ENZIMI KOJI

UČESTVUJU U

"PLANT

GROWTH

PROMOTING"

POENCIJALU

BTAKTERIJA

ZAŠTO JE OVO VAŽNO➢Klimatske promene

➢Porast broja ljudi na planeti

➢Veći zahtevi za poizvodnjom hrane, hrane za životinje, goriva posebno biodizela

➢Sve to na zemljištu koje ima povećan sadržaj metala (i teških metala), soli, smanjenu koncentraciju vode

➢Interdisciplinarni pristup je jedini koji može da da odgovore

➢ Izučavanje “Plant growth promoting bacteria – PGPB”

Shema dela korena koja pokazuje struktururizosfere (htpp://cse.naro.affrc.go.jp/)

Rizosfera je zona oko korena biljke kojunaseljavaju različite bakterijske populacijespecifične za svaku biljku.Danas je definicija proširena i rizosferu čini:Endorizosfera, rizoravan i ektorizosfera.

RIZOSFERA

INTERAKCIJA BAKTERIJA SA KORENOM BILJAKA

Najčešći su predstavnici rodova koji ulaze

u sastav rizofita i/ili endofita:

Pseudomonas, Bacillus, Azotobacter,

Rhizobium, Azospirillum, Arthrobacter,

Agrobacterium, Desulfovibrio, Clostridium,

i drugi.

DIREKTNI I INDIREKTNIMEHANIZAM DELOVANJA PGP BAKTERIJA

VIŠE BILJKE ŽIVOTINJE

BAKTERIJE FIKSATORI

AZOTA

N2

Nitrati

AMINOKISELINE

Amonijak Urea

Nitrificirajuće bakterije

Nitrobacter

Nitrificirajućebakterije

Nitrosomonas

Nitriti

CIKLUS AZOTA U ŽIVIM SISTEMIMA

Azotofiksacija

» Samo u prokariotima (bakterije i arhee)

» Proces osetljiv na kiseonik

» Slobodnoživeći i simbionti

» Tri tipa simbioze:

Rhizobium Frankia Nostoc

Azotofiksacija

» DIAZOTROFI je termin za sve bakterije i arhee koje imaju sposobnostfiksacije azota (fototrofi, hemoorganotrofi i hemolitotrofi). Diazotrofi mogubiti slobodnoživeći i simbionti. Diazotrofi simbionti su bakterije (familijaRhizobiaceae, rodovi Rhizobium, Bradyrhizobium i Azorhizobium),aktinomicete (rod Frankia) i cijanobakterije (rod Nostoc) koje žive u simbiozisa višim biljkama.

Rhizobium Frankia Nostoc

Faze u azotofiksaciji

1. •Signal i prepoznavanje

2. •Formiranje kvržice

3. •Redukcija azota

1.•Signal i prepoznavanje

» Razmena signala i prepoznavanje simbiotskih partnera

» Deformacija i uvijanje korenskih dlačica

» Ekxpreija nod gena i sinteza Nod faktora (Nodulini)

» Mogući uzroci: depolarizacija plazmaleme, promene u fluksu Ca2+,

promene protonskog efluksa, rearanžmani aktinskih filamenata

» Bakterijski signali: Lipohitooligosaharidi – Nod faktori

» 3 do 5 β-1,4-N-acetilglukozamina + masna kiselina + različite supstitucije

kako na redukujućem tako i na redukujućem kraju šećera

» Ograničen broj domaćina?

1. •Signal i prepoznavanje

» Sinteza triptofana, privlačenje bakterija, triptofan se prevodi u IAA koji dovodi do uvijanja korenove dlake i aktiviranja kompleksa nod gena

» Poligalaktouronaza (pektinaza) vrši depolimerizaciju ćelijskog zida i formira se infekciona nit

» Ekspresija nod gena i aktiviranje ekspresije cdc2 i mitotičkih ciklina, deoba biljnih ćelija i formiranje primordijum kvržice

» Samo neke biljne ćelije osetljive na Nod faktore

» Infkciona nit raste ka primordijumu kvržice

» Bakterije formiraju bakteroid (bakterije u endosimbiotskoj formi), luče citokine koji dovode do deobe ćelija korena i formiranja kvržice

» Kvržica se ispunjava bakteroidima koji aktiviraju nitrogenazu i proces azotofiksacije

2. •Formiranje kvržice

2. •Formiranje kvržice

Funkcionisanje kvržice

N2 + 8H+ + 8e- + 16MgATP → 2NH3 + H2 + 16MgADP + 16Pi

»Nitrogenaza

»Peribakteroidne membrane

»Osetljiva na kiseonik

»Oksidativni procesi neophodni. Paradoks?

