213

Ober den Mechanismus der Oxydations- vorgange. XXXII.

Die enzymatische Oxydation von Essigsaure durch Hefe;

von Heinrich Fieland und Robert Sonderhoff.

Mit 4 Figuren im Text.

IAus dem Chem. Laboratorium der Bayer. Akademie der Wissenschaften zu Munchen.]

(Eingelaufen am 29. September 1932.)

Hit einer Hefesuspension, die nach dem bereits be- schriebenen Verfahren ') durch etwa 20-stundiges Schiitteln unter Sauerstoff von ihren oxydierbaren Zellinhaltstoffen weitgehend befreit ist, ladt sich Essigsaure - als Natrium- salz in gepufferter Losung eingesetzt - in ziemlich rascher Reaktion zu Kohlendioxyd und Wasser verbrennen. Fuhr t man die Umsetzung nicht zu Ende, sondern unterbricht den Prozed zu einem Zeitpunkt, in dem noch ein gut Teil Acetat nicht angegriffen ist , so findet man auch weitaus den grodten Teil des in Reaktion getretenen Materials bis zu den Endprodukten oxydiert. Es lieden sich aber aus der Losung zwei interessante Oxydationsprodukte, namlich Bern- steinsaure und Citronensaure isolieren. An Bernsteinsaure erhalt man rund 5 Proc., an Citronensaure rund 10 Proc. vou der umgesetzten Essigsaure. Wir wolIen zuerst die Isolierung dieser beiden SLuren beschreiben.

Bernsteinsaure. Bierhefe vom Trockengewicht von rund 5 g - von der Lowenhrauerei Munchen freundlichst zur Verfugung gestellt - wurde in 1/2 Liter Wasser suspendiert und 16 Stunden lang unter Sauerstoff auf der Maschine geschuttelt. Die Eigenatmung der verarmten Hefe betrug jetzt fu r 100 mg Trockensubstanz 500 cmm 0, pro Stunde. Man fugte nun 13,6 g krystallisiertes Natriumacetat ('/lo 3101) zu der Suspension und schiittelte Linter Sauerstoff

l) A. 49'2, 183 (1932). Annalen der Chemie. 489. Band. 15

214 W i e l a n d und Xonderhof f ,

24 Stunden lang. Dann wurde mi t 2 n-Schwefelsaure kongo- sauer gemacht, von der Hefe abzentrifugiert, zweimal ge- waschen und die Losung im Olbad zuerst auf 30 ccm, nach Zusatz von 200 ccm Wasser erneut auf 20 ccm abgedampft. llz0 des Destillats verbrauchte 2,3 ccm "/,,-NaOH. Das entspricht 4,6 mMol Essigsaure. Demnach waren 95,4 mMol umgesetzt. Der Riickstand von der Destillation wurde, mi t wenig Wasser verdiinnt, im Extraktionsapparat 24 Stunden lang rnit Ather ausgezogen. Der i t h e r hinterliefi nach dem Verdampfen 323 mg vollkommen krystallisierter Bernstein- saure, die von wenig Schmieren durchsetzt war. Nach dem Umkrystallisieren aus Wasser, unter Zusatz von etwas Tier- kohle, lag der Schmelzpunkt bei 183-184°. Die Misch- probe rnit reiner Bernsteinsaure vom Schmelzp. 184O schmolz bei 183'.

Titratioit: 32,2 mg Subst.: 5,382 ccm "/,,-NaOH. Aquiv.-Gew. Ber. 59,O Gef. 59 , s .

Dieser Versuch ist mit geringen Bbanderungen mehr- fach wiederholt worden, auch mit frischer Hefe. Der Unter- schied in der Menge der gebildeten Bernsteinsaure ist, wie zu erwarten, nicht erheblich. Wir bringen die Ergebnisse in Tab. 1. Nr. 4 enthalt die Daten des beschriebenen Versuchs.

Dauer n Stdn.

