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Transformación Ingreso a la célula de DNA presente en el medio Bacterias Levaduras Células de animales (mamíferos) Células vegetales

Transformaci ón

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Transformaci ón. Ingreso a la célula de DNA presente en el medio. Bacterias Levaduras Células de animales (mamíferos) Células vegetales. Bacterias ( Escherichia coli ) Plásmidos → elementos extracromosómicos de replicación autónoma - PowerPoint PPT Presentation

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Page 1: Transformaci ón

Transformación

Ingreso a la célula de DNA presente en el medio

Bacterias

Levaduras

Células de animales (mamíferos)

Células vegetales

Page 2: Transformaci ón

Bacterias (Escherichia coli)

Plásmidos → elementos extracromosómicos de replicación autónoma

Plásmidos manipulados por ingeniería genética: vectores de clonamiento

►Origen de replicación

►Gen de resistencia a antibiótico (marcador de transformación)

►Sitio de clonamiento (“polylinker”)

Transformación (transfección) llevada a cabo por:

1. Permeabilización con CaCl2, choque de temperatura

2. Electroporación

Utilidad

►Biblioteca de cDNA - sitio de clonamiento asociado a gen de -galactosidasa

►Expresión de proteínas recombinantes - sitio de clonamiento asociado a operón

lac (expresión inducible por IPTG) y elemento que facilite purificación (ej. His-tag)

Page 3: Transformaci ón

H

HO

X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)

-galactosidasa

galactosa

Colonias azules : fragmento clonadoColonias blancas : sin fragmento

Productoazúl

- IPTG → expresión bloqueada+ IPTG → expresión

Page 4: Transformaci ón

Levaduras (Saccharomyces cerevisiae)

Plásmidos → del tipo lanzadera (“shuttle”)► Origen de replicación en E. coli► Gen de resistencia a antibiótico (selección en E.coli)► Origen de replicación en levadura

● 2 ● ARS (secuencia de replicación autónoma)

► Marcador de selección metabólico

YACs → Cromosomas artificiales de levadura► Secuencias teloméricas► Secuencias centroméricas► Marcador de selección metabólico► ARS (secuencia de replicación autónoma)

Page 5: Transformaci ón

(YAC)

Vectores y marcadores de selección en levaduras

Page 6: Transformaci ón

Transformación llevada a cabo por:

1. Generación de esferoplastos, permeabilización con CaCl2, choque de temperatura

2. Tratamiento con acetato de litio y PEG, choque de temperatura

Utilidad

► Expresión de proteínas recombinantes que no se pliegan correctamente en E. coli

► Clonamiento de fragmentos muy grandes para el estudio de genomas complejos

(YACs)

► Genes de levadura → similitud con genes de animales y plantas superiores

Levadura útil como modelo para probar función de genes de

otros organismos

Page 7: Transformaci ón

Manipulación de genes por recombinación homóloga

Page 8: Transformaci ón

Eliminación (KO) de genes cromosómicos

Page 9: Transformaci ón

“Plasmid shuffle”

Estudio de función de genesmutantes o genes foráneos

KO TPK1, TPK2, TPK3

Page 10: Transformaci ón

Interacción de proteínas por ensayo de doble híbrido

Page 11: Transformaci ón

Animales

Genes en:

► Fragmentos de DNA

► Vectores tipo plásmido con elementos virales

► Virus

Fragmentos y vectores que no se replican → Transitoria Permanente (integración)

Vectores que se replican y virus → Genomas extracromosómicos independientesPartículas virales

Page 12: Transformaci ón

Transformación llevada a cabo por:

Microinyección

DNA precipitado con fosfato de calcio (endocitosis)

Electroporación

Liposomas

Infección viral

Utilidad

► Expresión de proteínas recombinantes

► Estudio de la expresión de genes en entorno natural (promotor + gen reportero)

► Estudio de la función de los genes en entorno natural● Expresión● Silenciamiento (antisentido)

Page 13: Transformaci ón

Marcadores de selección

Page 14: Transformaci ón

Ejemplo 1: Transformación con

fragmentos de DNA

Page 15: Transformaci ón

Ejemplo 2: Transformación con

vectores

Page 16: Transformaci ón

Localización de HBZ-GFP y HBZ-SI-GFP en células COS7

Murata et al. J. Virol. 80(5): 2495-2505 (2006)

Vector: pcDNA3/HBZ-GFP pcDNA3/HBX-SI-GFP

Page 17: Transformaci ón

Ejemplo 3: Transformación combinada

fragmentos de DNA y virus

Page 18: Transformaci ón

Ejemplo 4: Transformación combinada

fragmentos de DNA y virus

Page 19: Transformaci ón

Ejemplo 5: Transformación con virus (retrovirus)