EVALUACIÓN DE LA CINETICA DE REMOCION DE Pentolita (2,4,6-trinitrotolueno y

pentaeritritol tetranitrato) EN MICROCOSMOS DE SUELOS PROVENIENTES DE UNA

PLANTA DE PRODUCCION DE EXPLOSIVOS

Kelly Hidalgo Martínez

Cindy Pardo Bojacá

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial

Para optar al titulo de

Microbióloga (s) Industrial(es)

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

Bogotá D.C

17 de noviembre de 2009

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EVALUACIÓN DE LA CINETICA DE REMOCION DE Pentolita (2,4,6-trinitrotolueno y

pentaeritritol tetranitrato) EN MICROCOSMOS DE SUELOS PROVENIENTES DE UNA

PLANTA DE PRODUCCION DE EXPLOSIVOS

Kelly Hidalgo Martínez

Cindy Pardo Bojacá

APROBADO

Ingrid Schuller Ph. D Janeth Arias MsC

Decana Académica Directora Carrera

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NOTA DE ADVERTENCIA

Articulo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus

trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral

católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien

se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”

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TABLA DE CONTENIDO

Resumen .................................................................................................................................... 6 INTRODUCCION ........................................................................................................................ 6 1. Formulación del problema y justificación ................................................................................ 8 2. Marco teórico .......................................................................................................................... 9 2.1 Explosivos ........................................................................................................................... 9 2.2 TNT ....................................................................................................................................... 9 2.2.1 Características .................................................................................................................. 9 2.3 PETN………………………………………………………………………………………………… 10 2.3.1 Características ................................................................................................................. 10 2.4 Efectos de la contaminación por explosivos en combinación ............................................... 11 2.5 Destino e impacto ambiental de explosivos en ambientes acuaticos y terrestres ................ 11 2.5.1 Solubilidad y disolución ..................................................................................................... 12 2.5.2 Volatilización ..................................................................................................................... 12 2.5.3 Adsorción ......................................................................................................................... 12 2.5.4 Fotolisis ........................................................................................................................... 12 2.5.5 Hidrólisis .......................................................................................................................... 12 2.5.6 Reducción ........................................................................................................................ 13 2.5.7 Biotransformación ............................................................................................................ 13 2.5.7.1 Transformación aerobia de TNT por bacterias ............................................................... 13 2.5.7.2 Transformación aerobia de PETN por bacterias ............................................................ 14 2.6 Microcosmos ........................................................................................................................ 15 2.7 Bioestimulación .................................................................................................................... 15 3. Objetivo ................................................................................................................................. 16 3.1 Objetivo general ................................................................................................................... 16 3.2 Objetivos específicos ........................................................................................................... 16 4. Materiales y métodos ............................................................................................................. 16 4.1 Diseño de la investigación ................................................................................................... 16 4.1.1 Población de estudio y muestra ........................................................................................ 16 4.1.1.1 Población de estudio ...................................................................................................... 16 4.1.1.2 Muestras ........................................................................................................................ 16 4.1.2. Variables de estudio ........................................................................................................ 16 4.2 Métodos ............................................................................................................................... 17 4.2.1 Lugar de muestreo ............................................................................................................ 17 4.2.2 Curva de calibración ........................................................................................................ 17 4.2.3 Procesamiento de las muestras ....................................................................................... 17 4.2.3.1 Recuento inicial ............................................................................................................. 17 4.2.3.2 Determinación de la concentración inicial de TNT y PETN ............................................ 17 4.2.3.3 Incubación de los microcosmos .................................................................................... 18 4.2.3.4 Determinación de la cinética de degradación de TNT y PETN ...................................... 18 4.3 Recolección de la información ............................................................................................. 19 4.4 Análisis de la información .................................................................................................... 19 5 Resultados y discusión .......................................................................................................... 19 5.1 Curvas de calibración .......................................................................................................... 19 5.1.1 TNT ................................................................................................................................... 19 5.1.2 PETN ............................................................................................................................... 19 5.2 Recuento inicial ................................................................................................................... 19 5.3 Concentración inicial de explosivos ..................................................................................... 21 5.4 Controles ............................................................................................................................. 22 5.5 Cinéticas de degradación .................................................................................................... 23 5.6 Efecto en la degradación de TNT y el PETN en mezcla ...................................................... 24 6. Conclusiones y recomendaciones ......................................................................................... 25 7. Bibliografía ............................................................................................................................. 26 ANEXOS

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Resumen

Para el estudio de la cinética de remoción de los explosivos, 2,4,6-trinitrotolueno (TNT) y el

pentaeritritol tetranitrato (PETN), se usaron dos muestras provenientes de la fabrica de

producción, para su análisis en microcosmos, evaluando la remoción de éstos bajo condiciones

de bioestimulación (adición de fuentes de carbono) y biodegradación intrínseca, por medio de

la determinación de las concentraciones residuales de los explosivos en Cromatografía liquida

de alta eficiencia (HPLC). Posteriormente se compararon las cinéticas obtenidas entre los dos

tratamientos (Biodegradación intrínseca y bioestimulación) de cada una de las muestras. Así

mismo se realizaron comparaciones con los resultados obtenidos en los estudios de Peña y

Ramos y Velásquez (2009), en donde se evaluaron las cinéticas de remoción de TNT y PETN

respectivamente.

En cuanto a los resultados se obtuvo que los controles no tuvieron el comportamiento

esperado, pues la concentración de explosivos disminuyo casi en su totalidad al día 7, es por

esto que los datos presentados de las muestras no son validos para concluir acerca de la

remoción de estos compuestos por biodegradación intrínseca o bajo condiciones de

bioestimulación.