_. __

__ __ 1 2 3 4 5 6* 7

Acetat (Mol x

~ _ _ _ _ _ _

Hefe in g (Trockenge w .)

Frisch ( :,5

_______

6 5

* Unter Vc

23,5 24 24 24 36

150 100 100 609 300

83 95 99

315 299,2

Die Hefestamme sind verschieden. Ein Vergleich von 4 und 5 sowie 6 und 7 zeigt, da13 bei praktisch vollstandigem Verbrauch des Acetats auch die Bernsteinsaure weiter um- gesetzt wird.

267 5,3 323 577 206 394 798 4 2 303 197

&er den Mechanismus der Oxydationsvorgange. XXXIX 215

Bringt man nur einen kleinen Teil der Essigsaure zum Umsatz, d. h. unterbricht man nach wenigen Stunden, so ist der Procentsatz an Bernsteinsaure auch kleiner. Diese Versuche wurden mit weniger Hefe in grol3en B a r c r o f t - W a r b u r gschen SchuttelgefaBen unter gleichzeitiger Be- stimmung der Sauerstoffaufnahme ausgefiihrt. Da die Gas- phase haufig ernenert werden muSte, sind die Zahlen f u r den Sauerstoffverbrauch nicht genau. Es ist stets verarmte Hefe angewandt.

T a b e l l e 2.

~~- __ Ra 6 1 1,2 3

3,5 :: : 1 ;:; 3 R a 6 1,55 5

39 6,8 14 3,4 794 70 14,7 45 5,l 14,4

573 30 5,3 - 25 12,2 26 3,5 14,2

-

216

der extrahierten wahigen Reaktionslasung gefunden. Um die Gegenwart wasserlijslicher Salze moglichst einzuschranken, wurde an Stelle von Natriumacetat das Bariumsalz der Essigsaure in der beschriebenen Weise dem aeroben Abbau durch Hefe unterworfen. Das Barium-ion hemmt zwar die Reaktion, die aber im iibrigen den gleichen Verlanf nimmt, wie wenn Na zugegeben ist. duch sind die Umsatze mi t Ba hinreichend grob.

1. 800 ccul Hefesuspension rnit 8 g Trockengewicht wurden 36 Stunden auf der Maschine nnter Sauerstoff ge- schuttelt. Dann fugte man 50 ccm 2 n-Bariumacetatlosung hinzu und setzte das Schiitteln nnter Sauerstoff 24 Stunden lang fort. Das Barium wurde rnit 50 ccm 2n-H2S0, ge- fallt und das Bariumsulfat mitsamt der Hefe abzentrifugiert und zweimal nachgemaschen. Die aus der Losung ab- destillierte Essigsaure entsprach 32,4 mMol, demnach sind 67,6 mMol umgesetzt.

Wie 1 a n d und Sonde r h o ff,

des Destillats verbrauchte 12,40 ccm n/I,-NaOH; der Eiodampf- ruckstand dieser Probe wog, bei 130° getrocknet, 104 mg, fur NaCO,CH, ber. 102 mg.

Der Destillationsriickstand wurde, in wenig Wasser gelost, 41 Stunden mit Ather extrahiert und lieferte 286 mg Bernsteinsaure.

also Reinheitsgrad der Bernsteinsaure 96,5 Proc. Bei der Titration verbrancht: 46,7 ccm "/,,-NaOH anstatt 48,5 ccm,

Die von Bernsteinsaure befreite waBrige Losung hinter- lieD nach dem Eindampfen i. V. einen gelben Sirup im Ge- wicht von etwa 1,8 g.

2. Ansatz wie unter I . Die verarmte Hefe wurde in 2 Teile geteilt. A wurde direkt rnit verdunnter Schwefel- saure angesauert, von der Hefe abzentrifugiert, dann die Schwefelsaure rnit Ba(OH), genau ausgefallt. B wurde mit 50 ccm 2 n-Ba-Acetatlosung 22 Stunden lang wie oben unter Sauerstoff geschiittel t und hierauf ebenso behandelt wie A.

