per la reproducció. La realitat és que per els 30 peixos que
tenia i donada la mida petita del peix zebra, cada vegada que en volia separar
un s’escapaven tots nedant ràpid en grup i això feia molt difícil poder separar-
los.
c) Fer el registre visual de les observacions (fotografies i vídeos) sempre amb el
mateix augment del microscopi i, en la mida de que sigui possible, amb el
mateix nombre d’embrions a cada imatge: això no és cap error, però facilitaria
la comparació visual dels diferents embrions i permetria treure conclusions
qualitatives a simple vista.
d) Posar tantes parelles mascle-femella a tancs de reproducció com sigui possible:
als primers intents de reproducció només feia servir un tanc, i en aquestes
condicions la probabilitat de que es reprodueixin és més petita. En la
reproducció definitiva vaig fer servir 4 parelles, de les quals només una es va
reproduir.
9.6. Properes passes
- Analitzar etapes posteriors del desenvolupament i estudiar si es mantenen les
tendències observades.
- Analitzar etapes posteriors del desenvolupament i comprovar si el peix zebra
continua essent un model vàlid d’experimentació per estudiar la Síndrome
d’Alcoholisme Fetal.
- Definir i provar un mètode que permeti analitzar de forma quantitativa els
canvis en el moviment dels embrions fent servir eines assequibles a un
estudiant de Batxillerat i amb un pressupost moderat.
98
10. BIBLIOGRAFIA
Beczkiewicz, Ryan D. (2013) Zebrafish and the Effects of Alcohol on Development.
Muskego High School
Brenet, Katica Andrea Boric (2012) ETHANOL EXPOSURE DISRUPTS CRANIAL NEURAL
CREST MIGRATION ANO PRIMARY CILlA IN DEVELOPING ZEBRAFISH EMBRYOS Tesi
Doctoral. Univ Valparaiso
Ciccolini, Chris (2013) Effect of Ethanol, Caffeine and Clorox on Zebra Fish
Embyos. Brookfield Central High School
Coors, A., Dobrick J, Möder M, Kehrer A (2011) The fish embryo toxicity test as a
screening method to predict the toxicity of biocidal products 4th SETAC EU Special
Science Symposium
Domènech M (2005) Artèmia salina. Centre de Documentació i Experimentació en
Ciències i Tecnologia. Adaptació protocol CDECT
Falcó, M., Moreno O (2010) Artèmia salina. Centre de Documentació i Experimentació
en Ciències i Tecnologia.
Kimmel CB, Ballard WW, Kimmel SR, Ullmann B, Schilling TF (1995) Stages of
Embryonic Development of the Zebrafish DEVELOPMENTAL DYNAMICS 203:255-310
Meyer, M.D. (2009) DEVELOPMENT AND APPLICATION OF A FISH EMBRYO BIOASSAY
FOR STUDIES OF SURFACE WATER TOXICITY IN THE BRAZOS RIVER Tesi Master,
Univ. Tech. Texas
Pettering DH, Berg C, Tomasiewicz H, Carvan M, Petering L, Hesselbach R, (2013),
ZEBRAFISH AS MODELS: STUDYING THE EFFECTS OF ENVIRONMENTAL AGENTS ON
HUMAN HEALTH, University of Wisconsin-Milwaukee
Pittz, Z., (2013), Effects of Ethanol on the developing Zebrafish Embryo , Waukesha
South High School.
Ramos Blasco, Juan (2011) CURSO DE FORMACIÓN PARA PERSONAL QUE LLEVA A
CABO PROCEDIMIENTOS CON ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN. Categoria B.
Recepción de animales. Parc Recerca Biomèdica de Barcelona.
Ramos Blasco, Juan (2011) BIOLOGIA FUNDAMENTAL DE LOS ANIMALES ACUÁTICOS.
BIOLOGÍA DE PECES Parc Recerca Biomèdica de Barcelona.
99
Reed R, Jennings M (2010) Guidance on the housing and care of Zebrafish Danio
rerio. Research Animals Department, Science Group, RSPCA
Reimers, M. J., Flockton, A. R. and Tanguay, R. L. , (2004) Ethanol- and acetaldehyde-
mediated developmental toxicity in zebrafish Neurotoxico/Terato/26(6): 769-81
Shaukat A, Champagne DL, Alia A, Richardson MK, (2011) Large-Scale Analysis of Acute
Ethanol Exposure in Zebrafish Development: A Critical Time Window and Resilience.
PLoSONE, Volume 6, Issue 5, e20037
100
11. WEBGRAFIA
Acuariofilia. Artemia salina.[Consulta:10 Maig 2014].Disponible a Internet:
http://www.acuariofilia.pauluk.8k.com/artemia.htm
FAQ Español de Acuariofília. Alex Patak. (Gener 1999) ¿Qué es el ciclo del nitrógeno?.
