TRASFEZIONE GENICATRASFEZIONE GENICA

CORSO DI BIOLOGIA CELLULARE e MOLECOLARE 2008CORSO DI BIOLOGIA CELLULARE e MOLECOLARE 2008

TRASFEZIONE GENICA

Trasferimento di DNA esogeno in cellule di mammifero per lo studio della funzione e dei meccanismi di controllo dei GENI

Perché trasferire nelle cellule frammenti di DNA esogeno?

• IN RICERCAIN RICERCA: a) cellule in coltura– Identificazione di sequenze regolatorie– Struttura e funzione genica– Produzione di proteine

• Studio• Farmaci

b) IN VIVO: produzione di animali transgenici• Modelli per la comprensione delle basi

molecolari di malattie umane• IN PRATICA CLINICAIN PRATICA CLINICA: TERAPIA GENICA

– Ripristino di funzioni metaboliche deficitarie– Aumento delle difese naturali

Il trasferimento genico

• Tipi cellulari: Non tutte le cellule possono essere trasfettate con successo – Processo in sé inefficiente – Necessaria una fonte abbondante di cellule di partenza

per ottenere un numero utilizzabile di cellule trasfettate

– Linee cellulari immortalizzate - Crescita in medium chimicamente definito per

tempo indefinito- Rapida duplicazione

• Vettore– PLASMIDE– VIRUS (infezione)

• Promotore:– Corte sequenze nucleotidiche – Danno inizio alla trascrizione– Enhancer: elementi di regolazione positiva

• Derivati da virus– SV40 early gene enhancer: attivo su molti tipi

cellulari– LTR: long terminal repeat

» Raus Sarcoma Virus» CMV

– Silencer: elementi di regolazione negativa• Fattori per la replicazione: cis, trans• ORI: sito di inizio della trascrizione (in genere SV40)

MCS

• TRANSIENTE: TRANSIENTE: - per esperimenti a breve termine (analisi ICC, studio del promotore…)

- le cellule sono normalmente raccolte 48-72 h dopo la trasfezione- over-espressione genica - popolazione cellulare disomogenea: poche cellule con molto plasmide

- immediata

• STABILE:STABILE: - per esperimenti a lungo termine

possibilità di isolare e propagare singoli cloni contenenti il DNA trasfettato

- il plasmide si integra nel genoma, processo lungo e laborioso- l’integrazione è casuale- necessario marker di selezione (morfologia, resistenza a sostanze…)- popolazione cellulare omogenea: molte cellule con poco plasmide

Che tipo di trasfezione?

1. Indagini sulla funzionalità di un gene• PROMOTORE STD + GENE D’INTERESSE

2. Controllo dell’espressione genica: indagini sulla regolazione del promotore• PROMOTORE DEL GENE D’INTERESSE + GENE

REPORTER

Scopo della trasfezione

2. Studi di attività trascrizionale: vettore promoterless

Promotore con inserzione + reporter

Enhancer + Promotore + reporter

Promotore deleto + reporter

Promotore + reporter

1. Studio attività-funzione di una proteina- promotore forte, cellula-specifico + gene per quella proteina

• Mk di selezione: Crescono solo le cellule che hanno acquisito il vettore– Creazione di linee stabili

• Reporter : Le cellule con il vettore acquisiscono particolari caratteristiche– Funzionalità di un promotore:

• reporter posto sotto il controllo di quel promotore– Funzionalità di un gene:

• Fusione del gene d’interesse con il gene reporter• Entrambi posti sotto la regolazione dello stesso

promotore

GENE REPORTER:GENE REPORTER: permette immediata identificazione delle cellule positivamente

trasfettate

• non deve avere un’attività proteica SIMILE a quella del gene d’interesse

• l’attività proteica del Reporter non deve INTERFERIRE con quelle fisiologiche della cellula: le vie di segnalazione e il metabolismo cellulare devono rimanere integri

• il saggio sull’attività del reporter deve essere specifico, riproducibile e immediato