INTRODUCCIÓN

A través del tiempo, se ha visto que las actividades de manufactura, uso, almacenamiento y

eliminación de explosivos, por parte de industrias como la minera, explotación de carbono,

petrolera y militar, ha generado contaminación en suelos y aguas, siendo esto una

problemática importante a nivel ambiental, debido a que explosivos como el 2,4,6-

Trinitrotolueno (TNT) y el Pentaeritritol tetranitrato (PETN) no se incorporan fácilmente en los

ciclos biogeoquímicos dificultando así su degradación.

Durante la detonación de los explosivos se pueden difundir restos de munición y pequeñas o

grandes cantidades de los constituyentes del explosivo como lo son las moléculas explosivas y

metales al ambiente, es por esto que se hace importante conocer los destinos ambientales de

los contaminantes, los cuales se ven afectados por procesos como la disolución, solubilidad,

sorción, volatilización, adsorción, transformación-degradación biótica y abiótica y

bioacumulación.

Es importante dar un paso hacia la búsqueda de alternativas que sean favorables en la

remediación de los ecosistemas contaminados, teniendo en cuenta el estudio y la relevancia de

los procesos anteriormente mencionados; para así llegar a implementar técnicas de

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biorremediación, es así que por medio del estudio de la evaluación de la remoción de TNT y

PETN en suelos provenientes de la planta de producción de los mismos, usando microcosmos

para simular la degradación natural de estos compuestos y aplicando fuente de carbono para

evaluar la posibilidad de estimular el proceso (bioestimulación), se quiso dar un primera

exploración hacia este tipo de estudios.

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1. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

Con el fin de disminuir los efectos desfavorables causados por el empleo de los explosivos en

los ambientes impactados, se han llevado a cabo diferentes investigaciones para la búsqueda

de alternativas de degradación biológica, de bajo costo y fácil implementación, y a su vez una

verdadera disminución de los efectos tóxicos del contaminante. Sin embargo hasta la fecha no

se ha descrito la mineralización completa de TNT o PETN por microorganismos, y la

remediación de éstos compuestos es todavía un desafío. Además, el efecto de contaminación

de éstas dos moléculas en conjunto es aún desconocido, y no es claro cuales condiciones, son

más favorables para su remediación. Es por esto que con ésta investigación se quiere dar a

conocer la tasa natural de biodegradación de la pentolita y que efecto tiene la bioestimulación

con fuente de carbono, siendo ésta utilizada, debido a que en condiciones naturales (suelo,

sedimento etc.) el carbono se considera como el nutriente limitante, y por literatura reportada

se sabe que el TNT y PETN no son utilizados como fuente de carbono por parte de los

microorganismos, sobre la degradación de los dos compuestos.

Con esta investigación se pretende generar un primer acercamiento a las cinéticas de remoción

de TNT y PETN, necesario para el entendimiento de las condiciones que se requieren para

lograr una descontaminación de los ecosistemas afectados, y así, dar un paso más hacia la

implementación de estas alternativas en la remoción de estos contaminantes y en el futuro

pueda implementada la biorremediación. Así mismo los resultados de este trabajo (la tasa de

tasa de remoción de pentolita) se comparo con los resultados de dos trabajos de grado

realizado en paralelo (la tasa de degradación de cada explosivo, TNT o PETN, por separado).

Con esta comparación se busca determinar si la existencia de los dos explosivos juntos tiene

efecto sobre su degradación.

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2. MARCO TEORICO

2.1 EXPLOSIVOS

Los explosivos son compuestos o mezcla de compuestos químicos que bajo la influencia de un

choque químico o térmico, se descomponen rápidamente y de forma espontanea con la

liberación de grandes cantidades de gases y calor (Brannon y Pennington, 2002). Están

clasificados en tres grupos basados en su sensibilidad a la detonación:

Explosivos primarios: caracterizados por presentar una alta sensibilidad (Manitol

hexanitrato (MHN) y Diazodinitro fenol (DDNP)).

Explosivos secundarios: presentan sensibilidad media (2,4,6-Trinitrotolueno (TNT),

Pentaeritritol tetranitrato (PETN), Ciclotrimetileno trinitamina (RDX)).

Explosivos terciarios: compuestos cuya sensibilidad es muy baja (Mononitrotolueno

(MNT), Amonio perclorato (AP)) (Doble y Kumar, 2005).

Los explosivos secundarios son los más ampliamente usados por diferentes industrias como la

militar, petrolera, minera y explotación de carbón, durante estas actividades éstos explosivos

pueden entrar al ambiente difundiéndose en el suelo, sedimento y agua, contaminando y

generando impactos potenciales en el ambiente y en la salud humana (Juhasz y Naidu, 2007).

Dentro del grupo de los explosivos secundarios existen tres categorías según la composición

química: nitroaromáticos, nitraminas, y esteres de nitrato. Los explosivos nitroaromáticos son

aquellos que tienen grupos nitro unidos a los átomos de carbono de un anillo aromático como

es el caso del TNT y el Metil-2,4,6-Trinitrofenilnitramina; las nitraminas presentan grupos nitro

unidos al átomo de nitrógeno presente entre el anillo alicíclico tales como RDX y HMX; en el

caso de los esteres de nitrato contienen grupos nitro unidos al átomo de oxigeno , el cual esta

ligado a un carbono alifático, dentro de este grupo se encuentra el PETN (Juhasz y Naidu,

2007).

2.2 TNT

2.2.1 Características

El 2,4,6-Trinitrotolueno (TNT) es un explosivo nitroaromático (Fig.1), química y térmicamente

estable, presenta un bajo punto de fusión, es soluble en agua y con baja volatilidad. Éste

explosivo ha sido ampliamente utilizado en las actividades militares, minería y explotación de

carbono (Juhasz y Naidu, 2007).

