Über den Anwendungsbereich von Triphenyltetrazoliumchlorid bei der Beurteilung von Milch und Milchprodukten

136 M. Bvssn und O. KANDLEI~:

erforderl ichen Gaskonzent ra t ion und anschl ie~ender ausreichender Belfif tungszeit erfolgen. Lebensmi t tc l , die nach angemcssener Durchlf i f tung noch fiber der ver t re t - baren Menge Blaus~ure enthal ten , sol l ten grundsi~tzlich n icht d a m i t begas t werdcn.

Literatur 1. F~V~SE~GV.~, M.: BGesundhBl. 7, 165 (1964). 2. BUTTENBERG, P., U. m. WE1SS: Diese Z. 48, 104 (1924). 3. BEYT~]~, A., u. W. DI]~M)m¢: L~boratoriumsbuch fiir den Lebensmittelchemiker. 7. Aufl.

S. 626. Darmstadt: Steinkopff 1957. 4. L~D~E~, A. F., u. L. LSWENECK: Mitteilung anl~l~lich des Fortbildungskurses fiir Lebens-

mitte]chemiker, 1956. 5. W~o~s~, M. : Chem. Anal. (Warszawu) 5, 457 (1960). 6. G~EGOROWICZ, Z., F. Buell u. E. SLIWA: Z. an~lyt. Chem. 186, 407 (1962). 7. GUNTHEI~, F., u. 1~. ]~LINN: Analysis of Insecticides ~nd Acaricides. S. 401. New York: Inter-

science Publishers Inc. 1955. 8. FEU~aSENG~, M.: Dtsch. Lebensmitt.-Rdsch. 55, 277 (1959). 9. ALn~IDGE, W. N.: Analyst 69, 262 (1944); 70, 474 (1945).

10. 2qUS~nUM, A., SI~tre~NKO: Z. Ind. Wastes 23, 875 (1951). 11. Cm~s~, W. : Wasserwirtschaft - - Wassertechnik 4, 369 (1954). 12. As~vs, E., u. H. GAlCSCtL~_GEN: Z. analyt. Chem. 138, 414 (1953). 13. ~,UDZACK, ~. J., W. A. MOOI~E u. C. C. t~UCKHOFF: Analyt. Chem. 26, 1784 (1954). 14. MtucT¥, G., u. T. V~SWA~T~n~: Analyt. chim. Act~ (Amsterdam) 2~, 293 (1961) 15. E r s ~ I ~ , J . : Analytic. Chem. 19, 273 (1947). 16. R ~ , J., u. J. W ~ L ~ s : Diese Z. 198, 270 (1958). 17. Scn~a~n~, H. : Arb. Kaiserl. Gesundheitsamt 18, 490 (1902). 18. Mitt. der F~. Degesch 1964.

~ber den Anwendungsbereich von Triphenyltetrazoliumchlorid bei der Beurteilung von Milch und Milchprodukten

I . Mit te i lung

Titerbestimmung an Rohmilch

Von

M. BUSSE und 0. KANDLER

Mitteilung aus dem Balcteriologischen Institut der Si~ddeutschen Versuchs- und Forschungsanstalt /i~r Milchwirtschaft, Weihenstephan

(Eingegangen am 10. Oktober 1964)

Einle i tung

U n t e r den Methoden zur bakter io logischen Kont ro l l e yon Milch k o m m t der Ke im- zah lbes t immung fl i t coliforme Bak te r i en eine besondere Bedeu tung zu. Der Grund daft i r ist, dal~ bes t immte Typen yon Escherichia coli charakter i s t i sche Ver t re te r der F/~k~lflora s ind und daher ganz al lgemein als Ind i ca to ren ffir fitkale Verunre in igung yon Wasse r a n d Lebensmi t t e ln ben i i tz t werden. I m speziellen Fa l l der bakter io- logischen Kont ro l l e yon Milch k o m m t noch hinzu, dab einige Ver t re te r der Coli- Aerogenes-Gruppe in Milch und Milch-Wassergemischen sehr gut wachsen. Man tr i ff t sic deshalb i iberal l do r t in grol~en Mengen an, wo Milch unsauber gewonnen oder ver- a rbe i t e t wird (WILsoN 1).

Zum ~achwe i s und zur Zithlung coliformer Bak te r i en benu tz t m a n a]lgemein Selekt ivmedien, wobei sich seit e twa fiinfzig J a h r e n Anil infarbstoffe wie Kr i s ta l l -

~Jber den Anwendungsbereich yon Triphenyltetrazoliumehlorid. I 137

violett, Brillantgr/in, Gentianaviolett oder Fuchsin besonders gut als selektive Hemm- stoffe bew/Lhrt haben. Nachdem die Selektiviti~t solcher Medien natfirlich hie v6llig spezifisch ist und in ihnen daher neben den cohformen Bakterien gelegentlich auch andere Organismen wachsen, engt man den Kreis der erfaBten Keime weiter ein, indem man nur solche Ans/ttze berficksichtigt, in denen die fiir Coliforme typische Gasbildung aus Lactose auftritt.

Mit der zunehmenden Anwendung yon Kfihlvorrichtungen beim Erzeuger und natfirlich auch in den Molkereien erlangen psychrophile Keime in Milch eine erhebliche Bedeutung. Unter ihnen finder man h/~ufig Achromobacter- oder Pseudomonas- arten, welche kein Gas aus Lactose bilden. Selbstverst/Lndlich sind auch sie Indica- toren ffir unerwfinschte Infektionen und beeintr/~chtigen wegen ihrer K/tltetoleranz die Hal tbarkei t der Milch. Damit wird auch die Frage akut, ob die Bestimmung des Cohtiters in jedem Fall zur Beurteilung der bakteriologischen Quaht/~t hin- reicht, oder ob nicht versucht werden sell, anstelle des Colititers eine Bestimmung des Titers gramnegativer StKbchen einzuffihren.