Caratteristiche di un reporter

• Cloramfenicolo acetil-transferasi:Cloramfenicolo acetil-transferasi:– Enzima batterico: resistenza all’antibiotico cloramfenicolo– Acetilazione del Cloramfenicolo– Se si usa come substrato l’antibiotico marcato con C14,

viene acetilato solo nelle cellule trasfettate e dove il promotore che controlla l’enzima è attivo. Si produce una miscela di molecole marcate rilevate su TLC o autoradiografia

Esempio: ANALISI TLC• IL Clone A non ha attività acetilasica• I Cloni B e C hanno attività acetilasica

clone

Acl

one B

clone

C

geni reporter

• ß-galattosidasi:ß-galattosidasi:– Codificato dal gene LacZ di E.coli– Conversione di alcune sostanze in composti colorati

• Citochimica: clivaggio del substrato XGal → comparsa di precipitati BLU (colonie blu)

• Spettroscopia: clivaggio di ONPG (o-nitrophenyl-b-D-galactopyranoside ) → composto solubile giallo

• Luciferasi:Luciferasi:luciferina + ATP luciferil adenilato

+ PPiluciferil eadenilate + O2 ossiluciferina +

AMP + LUCELUCE

geni reporter

Firefly Firefly LuciferaseLuciferase

T-inducibleluminescence

± TAR

HSV TK promoterHSV TK promoter

F Luc+F Luc+

SV40 lateSV40 latepoly(A) signalpoly(A) signal

pPRE-TK-lucpPRE-TK-lucreporter plasmidereporter plasmide

PREPRE

ori

Am

pr

HSV TK promoterHSV TK promoter

R Luc+R Luc+

SV40 lateSV40 latepoly(A) signalpoly(A) signal

pRL-TKpRL-TKplasmideplasmide

ori

Am

pr

XX reagent

Renilla Renilla LuciferaseLuciferase

YY reagent

inhibition

constitutiveluminescence

Dual system

-

• GFP: green fluorescent proteinGFP: green fluorescent protein– espresso nella medusa Aequorea Victoria– in natura produce bioluminescenza dovuta al

trasferimento di energia (processo Ca-dipendente associato alla proteina Aeqorina)

– l’esposizione della proteina a raggi ultravioletti produce autofluorescenza di colore verde in assenza di Ca, Aequorina o qualunque cofattore o substrato

– mutazioni puntiformi nel cromoforo producono varianti che emettono luce a differente lunghezza d’onda

• CFP (cyan, colore blu)• YFP (yellow, colore giallo)

geni reporter

QuickTime™ e undecompressore TIFF (Non compresso)sono necessari per visualizzare quest'immagine.QuickTime™ e undecompressore TIFF (Non compresso)sono necessari per visualizzare quest'immagine.

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• RNApolII trascrive anche il sito di poliadenilazione,parte della porzione 3' viene rimossa e l'RNA poliadenilato.

• Le sequenze downstream devono essere incluse nei vettori di espressione degli eucarioti per avere la sintesi di mRNA

• Due elementi indispensabili per corretta POLIADENILAZIONE– sequenze ricche di GU o U downstream il sito di

poliadenilazione;– sequenze di 6 nucleotidi AAUAAA localizzate 11-

30 nucleotidi upstream il sito di poliadenilazione

Sito di poliadenilazione

Clonaggio di un gene in un vettore

• CARATTERISTICHE:– Elevata efficienza– Bassa tossicità– Riproducibilità in vitro e in vivo

• PROCESSO:PROCESSO:– Introduzione del DNA nella cellula– Ottenimento dell’espressione del gene d’interesse– (selezione delle cellule che si sono trasfettate

stabilmente)– Caratterizzazione del gene/ proteina prodotta

• PROBLEMATICHE:PROBLEMATICHE:– Come superare le barriere naturali???