El TNT se caracteriza químicamente por que su anillo aromático presenta electrones π, que

son removidos gracias a la electronegatividad de los grupos nitro, haciendo que el núcleo se

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vuelva electrofílico. Los grupos nitro consisten en dos átomos de oxigeno y uno de nitrógeno, y

ambos son altamente electronegativos, pero el oxigeno es aun mas que el nitrógeno

polarizando el enlace. Estos grupos nitro se hacen fácilmente reducibles, debido a la alta

electronegatividad y a la carga parcialmente positiva del átomo de nitrógeno (Preuss y Rieger,

1995).

Fig.1 Estructura del 2,4,6-Trinitrotolueno (TNT).

Esteve-Núñez et al., 2001

El TNT ha sido reportado por la EPA como un contaminante prioritario, debido a que se han

observado efectos carcinogénicos y citotóxicos, además de ello se reportado que para la salud

genera anormalidades en los eritrocitos, disfunción del hígado y cáncer en mamíferos (Symons

y Bruce, 2005).

2.3 PETN

El PETN es difundido a ambientes terrestres y acuáticos, debido a las actividades de

manufactura, almacenamiento, transporte y difusión, generando contaminación en estos

ecosistemas (Snape et al., 1997). La contaminación de compuestos como el PETN se debe a

que estos no se incorporan fácilmente en los ciclos biogeoquímicos, lo cual los hace a parte de

xenobióticos, recalcitrantes (Esteve-Núñez et al., 2001).

2.3.1 Características

El Pentaeritritol tetranitrato (PETN) es un explosivo secundario perteneciente al grupo de los

esteres de nitrato (Fig. 5), de baja solubilidad en agua y cuya síntesis esta dada por medio de

la nitración directa del pentaeritritol con ácido nítrico y ácido sulfúrico como catalizador de la

reacción.

Estructuralmente el PETN no ha sido encontrado de forma natural en el ambiente, por lo cual

se considera un compuesto xenobiotico (Li, 2007). Además de su uso como explosivo, éste es

también empleado en el tratamiento de enfermedades del corazón, gracias a su capacidad de

vasodilatador de arterias coronarias (Li, 2007).  

 

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Fig. 5 Estructura química del Pentaeritritol tetranitrato (PETN)

Binks et al., 1996 

Con el fin de conocer una posible ruta metabólica de degradación que sea llevada a cabo por

microorganismos, es de importancia tener en cuenta que dentro del proceso de biodegradación

de la molécula de PETN, es necesario la caracterización de intermediarios que están

involucrados en la transformación del compuesto, para que así sea mas fácil su identificación.

Se ha visto que según estudios reportados la molécula de PETN es transformada por la

utilización de los nitratos presentes en ella a través de los microorganismos, generando

compuestos como mono, di y trinitrato de pentaeritritol, indicando que la degradación del

compuesto puede ser entendida mediante la evaluación de la concentración de los nitratos

(White et al., 1996, Li, 2007).

2.4 Efecto de la contaminación por explosivos en combinación

En una investigación realizada por Moshe et al. (2009), en la que estudiaron la degradación de

una mezcla de explosivos, compuesta por TNT, RDX y HMX, evidenciaron que el TNT e

intermediarios de su degradación como el tetraazoxytolueno ejercían una inhibición en el

metabolismo de los otros dos explosivos, demostrado por las bajas tasas de degradación que

presentaron cuando estaban en la mezcla, en comparación de las tasas individuales. De igual

manera se demostró que la biomasa y la diversidad disminuían con el aumento de la

concentración de TNT. Los investigadores proponen que la investigación esta dada por un

efecto citotóxico sobre las comunidades microbianas capaces de degradar RDX y HMX. Por

otra parte, se ha encontrado que PETN y TNT pueden ser metabolizados por la misma enzima

(French et al., 1998). Sin embargo, la degradación de una combinación de TNT y PETN, los

cuales se encuentran en el producto comercial Pentolita, aun es desconocido.

2.5 Destino e impacto ambiental de explosivos en ambientes acuáticos y terrestres.

La exposición y el riesgo que generan los contaminantes en suelo, agua y sedimentos son de

importancia para conocer el efecto y destino de los compuestos y los productos de su

transformación en el ambiente. El efecto ambiental y el riesgo potencial de los compuestos

contaminantes como los explosivos, esta afectado por diferentes procesos naturales. A

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continuación se describen los procesos de transporte por los cuales los contaminantes pueden

llegar a incorporarse en el ambiente.

2.5.1 Solubilidad y disolución

La solubilidad, se presenta como un parámetro critico que determina el destino y el transporte

de los contaminantes en el ambiente, viéndose ésta afectada por factores ambientales como el

pH y la temperatura (Huang et al., 2000; Lynch et al., 2001); por otro lado la disolución en agua

de estos compuestos, es un mecanismo por el cual son diseminados al ambiente (Lynch,

2002).

2.5.2 Volatilización

Proceso mediante el cual se presenta la transformación de la fase solida a gaseosa.

2.5.3. Adsorción

Esta definida como el proceso por el cual moléculas son acumuladas o retenidas en la

superficie de un material solido (Alexander, 1999; Juhasz y Naidu, 2007). La adsorción

puede incluir fuerzas de Van der Waals, puentes de hidrogeno e intercambio iónico (Alexander,

1999). Mientras que los procesos de absorción se refieren a la retención del soluto entre la

masa del solido y no en la superficie. En lo que refiere al termino de sorcion, este puede ser

usado como la combinación de procesos de adsorción y absorción (Alexander, 1999; Juhasz y

Naidu, 2007).