In den letzten Jahren wurde yon SCHOiNB]]I~G in einer Reihe yon Arbeiten (2, 3, 4, 5) der Vorschlag gemaeht, die bisher in Deutschland fibliche Gentianaviolett- Galle-Lactose-Pepton(GGL)-L6sung durch eine yon ihm entwickelte Triphenyltetra- zoliumchlorid (TTC)-Bouillon bzw. dureh TTC-Agar zu ersetzen. Das farblose TTC wird dureh lebende Zellen zu tiefrot gef£rbtem Tryphenylformazan reduziert. In h6heren Konzentrat ionen wirkt TTC bakteriostatisch, wobei verschiedene Bakterien unterschiedlich resistent sind (6). Nach den Angaben yon SC~6NB]~RO (3, 7) hemmt TTC in der yon ihm gew~hlten Konzentrat ion das Wachstum s/imtlieher in Milch vorkommender Bakterien mit Ausnahme der gramnegativen St/~behen. Zu den TTC- positiven St~bchen geh6ren daher auch Vertreter der Gattungen Pseudomonas und Achromobacter (KLwI~ 8, SEELEMAN~ ll. W]~G]~5IEI~ 9).

Der Vorteil, neben coli{ormen Keimen auch andere gramnegative St/ibchen zu erfassen, darf jedoch keinesfalls durch den Nachteil erkauft werden, da6 ein Teil der coliformen Keime, wie sie die bisher fiblichen Methoden anzeigen, yon TTC unter- drfickt wird, d. h. der TTC-Titer darf nut h6her, nie aber niedriger als der Coliformen- Titer sein. Aus den in der Literatur vorliegenden vergleichenden Untersuehungen fiber TTC- und Coliformen-Titer (14, 15) sowie aus eigenen gelegentlichen Beobach- tungen gewannen wir aber den Eindruck, dab diese Forderungen nicht erf/illt sind und der TTC-Titer aueh unter dem Coliformen-Titer liegen kann. Eine eingehendere Untersuchung fiber die durch den TTC-Titer erfa6ten Keimarten einerseits und die TTC-Empfindlichkeit der coliformen Keime andererseits erschien uns daher notwendig.

Wegen der sehr unterschiedlichen Mikroflora yon l~oh- und pasteurisierter Milch wurden die beiden Mileharten getrennt untersucht. Die I. Mitteilung beschreibt die Ergcbnisse der Versuche mit Rohmilch.

Material und Methode

Die GGL-L6sung nach KESSLER-SWENARTON wurde nach den Angaben yon DEMETER (10) hergeste]lt und zu je 10 ml in Reagensglaser abgefiillt. Die TTC-Bouillon nach Sc~6~rB~I~O enthielt 1% Pepton (aus Casein - - tryptisch verdaut), 0,3% LIEBIO'S Fleischextrakt und 0,5% NaC1 (11). Wir haben also die umstandlieh herzustellende und teure natursaure Bouillon dureh Fleischextrakt ersetzt. Zu 100 ml der autoklavierten und abgekiihlten Bouillon wurden 11 ml einer 2%igen TTC-L6sung zugesetzt. Die Bouillon wurde zu je 5 ml abgefiillt. Der Vollsti~ndigkeit halber sei darauf hingewiesen, dab die tatsachliehe TTC-Konzentration 1 : 505 (198 mg/100 ml) ist und nicht 1 : 450 wie allgemein angegeben wird (3).

Eine gewisse Schwierigkeit ergibt sich bei der Bewertung von positiven TTC-R6hrchen. In den Originalvorschriften der Methode (3, 11) wird angegeben, da6 eine kr/~ftig rote bis braunrote

Z. Lebensmitt.-Untersuch., Band 127 10

138 M. Bvss~ und O. I~ANDLEt¢:

F/~rbung als positiv gewerget werden soil In der PraMs lassen sieh jedoeh unter den krgftig gefgrbten l~6hrehen mindestens drei Abstuftmgen unterseheiden.

1. Diehter Formazanniedersehlag mit bratmroter Fgrbtmg. 2. Migiger Niedersehlag, weleher im Auflieht betraehtet ebenfalls mehr oder weniger braun-

rot gefgrbt isg. Im Durehlieht erseheint die Farbe allerdings eher braunrot his karminrot. 3, Wenig Niedersehlag mit braunroter Firbung im Auflicht; bei Betraehtung im Durehlieht

erseheinen die I~6hrchen kriftig hellrot. In der Literatur wird im allgemeinen angegeben, dag tiefro~e Ans~tze Ms positiv bewertet

wurden (9,19., 13, 14,15, 16). Bei Bewertung im Auflieht, d. h. bei Betraehtung der I~Shrehen gegen einen hellen Untergrund, schliegt dies zweifellos aueh Stufe 3 der oben gegebenen Unterteilung ein. Werden die l~Shrehen hingegen im Durchlieht bewertet, so mfissen Ans~tze mit wenig For- mazanniedersehlag (Stufe 3) vermutlieh noeh als negativ gelten. Es besteht also noeh eine erhebliche Unsieherheit fiber die ]3onitierung bei der Ti~erbestimmung mit TTC. Mit BECK (i2), SC~X~zEL (16) und S]~]~Mi~N u. W ~ a ~ R (9) sind wit der Auffassung, dag ffir die Methode auf alle F/tHe ein eindeutiges Bewertungssehema aufgestellt werden mug.

In der vorliegenden Arbeit wttrde Stale 3, d.h. krg~tig braunrote Firbung im Auflieht, welehe die Farbe des Mediums vSllig iiberdeckt, Ms unterste Grenze fiir positiven AusfM1 benutzt. Nachdem sieh der Formazanniedersehlag h~ufig absetzt, wurde der InhMt der t~Shrehen vor der Bewertung dttreh kreisende Bewegung aus dem Handgelenk aufgewirbelt. Von den Milehproben wurden in der fibliehen Weise Verdiirmungsreihen in sterilem Leitungswasser angelegt. Dabei wurden immer genfigend Verdtinnungen angesetzt, so dab mindestens die letzte Verdi~nnungs- stufe negativ blieb. Die Ablesung der GGL-l~6hrehen wurde wie iiblieh naeh 48 Std vorgenommen. Die TTC-RShrchen wurden entspreehend den Vorsehriften (3, 11) naeh 18 Std abgelesen; zusitz- lieh erfolgte noeh eine zweite Ablesung naeh 48 Std.