• DNA: fortemente POLARE (carica negativa)• MEMBRANA CELLULARE LIPOFILA

METODI DI METODI DI TRASFEZIONETRASFEZIONE

METODI DI METODI DI TRASFEZIONETRASFEZIONE

1)1) METODI CHIMICIMETODI CHIMICI

2)2) METODI FISICIMETODI FISICI

• CALCIO FOSFATOCALCIO FOSFATO

• Il DNA a contatto con una soluzione di fosfato di calcio forma dei precipitati i quali, con un meccanismo poco noto (probabilmente per endocitosi) entrano nelle cellule

• Gli ioni bivalenti possono promuovere l’ingresso di acidi nucleici attraverso le membrane.

• VANTAGGI• Economico• Relativamente versatile

• SVANTAGGI Tecnicamente delicato

- forma e dimensioni del precipitato- influenzato da variazioni anche

minime di pH Efficienza bassa Elevata Citotossicità Non funziona con alcuni tipi cellulari

Metodi chimici

• il primo metodo usato per l’introduzione di DNA nelle cellule eucariote

• DESTRANO: Polisaccaride costituito da unità di D-glucosio legate mediante legami di tipo alfa1/4 o alfa1/6. Quando viene associato a gruppi carichi positivamente DEAE (dietilamminoetile) è in grado di legare il DNA e di mediarne l’ingresso attraverso le membrane.

• Le cellule vengono trattate con glicerolo o DMSO (shock osmotico)

• VANTAGGI Molto semplice

• SVANTAGGI Molto poco efficiente Solo transfezioni transienti

• DEAE-DESTRANO:DEAE-DESTRANO:

Metodi chimici

• misto di lipidi policationici e neutri, permette la formazione di vescicole liposomiali unilamellari che portano una carica netta positiva

• La testa cationica del composto lipidico si associa ai gruppi P negativi dell’acido nucleico

• I complessi lipidi- DNA si fondono con le membrane cellulari e rilasciano spontaneamente il loro contenuto nelle cellule

• VANTAGGI: Bassa tossicità

• SVANTAGGI Difficile produrre liposomi Alta variabilità

• LIPOSOMI:LIPOSOMI:

Metodi chimici

• I lipidi cationici formano dei liposomi, con una superficie carica positivamente che consente l’associazione del DNA e media l’interazione con la membrana plasmatica (carichi negativamente)

• Molecole formate da una coda policationica (DNA) e da una porzione lipidica (membrana)

Esempio: LIPOFECTAMINAEsempio: LIPOFECTAMINA

•VANTAGGISempliceEfficientePoco tossico

•SVANTAGGICondizionato dalla presenza di siero o antibiotici

• Transferrina– Aggiunto al mix liposoma-DNA– Ligando che funziona da AGENTE DIREZIONANTE, grazie

alla sua affinità con recettori di membrana, facilita l’interazione e l’ingresso del complesso

– Non specifico (come insulina…)

Reazione cellulo-specifica: Ab-Ag

Esempio: LIPOFECTAMINAEsempio: LIPOFECTAMINAreagenti e metodoreagenti e metodo

• Un giorno prima : piastratura delle cellule– Devono arrivare a una confluenza del 50-80%: ottimizzazione della

densità cellulare• Trasfezione

– Diluire il DNA in medium PRIVO di siero e antibiotici– Aggiungere la Transferrina (Tf)– Lasciare reagire 15 min– Diluire la Lipofectamina in D-MEM privo di siero– Aggiungere la Lipo al DNA+Tf– Lasciare reagire 15 min– Cambio medium:

• Eliminare dalle piastre il medium di crescita • Aggiungere medium privo di siero e Ab (metà del volume)

– Gocciolare il mix Lipo-DNA-Tf sulle cell– Lasciare reagire 3h– Rabboccare con D-MEM + siero (in proporzione doppia) + Ab

• Il giorno dopo: cambio medium e trattamenti

Le cellule vengono poste in una soluzionecontenente DNA, e vengono esposte ad un breve impulso elettrico che produce transitoriamente dei pori nelle loro membraneVANTAGGI Può essere utile per quei tipi cellulari in cui non si ottengono risultati con i metodi classici Il DNA entra direttamente senza passare attraverso il compartimento endosomiale dove può aver luogo la degradazione dell’acido nucleico