Blok za kiseonik je leghemoglobin (hemoglobin kvržica

koji ima ulogu rezervoara i prenosioca kiseonika u

procesima oksido redukcije gvožđa).

» Sinteza nitrogenaze i leghemoglobina indukovana je

specifičnom ekspresijom biljnih i bakterijskih gena

NH3

šećeri

bpbm

ba

Nitrogenazni kompleks

Fe-protein (dinitrogenazna reduktaza)

» nifH

» Homodimer

» [4Fe-4S] klaster

» ATP vezujuća mesta na svakoj

subjedinici

MoFe-protein (dinitrogenaza)

» nifD i nifK

» 2β2-tetramer

» P-klaster [8Fe-7S]

» M-klaster [Mo-7Fe-9S-X-

homocitrat], X = C, N, O

»3 visoko homologne klase – Mo-, V- i Fe-nitrogenaza, najbolje proučena Mo nitrogenaza Azotobacter vinelandii

Nitrogenazni kompleks

nif operon Klebsiela pneumonie (Madigan 2011)

Osobine nitrogenaznih proteina su izuzetno konzervirana sekvenca obekomponente nitrogenaznog kompleksa se >70% poklapaju medju vrstama idomenima (Bacteria, Archea)

Katalitička reakcija nitrogenaze

Sklapanje P-klastera» Simetrija klastera → 2 [4Fe-4S]-slična klastera daju [8Fe-7S]

klaster

» Fe-proteina (Dinitrogenazne reduktaze) i hidroliza ATP

neophodni u sklapanje P-klastera koje se odvija ˝stepwise˝

» Konformaciona promena mesta za vezivanje M-klastera u

okviru α-subjedinice P-klastera koja iz zatvorene prelazi u

otvorenu formu i omogućava vezivanje M-klastera što je

poslednji korak pri njegovom sklapanju M-proteina

Sklapanje

M-klastera»Učešće 9 gena:

nifS, nifU, nifB, nifE, nifN,

nifV, nifH, nifD, nifK

»Sklapanje započinju nifS i

nifU

»Funkcija nifB nije jasna

Sklapanje

M-klastera»Dalje formiranje FeMoco

jezgra se prenosi sa NifB na

NifEN

»Prvo formiranje FeS jezgra pa

tek onda povezivanje za Mo i

homocitrat posredovano Fe-

proteinom

»Zavisno od hidrolize ATP-a, a

i od Fe-proteina jer je to jedina

poznata ATP-zavisna reduktaza

u in vitro procesu sklapanja

nativne konformacije proteina

Sklapanje

M-proteina»Transfer FeMoco sa NifEN na

MoFe-protein preko protein-

protein interakcije zasnovane

na negativno naelektrisanom

FeMoco i pozitivno

naelektrisanom tunelu na

MoFe proteinu

»Konformaciona promena u

˝zrelom˝ kofaktoru može biti

izazvana i vezivanjem Fe

proteina samo sa Mo bez

homocitrata – nema vezivanja!

Regulacija ekspresije gena za

nitrogenazu

Transkripciona regulacija

» O2 i nivo NH4+

» Da li su simbionti osetljivi na NH4+?

Post-translaciona regulacija

» Kod slobodnoživećih

» Ograničena E, dovoljno N2

» Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter capsulatus

*DRAT – dinitrogenazna reduktaza ADP-riboziltransferaza**DRAG – dinitrogenazna reduktaza-aktivirajuća glikohidrolazaR101 – Arg101 – N iz gvanido grupe Arg formira N-glikozidnu vezu sa ribozom iz ADP

Transfer elektrona

» [4Fe-4S]+2/+1 klaster Fe-proteina

» Asocijacija/disocijacija Fe- i MoFe-

proteina

» Hidroliza MgATP

» Akumuliranje najmanje 3, a verovatno

4 e- u MoFe proteinu pre vezivanja

supstrata (N2) za aktivno mesto

enzima

» Ranije studije nisu pokazale redosled

događaja

Transfer elektrona

Prvi model

˝sequential˝

» PN ˝resting state˝

» Super-redukovano stanje?

Drugi model

˝deficit-spending˝

» Oksidovano stanje?

» Trostruka veza u molekulu N2 ga čini inertnim, izuzetno skupa kataliza i

jedna od najtežih kataliza u biološkim sistemima

» Svi koraci redukcije direktno na nitrogenazi bez slobodnih intermedijera

» Može katalizovati redukciju različitih supstrata sa dvostrukom i

trostrukim vezama (acetilena do etilena, azida do N2 i amnijaka, CO2 do

CO, itd.)