[Consultat: 12 Maig 2014]. Disponible a internet: http://faq.thekrib.com/es/empezar-
ciclo-nitrogeno.html
Ibañez, Maria. Treball de recerca 2n batxillerat. Institut Icària de Barcelona .(2012).
L'efecte de la nicotina en el desenvolupament embrionari del peix zebra. [Consultat: 5
Febrer de 2014]. Disponible a internet: http://daniorerio.info/
Institut Català de la Salut. SISO (Sistema Integrat de salut d’Osona). (29 d’abril de
2009). Efectes de l’alcohol. [Consultat: 10 de Juny de 2014]. Disponible a internet:
http://www.siso.cat/?s=alcoholisme
Myers PZ. (28 Setembre 2006). Annotated zebrafish development timelapse.
ScienceBlogs. [Consultat: 5 Juny 2014]. Disponible a internet:
http://www.youtube.com/watch?v=6PhnHYZ5-zg&noredirect=1
Seriously Fish. (2014). [Consultat: 20 Maig 2014]. Disponible a internet:
http://www.seriouslyfish.com/species/danio-rerio/
Sorgeloos P, Lavens P, Lé P, Tackaert W, Versichele D. (1986). Manual para el cultivo y
uso de artemia en acuicultura. Universitat de l’Estat de Gant, Facultat d’Agronomia.
[Consultat 25 de Maig de 2014]. Disponible a internet: http://www.fao.org/3/a-
ab474s/AB474S00.htm#TOC
Zebrafish Model Organism Database (ZFIN), University of Oregon. (2014). Zebrafish
Developmental Staging Series. [Consultat: diversos dies de Febrer, Juny i Juliol 2014].
Disponible a internet: https://zfin.org/zf_info/zfbook/stages/index.html
101
12. AGRAÏMENTS
Sembla que ja és temps d’anar tancant una etapa, el Batxillerat. Fent un anàlisi
retrospectiu, me n’adono que encara que aquest Treball de Recerca porti el meu nom
hi hauria d’aparèixer molta més gent, ja que sense ells no hagués estat capaç de
finalitzar-ho.
M’agradaria agrair al meu tutor, el Sr. Alex Lòpez-Duran, pels teus consells i per la
oportunitat que m’has brindat per ampliar els meus coneixements. M’agradaria agrair
profundament també el treball desinteressat del Sr. Juan Ramos del P.R.B.B, “Parc de
Recerca Biomèdica de Barcelona”, que m’has trames l’ interès per món dels peixos i de
l’experimentació. Que m’has acompanyat ens els moments de desesperació amb la
teva gran experiència i coneixença en aquests temes.
M’agradaria agrair a la família, tots ells sempre interessats en les meves primeres
passes com a investigadora, sempre preguntant-me pels meus avenços. M’agradaria
agrair a tots vosaltres, en especial a la tieta Helena i tieta Cedes i al tiet Carles, la
paciència que heu tingut i teniu per aguantar els meus mals humors, indecisions i
temors i per estar sempre al meu costat per qualsevol problema.
A la meva mare, pel seu amor, impuls i energia, sempre pendent quan l’he necessitat.
Al Josep, pel teu suport, afecte i confiança dipositada, veient sempre amb bons ulls les
meves “grans” decisions.
A la memòria del meu Pare, Jordi al qui dedico aquest treball.
A la meva Escola Garbí, al seu director, gràcies Sr. Jordi Carmona, per la seva amabilitat
i per confiar en mi a l’hora de deixar-me el laboratori i totes les instal·lacions de
l’escola per desenvolupar el meu Treball de Recerca.
Al Sr Pedro i els seus companys de Manteniment de l'escola per obrir-me l’escola a
primera hora del matí per poder fer les observacions dels embrions.
Aprofito també per agrair al Toni de la botiga “Aquafish” per els bons consells i ajuda
que m’has brindat.
Bestfishes!
Moltes gràcies a tots!!!!
102
ANNEX
103
Annex 1 Glossari
Anell embrionari: blastodisc dels ous fecundats
Anell de germinació: regió de cèl·lules plana en forma de disc a partir de la qual es
desenvolupa l’embrió en l’ou fertilitzat
Arcs faríngics ( o arcs branquials): Estructures en forma d’esquerdes presents als
Vertebrats , que es desenvolupen per parelles des de la part posterior de l’embrió cap
la part frontal de la cara i el coll i que desenvolupen la seva pròpia artèria, un nervi que
controla un grup muscular i teixit esquelètic. Normalment hi ha 6 parelles d’arcs, però
en els humans el cinquè només existeix temporalment durant el desenvolupament.
