I Zeitschrift fur Allg. Mikrobiologie I 9 I 7 I 1969 I 531-543 I

(Institnt fur Organische Chemie der Deutschen Akademie der Wissenschaften zit Berlin, Berlin- Adlershof)

Uber den EinfluIS der Phosphat- und Stickstoffdosierung auf die Ausbeute und den Rohproteingehalt der Hefe wahrend der

kontinuierlichen Kultivierung von Candida utilisl)

M. LORENZ

(Eingeyanyen am 10. 4.1969)

Die Auswirkungen der Substratzusammensetzung auf das Wachstum und den Zellaufbau von Mikroorganismen sind oft beobachtet und beschrieben worden (z. B. HERBERT 1961). Auch bei der mikrobiellen EiweiBgewinnung rnittels Wuchshefen (= Futterhefen) hat es nicht an Versuchen gefehlt, die Okonomie der Futterhefegewinnung durch Veranderungen in der Zusammen- setzung der Nahrlosung moglichst giinstig zu gestalten.

I m allgemeinen enthalten die in unseren Futterhefefabriken gewonnenen Hefcn in der Trockensubstanz 2-4% PzO,. Aus der Literatur ist bekannt, claR Wuchshefen durch entsprechende Verminderung des Phosphatangebots in der Nahrlosung auch weniger als 2% PzO, enthalten konnen. FINK (1942) gelang iiber mehrere Generationen die Kultivierung einer Candida utilis, die nur 1,5-2% P,O,/HTS (= Hefetrockensubstanz) enthielt. Die Ausbeuten an HTS und der Rohproteingehalt lagen bei dieser phosphorsparenden Hefe- gewinnung in normaler Hohe. RIECHE (1954) fand in halbtechnischen Dauer- versuchen, daB durch einc entsprechende Phosphatclosierung in der Xahrlbsung die geerntete Hefe mindestens 1,7 yo P,O,/HTS enthalten muB, wenn normale Ausbeutcn und Rohproteingehalte erreicht werden sollen.

DaB bei Verminderung des Stickstoffangebots in der Nahrlosung der Roh- protcingehalt in Mikroorganismen abnimmt, wurde u. a. durch AURICH (1966) und KLEBER u. AURICH (1968) beobachtet. uber die Zusammenhange zwischen Hefcausbeuten und Rohproteingehalt findet nian in der Literatur jedoch ein- ander widersprechende Angaben. FINK u. KREBS (1939) sind im Gegensatz zu SPERBER (1946) der Ansicht, daR die zu errcichende Hefeausbeute vom Roh- proteinpehalt der Hefe abhangt. J e hoher der Rohproteingehalt in der Hefe ist,, desto niedriger sol1 die Hefeausbeute sein.

Zur Klarung der erwahnten unterschiedlichen Beobachtungen und Auffas- sungen und im Hinblick auf eine Optimierung des Verhefungsprozesses haben wir unter kontinuierlichen Versuchsbedingungen bei Candida utilis den EinfluR der Phosphat- und Stickstoffdosierung auf die erreichbare Hefeausbeute und den Rohproteingehalt untersucht. Als C-Quellen setzten wir Buchenholzsulfit,- ablauge, Zuckerriibenmelasse und Zuckerrohrrohzucker ein, da wir annehmen

1) Herrn Prof. Dr. G. HILGETAG zum 60. Geburtstag gewidmct. 37 Zcitscllrift f . Allg. Mikrobiologie, Bd. 9, Il. 7

532 31. LOREX?,

mufiten. tla13 die T'ersuchsrrpebnisse aucli durch unterschiedlich zusammen- pesetztt. ('-Quellen beeinflufit werden. In unsere Untersuchunpen haben wir weiterhin die Abhangigkeit der P- und S-T-erteilung in der Zelle von der Phos- phat- untl Stickstofftlosi~runp einhezogen.

X u t erin 1 ti l i d N e t h od e'n \~ersiiclisapparatiir: Die Versiiche n-urden iinter kontinuierlichen Redingungen in der

ron HILGETAG e t rrl. (1958, s. a. RIEL'HI.: et nl. 1962) bescliriebenen Apparatrir niit Caridida utilis durchgefulirt.

Salirlijsiingen: -41s S-Qnelle wurde (SH,),SO, bei Zuckerr~bennielasse, Zuckerrohrroh- zucker adrr Ainmoniak bei Rnchenholzsiilfitablaiige iind als P-Quelle H,PO, in Mengen eingesetzt, die von den1 jcn-eiligen \~ersuclisablanf abhangig waren.

a ) Zuckerriibeiimelasse: Die Sahrlijsitrig entliielt 30 g (= 59 g Blelasse) RS (= Redn- zierende Suhstanz) iind 0.4 g 31gS0, . 7 H 2 0 pro Liter Leitungswasser. Durch eino ent- sprecliencl konzentrierte Kalilauge. die dein Versurhssystem getrennt r o n der iibcigen SAhrlBsting znlief. n-urde der pH-\Vert wdlirend der Verhefung bei 4.0 -4.5 gehalten. Vern-eilzeit : 4 Std.

b) Zii~kerrohrroliz~icker: Pro Liter Leitmigsn-asser wirden 20.5 g Roliziicker (: 20 g RS) rind 0 . 2 g JIgSO, . 7 H,O ringesetzt. L)ivcli Zugabe voii Kxlilaugc crfolgte die Ver- liefung bci p€I 4.0-4.5. \-erwcilzeit: 5 Sttl.

c ) Biicl~enliolzsi~lfitablaiigr: ~uclieiiliolzsiilfitablaii~e n-urde ziinaichst 2 Std. bei 90 'C an SO, vernrmt tirid in1 1,arife dcr zweiten Beliiftungsstunde mit Kalkmileh auf pB 4.0 einpestellt. Dir SLhrliisiing entliielt 0.37 1 Bnclie~iholzsulfitablauge (= 20 g RS). 9,44 g K,SO, iiiitl 11.2 g JIgXO, . 7 H 2 0 pro 1,itt.r Leitiingsn.asser. Verliefnngs-pH 4.5-4.8; Ver- ~vcilzeit : 3 Std.