2.5.4. Fotolisis El proceso de fotolisis es considerado como el proceso mayor que afecta la transformación de

los contaminantes en corrientes de desechos y cuerpos de agua (Mc Grath, 1995), el término

de fotolisis se define como la alteración de un compuesto, que puede ser causado por efectos

indirectos o directos de luminosidad (Glover and Hoffsomer 1979). En el caso de compuestos

nitroaromáticos (TNT) el proceso de fotolisis puede ser dado por la oxidación de los grupos

metil, reducción de los grupo nitro (Juhasz y Naidu, 2007).

2.5.5. Hidrólisis Termino que define la reacción en la que un grupo funcional de un compuesto organico

reacciona con el agua con la formación de nuevos enlaces carbono-oxigeno. En compuestos

como los nitroaromáticos que son generalmente resistentes no se presenta ésta reacción, sin

embargo puede ocurrir hidrólisis cuando se da un aumento en el pH (Juhasz y Naidu,

2007).

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2.5.6. Reducción

En la mayoría de los compuestos energéticos que presentan grupos funcionales nitro se

generan reacciones de reducción abiótica, en donde los grupo nitro por una serie de

reacciones son reducidos a grupos amino, con procesos de sensibilidad a pH y el potencial

redox (McGrath 1995). En este tipo de reacciones requiere la activación por catálisis por

compuestos de hierro, macromoléculas orgánicas y minerales arcillosos. Por otro parte, se ha

descrito que mediante procesos microbianos se aceleran las reacciones de reducción. Sin

embargo la reducción abiótica de los contaminantes puede estar dada por condiciones

ambientales, siendo difícilmente distinguir si se presentan transformaciones bióticas o abiótica

(Juhasz y Naidu, 2007).

2.5.7. Biotransformación En los procesos de biotranformación los compuestos contaminantes son modificados, por el

potencial de los microorganismos para degradarlos bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas,

la degradación del compuesto en ocasiones puede alcanzar su mineralización completa y el

destino y el transporte de la transformación microbiana de los productos puede estar sujeta a

un número de reacciones.

La degradación de los compuestos puede darse como resultado de distintos mecanismos en

los que especialmente se encuentra, a) la utilización del compuesto como una única fuente de

energía y carbono, b) cometabolismo, reacción en la que la transformación de un compuesto

orgánico por un microorganismo no es usado como sustrato o fuente de energía y que por lo

tanto requiere de la presencia de sustratos primarios para soportar su crecimiento (Alexander,

1999; Juhasz y Naidu, 2007) y c) utilización de el compuesto como fuente de nitrógeno

(Boopathy et al.,1998)

A continuación se describe la degradación microbiana de TNT y PETN bajo condiciones

aeróbicas.

2.5.7.1 Transformación aerobia de TNT por bacterias

El metabolismo aerobio bacteriano de compuestos nitroaromáticos ésta clasificado en tres

categorías: a) oxigenación del anillo, seguido por la liberación de nitrito, b) ataque nucleofílico

por un ion hidruro para la formación del complejo hidruro-Meisenheimer del cual hay una

liberación de nitritos, y c) reducción de nitritos a la forma hidroxilamina o amina, que en

ocasiones es metabolizada. Sin embargo en la primera categoría solo han sido descritos

procesos de transformación de mono y dinitrotoluenos, razón por la cual el TNT no puede ser

degradado por ésta vía, debido a su alto grado de sustitución que hace que el anillo aromático

sea deficiente en electrones, impidiendo que éste actué como sustrato para el mecanismo de la

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oxigenación electrofílica (Lewis et al., 1997). En algunas investigaciones se ha reportado que

bacterias aerobias tienen la capacidad de transformar la molécula de TNT por reducción de uno

o dos grupos nitro a grupos amino o hidroxilamino (Anexo 1 Fig. 2 b), los cuales normalmente

se acumulan en el medio de cultivo sin que se presente su metabolización; a su vez se ha

encontrado la producción de hidroxilamino-dinitrotoluenos generando mutaciones (Symons y

Bruce, 2005). De igual manera se ha demostrado en estudios que el TNT parcialmente

reducido puede reaccionar con él mismo formando compuestos recalcitrantes llamados

azoxitetranitrotoluenos (Anexo 1 Fig. 2 a), los cuales causan mas efectos mutagénicos que el

mismo compuesto (Haidour y Ramos, 1996; George et al., 2001).

Una segunda vía de transformación del TNT esta asociada a la formación del complejo hidruro

y dihidruro-Meisenheimer catalizado por un grupo de enzimas dentro de las que se encuentra

la PETN reductasa, los iones hidruro son donados por NAD(P)H (Anexo 2 Fig. 3) (French et al.,

1998; Haidour y Ramos, 1996). Gracias a que el anillo aromático es deficiente en electrones los

grupo nitro del TNT son suficientes para lograr el ataque reductivo, formando el complejo, quien

es el que pierde la característica de aromaticidad, y es químicamente inestable generando la

liberación de un grupo nitro, y la formación de dinitrotolueno. Esta molécula es menos toxica, y

puede ser metabolizada por mono y dioxigenasas y por tanto es menos recalcitrante que el

TNT y sus intermediarios parcialmente reducidos. (Symons y Bruce, 2005).

2.5.7.2 Transformación aerobia de PETN por bacterias

En lo que se refiere a la degradación de PETN, se conocen pocos estudios acerca de éste,

entre los que se encuentran las investigaciones realizadas por Li en 2007 y 2008, en el que

analizaron la biodegración del explosivo con la adición de diferentes aceptores de electrones

(nitrato y sulfato), determinando las vías de degradación. Otro estudio fue el realizado por

Jenkins y colaboradores en 2007, en el cual evalúan la vida media de PETN en el suelo usando

microcosmos.