Ergebnisse

1. Vergleich der TTC-Titer (18 Ntd) mit den GGI-Titern Von 105 Milchproben einzelner IAeferanten wurde gleichzeitig der TTC-Titer und

der Coli-Titer mit GGL-L6sung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tab. 1 so dar- gestellt, dab sich ersehen lggt, welche TTC- mid GGL-Titer jeweils zusammen ge- hSren. Auf diese Weise kommt unmittelbar zum Ausdruck, wie stark die TTC-Titer der Proben mit gleichem Coligehalt streuen und umgekehrt. So verteilten sich z. B. die l l Proben, die einen Colititer yon 1 ml hatten, auf 3 verschiedene TTC-Titer- stufen; ngmlich 4 auf 1 ml, 5 auf 10-1ml und 2 auf 10-~ml; die 30 Proben, die einen einheitlichen TTC-Titer yon 10 -1 ml aufweisen, verteilen sich sogar auf 7 verschiedene Colititerstufen. Der l~bersichtlichkeit halber ist in der Tabelle die Diagonale 4urch~et tdruck hervorgehoben; es handelt sich dabei um diejenigen Titerkombi- nationen, bei denen der GGL- und TTC-Titer gleich ist. Alle Werte rechts oberhalb der Diagonale gelten Ifir Proben, bei denen TTC einen hSheren Titer aufwies als GGL und allc Werte links unterhalb der Diagonalen beziehen sich auf Proben bei denen die GGL-LSsung schgrfer anzeigte. Die unterste Zefle enth~lt die Summe Mler Werte der einzelnen Spalten, d .h . es handelte sich um die Titerhgufigkeiten ffir TTC nn- abhgngig yon den zugehSrigen GGL-Titern. Analog lgBt sich aus der letzten Spalte die Verteflung der GGL-Titer unabhgngig von den TTC-Werten ersehen.

Auf den ersten ]3lick fgllt an Tab. 1 auf, dab die Werbe in sehr unerwarteter Weise fiber die Tabelle verteilt sind. Zungchst stellt man lest, dab der Prozentsatz derjenigen Proben, bei denen GGL-Titer und TTC-Titer gleieh hoch sind und deren Anzahl sich aus den Zahlen der Diagonalen ergibt, mig 20% recht gering ist.

Eine zweite Gruppe bilden diejenigen Proben, deren TTC-Titer h6her ist als der GGL-Titer; sie sind rechts oberhalb der Di&gonalen zu fmden. Es handelt sich nut um 16 Proben, d. h. 15~o aller Werte. Das Auffgllige dabei ist, dab die fiberwiegende Mehrzahl davon Proben shad, welche einen extrem niedrigen GGL-Titer aufweisen.

Bei der Mehrheit der Broben ist der TTC-Titer niedriger Ms der zugeh6rige GGL- Titer (68 P r o b e n = 65~o , links unterhalb der I)iagonalen). ttier handelt es sich fast

b'ber den Anwendungsbereich yon TriphenyltegrazoliumcMorid. I 139

Tabelle 1. Vergleich yon GGL.Titer und TTC-Titer. 105 Rohmilchproben. GGL-Titer abgelesen nach 48 Std, TTC-Titer abgelesen nach 18 Std. Die Zahlen der Tabelle geben an, wie h~ufig die einzelnen Titerkombinationen (GGL; TTC) gefunden wurden. 5 ml TTC-Bouillon nach Se~6~nERG

TTC-Titer GGL-Titer

negativin 1 ml 1 ml

10 -1 ml 1 0 -2 ml lO 3 ml lO -4 ml 10 -5 ml 1 0 - 6 m l 10 -7 ml

Summe

negativ i in ' 1 ml

1

0 - -

TTC:positiv in 1 10 -1 10 =6 10 -6 10 -y ml

30

10 ~ 10 -3 10 4

1 2

4 1 7 0

10 6 3 5 2 3

4 6 2 l I 3

31 , 1 3 15 %--

1

0 0

~ 0 . . . .

Summe

6 11 10 12 10 21 12 16 7

ausschliel31ich urn Probcn, deren GGL-Titer relativ hoch ist, d. h. zwischen 10 -a ml und 10 -7 ml liegt. Es ergibt sieh also, daf~ der Vergleich der Titer, die mit TTC bzw. GGL-LSsung erhalten werden bei Milchproben mit hohem Coligehalt v611ig andere Ergebnisse liefert als bei Milch mi~ niedrigem Coligehalt. Bei hohem Coligehalt werden zu niedrige TTC-Titer gemessen, w/~hrend sich bei geringem Coligehalt zu hohe TTC-Titer ergeben. Es muB darauf hingewiesen werden, dab dies nicht nur bei der Untersuchung yon gohmilch gefunden wird, sondern auch bei pasteurisierter Trinkmilch in Erseheinung t r i t t (15, 17). Bedauerlicherweise eignen sieh die meisten bisherigen Ver6ffentlichungen fiber die Brauehbarkeit der TTC-Methode nieht ffir einen Vergleich mit unseren Befunden, weft in der Regel die Titer mit GGL-LSsung und TTC-Boufllon unabh/~ngig voneinander angegeben werden (9, 14, 18, 19, 20). Nur RACJ~ow (15) hat die von ihm gefundenen TTC-Titer naeh den zugeh6rigen GGL-Titern aufgegliedert. In vSlliger Ubereinstimmung mit unseren ]Befunden ergibt sich aus den Zahlen yon RAc~ow, dal~ TTC nur bei Proben mit niedrigem GGL- Titer sch~rfer anzeigt.