.lnalytik: Die Brstinimnnp 17011 KS. Stickstoff nnd der Hefrkonzentration (als HTS iingegebeii) i u i Siibstrat bzw. i m Ablanf erfoipte nach den r o i l BVTSCHEI< (1962) angege- henen Vorschriftcn.

Her I~ohproteiiigelialt cler Hefe n-urtlc dnrch Erniittliiiig des ~~esaii~t~tirkstoffgelialtes nadi der K ~ J E L I ) . ~ H L - J ( c t l l o d r und .\lultIplikation mit den1 Faktor 6.25 bestininit.

Die Restiinmung des loslichen Ytickatoffs uiid des ReineiweiWrs erfolgte in Xnlelinnng an clen von HOLDES (1950) beschriebenen Trmniinpsgang.

Die P-Fraktionitirung cler Hefe (KSS-. DSS-. lijslicher uiid Lipidphosphor) erfolgtc nach drr Vorschrift r o n HOLUES (1930). die Hestimniiing des 1'-Gehaltes tlcr rinzelncri Fraktionen nach der bekannten JIethode yon FISKE 1 1 . SI-BBARRO\V (1925).

IXe C:rsaint-~ohlei i l iy~~rate cler Hefe wiirrlei~ riiicli der -4iitIiron-JIetIiodc ( E ' A I . ~ 1951) unti die (:csarnt-I,ipicie n n c h einer JI~tliaiiol-Atlicr- Estlaktion (REICHERT iY44) erfafit.

Retain wiirde niit eirier gcsiittigteri A ~ i i ~ i ~ o n i i i r n r c i i i e c k ~ t - L ~ s ~ i ~ ~ ~ bei pH 1 in der Kalte (5') gefiillt. Der Siederschlag xvurde abfiltriert. in Areton-IVasser ( 7 : 3 ) gelijst nnd zii tfieser LOsiing vine Silbcr1iitr.nt-Satriiiiniiitrat-18siii1g (16.99 g AgKO, -T Y,O5 g NaLUO, in 1 1 aqua drst.) gegcben. Der eritstnnclcne Siedersctilap wiirde abgetrennt iind das Filtrat init Methylrot mit c).O:! S SriOH his zii in Farbiunsclilap titriert. Xus cler verhraiichten SaOH-Jlcnpc. konnte clcr Rctniii-(~rhnlt drr Probe berrclinet werden (s. a. AFRICH et al. lY(i.5).

E t gpbu issc?

in tler Salirlosunp 1 I<ulti\ icrung von ('tc,rt//rln t c t i l i \ be1 rariiertein Pliosphorangehot

Mit Zuckerrubenmelashe als ('-Quellc beobacliteten wir eiiie fast lineare -\bhangiyke~t der Hcfeausbeute J oin P-(:ehalt cler Sahrlosunp (Tab . 1). ltedu- zieiung t l e b P-Gthilteh in der Sahrlosung bewirkte eine Abnalime der Hefe- ansbeute untl ties P,O,-Gehaltes in dei Hefe Auch bei einein sehr gcringen P-A-lnpebot in tler Sahrlowng fie1 der P,O,-Gehalt in der Hefe nirht unter l ,S%

Beeinflussung der kontinuierlichen Kultur von C. utilis 533

ab. Andererseits war es uns trotz einer P-aberdosierung nicht moglich, mehr als 4% P,O, in der Hefe anzureichern, was im Gegensatz zu Angaben von FIX (1942) steht. ErwartungsgemaiS (s. z. B. BERNHAUER 1950) hatte bei Vermin- derung des P-Angebots in der Niihrlosung auch der Rohproteingehalt in der Hefe abnehmen mussen. Bis zu einem P20,-Gehalt von 0,460 g/l betrug jedoch der Rohproteingehalt unverkndert 54%; erst bei einem Gehalt unter 0,460 g/l nahm der Rohproteingehalt ab und erreichte, unabhangig vom weiteren Riick- gang des P-Gehaltes in der Hefe, Werte von ca. 49%.

Tabelle 1 Kultivierung von C. utilis bei variiertem Phosphatangebot

in der Nahrlosung

0,646 0,382 0,302 0,246 0,189 0,155 0,115

0,976 0,745 0,573 0,460 0,373 0,287 0,229 0,172 0,115

0,288 914 51,2 0,070 9>1 52,6 0 990 52,5 0 , 8,9 52,s 0 8 3 47,4 0 8 3 47,2 0 6 8 46,2