SVANTAGGI Necessità di ottimizzare le condizioni del campo elettrico -intensità e durata- Elevato livello di tossicità (50%)

• ELETTROPORAZIONE:ELETTROPORAZIONE:

Metodi fisici

il DNA viene inserito nella cellula -nel citoplasma o nel nucleo- attraverso un capillare di vetro, con un sistema ad alta pressione.Date le ridotte dimensioni delle cellule (alcune decine di mm di diametro) la microiniezione richiede una sofisticata apparecchiatura che comprende:• un microscopio,• un micromanipolatore• un iniettore VANTAGGI

effettuare il trasferimento selettivamente nel citoplasma o nel nucleo aumenta efficienza di espressione modulare facilmente il livello di espressioneSVANTAGGI Tecnicamente impegnativa Poche cellule alla volta COSTOSO

• MICROINIEZIONE:MICROINIEZIONE:

Metodi fisici

• Usa una pressione regolabile ad elio per sparare microcarriers d’oro rivestiti di DNA sulla parete interna di una cartuccia di plastica direttamente sul bersaglio

• Sistema per accelerare microproiettili d’oro o di tungsteno rivestiti di DNA su un bersaglio posto in una camera sottovuoto

VANTAGGI Possibilità di lavorare in situ Applicabile a quei sistemi cellulari poco responsivi ad altri carrier

per il trasferimento genico anche in vivo Possibilità di fare studi di espressione genica in condizioni

fisiologiche:• espressione tessuto specifiche• studi sullo sviluppo

Possibilità di usare meno DNA e meno cellule di partenzaSVANTAGGI

Trattamento invasivo Efficienza fortemente dipendente dal tipo cellulare Molti parametri da controllare COSTOSO

• GENE GUN:GENE GUN:

Metodi fisici

• DNA da trasfettare– Privo di contaminanti: proteine/ RNA– Soluzione sterile

• TIPO DI CELLULE• TIPO DI VETTORE

– Adatto per aumentare l’espressione in linee cellulari di mammifero

• TEMPO DI TRASFEZIONE– Da 30 min a 4 ore

• TIPO DI TERRENO DI COLTURA– Effetto di siero e antibiotici

OTTIMIZZAZIONE DEL OTTIMIZZAZIONE DEL PROCESSOPROCESSO

APPLICAZIONIAPPLICAZIONI

• SILENZIAMENTO SILENZIAMENTO GENICOGENICO

• SISTEMI INDUCIBILISISTEMI INDUCIBILI

• processo post-trascrizionale presente in molti organismi e tipi cellulari

• mediato da corte molecole di RNA (‘short interfering RNA’ o siRNA)

• provocano degradazione dell’mRNA con sequenza complementare --> “silenziamento” gene-specifico

• scoperti altre forme di RNA silenziatori: microRNA

• esistono forme endogene e forme esogeneendogeni: sintetizzate molecole di preRNAi da trascrizione di geni nucleari “non-protein-coding-genes”, servono per regolazione fine del ‘pool’ proteico in ogni fase del ciclo cellulare e ruolo in funzioni biologiche (difesa antivirale, silenziamento dei centromeri, riarrangiamenti cromosomici e silenziamento “trasposoni”)esogeni: molecole potenzialmente dannose provenienti da fasi d’infezione virale o frammenti di RNA di sintesi chimica, iniettati nella cellula

• sfruttati in ricerca e come potenziali agenti terapeutici

1) RNA interference (RNAi):

Small interfering RNA (siRNA):Small interfering RNA (siRNA):

• “silenziatori genici”

• originano da molecole dsRNA più lunghe rascritte da geni codificanti per prodotti non proteici

• nel citoplasma dsRNA vengono riconosciuti da Dicer (complesso multienzimatico con attività RNAsi III simile)

• si originano frammenti di 19-23 nt, i siRNA a doppio filamento

• siRNA-ds vengono inglobati in complesso ribonucleoproteico RISC (RNA-Induced Silencing Complex) attivato dallo svolgimento della doppia elica di siRNA

• RISC attivo riconosce mRNA con sequenza perfettamente complementare alla sequenza del siRNA legato