Die Proben, bei denen die Titerbestimmung mit T T C h6here Werte lieferte als die GGL-L6sung, entsprechen der yon SCgSNB]~RG und anderen Beffirworgern der T T C - M e t h o d e ausgesproehenen Erwartung, dal3 ein breiteres Spektrum yon Keim- arten effa6t wird. Die mikroskopische Kontrolle TTC-positiver Verdfinnungsstufen, die GGL-negativ waren, ergab allerdings, dab in allen F/~llen nicht nur gramnegative St/tbchen, sondern aueh Streptokokken vorhanden waren. Auch aus der Literatur ist bereits bekannt, dal~ eine grof~e Zahl yon Streptokokken und Mikrokokken durch- aus TTC-resistent sind (2, 7, 9, 21, 22, 23, 24). In welchem Unffang in den yon uns beobachteten F/~llen die verschiedenen Keimarten zum Zustandekommen eines fiber dem GGL-Titer liegenden TTC-Titer beigetragen haben, liei3e sich natiirlich nur sagen, wenn aile Keime isolier~ und auI Resistenz und spezifisehe t~eduktionsf/~higkeit gepr/ift worden w/iren. Sicher ist jedoch, daf~ der Vorteil der umfassenderen Anzeige unerwfinschter gramnegativer Keime mit einer Unseh~rfe der Selektivit~t gegenfiber Streptokokken erkauft wird. Dies ffihrt besonders bei der Prfifung pasteurisierter Milch zu unzul~ssigen Fehlbeurteilungen, worauf wir in der I I . Mitteilung n/~her eingehen werden (17).

Der weitaus gr6Bte Teil der Proben, n/imlich fast alle mit hohem Colititer, wider- sprieht offensiehtlich der oben erw~hnten Erwartung, da sic zu niedrige TTC-Titer

]0"

140 M. BvSSE und O. KANDLER:

aufweisen. Dies k a n n m a n nur mi t der Annahme erkli~ren, da$ die in I~ohmilch h~ufig vorkommenden St/~mme coliformer Keime gegen die tibliche TTC-Konzen- t r a t ion n icht hinreichend resistent sind. Eine ni~here Be t rach tung der fraghchen Werte m Tab. 1 zeigt, in welchem Ausma$ dies der Fal l ist. Zum Beispiel erreichte yon dan 12 Proben mi t einem GGL-Titer yon 10 -5 ml nu r eine Probe einen TTC- Ti ter yon ebenfalls 10 -5 ml. 3 Proben wiesen einen TTC-Titer yon 10 -4 ml auf, 2 Proben einen TTC-Titer yon l0 -a ml, 5 Proben ha t t en einen TTC-Titer yon 10 -2 ml u n d eine Probe einen Ti ter yon nur 10 -1 ml. Bei dieser le tzten Probe war also eine E insaa t yon mindestens 10000 GGL-posi t iven Ke imen notwendig, u m innerhalb yon 18 Std eine deutliche Formazanbf ldung zu erhalten. Weitere Beispiele ergeben sich aus dam un te ren Tefl yon Tab. 1.

Von den insgesamt 78 Proben mi t einem GGL-Titer yon 10 -3 ml aufw~rts wiesen n u t 3 Proben einen erhShten TTC-Titer auf. Bei nu r 8 weiteren Proben waren TTC- Ti ter u n d GGL-Titer identisch, w£hrend bei den restl iehen 67 Proben die TTC-Titer deutl ieh erniedrigt waren, d . h . die TTC-Methode zeigte den tats~ehliehen Gehalt dieser Milehproben an coliformen u n d erst reeht an gramnegat iven Ke imen nur sehr unvollst/~ndig an. Auf eine relativ starke Empfindl ichkei t yon l~einkul turen coliformer Keime gegen die verwendeten TTC-Konzen t ra t ionen weisen auch sehon die Arbei ten yon KLv.I~ (8) u n d PAPAVASILLIOC (18) hin, u n d in dam folgenden Ab- schni t t wird dies an Sti immen, die aus den yon uns un te rsuch ten Milehproben isoliert worden sind, noch n~her besehrieben.

2. Prii]ung der T TC-Resistenz einiger Stiimme von gramnegativen St~ibchen und Entero- kokken

Aus posi t iven TTC- und GGL-RShrehen wurde Material e n t n o m m e n u n d auf Hefe-Glucose-Agar mi t Zusatz yon Chinablau in den Verdf innungen 10 -5 bis 10 -7 ausplat t ier t . Einzelne Kolonien yon Siiurebildnern u n d Nichtsi iurebi ldnern wurden ditrch wiederholtes Ausplat t ieren gereinigt. Auf diese Weise sind bisher etwa 50 St/imme gramnegat iver Sti~bchen u n d 40 St~mme gramposit iver Streptokokken isoliert worden.

Eine grobe Charakterisierung der gereinigten St~mme wurde in folgender Weise vorgenommen. Bei den St~behen iiberzeugten wir uns dureh Gramausstrich und Beobachtung unter dem Phasenkontrastmikroskop, dab es sich um gramnegative, nicht sporenbildende Stabchen handelte. Die Unterscheidung der Enterobakterien yon den Gattungen Pseudomonas oder Achromobacter erfolgte auf Grund ihrer F~higkeit, Glucose unter anaeroben Bedingungen zu verg~ren [Huo~ u. LE~so~ (25)]. Die Enterobakterien wurden mit dem IMVIC-Test weiter differenziert. Bei der weiteren Differenzierung der obligat aeroben St~mme wurde vorli~ufig die Unterscheidung zwischen den Gattungen Pseudomonas und Achromobacter nur auf Grund des Oxydasetests nach KovAcs (26) vorgenommen. Bei allen Stammen wurde das Verhalten in Lackmusmflch und Gas- bildung aus Lactose in GGL-LSsung gepriift.

Die Charakterisierung der Streptokokken erfolgte auf Grund des Wachstums in Laekmusmilch bei 10 ° C und 45 ° C und der t~esistenz gegen 6,5o/0 NaC1 und Wachstum bei pi t 9,6 in Bouillon.

Die TTC-t~esistenz eines Stammes l~Bt sich in verschiedener Weise messen und ausdriieken. Im Zusammenhang mit der Bestimmung des TTC-Titers schien es uns am wichtigsten, zu bestim- men, wie viele Keime in die TTC-Bouillon eingeimpf~ werden miissen, um nach der Standardzeit yon 18 Std eine eindeutig positive t~eaktion zu erhalten. Urn dieses Ziel zu erreichen, wurde yon 14 Std alten BouiUonkulturen nicht nu rde r TTC-Titer angelegt, sondern auch die Keimzahl dnrch das normale Plattenverdiinnungsverfahren bestimmt. Die nach 18 St4 noch negativen TTC-l~Shrchen wurden bis 48 Std weiter bebrtitet, um auch die F~lle zu erfassen, bei denen TTC nur eine erhebliche Hemmung der Waehstumsgeschwindigkeit, aber keine vSllige Unterdriickung bewirkt.