Ablauf & P,O,

0,304 0,202 0,040 0

17,3 17,1 16.6 16.1

0 12,2 0 10,s 0 I 7,3

Rohprotein %/HTS

53,9 65,5 53,3 5 3 3 48,7 49,O 49,O 48,2 49,O

Substrat: ZucL,rriibenmelasse ; RS in Nahrlosung : 396

0,770 0,630 0,310 0,199 0,138

0,382 0,272 0 0 0

10,4 10,7 10,2 10,o 9 2

46,8 48,5 48,6 45,l 34,6

3,s 3,4 3.1 2.8 2,2 "1 1,s

3.4 3,3 2.7 1.8 1.5

Substrat: Buchenholzsulfitablauge; RS in Nahrlosung: 2",

Die Versuche mit Zuckerrohrrohzucker (Tab. 1) zeigten zwar ebenfalls eine Abhangigkeit zwischen dem P-Angebot und der erreichbaren Hefeausbeute. Diese Abhangigkeit war jedoch nicht so ausgepragt, wie bei Verwendung von Rubenmelasse ; sie war es noeh weniger, wenn als C-Quelle Sulfitablauge (Tab. 1) eingesetzt wurde. Die Beziehungen zwischen dem P-Gehalt der Nahrlosung und dem Rohproteingehalt der Hefe waren bei Rohzucker und Sulfitablauge die gleichen wie bei Rubenmelasse.

Vor einiger Zeit hatten NORDHEIM u. RIECHE (1966) uber diskontinuierliche Versuche zur Gewinnung phosphatreicher Hefe berichtet. Bei Kultivierung J7*

534 31. LOREX

phosphatarmer Zellen (O?S-Ot4Ss.b P205) in einem phosphathaltigen Substrat trat rasche Phosphatregenerierng der Zellen. verbunden mit einer Phosphat- iiberkompensat.ion ein : es konnten Hefezellen mit einem Gehalt von bis zu 140;b P,O, geernt.et w-erden. Wir haben rersucht, ob die Gewinnung einer phosphatreichen Hefe auch , unter kontinuierlichen Wschstumsbedingungen moglich ist.

-41s C-Quelle fur diese Versuche wrwendeten wir Zuckerriibenmelaese; die Versuchs- durchftihrung erfolgtc nach einem zaeistufigen Verfahren. In der ersten Verhefungs- apparatnr wurden die Hefezellen bei einer T’erwveilzeit von 4 St.d. auf einem P-Mangel- medium phosphatarm vorkultiviert. Die hier gewvachsenen ,.phosphatarmen” Hefezellen cnthielten 2yo P,O,/TS. Wir hatten eine solche Hefe ausgewiihlt, weil wir ails den voran- gegangenen Versuchen (s. Tab. 1) rulten, dal Hefezellen mit diesem P,O,-Gehalt noch befriedigende Ausbeuten crgaben. was fiir uns deshalb wichtig war, weil wir in der Zeit- cinheit eine niogliehst. grole Hefemenge niit Phosphat anreichern aollton. Aus der ersten Versuchsapparatur gelangte die Hefesuspension zusammen rnit einem phosphathaltigen Substrat kontinnierlich in eine zweite Apparatur, wo dann nach einer Verweilzeit von 9 Std. die endgiiltige Ernte der Hefezellen erfolgte.

Tabelle 2 Kontinuierliche (:en-innung phosphatreicher Zellen von C. utilis

Wir bepwnnen insere T’ersuche (Tab. 2) init einem Regenerierungssubstrat, das a u k Phosphor noch geringc Mengen Mclasse enthielt ; die geerntete Hefe enthielt i,8”.; P20,. Entsprechend clem RS-Gehalt, des Regenerierungssubstrats hatte die Hefekonzentration in cler 2. Apparatur v-on urspriinglich 15,3 g/l auf 20:2 g/1 zugenommen. Enthielt clas Regenerierungsmedium keine Melasse mehr, d a m konnte in den Hefezellen der P205-Gehalt bis auf ca. 9% angehoben werden. Trotz Fehlens einer zusatzlichen C-Quelle erfolgte auch hier eine gering- fiipige Erhohunp der Hefekonzentration von 14?9 auf 15,Q g/1.

In der Tabelle 3 sind die Beziehungen z\vischen dem P-Gehalt der Zellen und der Verteilung des Phosphors innerhalb der Zelle dargestellt. Zunlichst konnte festgestellt, werclen, daB der in Cregcnwart eines Phosphatiiberschuases in der Xiihrliisung erreichbare masimalc Gesanit-P-Gehalt in den Zellen vom einge- setzten Subst.rat abhlingig war. Den hochsten Gesamt-Y-Gehalt hatten Zellen aus Zuckerriibeniiielasse, den niedrigsten solche aus Ruchenholzsulfitablauge. Xelbn mit niedrigerem Gesamt-P-Gehalt wiesen auch in den einzelnen Frak- tionen einen geringeren P-Gehalt auf. Rezogen auf den Gesamt-P-Gehalt nahm bei allen Substraten der saurcliisliche Phosphor nicht oder nur geringfiigig ab, wenn der Gesamt-P-Gehalt niedriger war. RSS-P war dann nur wenig erhiiht, DXS-P wenig erniedrigt. Der prozentualen Zunahme des Lipid-P am Gesamt-P stand mit Ausnahme der Zellen RUS Buchenholzsulfitablauge auch eine Erhii- hung dex Lipidgehaltes der Zellen gegeniiber. In allen Versuchsreihen nahm mit fallendem Gesamt-P-Gehalt auch der Iiohlenhydratgehalt in der Trocken- substanz ab.

1,75

0.

76

1,66

0,

78

1,49

0.