Essigsaurebestirnmung: In A waren 8,4 ccrn n/10 enthalten, also in 4 g Hefe rund 50 mg. Die Essigsaure ist zweifellos aus dem durch VergLrung der restlichen Kohlehydrate ent- standenen Alkohol hervorgegangen, der j a beim Verarmen

Oher den Mechanismus der Oxydationsvorgange. X X X I I . 217

im wesentlichen verbrannt wird. Wir finden in verarmter Hefe stets etwa die obige Menge an Essigsaure.

In B waren noch 220,4 ccm "/,,-Essigsaure enthalten, demgemab bei der Reaktion 78 mMol umgesetzt.

Uer Inhalt der Ba-freien wabrigen Losungen, der hier verglichen werden sollte, betrug fur A rund 0,7 g, fur B 2 g. Die qualitative Untersuchung von B, dessen Losung neben freier Same noch Alkalisalze enthielt, ergab auch nach %stundigem Erhitzen einer Probe mit 2-proc. Salzsaure keiiie Reaktion auf reduzierenden Zucker , dagegen gaben A wie B starke Ninhydrinreaktion auf Aminosauren.

3. Ansatz wie bei 2. Auch Teilung in A und B. Um- satz in B 80,7 mMol Essigsaure.

Bernsteinsaure in A 16 mg, B 379 mg (Titration 58,l ccm "/lo-

NaOH, ber. 64,2). Wassarloslicher Riickstand in A 0,72 g , B 1,30 g . Die wabrige Losung von B wurde mit Bleiessig bis

zur schwach alkalischen Reaktion gefallt - A gab nur die Spur eines Niederschlags - und das Bleisalz rnit Schwefelwasserstoff zerlegt. Dadurch wurde eine weit- gehende Abtrennung der Aminosauren erreicht. Der ge- trocknete Inhalt des entbleiten Filtrats, 0,8 g , enthielt 9,82 Proc. Stickstoff, die Sauren aus dem Bleisalz, 0,49 g, dagegen 2,79 Proc.

Durch absoluten Alkohol, in dem sich die organische Saure loste, wurden, nach Zugabe von absolutem Ather, weitere Anteile an Aminosauren zuruckgelassen. Die ein- gedampfte alkoholische Losung begann nach einigem Stehen zu krystallisieren. Weitere Reinigung unter 4.

4. 2400 ccm Hefesuspension mit 24 g Trockengewicht wurden in einer 8,5 Liter-Flasche 24 Stunden uiiter Sauer- stoff geschuttelt. Die eine Halfte der Losung wurde wieder als Kontrolle fur sich aufgearbeitet (A), die andere rnit 150 ccm 2,02 n-Bariumacetat weitere 24 Stunden lang ge- schuttelt.

A. Mit Ather extrahiert 19 m g roher Bernsteinsaure; mit Bleiessig gab die wabrige Losung des Ruckstandes, der 0,72 g wog, nur eine geringfugige Fallung.

218 W i e l a n d und S o n d e r h o f f ,

B. Die Losung enthielt noch 148,4 mMol Essigsaure, umgesetzt 161 mMol = 52 Proc. Mit Ather wurden 401 mg roher Bernsteinsaure extrahiert, in der wafirigen Lasung waren danach noch 4,96g Substanz enthalten. Uber das Blei- salz wurde wie oben 1 , O l g krystallisierte, rohe Citronensaure isoliert. Ein Teil wurde in das Chisiinsalz iibergefuhrt, das sich aus heidem Wasser zu verfilzten Nadeln umkrystalli- sieren liel3. Schmelzp. 193O. Aus Citronensaure dargestelltes Chininsalz schmolz bei 194O und hatte die gleichen Eigen- schaften. Mischprobe.

Zur Oewinnung der reinen Citronensaure wurde ein Teil des Chininsalzes i n heiDer wadriger Losung mi t Blei- essig gefallt, das Bleisalz wie oben zerlegt und die Losung der Saure eingedampft. Die erhaltene Krystallisation gab mit reiner Citronensaure keine Schmelzpunktsdepression.