Als weitere N[odifikation wurde der TTC-Titer jeweils auch in TTC-Bouillon mit Zusatz yon 2% steriler Magermflch angesetzt, denn aus den Versuchen yon SC~TZEL (16) geht hervor, dal~ Milchzusatz zu einer rascheren Bfldung yon ~ormazan fiihrC. Vermutlich ist die TTC-Bonillon ein snboptimaler N~hrboden iiir die gramnegativen Keime und wird durch Milch verbessert.

Uber den Anwendungsbereich yon Triphenyltetrazoliumchlorid. I 141

Weiterhin wurde auch der Colititer in GGL bestimmt, um noch einmal zu zeigen, dab dieser Test alle Gasbildner tats~chlich bis zur hSchsten Verdiinnung anzeigt.

Typische Ergebnisse einiger der geprfiften Stgmme zeigt die Tab. 2.

Tabelle 2. TTC-Resistenz verschiedener Stiimmc von gramnegativen Stiibchen urul Streptococcus /aecalis. Ausgangskeimzahh Hefe-Glucose-Agar. TTC-Titer: 5 ml TTC-Bouillon n~ch

SC~5~BEnG bzw. 5 ml TTC-Bouillon ÷ 2% sterile Magermilch

Organismus

Aerobacter aerogenes

Achromobacter spez. Pseudomonas spez.

Streptococcus ]accalis

Stature

614 B 6T

65 B 61 B 53

I T 5T

45131 4351

I1

Ausgangs- keimzahl

2,10 8 2,10 9 2,10 9 5,10 8 6,10 8

5,10 8 2,10 9

7,10 8 2,10 8 7,10 8

TTC-Titer

18 Std 48 Std

~ c I TTC + Milch I TTC + Milch TTC

1 0 - 8 10-8

IO-G

10-9

10-9 1 0 - 9 10-8

10-8

10-9 10-7 10-7

10-8 10-8 10-9 10-8 10-9 10-9 lO-S lO-S

10-8 10-8

10 8 10-8 1 0 - 8 1 0 - 8

_ _ 1 0 - 9

GGL-Titer

1 0 - 8 10-9 10 9

10-8 10-8

Die Ausgangskeimzahl der Kul turen betrug rund 109 Keime/ml. Der Stamm 614 B lieferte naeh 18 Std bei einer Verdiinnung yon 10-" in reiner TTC-Bouillon einen tiefroten Formazanniederschlag. Der Stature ist also eindeutig resistent gegen die iibliche TTC-Konzentration. Beim Stamm 6 T fielen nach 18 Std dagegen die Verdiinnungen 10 -7, 10 -s und 10 -9 negativ aus (nur geringe Ansgtze einer TTC- Reduktion). Nach 48 Std allerdings war auch die Verdiinnung 10 -9 eindeutig positiv. Das Waehstmn dieses Stammes wird also durch TTC sehr s tark verz6gert, aber auch die Animpfung mit nur einem Keim/ml ffihrt noch - wenn auch verspgtet - zu einer positivcn Reaktion. Der Zusatz yon Milch hat bei diesem Stamm einen deutlieh fSrdernden EinfluB auf die TTC-Reduktion. Es ist anzunehmen, dab die Zellen in dem mit Milch angereieherten Medium die TTC-bedingte Wachstumshemmung fiber- winden.

Noeh weniger resistent ist der Stamm 65 B; nach 18 Std war hier selbst die nied- rigste angelegte Verdiinnung (10 -5) negativ, obwohl bei dieser Verdfinnung immerhin 10000 Keime in den Ansatz gebracht wurden. Zusatz yon Milch bewirkte hier erheblich besseres Wachstum, so dab immerhin noch die Verdfinnung 10 -s positiv aus- r id; es wurde also in diesem Fall nur noch eine Einsaat yon rund 10 Keimen pro R6hrchen benStigt. Die St£mme 61 B und 53 sind sehr TTC-empfindlich. Stamm 61 B zeigt innerhalb yon 18 Std aueh mit Milchzusatz bei der Verdfinnung 10 -5 keine Formazanbildung, obwohl entspreehend der Ausgangskeimzahl der Kul tur die Ein- saat rund 5000 Keime betragen hatte.

Bei 48 Std Bebrfitung waren immerhin noch etwa 500 Keime pro R5hrehen ftir eine positive Reakt ion eriorderlich. Der Zusatz von Milch bewirkte bei Stamm 61 B keine F5rderung, Stamm 53 vermag in TTC-Bouillon offensiehtlich fiberhaupt nicht zu wachsen; er wird infolgedessen bei der Titerbestimmung mit TTC auch nieht erfaBt.

Im Gegensatz zur groBen Variabili t~t des TTC-Titers stimmen die Titer mit GGL-LSsung bei den fiinf St/immen yon Aerobacter aerogenes sehr gut mit den

142 M. BvssE und O. KANDLER:

Keimzahlen fiberein (Tab. 2, letzte Spalte). Offensichtlich zeigt die GGL-LSsung bei allen St/~mmen selbst einen Keim pro Ansatz noeh an.

~hnlich wie bei den lactosepositiven, gramnegativen St~bchen war auch bei den 15 bisher gepr/iften lactosenegativen St/immen die TTC-Resistcnz recht verschieden. Die fiberwiegende Mehrheit war nur m/~Big TTC-resistent, d. h. innerhalb von 18 Std trat eine deutlich sichtbare Formazanbildnng nur dann auf, wenn eine hohe Einsaat an Zellen benutzt wurde. Eine Reihe yon St/~mmen war TTC-negativ. In Tab. 2 wurden die Ergebnisse fiir zwei St/imme aufgenommen. Stature 1 T ist der bisher TTC-resistenteste Stamm unter den yon uns geprfiften lactosenegativen St/~bchen. Ohne Milehzusatz ben6tigt dieser Stamm eine Einsaat von rund 100 Keimen pro R6hrchen urn innerhalb yon 18 Std TTC-Reduktion zu zeigen. In Gegenwart yon 2% Milch werden jedoch schon wenige Zellen erfaBt, wie der Titer yon 10 -s m] bei einer Ausgangskeimzahl yon 5 . l0 s beweist. Der Stamm 5 T dagegen war v611ig TTC-negativ.

