04.03.2011
TUTUKLANMI ENZ M ( MMOB L ZE ENZ M)Do.Dr. Berrin Bozan Anadolu
niversitesi Mhendislik Mimarlk Fakltesi Kimya Mhendislii Blm
2010-2011
Tutuklama ilemi (immobilizasyon), aktif olan enzim veya
hcrelerin hareketli bir fazdan, fiziksel olarak, substrat ve rn
molekllerinin fazlar arasnda yer deitirebilecei ekilde ayrlmasdr.
Tutuklanma sonucunda biyokatalizrler, suda znmeyen bir taycda deiik
yntemlerle tutuklanarak hareketleri engellenir, buna karlk oluturan
sistem substrat ve rn hareketine olanak verir.
1
04.03.2011
mmmobilize hcrelerin/enzimlerin serbest hcrelere/enzimlere gre
avantajlar ortamdan kolayca ayrlabilirler ve tekrar tekrar
kullanlabilirler. fermantasyon ortamn kirletmezler. Tutuklanm
hcreler/enzimler srekli sistemlerde almaya ok uygundur ve bunlarla
daha yksek hacimsel verimlilik deerleri elde edilir.
Harcanmayacandan ayn mikroorganizma kullanarak serbest hcrelere gre
daha fazla rn elde edilmektedir. Tutuklama ilemi birok durumda hcre
aktivitesi stabilize eder ve kontaminasyona daha az duyarldr. evre
koullarna (pH, scaklk.vb.) kar daha dayankldrlar. Birbirini izleyen
ok kademeli reaksiyonlar iin uygundurlar. Srekli ilemlere
uygulanabilirler. Serbest enzimlere gre daha kararldrlar ve baz
durumlarda serbest enzimlerden daha yksek aktivite
gsterebilirler.
Dezavantajlar:
Hcre ile reaksiyon svs arasndaki ktle transfer
kstlamalarTutuklanm hcre zarnn paralanp istenmeyen yabanc
maddelerin reaksiyon ortamna karabilmesi hcrede bulunan dier
enzimlerin aktiviteleri sonucunda yan
reaksiyonlar oluabilmesi ve daha az saflkla rn elde
edilmesiTutuklanm enzimlerin zellikleri enzim ve tayc materyalin
zelliklerine bal tutuklanm enzim kimyasal, biyokimyasal, mekanik ve
kinetik zellikler kazanr ve bu zellikler tutuklanm enzimin verimini
ve performansn etkiler.
2
04.03.2011
Tutuklama Yntemleri K MYASAL YNTEMLER Kovalent balanma apraz
balama
F Z KSEL Adsorpsiyon Hapsetme (entrapment) Mikroenkapslasyon
3
04.03.2011
K MYASAL YNTEMLER Kovalaent balanma: Hidroksil,
amonyum,karboksil veya anhidritler ieren kat destek maddelerine
balanma ile tutuklanma gerekleir . Kovalent balanma metodunun
avantajlar Enzim matriksten sklmez ve azalmaz Matriksin hemen
zerinde olduu iin enzim substratla ok kolaylk etkileim gsterir.
Enzimler kendi arasnda ve matriksle gl etkileimden dolay enzimlerin
stabilitesi artar.
K MYASAL YNTEMLER Kovalaent balanma Dezavantajlar Tutuklama
prosedr iin optimal artlarn salanmas ok zordur Tayc yenilenmesi ve
biyokatalizin taycdan sklmesi genellikle imkanszdr. Dier yntemlerin
ounda olduundan daha fazla aktivide kayb meydana gelir. Bu yntemle
canl hcre immobilizasyonu iin nadiren uygundur. nk bu teknikle
immobilize edilmi hcreler balandklar yzeylerden hcre blnmesi
esnasnda ayrlabilir ve fermantasyon ortamna karabilir
4
04.03.2011
Balanma olaynda destek kat moleklnn balanacak ucu aktive
edilmelidir.
Kovalent balanma iin kullanlan suda znmeyen bir kat destek
maddeleri Sentetik destek katlar Akrilamit polimerler Stiren
polimerler Metakrilik polimerler Stiren polimerler ve peptidler
Doal destek katlar Agar (Sepharos) Selloz Dekstran (Sephadex) Cam
niasta
mmobilize enzimleri hazrlamak iin daha nceden aktifletirilmi
polimerler (maleik anhidrit kopolimerler gibi) sadece enzim ile
kartrlr. Genelde doal veya sentetik polimerler enzim ilave etmeden
nce aktive edilmelidirler. Aktivasyon polimerin fonksiyonel
grubunun kimyasal dnmdr. Enzim aktif ucundan katya balanmamaldr. nk
aktivitesini kaybeder!!!!
RNEK UYGULAMA Glukoz oksidazn agara kimyasal tutuklanmas: Agarn
aktivasyonu: Suyla iirilmi Agar (Sepharose 2B) partikllerini cam
filtreden geirerek suyundan uzaklatrma 3.4 g agar+4 ml siyanojen
bromit zeltisi (15 mg siyonojen bromit(1 mL) pH 11 de 23 oC da 6 dk
aktivasyon. Cam filtreden szme Su ile ykama 0.1 M fosfat tamponla
ykama
Glukoz oksidazn balanmas aktive edilmi agar ile 24 mg glukoz
oksidaz/1 ml 0.1 M fosfat (pH:7.4) zeltisini hafife kartrarak 10 sa
reaksiyon
5
04.03.2011
K MYASAL YNTEMLER apraz balama Glutaraldehit gibi kk molekl
arlkl ok fonksiyonlu reaktiflerle Suda znmeyen enzimler
hazrlanabilir. Enzimler reaktifle yardmyla birbirleri ile apraz
balanrlar. Oluan yeni yap suda zlmez. Bu ilem kat destek zerinde de
yaplabilir. ok fonksiyonlu reaktifler ayn zamanda suda znmeyen
polimerlerin oluumunda da kullanlabilir. Bu polimerler kovalent
olarak enzimlerii de balayarak suda znmeyen enzim yaparlar.