C,H,O, (192) Ber. C 37,4 H 4,20 Gef. C 37,70 H 4,51.

Bquiv.-Gew. Ber 64 Gef. 65,7.

4,341 mg Subst.: 6,000 mg CO,, 1,75 mg H,O.

7,881 mg Subst.: 2,318 ccm "/,,-NaOH.

Die Ausbeute betragt in diesem Versuch fur Bernstein- saure 4,O Proc., fur Citronensaure 10,5 Proc., bezogen auf die umgesetzte Essigsaure.

5. Ansatz wie bei 4. Eingesetzt 300ccm 2,03 n-Ba-acetat. Vollstandig gemab B verarbeitet. Umsatz an Essigsaure 315 mDiIol(52 Proc.). Rohbernsteinsaure 0,798 g. Rohcitronen- saure 1,521 g. Die Citronensaure wurde diesmal iiber das schwer losliche Ba-Salz gereinigt, das anfangs amorph, beim Stehen zu feinen Buscheln - wie Bariumcitrat - krystalli- sierte: 2,391 g.

0,2125 g Subst. verloren i. V. bei 130O 15,4 mg. (Ba,Ci,),. 7 H,O Ber. H,O 7,38 Gef. H,O :,25.

Nach dem Gliihen an der Luft ergaben sich 0,1451 g BaCO,. Ber. Ba 52,16 Gef. Ba 52,68.

Die Untersuchnng der ubrigen Reaktionsprodukte ist noch nicht abgeschlossen. Wir wollen noch bemerken, daO Athylalkohol nicht aufgefunden wurde.

Uber den Mechanismus der Oxydationsvorganye. XXXII . 219

Z u r K i n e t i k d e r e n z y m a t i s c h e n E s s i g s a u r e o x y d a t i o n d n r c h Hefe.

Ehe wir des naheren auf Versuche iiber die Natnr des Verlaufs der beschriebenen Oxydationsvorgange eingehen, sei das Ergebnis der kinetischen Studien besprochen.

Die Abhangigkeit des Perlaufs von cler Acetatkonzentration. Aus den in Fig. 1 wiedergegebenen Umsatzkurven ersieht man, dafl die Oxydation der Essigsaure etwas mehr von der Substratkonzentration abhangig ist als die des Alkohols. lmmerhin betragt die Reaktionsgeschwindigkeit einer m/128-

Acetatlosung noch gut 75 Proc. von der einer m/,-Losung, wobei man zu beriicksichtigen hat, daB ihr ein Gesamt- verbrauch yon nur 2800 cmm Sauerstoff entspricht. Die Affinitat der Essigsaure zur aktiven Oberflache is t demnach, gleich der des Alkohols, auflerordentlich grob.

30 28

2 6

2 4

2 2

2 0

7 8 76 74 22

$08 06

04

a2

I0 20 30 40 50 60 70 80 90 700 7fOMin

Fig. 1. 0,-Aufnahme bei der Essigsiiure-Oxydation. Konzentration I: %, XI: m/,6, 111: m/128, IV: Eigenatmung.

Aus den Kurven, die in iibereinstimmendem Verlauf noch durch die Ergebnisse zahlreicher, hier nicht wieder- zugebender Versuche belegt werden konnten, geht weiter hervor, daS die Reaktion eine Selbstbeschleunigung erfahrt. Die Sauerstoffaufnahmen pro Zeiteinheit erhohen sich. Da-

220 T i e l a n d und Sonderho ff,

durch kommt zum Ausdruck, daB Zwischenprodukte, die uberschritten werden, eine groSere Oxydationsgeschwindig- keit besitzen als Essigsaure selbst. Im aeroben Umsatz steht Essigsaure hinter Athylalkohol nur um weniges zuruck.