Xhnliche Verh~ltnisse ergeben sich bei den aus positiven TTC-Ans/~tzen isolierten Streptokokken. Es handelt sich dabei, soweit wir unsere St/~mme bisher bestimmt haben, um Enterokokken. Dies stimmt mit der Angabe von LIE~HOP (22) fiberein, wonach Streptococcus ovalis schwach TTC-positiv sein soll. Die TTC-resistenten Kok- ken zeichnen sich dadurch aus, dab sie in TTC-Bouillon ohne Milehzusatz nur sehr schlecht wachsen. Nut einige wenige unserer Stiimme reduzieren TTC in reinem TTC-Medium innerhalb von 18 Std. Ein typischer Vertreter daffir ist Stamm 45131 (Tab. 2), jedoch benStigt er eine Einsaat von etwa 100 Keimen. In seiner Resistenz entspricht dieser Stamm etwa den St/~mmen 6 T oder 1 T bei den gramnegativen St/~bchen. Andere St/imme sind weniger resistent, wie etwa Stamm I 1, welcher ohne Milchzusatz in TTC-Bouillon fiberhaupt nicht wi~chst.

3. Verlinderung der T TC-Titer bei Verl~ingerung tier Bebri~tung

Aus Tab. 2 ging hervor, dab infolge der mehr oder wcniger ausgepr/~gten TTC- Empfindlichkeit vieler gramnegativer St/~bchcn der endgfiltige Titer nach der tiblichen Zeit yon 18 Std noch nicht erreicht ist. Die Tab. 3 und 4 sollen nnn zeigen, welche TitererhShungen sich ffir Rohmi]ch ergeben, wenn man die Bebriitung um 30 Std verl/inger~ und wie sieh der TTC-Titer nach 48 Std zum GGL-Titer verb/fit.

Tabelle 3. Vergleich yon TTC-Titer nach 18 Std und TTC-Titer nach 48 Std. Die Zahlen der Tabelle geben an, wie hi~ufig die einzelnen Titerkombinationen (18 Std/48 Std) gefunden wurden. 5 ml

TTC-Bouillon nach SC~6NBE~G

TTC-Titer nach 18 Std

negativ in 1 ml ~1 ml [10 ~1 ml [10 -2 ml

TTC- |10-3 ml positiv ~i0-4 ml

in ]10-5 ml ]10 -6 ml ( 1 0 -7 ml

Summe

negat iv I

0

I

TTC-Titer nach 48 Std

TTC-posit iv in

10 -1 10 ~

10 20

10 -3 10 4 I 10-~ l

I

1

2 3 7 3

2 1

I0 -e i 0 - ' ml

1

1

0

Surame

0 5

30 31 19 15 ]0

i 1 I 0

Ober den Anwendungsbereich von Triphenyltetrazoliumchlorid. I 143

Tabelle 4. Vergleich yon GGL- Titer und T TC- Titer. 105 Rohmilchproben. GGL-Titer und TTC- Titer abgelesen nach 48 Std. Die Zah]en der Tabelle geben an, wie h/~ufig die einzelnen Titerkombi-

nationen (GGL/TTC) gefunden wurden. 5 ml TTC-Boui]lon nach SCHSN~RG

TTC-Titer

GGL-Titer

negativin 1 ml

TTC-positiv in

1 ml 10 1 ml 10 -2 ml 10 -3 ml GGL-

positiv 10 -4 ml in 10 -5 ml

110-6 m l (10 -7 ml

Summe

10 -~ ] 10 -3

- - 1 10 20

10 4 10-5 I10 -~ml Summc

10-~

4 1

3 11 7 4

T

6 1

4 3

16 13 ] 6

6 11 10 12 10 21 12 16 7

In Tab. 3 sind zun~chst die TTC-Titer nach 18 Std mit den TTC-Titern nach 48 Std verglichen. Die ])arstellung erfolgte nach dem selben Schema wie in Tab. 1. Die fett gedruckten Ziffern in der Diagonale geben die Anzahl der Proben an, deren Titer sich dutch die Verl~ngerung der Bebr/itung nicht ver~nder~ hat. Es handelt sich dabei um 26 Proben, d .h . um 25%. Rechts oberhalb der DiagonMen ist die Anzahl der Proben zu finden, deren Titer bei der zweiten Ablesung erh6ht war; es sind zusammen 79 Proben oder 75%. Aus der Tabelle li~Bt sich wciter entnehmen, um wieviele Verdfinnungsstufen sich der Titer der einzelnen Proben erh6ht hatte. Der groi~e Prozentsatz yon Proben, deren Titer sich bei der zweiten Ablesung noch erh6hte, zeigt deutlich, dab mgBig TTC-resistente Bakterien in Rohmilch weir ver- breitet sin& Auch das Ausmag der Erh6hung ist interessant. Von den 79 Proben hatten 38 (48%) ihren Titer um nur eine Verdfinnungsstufe erh6ht, bei 24 Proben (30%) war der Titer schon um zwei Sttden gestiegen und bei 17 Proben (21%) sogar um mehr als drei Titerstufen. Von den insgesamt 105 Proben enthielten also nur rund ein Viertel so resistente Keime (26 Proben), dab der Titer schon nach 18 Std den Endwert anzeigte. Rund ein Drittel (38 Proben) enthielt m~Big TTC-empfindliche Bakterien mit einer Titererh6hung um eine Stufe, w~hrend die restlichen 40% (41 Proben) TTC-empfindliche Keime aufwiesen, deren TTC-Titer nach 18 Std um mehr als eine Titerstufe zu niedrig waren.