Los átomos de carbono en compuestos de esteres de nitrato como el PETN, son derivados de

alcoholes polihídricos, y sus átomos de nitrógeno, logran ser asimilados por los

microorganismos, permitiendo el desarrollo de la biomasa, generando así que la

biodegradación del compuesto, sea una solución mas segura para su remediación (Anexo 3 Fig

6) (Ye et al,. 2004).

Por otra parte en la investigación realizada por Binks et al. (1997) se demostró que la enzima

producida por Enterobacter cloacae PB2, PETN reductasa es capaz de degradar PENT en

condiciones aeróbicas y limitantes de nitrógeno, con la aparición de subproductos como

pentaeritritol dinitrato, 3-hidroxi-2,2-bis[(nitrooxi)metil]propanal, 2,2-bis[(nitrooxi)

metill]propanodial

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En el estudio realizado por Christodoulatos et al. (1997) reportaron que el glicerol trinitrato

(compuesto análogo al PETN), se degrada por medio de la remoción sucesiva de los nitritos,

formando glicerol dinitrato y mononitrato como intermediarios. En otra investigación el GTN fue

reducido a 1,2 y 1,3-dinitroglicerina y después a 1- y 2-mononitroglicerina, para finalmente ser

transformado a glicerol (Oh et al., 2004).

2.6 Microcosmos

Un microcosmos es un sistema de laboratorio que simula una parte del ambiente, sin embargo

no pueden representar en su totalidad el ecosistema, solo porciones del ambiente. Son muy

usados para determinar efectos en estructura y funciones de ecosistemas específicos,

causados por diferentes factores, como es el caso de los contaminantes (Morris, 1992).

Comúnmente los ensayos en biodegradación suelen ser llevados bajo condiciones controladas

empleando microcosmos, en los cuales se pueden utilizar además de suspensiones de suelos

y sedimentos en un medio definido, suspensiones de cultivos puros, consorcios

metabólicamente estables o cultivos enriquecidos, teniendo éstos una gran ventaja por su

reproducibilidad (Neilson, 1996).

El uso de microcosmos para investigaciones con explosivos fue llevado a cabo para la

determinación de la vida media de éstos en el suelo. En dicho estudio determinaron que la vida

media del PETN en el suelo varia entre 0,45 a 2,4 días (Jenkins et al., 2007)

2.7 Bioestimulación

Una de las estrategias de biorremediación, término que define al proceso mediante el cual el

uso de microorganismos presentes en un sitio producen la transformación o degradación de un

contamínate (Kavamura y Esposito, 2009) es la bioestimulación, que consiste en la

estimulación de los microorganismos de un ambiente natural por medio de la adición de

nutrientes, incrementando su actividad metabólica, para así mejorar la eliminación de los

contaminantes (Kavamura y Esposito, 20009; Mulligan y Raimond, 2003)

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3. Objetivos

3.1 Objetivo general

Evaluar y comparar la cinética de remoción de 2,4,6-Trinitrotolueno (TNT) y el Pentaeritritol

tetranitrato (PETN) en microcosmos de suelos en condiciones de bioestimulación y de

biodegradación intrínseca.

3.2 Objetivos específicos

Comparar la cinética de remoción de TNT y de PETN de la muestra de fitorremediación y

campo de prueba.

Determinar la concentración inicial de TNT y PETN en las muestras.

Comparar el efecto en la biodegradación intrínseca y en la bioestimulacion en la cinética de

remoción de TNT y PETN.,

Comparar el efecto de la presencia de los dos compuestos en combinación o no, en la

cinética de remoción de ambos explosivos.

4. Materiales y métodos

4.1 Diseño de la investigación

El diseño experimental constó de dos muestras tomadas en una planta de producción de

explosivos, para cada una de las cuales se tuvieron 18 unidades experimentales, compuestas

por dos tratamientos (con carbono y sin carbono) y tres tiempos de muestreo (0, 3 y 7 días),

por triplicado, el muestreo se realizó por sacrificio. (9 mas fuente de carbono y 9 sin fuente de

carbono). A cada unidad experimental se le determino la concentración de explosivos en cada

tiempo de muestreo para evaluar la remoción de TNT y PETN, por biodegradación intrínseca y

bioestimulación.

4.1.1 Población de estudio y muestra

4.1.1.1 Población de estudio

Se definieron seis puntos de muestreo entre los que se encuentran sedimentos y suelos en la

planta de producción de explosivos ubicada en del vecindario de Bogotá D.C. de los cuales

fueron seleccionados dos, para todos los ensayos, siendo cada punto una población, la cual

esta representada por las comunidades microbianas.

4.1.1.2 Muestras

Se utilizo la muestra proveniente del área de Fitorremediación y de campo de prueba de

detonación de los explosivos en la planta de producción, siendo la muestra en estudio las

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comunidades microbianas presentes en la cantidad de suelo tomada. Se utilizo como control,

suelo estéril de la muestra de campo de prueba.

4.1.2 Variables del estudio

En el presente estudio se evaluará como variable dependiente el porcentaje de degradación de

TNT-PETN de cada unidad experimental, cuya medición se realizará por medio de

cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC), por otro lado las variables independientes

serán, el tipo de muestra, ya que entre ellas se encuentran, sedimento y suelo, y la adición o

no de fuentes de carbono (bioestimulación) siendo esta la variable mas importante del estudio.

4.2 Métodos

4.2.1 Lugar de muestreo

El muestreo se realizó en la planta de fabricación de explosivos ubicada cerca a la ciudad de

Bogotá en el departamento de Cundinamarca (el lugar exacto es confidencial). Se muestrearon

seis puntos diferentes dentro de la fabrica, mediante el uso de barrenos (500 g) de suelo y con

muestreadores de agua (500 ml), las muestras fueron almacenadas en refrigeración a 4ºC

hasta su procesamiento.