Blastòmer: Cadascuna de les cèl·lules, anomenades també cèl·lules filles, formades
durant la divisió de l'ou fertilitzat en els primers estadis del desenvolupament
embrionari.
Blastodisc: Estructura embrionària amb forma convexa que es segrega des del rovell
durant la divisió.
Ectoderma: Capa germinativa que es troba a l'exterior dels embrions de metazous.
Dóna lloc a diverses estructures, com per exemple, l'epidermis i el tub neural.
Endoderma: capa que es troba a l'interior dels embrions que dona lloc a diverses
estructures, com per exemple el fetge, el pàncrees, part del tub digestiu, epitelis de la
tràquea, bronquis, uretra, i altres.
Epibòlia: Moviment de làmines generalment ectodèrmiques, que es despleguen com a
una unitat per a envoltar les capes profundes de l'embrió. Expansió d'una làmina de
cèl·lules sobre altres cèl·lules.
Melanòfors: Cèl·lules amb pigments a l’interior que reflecteixen la llum i que serveixen
al peix zebra per mimetitzar-se amb l’entorn segons la llum que hi ha.
104
Mesoderma: Capa germinativa que es troba només en embrions d'animals triblàstics.
Dóna lloc a diverses estructures embrionàries que derivaran en teixits i òrgans com el
cor, part dels ossos, els músculs o el conjuntiu.
Miòtom: Grup de teixits format per un somita que es desenvolupa a la paret muscular
del cos.
Notocordi: És un fi cordó que es desenvolupa a partir de la paret dorsal de l'intestí en
fase embrionària i que s'estén en sentit longitudinal al llarg de tot el cos, paral·lel al
sistema nerviós central. Es tracta de la principal característica anatòmica que permet
diferenciar als Cordats dels animals més primitius i dels més evolucionats, com els
homínids.
Placoda: Estructura amb forma de placa que es produeix per un engruiximent de
l’ectoderma a partir de la qual es desenvolupa una estructura definitiva, per exemple
l’oïda.
Pol : Lloc de l’ou on s’ha produït la fertilització, just sota el punt en que l’esperma ha
penetrat l’ou.
Solc neural: És el canal produït després de l'etapa de gastrulació en l'embrió, que
donarà lloc a la formación del tub neural. És un solc poc profund situat entre els plecs
neurals
Somita: Quan l'embrió s'està formant, en un moment donat es divideix en endoderma,
ectoderma i mesoderma. Els somites són com unes cèl·lules mare del mesoderma
especialitzades a formar teixits.
Tub neural: És una estructura embrionària dels Vertebrats precursora dels sistema
nerviós central que comprèn el cervell i la medul·la espinal.
YSL (yolk syncial layers): capes del rovell, estan formades per cèl·lues amb molts nuclis.
105
Annex 2. Etapes del desenvolupament embrionari del peix zebra
Període Etapa Començame
nt Fites de desenvolupament
Zigot (0 - 0.75 h) 0.00 h
El citoplasma flueix cap el pol per formar el
blastodisc
1-cèl·lula 0.75 h Escissió parcial
Escissió 1.00 h Disposició en matriu 2 X 2 de blastòmers
2-cèl·lules 1.25 h disposició en matriu 2 X 4 de blastòmers
(0.75 - 2.25 h) 4-cèl·lules 1.50 h disposició en matriu 4 X 4 de blastòmers
8-cèl·lules 1.75 h disposició en matriu 4 X 8 de blastòmers
16-cèl·lules 2.00 h 3 fileres regulars de blastòmers
32-cèl·lules 2.25 h 5 fileres de blastòmers; plans d'escissió irregulars
64-cèl·lules 2.50 h 7 fileres de blastòmers
Blàstula 2.75 h
9 fileres de blastòmers
Formació d'YSL
128-cèl·lules 3.00 h
11 fileres de blastòmers; una fila de nucli YSL; cicle
cel·lular asíncron
(2.25 - 5.25 h) 256-cèl·lules
3.33 h > 11 fileres de blastòmers; comença l'aplanament
del blastodiscs; nucli YSL nuclei en 2 files
512-cèl·lules 3.66 h
Aplanament del blastodisc: múltiples files de nucli
YSL
1024 -
cèl·lules 4.00 h Forma esfèrica; vora plana entre blastodisc i vitel
Alta 4.33 h
Vitel de la cèl·lula engreixant-se cap el pol quan
comença l'epibòlia
allargat 4.66 h Blastoderm una copa invertida de gruix uniforme.