In Tab. 4 sind die TTC-Titer nach 48 Std und die GGL-Titer miteinander verglichen. Die Darstellung ist wiederum so wie in Tab. 1. Die Anzahl der Proben, welche gleiche TTC- und GGL-Titer aufweisen, hat sich auf 39 (37 %) erh6ht, dagegen ist die Zahl der Proben, deren TTC-Titer niedriger liegt als der Titer mit GGL- L6sung auf 24 (23 %) abgesunken. Die Unterschiede zwischen TTC-Titer und GGL- Titer sind auch nicht mehr so drastisch wie in Tab. 1. Eine erhebliche Zunahme zeigt die Zahl der Proben, bei denen der TTC-Titer den GGL-Titer fiber~rifft. Es handelt sich dabei um insgesamt 42 Proben (40%). Im Vergleich zu Tab. 1 hat sich also das Ergebnis zugunsten yon TTC verschoben. Interessant ist jedoch, da~ sich auch in Tab. 4 grunds~tzlich dieselbe AbMngigkeit des Verh/~ltnisses zwischen TTC- und GGL- Titer vom Coligehalt der Milch zeigt wie in Tab. 1. Von den 42 Proben mit fiberlegenem TTC-Titer geh6rt etwa die H£1fte den keimarmen Milchproben an, bei diesen finder sich keine einzige mit zu niedrigem TTC-Titer. Je keimreicher die Milchproben jedoch waren (GGL-Titer ]0 -3 ml und hSher), urn so gr6~er wird der Anteil der Proben,

144 M. Buss~ und O. KA~DLE~:

bei denen der TTC-Titer den GGL-Titer nicht mehr erreicht. Auf 24 Proben mit iiber- legenem GGL-Titer kommen bier nur 13 mit fiberlegenem TTC-Titer. Nach einer Bebriitungszeit yon 48 Std zeig~ sieh also bei pausehaler Betraehtung die TTC- Bouillon der GGL-LSsung fiberlegen, d. h. im Durehschnitt werden mit TTC hShere Titer erhalten als mit der GGL-LSsung. Allerdings beruht diese Uberlegenheit aus- sehlieBlich auf dem Ergebnis an keimarmen Milchproben. Gerade bei diesen bleibt aber often, bis zu welehem Grad die erhShten TTC-Titer auf Enterokokken zurfick- zuffihren sind (Buss]~ u. KANDLEI~ 17; Tab. 2).

Zusammenfassend 1/iBt sieh sagen, dab die Titerbestimmung bestenfalls bei einer Testdauer yon 48 St4 anwendbar ist. Dabei ist allerdings zu beachten, dab die Werte der TTC-Titer bei den hSheren Verdiinnungen selbst nach 48 Std h/iufig zu niedrig sind. Ganz wesentlich ist auBerdem, dab bei Verl/ingerung des Testes die Ergebnisse der Titerbestimmung mit TTC nieht mehr friiher vorliegen als bei der GGL-LSsung. Damit verliert die TTC-Methode ihren Hauptvorteil , n/imlieh die Zeitersparnis.

4. Verwendung der TTC-Reduktionszeit an Stelle des TTC-Titers Eine andere Anwendung yon TTC ffir die Priifung der bakteriologisehen Qualit/it

yon Rohmflch besteht darin, den Farbstoff als Redoxindieator in einer Reduktions- probe zu benutzen (ScHS~B~G 21, D ~ T ~ R 10),

Dazu werden 0,5 ml einer 1,0~oigen TTC-LSsung zu 5 ml Milch gegeben; die TTC-Konzen- tration betr~gt hier also nut die ~IMfte derjenigen in der TTC-Bouillon. Die Bebriitung erfolgt bei 37 ° C ira Wasserbad und es wird die Zeit bis zum Auftre~en einer deutliehen l~otf~rbung bestimmt. Es entfallen dabei natiirlieh die Verdiinnungen. Die Versuehsanstelhmg unterscheidet sieh yon der Titerbestimmung insofern grunds~tzlich, als sich hier die Reduktionsleistung aller TTC-resistenten Bakterien einer Milehprobe summieren, w~hrend bei der Titerbestimmung alle zahlenm~Big unterlegenen Organismen infolge der Verdiinnung keinen Einflul~ auf das Ergebnis haben. Aul~erdem finder die Bestimmung in dem besseren Substrat Milch start; info]gedessen f~l]t die geringe TTC-Resistenz vieler gramnegativer St~behen nieht mehr so en~scheidend ins Gewicht. Aueh die TTC-resistenten Enterokokken werden dabei selbstverst~ndlieh miterfal~t.

I m Vergleieh zu anderen Reduktionsproben, etwa mit Methylenblau oder l~esa- zurin, hat die Probe mit TTC den Vortefl, dab die Milehs/iurestreptokokken wegen ihrer ge~ngen TTC-Resistenz nieht an der Reduktion beteiligt sind. Das Verfahren w/ire also in erster N/iherung der Bestimmung der ~qitratreduktion (KANDLEI~ 27) equivalent und kSnnte sieh mSglicherweise zur Aussonderung soleher Rohmilch eignen, welehe besonders viele gramnegative St/ibchen enth/i]t. In welchem Umfang sich die Mitbeteiligung der Enterokokken bier stSrend auswirkt, und ob dureh das Vor- handensein einer sehr groBen Zahl yon Streptococcus lactis Fehlbeurteilungen ein- treten, mnB allerdings erst gekl/irt werden. Wir beabsichtigen diese Art der Verwen- dung yon TTC zur Rohmilehkontrolle in einem sp/iteren Beitrag ausffihrlieher zu besprechen.