4.2.2 Curva de calibración

Se realizó la curva de calibración de TNT y PETN con concentraciones de 20, 50, 75, 100 y

150 ppm, en acetonitrilo como diluyente. Se analizaron por cromatografía liquida de alta

eficiencia (HPLC) para la obtención de la ecuación para la determinación de concentraciones

de los explosivos. Las condiciones de corrida en el HPLC fueron: columna Premier C18; fase

móvil metanol:agua:acetonitrilo 54:2:44; volumen de inyección 20 µl; flujo 1 ml/min.

4.2.3 Procesamiento de muestras

4.2.3.1 Recuento inicial

Se realizó un recuento de microorganismos viables aerobios por la técnica en placa, tomando

10 g de cada muestra y agregándola a 90 ml de solución salina 0.85%, posteriormente se

realizaron diluciones seriadas desde 10-2 hasta 10-8, luego se realizó la siembra en los medios

de cultivo R2A (anexo 4, Tabla 1) (diluciones 10-5 a 10-8) , agar TNT, PETN y pentolita (anexo

5, Tabla 2) (diluciones 10-2 a 10-5) por triplicado, por ultimo las placas fueron incubadas durante

5 días a temperatura ambiente (20 +/- 2ºC)

4.2.3.2 Determinación de la concentración inicial TNT y PETN

Se llevó a cabo la determinación de la concentración inicial de TNT y PETN en las muestras

por medio del método modificado de la EPA 8330B, el cual consistió en tomar 5 g de la

18  

muestra, primeramente secada a temperatura ambiente hasta peso constante, macerada y

tamizada (10 mesh) y se agregaron 10 ml de acetonitrilo, se homogenizó mediante vortex por

un minuto, posteriormente se llevó a un baño de ultrasonido (KASAI-Emasonic 30H) durante 18

horas en refrigeración. Tras la sonicación y un periodo de reposo de 30 minutos, se filtraron 1,5

ml con filtros micropore PVDF, para su análisis por cromatografía liquida de alta eficiencia,

usando una columna premier C18, con una fase móvil metanol:agua:acetonitrilo (56:42:2), flujo

constante 1 ml/min, volumen de inyección 20 µl y tiempo de corrida de 15 min, la presencia de

los explosivos fue detectada por medio de un detector de arreglo de diodos, con un barrido de

longitudes de 210 y 254 nm, correspondientes a PETN y TNT respectivamente.

4.2.3.3 Incubación de los microcosmos

Fitorremediación: Se pesaron 5 g de muestra, a los cuales se les inocularon 200 µl de

solución stock de 2500 ppm TNT y PETN para llegar a una concentración final en el

microcosmos de 100 ppm y 200 µl de solución de fuente de carbono para una

concentración final de 1% p/v, se homogenizo mediante vortex durante un minuto.

Campo de prueba: Se pesaron y tamizaron 5 g de muestra, a los cuales se les inoculo 200

µl de TNT y PETN a partir de una solución stock de 2500 ppm TNT y PETN para llegar a

una concentración final en el microcosmos de 100 ppm y 200 µl de solución fuente de

carbono para una concentración final de 1% p/v.

Controles Estéril: Se esterilizo muestra de campo de prueba mediante autoclave 3 ciclos

de 15 min, 121ºC y 15 lbs de presión. Posteriormente se pesaron y tamizaron 5 g de

muestra, a los cuales se les agrego 200 µl de solución stock de 2500 ppm TNT y PETN

para llegar a una concentración final en el microcosmos de 100 ppm y 200 µl de solución

de fuente de carbono para una concentración final de 1% p/v, adicionalmente se realizaron

controles de esterilización después de haber agregado los explosivos y la fuente de

carbono.

Los microcosmos se incubaron a temperatura ambiente (20ºC+/-2ºC), durante 7 días.

Todo el montaje fue realizado por triplicado y el número de unidades experimentales fue

determinado para realizar los 3 eventos de muestreo por descarte.

4.2.3.4 Determinación de la cinetica de degradación de TNT y PETN

Se realizaron eventos de muestreo al tiempo cero, y en los días 3 y 7 de incubación. Para ello

se tomo las unidades experimentales y se les agrego 10 ml de acetonitrilo, se homogenizaron

con vortex durante un minuto y posteriormente se llevaron a baño de ultrasonido por 18 h en

refrigeración. Trascurrido este tiempo, se dejaron en reposo durante 30 min, y luego fueron

filtrados 1,5 ml de cada unidad usando filtros de PVDF, para su análisis en cromatografía

liquida de alta eficiencia, bajo las mismas condiciones anteriormente nombradas.

19  

4.3 Recolección de la información

La obtención de los datos para esta investigación se harán mediante la realización de

cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC), y el análisis de los cromatogramas

correspondientes de cada muestra a evaluar, correlacionándolos con una curva patrón de TNT

y PETN realizada para dicho estudio.

4.4 Análisis de la información

La comparación entre las cinéticas de degradación de cada tratamiento y cada muestra fue

analizada por estadística descriptiva utilizando la desviación estándar y el coeficiente de

variación, además del uso de porcentajes de degradación.

5. Resultados y discusión

5.1 Curvas de calibración

5.1.1 TNT

La curva de calibración para la cuantificación de TNT se encuentra en el Anexo 7, fig 7, con la

cual se obtuvo la siguiente ecuación y coeficiente de correlación.

Ec (1) Y = 69780,14x – 26726,6

R2 = 0,99

El TNT tiene un tiempo de retención de 6,32 0,01, correspondiendo al pico señalado en el

cromatograma No.2 del patrón de 100 ppm en el Anexo 9.