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9,7

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I 9,C

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7,6

536 31. LOREXZ

2 . Kultirierung von Caizdidu u t i Z L 5 bei variiertem Stickstoffangebot in der Sahrlosung

Bei Verwendung on Rohzucker beobachteten wir eine Abnahme des Roh- protcingehaltes in den Hefezellen. wenn das S-Bngebot in der Xahrlosung recluziert wurdc (Tab. 1). .4uch bei sehr nieclrigcn S-Konzentrationen sank der Rohproteingehalt niclit unter cci. 36", ab. Von einer bestinimten N-Konzen-

Tabelle 4

bei vari~erteni Stickstoffanpbot 111 tier S~ th r lo<ung

I<ultl\ lelung \-on c. u t i l l a

1.3K ) 1.18ll 1 .O.iC 1 0.910 0,743 0 638 0.Xi 0.434 0.3i4 0,'380 0.2 10

9.2 8.4 8.3 7 . 1 3.6

H ohprotein O,,/THS

53.ti 48.7 40,3 35.6 37.5

10.9 13.9 14.8 11,4 14.7 14.*5 14.0 12.7 11,i 11,l 10,4

54.4 X3,l 5'3.7 51.0 47.1 44.9 40,o 45,6 46.5 41.9 41.6

Substrat : %iic,zrriiberri~relasse: RS in SKlirlijsung: 3,lo; 1 9,9 45.7 403 0.840 Cl.700 0 . X i

0,134 9.1 34.6 0.350 6.5 28,Y

Substrat : Bnche~iholzs~ilfita),lauge; RS iiiSahrl6sung : 9 0 - 0

tration a n pingcn aucli (lie Alusbenteii a n HI'S zuriick. Der Qehalt des hef'e- freien E'iltrats ( 7 ;\blauf) an orpanischeni Stickstoff blieb wahrend der gesam- ten lTersnchsscric rclativ konstant. Ilas tleutct tlarauf hin; daf.3 die Hefezellen anch linter S-l\laiipelbedingunprn nicht nwiaehrt organischen Stickshoff' aus- scheiden .

IVir haben weiterhin rersucht . rohproteinarine Hefezellen in Gepenwart eines zu rcgcneiieren.

Zii diescni Z n - c ~ k wnrclcn Zelleii mit eineni Rohproteingelialt yon 36 - 37:; in Gegen- \Tart r o n (SH,),HPO,i unter rliskontinriierlicl~en Bedingungen bis zu dem Zeitpunkt

Beeinflussung der kontiniiierlichen Kultur von C. utilis 537

(2-21/, Std. nach Versuchsbeginn) kultiviert,, wo keine N-Aufnahme nielir festgestcllt, nerden konnte, anschlieDend geerntet und auf ihren Rohproteingehalt untersucht.

Wir fanden, daR die Regeneration rohproteinarmer Hefezellen nwar sehr schnell erfolgt. Eine EiweiBiiberkompensation, ahnlich der einer Phosphat,- iiberkompensierung phosphatarmer Hefezellen in Gegenwart eines Phosphat,- iiberschusscs, gelang uns unter den genannten Versuehsbedingungen jedoch nicht : die geerntete Hefe enthielt 52% Rohprotein.

Abweichend vom Rohzucker zeigten sich bei der Sulfitablauge (Tab. 4) nur ncringe Beziehungen zwischen der K-Konzentration der Nahrlosung und der erreichbaren Hefeausbeute. Wesentlich deutlicher erkennbar war da.gegen die Beeinflussung des Rohproteingehaltes vom N-Angebot im Substrat'. Mit ca. 29:; wurde auBerdem ein recht niedriger Rohproteinwert erhalten ; das FlicU1gleich- gewicht, im Versuchssystem brach dennoch nicht zusanimen.

Durch die Verwendung von Zuckerrubenmelasse als C-Quelle sollte u. a . auch die Frage untersucht werden, ob es bei Verminderung des anorga,nischen Stick- st offs in der Nahrlosung zu einer verstarkten Verwertung des organischen Stick- stoffs der Melasse kommt.

Resonders interessierte uns, ob dann auch das Betain assimiliert, wird, das belianntlich in erheblichen Mengen in der Zuckerrubenmelasse vorkommb uncl von dem man bisher annahm (BERGANDER 1959, BUTSCHEK 1957, KRETZSCHMAK. 1955), tlaB es von Candida utilis nicht als N-Quelle verwertet wird.

Tabelle 5 St.ickstoffassimilation von C. utilis bei der Kultivierung auf Zuckerriibenmelasse

0,210 ,

Anorgan. X g/l

0,735

1,300 1,180 1.050 0,910 0,743 0,658 0,546 0,434 0,364 0.280

Zulauf

Organ. E g/l

0 35

Retain-N SIl

0 28

0,228

Anorgan. N g/l

0,062 0,029 0,025 0 0

0 0 0 0 0

Ablauf

Organ. K g/l

0,561 0,535 0,464 0,462 0,394 0,393 0,397 0,262 0,249 0,252 0,240

Betain-n' g/l

0,228 - -

0,182

0,137 0,137 0,045 0.024

-

- -

Substrat : Znckerrubenmelasse; RS in Nahrlosung : 3,196

Die Reziehungen zwischen dem N-Angebot in der Nahrlosung und der Hefe- ausbeute waren bei den Melasseversuchen (Tab. 4) Bhnlich wie bei der Versuchs- serie mit Rohzucker. uberraschend war, daB die Hefezellen auch noch bei einer X-Konzentration von nur 0,210 g/l wuchsen. Die Ausbeute betrug dann zwar nur noch 10,4 g HTS/1, das FlieBgleichgewicht des Verhefungsprozesses brach jedoch nicht zusammen.