Diskuss ion der Ergebn i s se

Die hier beschriebenen Versuche zeigen, dab der TTC-Titer bei Rohmflch ent- gegen den Angaben in der Literatur (2, 4, 5) keineswegs alle coliformen Keime und zusKtzlich noeh andere gramnegative St/ibchen anzeigt. Bei der Mehrzahl der Proben ist der TTC-Titer vielmehr erheblich niedriger als der Colititer (Tab. l). Somit ist die Titerbestimmung mit TTC nicht geeignet, die bisher fibliehen Verfahren zur Ermit t lung des Colititers zu ersetzen. Nur bei Verl/ingerung der Ableseperiode yon ]8 Std auf 48 Std kommt eine einigermaBen brauchbare Ann/iherung der TTC- Titer an den Colititer zustande, aber selbst unter diesen Bedingungen weisen gerade die stark infizierten Milchproben noch deuthche Abweichungen zu ungunsten des TTC-Titers auf (Tab. 4). Der entseheidende Mangel der TTC-Bouillon ist also, dab

Uber den Anwendungsbereieh von Triphenyltetrazoliumehlorid. I 145

in ihr ein groger Teil der g r amnega t iven St/~behen nur sehleeht w/~ehst und daher f iberhaupt n ieht oder nur versp/ t te t angezeigt wird (Tab. 2).

Ein wei terer Naehte i l der Methode is t die zu geringe I l e m m w i r k u n g gegenfiber S t r ep tokokken , yon denen sieh besonders die E n t e r o k o k k e n in TTC-Boui l lon kr£f t ig ve rmehren (Tab. 2) und d a m i t mi t Sieherhei t a m pos i t iven Ausfal l der P roben mi t - wirken. Infolgedessen ist gerade bei den P roben mi t ger ingem ColigehMt, bei denen TTC seh/~rfer anzeigt, n ieh t die Gew/~hr gegeben, dag die e rh6hten TTC-Ti te r auf e inem fiber den Coli t i ter h inausgehenden Gehal t an g ramnega t iven St/~behen zurfiek- zuffihren sind. Al lerdings wird bei Rohmi leh in solehen TTC-Ans/i tzen, die bei h6heren Verdf innungen pos i t iv reagieren als die zugehSrigen GGL-Ans~tze, in der Regel eine Misehflora yon St~behen und S t r ep tokokken gefunden, so dab eindeut ige Fehl - beur te i lungen n ieht allzu hgufig sein dfirften. Anders l iegen aber die Dinge bei pas teu- r is ier ter Milch und Troekenmileh, wo die Betei l igung der S t r ep tokokken an der TTC- l~edukt ion eine erhebliche Fehlerquel le dars te l l t (17).

Zusammen/assung An 105 Rohmi l chp roben wurde ein Vergleich der Ti ter durchgeff ihr t , die sich

mi t Tr ipheny l t e t r azo l iumehlo r id -Boui l lon bzw. mi t Gent ianav io le t t -Gal le -Lac tose- LSsung ergeben. A u g e r d e m wurde an einigen Re inku l tu r en die TTC-Resis tenz von g ramnega t iven St/~bchen a n d yon E n t e r o k o k k e n bes t immt .

Es wurde festgestel l t , dab die GGL-L6sung wesentl iche h6here Ti te r liefet¢ als TTC-Bouil lon. I n Ube re in s t immung d a m i t konnte gezeigt werden, dab Re inku l tu ren von g r amnega t i ven St/~bchen h/~ufig nur m/~Big TTC-res is tent s ind und n u t bei sehr hoher Anfangske imzahl posi t ive P roben ergeben. Auf der anderen Seite ergab sich, dab E n t e r o k o k k e n in TTC-Boui l lon zu wachsen vermSgen und zur R e d u k t i o n ffihren. Die Selekt iv i t / i t der TTC-Boui l lon is t demnach n icht hinreichend.

Literatur 1. WILSOn, G. S. : The bacteriological grading of milk. London: H. M. Star. Office 1935. 2. SCg6NBERG, F. : Lebensmitteltierarzt 4, I76 (1953). 3. SeH6NBERG, F. : Lebensmitteltierarzt 5, 116 (1954). 4. SCH6NSERG, F.: Arch. Hyg. Bakt. 138, 538 (1954). 5. SeHS~BE~G, F., u. H. KRAUS: Arch. Lebensmitt.-Hyg. l l , 113 (1960). 6. WU~DT, W.: Dtsch. med. Wschr. 75, 1471 (1950). 7. SCgS~BE~G, F.: Lebensmitteltierarzt 4, 137 (1953). 8. KL]~IS¢, H. : Berl. Miinchn. Tierarztl. Wschr. 68, 214 (1955). 9. SEEL~MAN~, M., u. K. It. WEGn~ER: Milchwiss. 11, 51 (1956).

10. DEMETER, K. g.: Bakteriologische Untersuchungsverfabren der Milchwirtschaft. 3. Aufl. Stuttgart: Eugen Ulmer 1953.

l l . Verordnung fiber digtetische Lebensmittel. BGB1. Tell I, Nr. 32, S. 415 (1963). 12. B~eK, G.: Arch. Lebensmittelhyg. 13, 173 (1962). 13. KnAus, H. : Lebensmitteltierarzt 5, 177 (1954). 14. KLEIN, H.: Arch. Lebensmitt.-Hyg. 8, 59 (1957). 15. ]~ACKGW, H. G. : Milehwiss. 16, 565 (1961). 16. SegXTZEL, K. : Milchwiss. 14, 530 u. 584 (1959). 17. BuSSE. M., u. O. KANDLE~: Diese Z. (ira Druck). 18. PAPAVASSILIOV, I. : Milchwiss. 15, 183 (1960). 19. PIETZ, P,: Milehwiss. 14, 490 (1959). 20. SeH6~-g~I~R, W. : Milchwiss. 11, 280 (1959). 21. SeH6NBE~a, F.: Lebensmitteltierarzt 2, 52 (1951). 22. LIE~N~Or, E. : Lebensmitteltierarzt 5, 115 (1954). 23. IIEYL, W., H. J. HOLTHOF~ U. W. SeH55~eom~: Milchwiss. 12, 213 (1957}. 24. WEaE~ER, K. H.: Milchwiss. 13, 177 (1958). 25. ]:[t¢~, R., u. E. LEisSOSr: J. Bact. 66, 24 (1953). 26. Kovacs, N.: Nature (Lond.) 178, 703 (1956). 27. KA~DLER, O.: Dtsch. Molkerei-Ztg. 82, 1 (1961).

Documents

Über den Anwendungsbereich von Triphenyltetrazoliumchlorid bei der Beurteilung von Milch und Milchprodukten