5.1.2 PETN

La cuantificación de PETN fue evaluada mediante la curva de calibración (Anexo 7, fig 8), cuya

ecuación se encuentra a continuación:

Ec (2) Y = 31143,79x + 26143,81

R2 = 0,99

El PETN presenta un tiempo de retención de 8,82 0,01, el cual puede ser observado en el

cromatograma No. 1 del patrón de 100 ppm en el Anexo 9.

5.2 Recuento inicial

En el recuento en placa de bacterias aerobias realizado a las seis muestras seleccionadas para

el estudio (Campo de prueba y fitorremediación) se encontró que la concentración de bacterias

en ambas muestras, respecto a los medios utilizados no fueron muy diferentes (fig 9), de igual

20  

manera al realizar una descripción macroscópica de las colonias obtenidas se observó

claramente un patrón de morfología en los medios suplementados con explosivos,

caracterizadas por presentar una apariencia de gotas de agua, pequeñas y grandes. Colonias

con estas características fueron también obtenidas en el estudio realizado por Villegas y

Fajardo (2009), en donde a partir de muestras de suelo provenientes de la misma fabrica de

producción de los explosivos realizaron un enriquecimiento por 10 días, encontrando que la

mayoría de estas presentaban las características anteriormente nombradas.

Fig. 9 Recuento de bacterias aerobias inicial de dos suelos contaminados en diferentes

medios.

Los recuentos obtenidos en medios suplementados con PETN de Velázquez (2009), se

observaron colonias que producían pigmentación amarilla y café difusible al medio. El segundo

grupo de colonias predominantes en todos los medios incluido R2A fueron de texturas

cremosas, blancas y grandes.

En la muestra denominada silvestre (No contaminada), se obtuvieron levaduras blancas y

pigmentadas, las cuales no fueron observadas en las muestras provenientes de la fábrica.

Las colonias que crecieron en los medios suplementados con explosivos no fueron contenían

fuente de nitrógeno, lo cual llevó a inferir que los microorganismos encontrados pueden ser a)

posiblemente degradadores pues podrían haber utilizado el TNT y el PETN como fuente de

nitrógeno (Duque et al 1993; Boopathy y Kulpa, 1994; Li, 2007), b) fijadores de nitrógeno

atmosférico c) o crecieron a expensas de las trazas de nitrógeno provenientes del suelo.

Muestra

Campo de prueba Fitorremediación

Log

UF

C/m

l

0

2

4

6

8R2A TNT PETN Pentolita

21  

5.3 Concentración inicial de explosivos

Según la tabla 4 se muestra que los porcentajes de recuperación obtenidos para TNT y PETN

con éste método de extracción fue del 105% y 91,5% respectivamente. En las determinaciones

de la concentración inicial de TNT y PETN en los seis puntos muestreados se evidencio que la

muestra perteneciente a la caja de captación, que es el sitio por donde fluyen los vertimientos

de los explosivos provenientes del proceso de producción de los mismos, presento una

concentración de 1687,92 ppm de TNT y 2544,86 ppm de PETN; siendo esta la razón, por la

cual éstas muestras no fueron seleccionadas para ser usadas en los microcosmos.

Para el estudio realizado solamente fueron elegidos dos puntos de muestreo, campo de prueba

y Fitorremediación (suelos), debido a que presentan importancia por ser el lugar donde se

realizan las pruebas de detonación y donde se llevan a cabo procesos de remediación con una

plantas de una variedad de caña. Los valores de las concentraciones iníciales para la muestra

de campo de prueba fueron 1,75 ppm y 1,84 ppm de TNT y PENT, en cuanto al suelo de

Fitorremediación se encontró concentraciones correspondientes de 1,26 ppm de TNT y 17, 54

ppm de PETN.

Por otra parte es importante, resaltar que los valores presentados de las concentraciones

iníciales de las dos muestras para PENT, resultaron ser más altos en comparación de los

valores de TNT (Tabla 4), muy posiblemente por los procesos de manufactura generados en

planta para PETN, el cual es fabricado en dicha planta, mientras el TNT es importado.

Tabla 4. Concentración inicial de TNT y PETN

Muestra Concentración

TNT [mg/kg] CV

Concentración PETN [mg/kg]

CV

Fitorremediación 1,26 25,61 17,54 48,36

Campo de prueba 1,75 35,72 1,84 0,96

Caño PTAR 1,20 17,04 2,21 30,66

Exterior de la planta 1,93 6,07 98,96 18,36

Silvestre 2,59 41,04 0 -

Caja de Captación 1.687,92 5,68 2544,86 6,79

22  

5.4 Controles

Fig. 10 Controles estériles de campo de prueba

En cuanto se refiere a los controles realizados, según como se observo en la figura 10, se

estableció que no son controles confiables que permitan sustentar los datos de los demás

resultados, debido a que se evidencio que hay un porcentaje de degradación (Anexo 9) de los

compuestos mayor, en referencia a los tratamientos descritos anteriormente. La figura 11

muestra claramente como a los siete días de medición hay una completa degradación del TNT

y PETN siendo esto lo no esperado, pues al ser un tratamiento abiótico se busca demostrar

que este presente en su totalidad la concentración del explosivo o que se vea a través del

tiempo pequeñas disminuciones del compuesto. De esta manera, lo ideal para no tener

interferentes en los controles se debe realizar de nuevo el montaje para poder tener una mayor

confiabilidad de los datos.

Tiempo (días)

0 2 4 6 8

Con

cent

raci

ón

[mg/

kg]

0

20

40

60

80

100

120

140

campo prueba +fc esteril antes TNT Campo de prueba +fc esteril despues TNT Campo de prueba +fc esteril despues PETN campo prueba +fc esteril antes PETN

23  

5.5 Cinéticas de degradación

Fig. 11 Concentraciones de TNT y PETN en el tiempo durante incubaciones en a) campo

de prueba y b) fitorremediación en microcosmos con y sin adición de fuente de carbono.