• degradazione mRNA e conseguente --> ‘silenziamento sequenza-specifico’

microRNA (miRNA):microRNA (miRNA):

• piccole molecole non codificanti di RNA

• RNA a singolo filamento di 19-23 basi

• conservati durante l’evoluzione, identificati in diversi organismi tra cui uomo, nematodi, moscerino della frutta e piante

• originano da lungo dsRNA, processati da Dicer che utilizza precursori di 70-100 basi a forma di ‘forcina’ (hairpin)

• miRNA di 19-23 basi vengono legati da un complesso simile a RISC

• specificità d’appaiamento enzima-miRNA e mRNA target determina destino target:a) poco specifico: legame tra miRNA e target avviene al 5’UTR del mRNA --> non si lega apparato traduzionale ma mRNA non viene degradatob) altamente specifico: mRNA viene degradato

• numero di geni target dei miRNA è maggiore di quello dei siRNA

STRATEGIE SPERIMENTALI:STRATEGIE SPERIMENTALI:

• a differenza di quanto accade per le celule vegetali, in C. elegans e in Drosophila, nelle cellule animali l’ingresso di dsRNA di lunghezza maggiore di 30 nt può scatenare un processo di degradazione del filamento medesimo (meccanismo di difesa della cellula contro frammenti di genoma virale).

• quindi si utilizzano direttamente i siRNA (dsRNA di l<25nt) che vengono direttamente assemblati nel complesso RISC.

• siRNA possono essere: sintetizzati chimicamente trascritti in vitro e poi introdotti nella cellula mediante

trasfezione iniettati in topi o inseriti in piante

• modificazione della tecnica: RNA interference DNA diretta (ddRNAi)

APPLICAZIONI:APPLICAZIONI:

• controllo mirato e studio dell’espressione genica: è infatti possibile spegnere geni specifici sia in colture cellulari che in modelli animali

• applicazioni anche nelle analisi di genomica funzionale

• applicazioni di tipo terapeutico: inibire oncogeni correlati a tumori prodotti in seguito a traslocazioni cromosomiche o mutazioni puntiformi.

• inibizione della replicazione virale in colture cellulari.

ddRNAi:ddRNAi:

• permette uso di RNAi per silenziamento genico a scopo terapeutico e per lo screening di interi genomi

• si basa su:a) azione di promotori per l’RNA pol III e per RNA pol II per l’espressione di specifiche sequenze di siRNA trasfettate in cellule di mammifero permette di utilizzare DNA templati che permettono la sintesi di dsRNA corti in vivo, strutturalmente equivalenti ai siRNA attivi sintetizzati in vitrob) in alternativa si può usare uno ‘short hairpin RNA’ (shRNA), cioè RNA costituito da sequenza omologa a mRNA da silenziare, un loop, ripetizione invertita della sequenza target

Protocollo per una trasfezione stabile:

• prima della trasfezione determinare la concentrazione a cui usare l’agente selettivo

• è necessario trasfettare oltre al gene di nostro interesse anche il gene che conferisce la resistenza all’agente selettivo

• trasfettare anche cellule, come controllo, senza il gene della resistenza

• per circa 14 gg cambiare il medium e aspettare che muoiano le cellule non trasfettate (non resistenti) o che non hanno integrato stabilmente il plasmide (che altrimenti viene perso dopo un certo numero di divisioni). Nella coltura di controllo le cellule devono morire

• quando si iniziano a vedere “isole” di cellule resistenti, trasferire i singoli cloni in MW96 e continuare con lo screening

• permettono di regolare l’espressione di un gene

• richiedono espressione stabile del gene che si vuole regolare

• permettono di studiare l’espressione di geni tossici: si possono ottenere linee cellulari trasfettate stabilmente col gene da studiare che viene:

- mantenuto “spento” in propagazione- “acceso” al momento dell’esperimento

2) I sistemi inducibili

Geni per markers selettivi:Geni per markers selettivi:

Il marker può essere presente sullo stesso plasmide del gene di nostro interesse oppure co-trasfettato con un secondo plasmide.