Wir haben oben gesehen, daS in den groberen Ansatzen, aus denen Bernsteinsaure und Citronensaure isoliert wurden, obwohl dort ein mehr oder weniger grober Anteil der an- gewandten Essigsaure verbraucht wurde, andere Reaktions- produkte nur in geringer Menge neben den beiden genannteu aufgetreten sein konnen. Dies weist darauf hin, daS das in die Reaktion eingetretene Material bis auf diese ,,liegen- gebliebenen" Produkte vollkommen oxydiert sein mu& Wir haben uns bemuht, durch die analytische Bestimmung des Gasstoffwechsels in bestimmten Phasen der Reaktion uber die Verhaltnisse naheren AufschluS zu gewinnen, und zwar in der Weise, daS wir feststellten, welcher Sauerstoff- verbrauch und welche C0,-Bildung der jeweils umgesetzten Essigsaure entsprachen.

Das Verhaltnis Sauerstoff sowie Kohlendioxyd zu Essig- saure ist fur die vollstandige Oxydation = 2 : 1, der Quotient CO,/O,, von Stnnde zu Stunde bestimmt, ziemlich genau = 1. Wenn sich Zwischenprodukte bilden, die langsamer als Essigsaure selbst weiter oxydiert werden, mull der Quotient < 1 sein. Es wird nun CO,/O,, von Stunde zu Stunde bestimmt, ziemlich genau = 1 gefunden. Damit kommt zum Ausdruck, daS die Essigsaure von allem Anfang an ohne Andeutung von Zwischenreaktionen zu GO, und H,O verbrannt wurde. Eine Korrektur nach unten erfahren die Werte fur CO,/O, durch Berucksichtigung der Eigen- atmung der verarmten Hefe. AuSerdem laBt der jeweils bestimmte Umsatz an Essigsaure den Wert 1 nicht als reel1 erscheinen. Das Verhaltnis 0, /CH, .CO,H wurde niemals, so wie CO,/O,- 1 es erwarten liebe, zu 2, sondern immer niedriger, zu 1,7--13 gefunden. Dies erklart sich aus dem Auftreten der beiden isolierten Sauren.

Wir konnen uber die Kinetik der Essigsaureoxydation durch Hefe demnach aussagen, daS durch die praparative Untersuchung der Reaktionsprodukte im Zusammenhang

Uber den Mechanismus der Oxydationsvorgange. XXXII , 22

mit dem Studium des Gasstoffwechsels ein Reaktionsverlau sichergestellt ist, nach dem im wesentlichen das Snbstra vollkommen oxydiert wird. Die Frage, wie dieser Prozei verlauft und ob in der Bernsteinsaure und Citronensaurc Zwischenprodukte anzunehmen sind, wird nachher noch ZI diskutieren sein.

Der Quotient CO, / 0, wurde in der Weise messend vcrfolgt, da4 in 4 Bilan~gefaBen~) mit j e 1 mMol Na-Acetat (entsprechend 60 rng Essigslure) verarmte Hefe (206 g Trockengewicht) unter Sauerstoff irr Thermostaten bei 30 O geschiittelt wurde.

Die gebildete Kohlensaure befindet sich teils im Gas- raum, teils ist sie als primares Carbonat gebunden. Man bestimmt zuerst durch 1-stundiges Einleiten eines Stickstoff- stroms im vorgelegten Barytwasser die freie Kohlensaure, sauert dann im geschlossenen System mit 10 ccm 2 n- Schwefelsaure an und findet dann auf die gleiche Weise die gebundene. Der aufgenommeiie Sauerstoff wird errechnet &us der manometrisch abgelesenen Volumabnahme des Ge- fa0es plus dem im Clasraum vorhandenen Kohlendioxyd. Die Essigsaure wurde in der schwefelsauren Losung in der ublichen Weise bestimmt.

Die Werte fur Sauerstoff und Kohlendioxyd sind fur 2 Reihen gleicher Art (30. 6. 32 nnd 5. 7. 32) nachstehend tabellarisch angegeben.