En este estudio se encontró que la concentración de TNT y PETN después de los siete días de

medición disminuyo observándose que en la muestra de fitorremediación (Fig 11 b) de TNT la

concentración del explosivo fue disminuyendo notablemente tanto para el tratamiento en

condiciones de bioestimulación y sin adición de fuente de carbono, en comparación con la

‐‐‐    ‐‐‐ PETN Campo de prueba 

mas fuente de carbono 

‐‐‐    ‐‐‐ PETN Campo de prueba 

sin fuente de carbono 

               TNT Campo de prueba 

mas fuente de carbono 

               TNT Campo de prueba 

sin fuente de carbono 

‐‐‐    ‐‐‐ PETN Fitorremediación 

mas fuente de carbono 

‐‐‐    ‐‐‐ PETN Fitorremediación 

sin fuente de carbono 

               TNT Fitorremediación 

mas fuente de carbono 

               TNT Fitorremediación 

sin fuente de carbono 

Tiempo (días)

0 2 4 6 8

Con

cent

raci

ón [

mg/

kg]

0

20

40

60

80

100

120a

Tiempo (días)

0 2 4 6 8

Con

cent

raci

ón [m

g/kg

]

0

20

40

60

80

100

120 b 

24  

muestra de campo de prueba (Fig 11 a) presentó una menor disminución de la concentración;

así mismo se logró evidenciar en la remoción de PETN un descenso rápido en la concentración

del compuesto a partir del tiempo 0 para la muestra de fitorremediación (Fig 11 b). Es

importante tener en cuenta la vida media del PETN en suelos que ha sido reportada entre 0,45

y 2,4 días (Jenkins, et al 2003). Sin embargo se debe aclarar que debido a los inconvenientes

con los controles, estos resultados carecen de validez, y deben ser confirmados con los

eventos de muestreo siguientes, pues se cree que en el muestreo en el día 7 pudo haber algún

problema con la extracción, o con el detector en el HPLC. En todo caso no puede descartarse

que debido a que la muestra de fitorremediación proviene de un área de la fabrica, en donde se

llevan a cabo procesos de remediación de suelos contaminados con la estrategia de

fitorremediación, se puede inferir que una de la razones por la cual ésta muestra presenta

mayor degradación en contraste con el otro suelo utilizado se deba posiblemente a

mecanismos de integración de metabolitos y/o el contaminante a la biomasa vegetal (Sens et

al., 1999).

Según como se observo en la figura 11 a y b) no se presento ningún efecto de la

bioestimulación en la disminución de la concentración de los explosivos para las dos muestras,

ya que las tendencias fueron muy similares para cada una de ellas. Sin embargo en estudios

realizaos por Clark, y Boopathy en el (2007) se evidencia claramente como la adición de

fuente de carbono, especialmente melazas, favorecen la remoción del TNT con un porcentaje

del 99% mediante la implementación de reactores de lodos; así mismo en otros investigaciones

la bioestimulación con fuentes de carbono como el succinato favorece la degradación del

compuesto, ya que por consorcios bacterianos el TNT puede ser degradado por

cometabolismo. (Boopathy et al., 1994)

Otra razón por la cual puedo verse influenciada la disminución de compuestos como TNT y

PETN, son los procesos asociados a fenómenos como la adsorción mediante el cual los

contaminantes pueden llegar a incorporarse al ambiente.

5.6 Efecto en la degradación del TNT y el PETN en mezcla

Este estudio se realizo en paralelo con dos investigaciones, las cuales evaluaron la tasa de

degradación de TNT y PETN por separado, reportando que bajo las mismas condiciones de

esta investigación no hubo degradación de PETN (Velázquez, 2009), en cuanto al TNT se

obtuvieron porcentajes de degradación del 40% en la muestra de campo de prueba sin fuente

de carbono (Peña y Ramos, 2009), similares a los obtenidos en TNT en mezcla, en lo que se

refiere a la muestra de fitorremediación bajo condiciones naturales Peña y Ramos obtuvieron

porcentajes de remoción del 25% comparados con 98% en el mismo tratamiento cuando el

explosivo se encuentra en mezcla.

25  

Estos datos serán confirmados con la continuación de estos estudios, ya que hasta el momento

la investigación solo se ha llevado a cabo 3 eventos de muestreo, los cuales no son suficientes

para afirmar estos hallazgos, más aun con el problema que se tuvo en los controles.

6. Conclusiones y recomendaciones

En la muestra de fitorremediación se obtuvo mayor porcentaje de degradación de TNT y PETN

comparado con el obtenido en la muestra de campo de pruebas, sin embargo como se

mencionó anteriormente se deben comprobar estos datos con eventos de muestreo

posteriores, debido al comportamiento de los controles.

Por otra parte no se evidenciaron diferencias entre los tratamientos de bioestimulación y

atenuación natural, en lo referente a los porcentajes de degradación de TNT y PETN.

Aparentemente la degradación de TNT y PETN se ve favorecida cuando estos compuestos

están en combinación, pero se deben confirmar estos datos un número más alto de eventos de

muestreo y con sus respectivos controles.

Es importante que para estudios de este tipo de enfoque se realicen análisis físico-químicos a

las muestras a utilizar, para que de esta manera pueda haber confiabilidad y comparación de

los datos.

Es de relevancia aclarar que el método de extracción propuesto por la EPA (8330B) esta

diseñado para suelos secos, por lo tanto no es el ideal para este tipo de ensayos, pues no se

pueden cambiar las condiciones de las muestras para lograr la máxima similitud con las

condiciones naturales, es por esto que se recomienda establecer y estandarizar el método que

permita la extracción de explosivos bajo estas características de las muestras.

26  

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