Tm Gegensatz zu den Versuchen mit Rohzucker und Sulfitablauge war bei den Melasseversuchen der EinfluB der N-Konzentration auf den Rohprotein- gehalt der Hefe nicht signifikant. Zwar nahm der Rohproteingehalt, bei Ver- minderung des anorganischen Stickstoffs ebenfalls ab, doch erfolgte diese Ab-

538 31. LORESZ

nahme nicht wie bei den anderen Substraten parallel zur Abnahnie der S-Kon- zent.ration in der Siihrlosung. Die Vrsarhe fiir dieses unterschiedliche Verhalten ist, darin zu suchen, daB die Hefezellen bei der Iiultivierung auf Zuckerruben- Inelasse iiicht, nur den anorganisclien Stickstoff der Salirlosung verbrauchen (Tab. 5 ) (s. auch MARTISI ct c l l . 1968). Rereits bei S-t'berschuB (1 .3 g/l) assi- milierten die Hefezellen einen Tcil des orpanischen Stickstoffs cler Melassr (wahrscheinlich Glutaminsaure) : Retain wird jedocli noch nicht angcgriffen.

Erst nacli weiterer Reduzierung des anorganisehen Stickstoffs setzt die Ver- nertnnp tlcs Betain-S ein ; sie niiiinit bei fortlaufender Verrniiidrrung des (SH,),SO,-S in cler Salirlosung zii. Bei eineni Gehalt von nur noch 0,280 g/l anorpankchen Stickstoff's ist aller \-ern-ertbarer Stickstoff der Melnsse ron den Zelleii assimiliert : Retain wird clann im hefefreien Ablauf nicht, mehr pefunden.

Die Tatsaclie. daM die Hefezelle bei tler I<ulti\-ieriing auf Zuckerrftlbenmelasse iliren S-Bedarf ullter S- iipelbedinpiingeii verstbrkt aus den organischen S-Quellen tier AIclasse: tlaruntrr clein 15etain: deckt. veranlaBte uns zu unt>er- suchcn. ob Betain von C'ccutlirlcr ir t i l iv a u c h als wlleinipe S-Quelle verwcrtet wird.

S-frcie C-Quelle Zncl ierrohrrohz~icl~~~r : in1 T'er- 0,-S sukzessiw durch Retain-S (in Form voii .ker crlatibte 1111s. die ctwns aufn-endigen Betain-

Fiir tlicse Vcrsuche vern.eiitleten wir Iaufe tlcs \.ersnchs ersctzteu wir (SH, Betaiii-H('I). Die Ver~vczitliinp v011 Roll brstiiiirnuiigcii Z I I iiiiigelien u i i t l t lei i 13ctaingelialt der Siihrlosiing hzw. des Bcstiiiiiniirip dcs . .K.JELI)AIIL-S" Z I I erinittelii (in Tab. 6 als ..orgaiiisclier Sti yctvicseri). (klegentliclic Bctiiiiihestiiiiiii~itiFeii (in Tab. 6 jeweils in Klammern niifgefiilirt) zcigtcii jetloch eine gute ~-berciiistiiiiniiiiiF zn-ischen ..ICJELDAHL-S"- und analytiscii erinittelten Betaiii-S-\Verteii. Die Vcrsuclie n-iirden hei einer Tern-eilzeit roil 4 Std. tlurchgef iilirt.

Tabelle G Knltivierunp \-on C'. u f i f i s aiif %uckerroh~rohzucker in Gegenwart. von Bet,ain

0.784 0.610

0.41 0

( J.2 1 0

0 0*)

0.208 0.148

(0.153) 0.207

(0220) 0.334

(0.345) 0.434 0.318

9.6 30.9 9.1 48,3

9.0 41,G

8.0 a,," 3.8 -

7.6 4 2 3

Substrat : Zuckerrolirrol~zocker; RS in Si(1lrliisiilig: ?*o

*) mit Hefeestrakt.

In Gepenua-t eiiies S- cberschusses (Tab. 6) (0,784 g/l anorganisclier St,ick- stoff) erhielten wir (lie iiblichen Hcfeausbcuten und Rohproteinwertc (s. auch Tab. 5 ) . Betain-S wird noch niclit, assimiliert; es wird sogar organischer Stick- stoff von den Zellen ins Jlediuin auspeschicden. Bei Verminderung ctes anorga- nischen Stickstoffs untl pleichzcitiper Erholiuiig ties Bctain-S konnt'e eine sicli rerstbrkentle Ausnutzung cles Betain-S festpevtellt werden. Gleichzeitig nah- iiicn die Hefeausbeuten ab , und cler Roliproteingehalt erreichte Werte von

Beeinflussung der kontinuierlichen Kultur von C. utilis 539

ca. 42%. Bei einer Betain-N-Konzentration von 0,630 g/l muBte die Verweil- zeit auf 7 Std. erhoht werden, wenn die in der Nahrlosung angebotene RS ron den Hcfezellen vollstandig assimiliert werden sollte. Die Hefezellen bildeten auBerdem wahrend dieses Versuchsabschnitts ein Pseudomycel. Wurde cler gcsamte Stickstoff in die Nahrlosung als Betain-HC1 eingebracht, dann erhohte hirh der Anteil an nicht assimilierter RS im hefefreien Ablauf, und die Hefc- ausbeute nahm entsprechend ab, sclbst wenn die Verweilzeit auf 9 Std. crhoht wurde. Das FlieBgleichgewicht des Verhefungsprozesses drohte zusammenzu- brechen. Eine Stabilisierung des Prozesses gelang durch Zugabe von 1 g/l Hefe- extrakt (DIFCO) zum Substrat. Jetzt wurde die Substrat-RS auch dann wicder fast vollstandig assimiliert, wenn die Verweilzeit auf 6 Std. herabgesetzt wurde. Die Hefeausbeute stieg wieder an, der Betain-N wurde jedoch auch jetzt niclit vollstandig assimiliert ; im hefefreien Ablauf verblicben ca. 40 yo seiner ein- gcsetzten Menge.