Esfèric 5.25 h Blastoderm roman de gruix uniforme
Cúpula 5.66 h Anell del gèrmen visible des del pol. Epibòlia 50%
106
Epibòlia
30% 6.00 h Escut embriònic visible des del pol. Epibòlia 50%
Gàstrula
8.00 h Costat dorsal clarament més gruixut; epiblast,
hipoblast i zona d'evacuació visibles
50%-epibòlia 9.00 h
Axis i placa neural; cervell i rudiments
lnotocordaals
(5.25 - 10.33 h) Anell
alemany 10.00 h Brot de cua prominent; primer polster; epibòlia
100%
Escut 10.33 h Primer solc somita
75%-
epibòlia 11.66 h Polster prominent; vesícula òptica vesicular de
Kupffer, quilla neural
90%-
epibòlia 14 h Formació de pronefres
Capoll 16 h
LE (longitud embrió) = 0.9 mm; placoda òtica,
neuròmers cerebrals
Segmentació 1-4 somites 19 h
LE = 1.4 mm; lent, vesícula òtica, romboencèfal
neuròmers
(10.33 - 24 h) 5-9 somites 22 h
LE = 1.6 mm; illes de sang, otolits, separació
mesencèfal-ortoencèfal
10-13
somites 24 h LE = 1.9 mm; pigmentació inicial, batec del cor
14-19
somites 30 h LE = 2.5 mm; primer reflex de tacte, retina
pigmentada
20-25
somites 36 h LE = 2.7 mm; mobilitat inicial, pigmentació de la
cua
26+ somites 42 h LE = 2.9 mm; rudiments d’aleta pectoral
Faríngula 48 h LE = 3.1 mm; brots d’aleta pectoral allargats
Prim-5 60 h LE = 3.3 mm; fulles d’aleta pectoral
(24 - 48 h) Prim-15 72 h 3.5 mm longitud total cos
Prim-25 96 h 3.7 mm longitud total cos
107
High-pec 120 h 3.9 mm longitud total cos; 6 dents
Eclosió 144 h 4.2 mm longitud total cos
Long-pec 168 h 4.5 mm longitud total cos; 8 dents
(48 - 72 h) Pec-fin 14 d 6.2 mm longitud total cos; 10 dents
Larval 21 d 7.8 mm longitud total cos
Protruding-
mouth
30 d 10 mm longitud total cos; adult fins/pigment
Dia 4 45 d 14 mm longitud total cos; 12 dents
Adult (90 d - 2
y) 90 d Adult reproductor
Taula A1. Etapes del desenvolupament
108
Annex 3. Numeració d’etapes del desenvolupament embrionari del peix zebra
Aquesta taula indica el número seqüencial de cada etapa, el temps hpf de cada etapa i
remarcat en groc les etapes que he observat
Nº Etapa Període Descripció Inici
1
Zigot (0 -
0.75 h)
0.00 h
2 1-cèl·lula 0.75 h
3 Escissió 1.00 h
4 2-cèl·lules 1.25 h
5
(0.75 - 2.25
h) 4-cèl·lules 1.50 h
6 8-cèl·lules 1.75 h
7 16-cèl·lules 2.00 h
8 32-cèl·lules 2.25 h
9 64-cèl·lules 2.50 h
10
Blàstula
2.75 h
11 128-cèl·lules 3.00 h
12
(2.25 - 5.25
h) 256-cèl·lules 3.33 h
13 512-cèl·lules 3.66 h
14
1024 -
cèl·lules 4.00 h
15 Alta 4.33 h
16 allargat 4.66 h
17 Esfèric 5.25 h
18 Cúpula 5.66 h
19 Epibòlia 30% 6.00 h
20 Gàstrula 8.00 h
109
21 50%-epibòlia 9.00 h
22
(5.25 - 10.33
h) Anell 10.00 h
23 Escut 10.33 h
24 75%-epibòlia 11.66 h
25 90%-epibòlia 14 h
26 Capoll 16 h
27 Segmentació 1-4 somites 19 h
28
(10.33 - 24
h) 5-9 somites 22 h
29
10-13
somites 24 h
30
14-19
somites 30 h
31
20-25
somites 36 h
32 26+ somites 42 h
33 Faríngula 48 h
34 Prim-5 60 h
35 (24 - 48 h) Prim-15 72 h
36 Prim-25 96 h
37 High-pec 120 h
38 Eclosió 144 h
39 Long-pec 168 h
40 (48 - 72 h) Pec-fin 14 d
41 Larval
21 d
42
Protruding-
mouth
30 d
43 Dia 4 45 d
44
Adult (90 d -
2 y) 90 d
Taula A2. Numeració del retard de desenvolupament
110
Annex 4 Comparació d’anomalies morfològiques
hpf CONTROL 30mM 100mM 300mM
24
RETARD
48
72
Taula A3. Morfologia del cap. Fotografies: G. Camps
111
hpf CONTROL 30mM 100mM 300mM
24
RETARD
72
Taula A4. Altres anormalitats: 24 hpf: Cua doblegada; 72 hpf: edema de pericardi. Fotografies: G.Camps