» Više redoks stanja

» Unidirekciono kretanje e-

» Gde i kako se elektroni akumuliraju?

3. •Redukcija supstrata

Značaj fiksacije azota

Lucerka300 kg/ha/god

Bob600 kg/ha/god

Azotobacter7 kg/ha/god

Cyanobacteria80 kg/ha/god

Značaj fiksacije azota

» Pionirske zajednice

» Nova istraživanja – simbioza sa kukuruzom i pšenicom?

» Više sreće sa slobodnim diazotrofima?

» Biljke koriste P u formi H2PO4- i

HPO42-

» Neke bakterije (Rhizobium,

Pseudomonas, Bacillus,

Agrobacterium, Erwinia,

Microcobacterium, Flavobacterium,

Bijerinckia i Burkholderia) mogu

da rastvaraju nerastvorljiva

neorganska fosfatna jedinjenja

(trikalcijum fosfat, dikalcijum

fosfat, hidroksil apatit)Kretanje fosfora kroz zemljište

(Ahemad i Kibret 2014)

ENZIMI KOJI UČESTVUJU U TRANSFORMACIJI NEPRISTUPAČNIH

JEDINJENJA FOSFORA

» Kisela, neutralna i alkalna

fosfomonoesteraza

» Egzopolisaharidi

» Organske kiseline

» Fitaza

ENZIMI KOJI UČESTVUJU U TRANSFORMACIJI NEPRISTUPAČNIH

JEDINJENJA FOSFORA

Različita organska i neorganska jedinjenja koja sintetišu bakterijesposobne da oslobađaju fosfor iz nepristupačnih jedinjenja

(Ahemad i Kibret 2014)

Fitaza

» Bakterije proizvode fitazu koja hidrolizuje Fitat u inozitol i fosfornu kiselinu,

fitat koji teži da formira nerastvorne komplekse sa Fe, Ca, Zn i Al i da se

akumulira u zemljištu.

BAKTERIJSKI ENZIMI KOJI UČESTVUJU U BIOSINTEZI AUKSINA

– Prva grupa biljnih hormona koji su otkriveni na osnovu toga što stimulišu

rastenje biljnih ćelija.

– Naziv potiče od grčke reči auxein – rasti.

– Po hemijskom sastavu glavna grupa auksina su indolna jedinjenja, ali kod

nekih je prisutna i fenil sirćetna kiselina.

– Pored biljaka, mnoge bakterije proizvode auksin kao što su bakterije

rizosfere fitopatogene (Agrobacterium tumefaciens) i PGPB, ali nije dokazan

uticaj auksina na rast i razmnožavanje bakterija.

BAKTERIJSKI ENZIMI KOJI UČESTVUJU U BIOSINTEZI AUKSINA

Indol-3-sirćetna kiselina

Fenil-sirćetna kiselina

BIOSINTEZA AUKSINA –INDOL-3-SIRĆETNE KISELINE (IAA)

– Kod viših biljaka postoje dva glavna puta biosinteze auksina:

1. triptofan-nezavisan put biosinteze (indol-3-glicerol fosfat je najverovatniji

prekursor)

2. triptofan-zavisan put biosinteze u kojoj je definisano više puteva:

- put indol-3-acetoamida

- put indol-3-pirogrožđane kiseline

- put triptamina

- put indol-3-acetaldoksima...

– Neke bakterije mogu sintetisati auksine zasebnim putem sličnim triptofan-

zavisnim putevima viših biljaka.

BIOSINTEZA AUKSINA KOD BILJAKA

Triptofan

Indol-3-acetamid

Indol-3-sirćetna kiselina

Triptofan-2-monooksigenaza

Indol-3-acetamidna hidrolaza

aux1/iaaM/tms1 gen

aux2/iaaM/tms2 gen

BIOSINTEZA AUKSINA KOD BAKTERIJA

Trp

Indol-3-piruvat

Indol-3-acetaldehid

Indol-3-sirćetna

Trp aminotransferaza

IAD dekarboksilaza

IAD oksidaza

BIOSINTEZA AUKSINA - IAA

Olanrewaju et al., 2017

Shema poznatih puteva biosinteze IAA kod bakterija.

Isprekidane linije predstavljaju neenzimske reakcije.

BIOSINTEZA AUKSINA - IAA

Shema pet triptofan zavisnih puteva biosinteze IAA kod bakterija. Saepen et al., 2007

1-aminociklopropan-1-karboksilat deaminazna (ACC)

➢ Etilen je jedini gasoviti biljni hormon kojisintetišu biljke usled delovanja različitihbiotičkih i abiotičkih procesa. Poznat je i kao hormon stresa jer pomaže biljkama da prežive sušu, visoku koncentraciju soli, toksičnihmetala (Ni, Pb, Zn i Cd), poplave, prisustvo patogenih bakterija.