Tabelle 7 Z usammensetzung der N-Fraktion in Abhangigkeit T om Roliproteingehalt der Hefezellen

~ _ _ -~ ~ ~~

I ~ I- ~

-~ ~~ ~~~~

8.50 ' 6,12 1,64 ' 72,O ' 19,3 I 735 29,3 6,40 1 4 80 1 1,07 1 75,O 16,9 , 10,5 ! 25,9

Zuckerritbenrnelasse ~- ~~ ~ ~~ ~ ~~ .~ -~ ~

8,25 1 G,60 1,48 80,O 5,s 34,s 6,15 , 5,15 j o,83 ' 84,O 13,5 17" I 8,2 1 24,d

Zuckerrohrzucker -_

1,05 , 7 5 3 4 3 25,7 4,63 3,58 0,48 1 77,8 j j 7,O ~ 15,6

Buchenholzsulfitablauge 7380 I 537

In der Tabelle 7 sind die Beziehungen zwischen dem N-Gehalt der Zellen und der Verteilung des Sticlistoffs auf die Fraktionen des Reinproteins und des loslichen Stickstoffs dargestellt. dhnlich wie bei den Versuchen mit unterschieci- lichen Phosphatkonzentrationen (s. Tab. 3) konnte auch hier festgestellt werdcn, dal3 deu in Gegenwart eines Stickstoffuberschusses in der Nahrlosung erreich- bare maximale Rohprotein-N (= Gesamt-N) in den Zellen vom eingesetzten Substrat abhangig war. Den hochsten Gesamt-N-Gehalt hatten die Zellen aus Zuckerrubenmelasse, den niedrigsten die aus Buchenholzsulfitablauge. Kezogen auf den Rohprotein-K nahm der prozentuale Gehalt des Stickstoffs in der Reinprotein-Fraktion bei Zellen mit geringerem Rohprotein-N zu. Der Gehalt an loslichem Stickstoff nahm dann ab. Der Anteil beider Fraktionen a m Gesamt-N war ebenfalls vom eingesetzten Substrat abhangig. Bei den Zellen aus Zuckerrohrrohzucker wurden durch Reinprotein und loslichen Stickstoff ca. 97% des Gesamt-N erfaBt, bei denen aus Zuckerriibenmelasse ca. 91 yo und bei Zellen aus Buchenholzsulfitablauge ca. 88%. Hinsichtlich des Lipidgehaltes wurdc eine Zunahme beobachtet. wenn der Gesamt-N-Gehalt abnahm. I)er

540 31. IARESZ

I~olilenhyclratpelialt der Bellen nahm tlann jedoch deutlich ah. Zellen ans Buclienliolxsulfita,laupr hatten ,sonoh1 clen nicdripsten Lipid- als auch Kohlen- hytlratgehalt .

I l i s k its.siou

Unscre Versuche iiber den I<influll t l c ~ Pliospliatdosierunp auf die Ausbeut>c uric1 clen Roli~)rotei~ipeliaIt habc,n cintleutip die Substrat,abha,ripipkeit solcher Untersucliunpen aufgezeipt .

Die ~ 0 1 1 RIECHE (1954) (s . a . FISK 1942) yeniaclite Beobacht,ung, daB Hefe- zellen init nur 1 . i 0 , l',O,/HTS bei I*rr\vendunp von Uuclicnholzsulfitabl~ug'e nocli norniale ;\usbcuten erpeben. koiintc \-on uns an diesern Substrat, best,iitig't n.wt1t.n. Die Versuchc mit Buc1;err t~l i~~i~oIizi ic~t~r untl noch deutjlicher rnit %iickerriibcnmelasse erpaben tlapepc~n eint, =\bliiinpipkeit~ der Ausbcut,c vorii J-',O,-C~chalt der Zellen. .Rei beitlcn Snbstrattn I\-arcn die Busbeliten urn so y.ring.cr. ,je nicdrigrr der P,O,-GehaIt in den Zrlleii wir: was in Vbereinst.im ~

iiiiing niit A4iipaI)en von ~ I A R K H A I I r.t ul . (1066) stelit. Hr i allen \-on uns antersuelitcn Sul)strntcn ~vurt lc die Hohe des Rohprot'ein-

g(4i;tltt.s in tlrn Zcllcn w i n P,O,-Ckhalt tier Sdirlosung nur peringfiigig beein- f'lnIlt. Das stelit i i n Gegensatz zn ;\npabcm \-on JI.L%S-FORSTER (1955). in denen von cincm Kiic.kg;iny tles Roliprotrin~!.c~lialten unter P-J lan~elbedinpun~en bc- rich t e t n - i d .