F Z KSEL YNTEMLER Adsorbsiyon yntemi ile immobilizasyon:
Enzimler kat faz ile hareketli sv faz arasndaki ara yzeyde Van der
Waals kuvvetleri, hidrofobik etkileimler veya kuvvetli iyonik
balarla tutulurlar. selloz, seramik baz mineral maddeler, alumina,
anyon vaya katyon deitirici reine, kalsiyum karbonat,karbon, cam
plaka, diatome topra, Adsorbann, mikroorganizmann ve evresel
zellikler biyokatalizin adsorpsiyonunu etkileyen faktrlerdir. Bir
mikroorganizmann adsorbe edilen miktar destek maddesine gre
deiir.
6
04.03.2011
F Z KSEL YNTEMLER Adsorbsiyon yntemi ile immobilizasyon:
Avantailar: lem kolay mmobilize edilirek enzim saflatrlmas ve ayrmn
mmkn klar Bu yntemde enzimler genellikle deaktive olmazlar
Adsorpsiyon geri dnebilir bir prosestir. Dezavantajlar: Oluan balar
ok zayftr mmobilizasyon zeltinin pH , iyonik gc ve scaklkla
kolaylkla deiebilir Kat yzeye immobilize edilebilen enzim miktar
dktr
Hapsetme (Entrapped): Enzimler apraz bal polimerlerin iine
hapsedilebilir. Enzimi kimyasal ilem uygulanmaz Jel oluumu srasnda
enzim aktivitesini kaybedebilir. Enzimin polimer iinden akmas sz
konusudur. Enok poliakrilamid jel sistemi kullanlr. Uyguland
enzimler: alkol dehidrojenaz, glukozoksidaz, aminoasit oksidaz vb.
Mikroenkapslasyon Yar geirgen membran mikro kapsllerde immobilize
edilebilir. Enzim ile kartrlm polimer membran znmeyen baka bir zcde
kk damlacklar haline getirilir.
7
04.03.2011
MMOB L ZE ENZ M N EN byk dezavantaj ktle transferine olan
direndir. SUBSTRATIN immobilize enzim iine transferi zelti 1 CSb 2
3 mmobilize enzim
CS 1. Substratn zeltiden immobilize enzimi evreleyen karmam sv
film tabakasna transferi 2. Karmam sv film tabakas iinde difzyonu
3. Yzeyden enzimin aktif blgesine difzyonu 1 ve 2 ktle transferine
external diren 3 internal diren
External (D) Ktle transfer direnci
Enzimin partikln yzeyine tutturulduu dnlnce, d ktle transferi
direnci 1. ve 2. yoldan ibarettir. Ktle transferi hz srkleyici
kuvvet olan konsantrasyon fark ile orantldr. (Film teorisi)
8
04.03.2011
External (D) Ktle transfer direnci
Bir immobilize enzimin enzimatik reaksiyonu srasnda, transfer
olunan Substratn hz substratn tketimine eittir. Enzim reaksiyonu
Michaelis-Menten eitlii ile aklanrsa
zeltideki substrat konsantrasyonu ve yzeydeki substrat
konsantrasyonu arasndaki iliki. a: reaksiyon zeltisinin birim
hacminin toplam yzey alan
Boyutsuz gruplar cinsinden ifade edilirse
NDa:
Damkhler says: Maksimum reaksiyon hznn maksimum ktle transferine
oran
1. NDa1 reaksiyon hz ktle transferi hzndan byktr ve toplam
reaksiyon hz birinci derece hz eitlii ile verilen ktle transfer hz
tarafndan kontrol edilir.
9
04.03.2011
Ktle transferine olan direnten dolay reaksiyon hz azalr.
Dolaysyla immobilize Enzim iin etkinlik (verimlilik) faktr
tanmlanr.
Etkinlik faktr xS ve nn fonksiyonu. xS=1 ise CS=CSB, =1 ve ktle
transferine diren yok
CS nternal (partikl iinde) ktle transferi Enzimler eer
kopolimerizasyon veya mikroenkapsilasyonla immobilize edilirse,
partikl iindeki ktle transferi direnci enzim reaksiyon hzn etkiler.
Ktle transfer hzn bulabilmek iin bir takm varsaymlarda bulunmak
gerekir. 1.Reaksiyon immobilize enzim iinde her yndedir ve
reaksiyon kinetii, serbest enzim iin grlen reaksiyon hzna eittir 2.
mmobilize enzim iindeki ktle transferi molekler difzyon ile
gerekleir. 3. mmobilize enzim d yzeyinde ktle transferine diren
yoktur. 4. mmobilize enzim bir kredir. Gelitirilen model
DISTRIBUTED: datlm model olarak bilinir. dr dr r R
CSb
10
04.03.2011
mmobilize enzim iinde kabuk dengesi CS dr dr r R
CSb
Giren-kan+retilen/Kaybolan=Biriken
DS: substratn immobilize matrisin iindeki difzyonu
Birikimin olmad durumda dCS/dt=0 dr. Sadeletirmeler yapldnda 2.
dereceden bir diferansiyel eitlik elde edilir
Bu eitlik rS ye gre deiir. Reaksiyon hz sfrnc mertebede
olsun
Michaelis-Menten eitliinde
11
04.03.2011
Eitlik DS ye blnp rs yerine k0 konulduunda
Snr koullar
12