(Glick 2014)

➢ ACC deaminaza katalizuje razgradnju ACC na α-ketobutirat i amonijak i na taj način smanjuje nivo etilena, a dobijeni metaboliti se koriste za rast bakterija. Ovaj enzim je pronađen samo kod mikroorganizama.

➢ Usled izlaganje biljke stesnim situacijama primećena su dva pika količine etilena. Jedan je manji i veruje se da on odgovoran za transkripciju gena koji kodiraju baketijske zaštitne proteine. A drugi pik je mnogo veći i javlja se u situacijama koje štete biljci i izazivaju senescenciju, hlorozu i abscisiju...

Olanrewaju et al., 2017

1-aminociklopropan-1-karboksilat deaminazna (ACC)

➢ ACC deaminaza katalizuje razgradnju aminociklopropan-1–karboksilata (ACC) koji koji je prekursor za sintezu etilena do α-ketobutirata i amonijaka

➢ Multimerni enzim, molekulske mase 35-42 kDa, pronađen je samo kod mikroorganizama, koristi piridoksal fosfat kao kofaktor.

➢ ACC deaminaza ima dva domena od kojih svaki ima uvrnutu, otvorenu α/β strukturu koja je slična β subjedinici enzima triptofan sintaze.

1-aminociklopropan-1-karboksilat deaminazna (ACC)

➢ Dobijeni 5-metil-tioadenozin ulazi u proces regeneracije metionina koji se zove Jangov ciklus.

➢ Sledeći korak je prevođenje ACC-a u etilen pomoću ACC-oksidaze. Međutim da bi se održao optimalan nivo etilena i kako bi i u stresnim uslovima biljka imala mogućnost da obavlja neke procese potrebno je da se smanji nivo etilena odnosno ACC-a, pomoću enzima ACC deaminaze.

➢ Otvaranje ciklopropanskog prstena je glavna karakteristika reakcije katalizovane od strane ACC deaminaze.

1-aminociklopropan-1-karboksilat deaminazna (ACC)

➢ Geni acdS ACC deaminaze su povezani sa genima fiksacije azota i moze biti regulisana pomocu nifA za koji je poznato da regulise i ekspresiju gena nif.

Geni koji kodiraju ACC deaminazu

➢ Jedan od glavnih reglutornih proteina koji učestvuju u ekspresiji acdS gena je LRP protein koji se sa AcdB proteinom vezujeza ACC i grade trinarni kompleks koji aktivira transkripciju acdS gena tako što se vezuje za njegov promotor. Takođe, transkripcija ovog gena je negativno regulsana leucinom koji se sintetiše od α-ketobutirata koji je produkt reakcije katalizovane ACC deaminazom, tako da leucin utice na isključivanje transkripcije acdS gena.

➢ Poboljšanje rasta biljke pomoću ACC deaminaze bakterija je motivisalo naučnike da prenesu gen koji kodira ovaj enzim u biljke. To bi predstavljalo jedan od načina da se smanji štetni efekat etilena kod biljaka podložnim stresnim situacijama. Transgena Petunia održava znatno smanjenu količinu etilena u ćelijama polena. Slično tome postojanje transgene uljane repice je doprinelo boljem rastu u uslovima povećane količine soli. Konstruisane su i dve sorte paradajza i duvana u kojima je zbog smanjene količine etilena odloženo starenje.

Transgene biljke sa aktivnošću ACC deaminaze

ULOGA PGPB UPREŽIVLJAVANJU SUŠE

ZAKLJUČAK

➢ Primena PGPB kao biofertilizatora je našla široku primenu u poljoprivredi

➢ Prednosti: - smanjuje se upotreba skupih mineralnih đubriva- biljke lakše usvajaju hemijske elemente- utiče se na dinamiku i pravac mikrobioloških procesa koji posredno

utiču na određivanje i povećanje plodnosti zemljišta- biološka kontrola

➢ U cilju odabira optimalnih sojeva bakterija, ubuduće je potrebno jasno definisati koje bakterijsko svojstvo je korisno i neophodno za određene uslove sredine i različite biljke, a u skladu sa tim i koja enzimska aktivnost ovih bakterija je korisna u datim uslovima.

Teme za prezentacije

» Fiksacija azota – primer Frankia

» Enzimi uključeni u sintezu citokina i giberelina kod bakterija

» Uticaj prisustva teških metala na sintezu IAA i ACC deaminaze

» Fitaze – nove uloge za stare enzime

Hvala na pažnji!