Ijcr Lipitlgclialt in tlen Zellen sticp an. ii.etin als Polge einer erniedrigt'eii P,U,-IConzriitt,ation in c l e i . Sdirliisuiip tler I',O,-C:ehalt~/HTS abnahm. Dies? ~Keohchturig \vurdc bereits von antleren Autoreti geniacht (u . a . SCHULZE 1951. BEESHAT-ER 1950. ~IA.~S-FORSTEK 1955. SIEI,SES 11. S i m s E N 1953) und fand ilirc praktische L-\ni\-entlun~~ bei tlrr tcclinischcn Gewirinunp fettreicher Hefeii ( DRP 7 5 2 271). ~ ~ u c l i der Iipiclgchalt zeiptc eine 8uhst'ratabli~ngiXkeit, : der 1,ipidpehalt von Zellen n u s Buclienliol ,ulfitablaiige wurde z. R . tlurch die Holie tles I'20,-CkliaItr~s tlrr Zcllcn niclit bc

Parallel ziim hnstieg tles 1,ipitlpelialtes nahiii aurli tler Lipid-P/Gesamt,-P zu. Der prozrntuale -1nteil tler einzelnen 1'-Fraktionen am C*esamtj-P-Gehalt, zeigt'e jetloch lwine allzu grol;lcn Schn.anl\-uiiyc~n. bas cleutet. dnrauf hin. daB unt,er P-?tIanpclttetliii~Lin~cri bcstininite Stoffr-ec.1iselprozesse in der Hefezellr nicht be\-orzupt ablaufcn untl andere clafiir iinterdriiclit werden.

I k r niaxiinal crreichbare P,O,-CkIiait i n tlen Zellen war ebenfalls vom ein- pesetztcn Substrat ahhiinpip. Den liiiclisten P,O,-Gehalt~ fanden wir in den Zc~llen aus Znclrerriibenmelasse. \7erniutlicli spiclt (lie gut'e Wuchsst'offversor- gunp tler Zellen bei dieseni Substrat eine Rolle. Die niedri@en P,O,-Wcrte erliielten wir niit Zellen a u s Buclicnliolzsult'itablaupe. IIierbei mag nicht so sehr pin JIanpel a n Krichsstoffen in t l i t w n i Substrat r o n Bedeut,ung sein - Zurker- rolirrohzuckcr entlialt ebenfalls n-enigcr \Vnchsstoffe als Riibenmelasse. untl tloc.11 nurtlrn hier l iol ie i~ P,O,-Werte als init Sulfitablaupe erhalten - sondern v j~ ln i eh r d ~ r (&,halt tler Ynlfitablaupe a n Heinnistoffen.

T I N Gepensatz zii FTXK ( 1942) pelanp es tins trotz tles Phosphatiiberschusses in den Substraten nicht. Zellen init niclir als 4 P,O,/HTS zu kultiuieren. Dies tt.ar nur miiplich. wenn wir pl~ospliatarn~ \-orkultivierte Zellen in Gcgen- wart \-on reichlich Pliospliat \r-eitcrkultiric.rtt,Ii. Die Tatsache, dnB wir dabei Zellen niit nur c ( i . 9: ;) P,O, erhielten. steht nic-lit iiii Gegensat,z zu den Beobach- tunpcn von SORDHEIJZ u. RIECHE (1966). die Zellen niit bis zit ca. 14% P,O,/HTS

Beeinflussung der kontinuierlichen Kult.ur von C. utilis 54 1

isolieren konnten. Beide fanden namlich, daR das AusmaR der P-fiberkompen- sation vom Ausgangs-P-Gehalt der Zellen abhangt.

Auch unsere Versuche uber den EinfluB der Stickstoffdosicrung auf die Aus- beut>e und den Rohproteingehalt zeigten im Ergebnis eine Subst,ratabhangig- Iceit. Mit' Ausnahme der Versuche mit Buchenholzsulfitablauge nahmen bei Retluzierung des N-Angebots in der Nahrlosung die Ausbeuten ab. Der Aus- beuterhckgang war geringer als bei den Versuchen mit P-Reduzierung.

\Vie nicht anders zu erwarten, nahm bei fallender K-Konzentration der Roh- proteingehalt in den Zellen ab. Der niedrigste in den Zellen erreichbare Roh- proteingehalt war wiederum von der eingesetzten C-Quelle abhangig.

Wiihrend bei Sulfitablauge und Rohzucker die Abnahme des Rohproteins beinahe parallel zur Verringerung der N-Konzentmtion in der Xahrlosung crfolgt,e, war dies bei den Versuchen mit Melasse nicht. der Fall. Hinsichtlich cler Verwertung der verschiedenen N-Quellen im Melassesubstrat, (anorganischer Stickstoff, Aminosauren, Betain) wurde ein Diauxie-Effekt bcobachtet,, der sich rlann in den Schwankungen des Rohproteingehaltes wahrend clieser Versuchs- serie manifestierte. Bctain wurdc dabei von den Zellen erst dann assimiliert, nac:htlem die Aminosauren vermutlich verbraucht, waren untl ein Mange1 an nnorganischem Stickstoff vorlag. Eine ahnliche Beobachtung wurde von AURICH et ul . (1965) gemacht. Sie fanden, daB Pseudomonas-Arten zwarBet,ain assimilieren : in Gegenwart anderer N-Quellen geschieht dies jedoch wesentlich langsamer.

Als allcinige N-Quelle wurde Betain nur bei Anwesenheit, von Hefeextrakt assimiliert, : in seiner Abwesenheit war der VerhefungsprozeM dagegen empfind- lich gcst,ort. Der verwendete Hefeextrakt enthielt hauptsachlich Aminosauren und die Vitamine des B-Komplexes. Es kann angenommen werden, daR die Sormalisierung der Zellsubstanzsynthese durch die B- Vitarnine des Extraktes erreicht wurde, eine Vermutung, die jedoch nicht, bewiesen werden konnte. Auf licincn Fall wurden die Zellen jedoch dureh den Hefeextrakt an Betain atlaptiert. Weglassen des Extraktes fiihrte trotz Erhohung der Verweilzeit' wiederum zu einem Anstieg an RS im hefefreien Ablauf und zu einer Ausbeut>e- mi riderung.