• timidina chinasi (Tk): enzima che permette la sintesi della timidina. Si selezionano cellule Tk- che vengono poi trasfettate con il plasmide Tk+. In un terreno –timidina crescono solo le cellule che hanno acquisito il plasmide.

- sono poche le cellule Tk- e non è detto che vadano bene per il nostro studio

• aminoglicoside fosfotransferasi (Neo): conferisce resistenza agli antibiotici aminoglicosidici (kanamicina, neomicina, geneticina…).Questi antibiotici tendono a non essere tossici a piccole dosi, per selezionare le cellule sono necessarie dosi elevate che però possono danneggiare anche le cellule trasfettate necessario determinare la dose appropriata.

• igromicina B fosfotransferasi: conferisce resistenza all’igromicina (Hyg)

• asparagina sintetasi

• xantina-guanina fosforibosil transferasi

Lac system:Lac system:

Operone Lac: tre enzimi codificati dalla stessa unità trascrizionale - lacY permeasi necessaria per ingresso del lattosio nella cellula - lacZ beta-galactosidasi che converte lattosio in glucosio e galattosio - lacA tiogalattoside transacetilasi, non richiesta per metabolismo del lattosio

Controllo da parte del repressore lac (gene lac I)separato dall’operone e sintetizzato in forma attiva;si lega sul promotore (operatore) e impediscetrascrizione dell’intero operone.

• sistema di repressione batterico.

• scoperto negli anni’50 all’Istituto Pasteur di Parigi da F. Jacob e J. Monod, studiando l’eredità dei geni che controllano il metabolismo del glucosio e di altri zuccheri in E.coli.

- lac lacI attivo blocco trascrizione Gli enzimi della via metabolica non sono sintetizzati se non richiesti

+ lac (o analogo IPTG) lacI viene inattivato trascrizione dell’intero operone

Plasmide pGEX:

- contiene proteina GST con a valle un sito di taglio per la trombina

- regolato da promotore “tac”, promotore ottimizzato artificialmente, derivante dalla fusione del lac promoter operon con parte del promotore

dell’operone trp (triptofano) - Mantiene inducibilità da IPTG, ma presenta livelli di espressione assai più alti rispetto al lac normale

produzione di grosse quantità di proteina, purificabile mediante GST

AD+polyQ

ARGST

LBDTrombine cleavage site

Promotore lac

ChimeraGST-AR

TROMBINA:Taglio proteolitico

Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser

AR libero+

GST legato

MATRICERESINA

GLUTATIONE SEPHAROSE 4BSfere di diametro 45-165µm

Spaziatore di 12 atomi legato a glutatione

(glicina, glutammato, cisteina)

Sistemi regolati dalla tetraciclina (Tc) o da suoi analoghi come la doxyciclina (Dox).

Tet-On: l’aggiunta di Tc o Dox accende il nostro gene

Tet-Off: l’aggiunta di Tc o Dox mantiene spento il nostro gene

Sistemi sfruttano le proteine di E.coli coinvolte nella resistenza alle tetracicline:

Tet R= tet repressor protein: regola negativamente l’espressione dei geni coinvolti nella resistenza (trasposone Tn10). In assenza di Tc, Tet R si lega alla sequenza Tet O=tet operator e blocca la trascrizione.

Per gli exp in cell di mammifero Tet R è stata modificata:

- tTA= Tc-controlled trans activator: proteina ibrida (37 kDa) ottenuta dalla fusione dei primi 207 aa di Tet R con 127 aa del C-ter dell’activator domain VP16 di herpes simplex virus diventa attivatore trascrizionale in presenza di Dox

- rtTA= reverse tTA: proteina ottenuta modificando 4 aa di Tet R; ha comportamento opposto a tTA in risposta a Dox

Tet system: TET-ON e TET-Tet system: TET-ON e TET-OFFOFF

TET-ON rtTATET-OFF tTA

Il gene che vogliamo regolare deve essere inserito a valle di una sequenza TRE= Tc responsive elements, sequenze di 42 bp che contengono sequenza Tet O. L’espressione basale del promotore è molto bassa in assenza di Tc.