Uiiter N-Mangelbedingungen stieg der Lipicigehalt der Zellen starker als ui i ter P-Mangelbedingungen an, ein Beweis dafur, daB die N-arme Kultivierunp elier. zu einer Verfettung der Zellen fuhrt.

Bei unseren Untersuchungen uber die Abhangigkeit der Synt,heseleistung von von der Temperatur (LORENZ et al. 1967) fanden wir eine Zunahme des

Rcinprotcinanteils am Gesamt-X, wenn die Zellen rohproteinarm waren, und gleiclizeitig eine Abnahme des losliehen Stickstoffs. Die gleiche Beobachtung konnten wir bei unseren jetzigen Versuchen machen. Das deutet auf ein gene- relles Verhalten beider Fraktionen beim Ubergang von rohproteinreichen z u rohproteinarmen Zellen hin, unabhangig davon, welche exogenen Faktoren die Rohproteinabnahme verursacht haben. Unsere Ergebnisse lassen weiterhin ver- mutcn, daB auch bei N-Mange1 in der rohproteinarmerl Hefe der Enzymprotein- gehalt nicht. erniedrigt ist.

Unsere Ergebnisse haben auSerdem gezeigt, daB bei a'llen Substraten mit fallendern Rohproteingehalt in der Hefe auch die Hefeansbeut,en abnehmen. Eiii hoher Rohproteingehalt war dagcgen mit hohcn Ausbeuten gekoppelt . Unsere Ergebnisse stimmen daher mit den Beobacht'ungen SPERBER'S ( 1945) iiberein, sie stehen im Gegensatz zu den Aussagen von FIXK u. KREBS (1939).

542 31. LOREX

Wir konnten beobachten. d a B tlie S- ocler P-Jlangelbedingungen keine Erhohung der 1 on tins g e i d i l t e n T7erweilzeit notwendig machten. obwohl denk- bar ist. tlaW unter beidell Bediiipunprn das Wachstuin cler Zellen verlangsanit wird.

Zusn / t i l i l t ?qf~ltssullg

1. I n kotitinitierliclic.~l Versuclien wurde bei \~er \ r~endung yon Zuckerriibenmelasse, Zuckerrohrroliziicl~er untl B~iclietiliolzsiilfitahlallge wls Si ihst ra t der EinfluU der Phospiiat- iind St ickst offdosiern ng a rif die -4iisl)cLii te ii t ic1 den Rohproteingehalt , sowie die Verteilung des Pliospiiats und Stickstoffa inticrliath der Zellcn r o u C‘ndida utilis nnteraucht.

2. Nit ,\iisn;ihme der Siilfitnl~laupc~ iiahnien hei den arideren Suhstraten die Ausbeuteii an HTS niit fallenctein P-(khal t in tier Siihrlcisunp n l ) . Die Hiihe des I(o1i~~rotcitiRehnltes in den Zellen wtrde dann nur w n i g btvinfliillt.

Verniinderung dcr 1’-Dosiprung fiilirte ziir A4bnalinie des P-Gehaltes in den Zellen. Bezogcn auf ~:esatiit-P-(;clialt der Zclleii zeipten tlie einzehieii P- Fraktioiicn (siiureliisl,-, KSS-, DSS-. Lipid-P) Iwim \-ergleich P-reiclier niit 1’-arineti Zellcri niir geringfiigipe Schn-anku npen.

In cineni Zn-eistufeIi-~ct.falireti gelang die kontintiicrliclic Kiiltivierung pliosphatreiclier Hefen niit einetn P2O;-(+elia1t ro i t co. YC’*,.

3. 3Iit .+ustiahtnc tler \-t.rsuc.hc tnit Stilfitablaiipe fic~lcn die .Ausbeiiten bei Verminderurig tles S-Atigc~bots in der Siilirldsung al ) . lki Zelleti i i i is Sulfitablauge und Roliziicker wurtle der Rohpr~)teiiigeh;~lt cter Zellen parallel zur Emiedrigung der S- Konzentration in der Siihrlosunp kleiner. Hei J1cl;tsse konnte unter t i Bctlingungen wegen des Vorliepns verschietlener S - Q t d l t A 1 i ( i i i ior~~i i i iscl~c~- . A X n i i t rc’- iind Betain-K) hinsichtlich dcr S-A4ssiniilation pin Diausie-Hffekt I)eobac.litet en. Betain-S n-urde voii den Zelleti

imiliert. nachdeni die _Iniinos$~iror vcrbraiicht waren und ein Xangel a n ariorganischem Stickstoff i n tlcr . \ Ir l~i; ise-S~~lirl is~tt i~ vorlng. -*Is dlcinige K-Quelle wurde Betain niir in (;egen\v:irt eines Hefeestraktes niit befriedigenden Alusbeuten verwertet.

Bezogen auf den C~rsamt-S-(~elialt der Zellcn wtir bei rohproteinarmen Zcllcn die Frali- tiori des Reinproteins griilkr i i n t l die tles IIjsli(~livn Sliclrstoffs kleiner als hei rohprotein- rei ellen.

Unter S-JIangelbetliiigiiiIgen stiep tler 1,ipidgelialt dcr Zellrn starker als untcr P-Mangel- I)edingungrn an.

Frau GISELA \VEIZISYHEC,I< hat inicli bci tler tcchnischen UurclifiihrLing der Versuclie tntkriiftig iinterstiitzt. xvofiir iv l i ihr sehr claiiketi nib(-hte.

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