Tet-On vs Tet-Off:Tet-On vs Tet-Off:

I due sistemi sono complementari.

• nel sistema Tet-Off è necessario aggiungere Tc o Dox nel medium per mantenere lo stato inattivo. Le due molecole però hanno emivita breve ed è quindi necessario aggiungerle ogni circa 48 h per reprimere l’espressione del gene X.

• il sistema Tet-On è responsivo solo alla Dox, mentre Tet-Off è sensibile a entrambi.

• le concentrazioni di Tc o Dox necessarie sono molto basse, inferiori a dosi citotossiche (sia per colture cellulari che per animali transgenici)

• in entrambi i casi sono necessarie due trasfezioni stabili consecutive: il plasmide regolatore e successivamente pTRE-gene X

1. piastrare cell e lasciarle crescere fino a circa 80% di confluenza

2. trasfezione con vettore pTet On/Offplasmide può essere linearizzato per aumentare efficienza di integrazione

3. permettere a cell di duplicarsi (24-48 h) e quindi aggiungere agente selezionante (G418, 400-500 ug/ml)

4. cambio medium ogni 48 h o quando necessario. Dopo circa 5 gg le cellule che non hanno preso la resistenza iniziano a morire

5. dopo circa 2-4 week iniziano a comparire le colonie singole. Isolare le singole colonie e trasferire ognuna in una well

6. screening: trasfezione con plasmide reporter, ex: pTRE-luc che contiene gene per la luciferasi di lucciola regolato da sequenza TRE

7. selezione delle colonie migliori (maggior differenza indotto-non indotto)

8. congelare stock dei cloni positivi

1^trasfezione 1^trasfezione stabile:stabile:

Trasfezione transiente Trasfezione transiente preliminare:preliminare:

I cloni stabili positivi ottenuti nella 1^trasfezione vengono trasfettati in transiente con il plasmide pTRE-gene X per verificare l’effettiva regolazione genica sul costrutto che si vole trasfettare stabilmente.

L’analisi della regolazione può essere effettuata con diverse tecniche:

- Western Blot- RT-PCR-saggio funzionale per la proteina X- […]

1. piastrare cell stabili per pTet On/Off e lasciarle crescere fino a circa 80% di confluenza

2. Co-trasfezione con vettore pTRE-gene X e pTk-Hyg (10:1). I plasmid pòssono essere linearizzati per aumentare efficienza di integrazione

3. permettere a cell di duplicarsi (24-48 h) e quindi aggiungere agente selezionante (igromicina B, 200-400 ug/ml) e Dox nel caso del sistema Tet-Off

4. cambio medium ogni 48 h o quando necessario. Dopo circa 5 gg le cellule che non hanno preso la resistenza iniziano a morire

5. dopo circa 2-4 week iniziano a comparire le colonie singole. Isolare le singole colonie e trasferire ognuna in una well

6. screening: verificare espressione gene X, utilizzare la stessa tecnica usata nel controllo della trasfezione transiente

7. selezione delle colonie migliori (maggior differenza indotto-non indotto)

8. congelare stock dei cloni positivi

2^trasfezione 2^trasfezione stabile:stabile:

lo scopo è quello di generare una linea stabile che abbia un basso background e alti livelli di espressione della proteina X quando indotta (differenza di almeno 20 volte)

livelli di espressione e induzione possono risentire del sito d’integrazione (ex: se integrazione avviene vicino a degli enhancer si può avere un aumento del livello di espressone basale). Per questo motivo è meglio screenare il maggior numero di colonie possibili per identificare quelle con le migliori caratteristiche

se il plasmide pTRE non contiene un marker di selezione è necessaria co-trasfezione ad ex con plasmide pTk-Hyg. pTRE-gene X: pTk-Hyg 10/20:1 per aumentare probabilità che vengano acquisiti entrambi i vettori dalla cell e non solo quello della resistenza

esempio: NSC34-Tet Offesempio: NSC34-Tet Off