T a b e l l e 3. - ~ _ _ _ _ _ ~ _____

S t u n d e n 1 1 1 2 1 3 1 4 1 1 1 2 3

ccm 0, 1 12,7 I 2;:;, 1 38,6 1 43,7 I W::, 1 30,5 ccm co, 14,5 26,9 40,4 47,9 14,5 32,3 39,2 CO,/O, 1,14 1,05 1,lO 1,06 1,06

~ ~ _ _ _ ______._.___

In der folgenden Reihe wnrde jeweils die umgesetzte

ccm 0, . . . * . . . chm CO, . . . , . . , co,/o, . . . . * . . mMol Essigsliure umgesetzt OI/C2H,02 . . . . . .

Essigsaure bestimmt.

- - - 0,25 1,72

T a b e l l e 4.

34,9 38,s 1,11 0,94 1,6G

39,2 - - 0,975 1,Sl

2

25,O 29,4 1,17 0,68 1,G i

a 1 4

l) A. 492, 203 (1931).

232 Vie land und So nd ern o ff,

Bringt man die Korrektur fur das aus der Hefe stam- mende CO, (etwa 3 ccm) an, so gelangt man fur CO,/O, zu Werten, die fiir die erste Stunde urn 0,9 liegen, um dann ansteigend nach volliger Oxydation den Wert von 1 zu erreichen. Dies geht deutlich aus der ersten Versuchsreihe von Tab. 3 hervor, wo nach 4 Stunden der fur die totale Verbrennung erforderliche Sauerstoff (43,7 statt 44,s ccm) nahezn aufgenommen ist. Bei der etwas weniger aktiven Hefe, die fur die Reihe in Tab. 4 gedient hat, ist zwar die Essigsaure praktisch vollstandig umgesetzt (0,976 statt 1,0 Nillimol), zur vollstandigen Oxydation fehlen aber noch 5,6 ccm Sauerstoff, die ziemlich gut der noch vorhandenen Bernsteinsaure und CitronensLure entsprechen. Such der Quotient 0,/C,H40, von 1,81 fugt sich dieser Bestimmung befriedigend ein.

Es sei noch eine Bestimmung des Quotienten CO,/O, mit freierEssigsaureangefuhrt,dievolurnetrisch in B a r c r o f t - War b u r g - Gefaben vorgenommen wurde.

Stamm Rb 5 (28. 11. 31) Verarmte Hefe von je 53,4 mg Trocken- gewicht pro Ansatz. Jeweils 0,0643 mMo1 freie Essigsaure in 8 ccm LGsung. I, 11, I11 mit 0,5 ccm 50-proc. KOH irn inneren Behalter, IV und V ohne KOH. Hier wurde nach Beendigung des Versuches aus dem eingeschliffenen Kippansatz je 1 ccm 2 n-SalzsLure eingegossen und so das entwickelte CO, bestimmt. Versuchsdauer 155 Min. 1’ = 30°.

I I1 I11 IV v 0,-Aufnahme in ccm . . . . 2,43 2,31 2,28 ccm CO, . . . . . . . . 2,44 2,60

Bei einem Mittel von 2,34 ccm 0, errechnet sich fiir CO,/O, 1,04 und 1,ll.

Es ergibt sich aus den bisherigen Versuchen, da8 die Oxydation der Essigsaure durch Hefe zum iiberwiegenden Teil von Anfang an .ohne nachweisbare Zwischenprodukte bis zur Kohlensaure fuhrt. Es ist recht wenig wahrschein- lich, da8 dabei die Methylgruppe direkt oxydiert wird, und dafl Glykolsaure und Oxalsaure dabei als nicht fafibare Zwischenprodukte auftreten , denn diese beiden Sauren werden durch das enzymatische System der Hefe bei Gegen-

Uber den Mechanismus der Oxydationsvorgange. XXXIL 223

wart von Sauerstoff nicht oder kaum angegriffen. Vielmehr deutet das Auftreten der Bernsteinsaure darauf hin, daa der Weg der vollstandigen Verbrennung iiber sie als Zwischen- produkt hinweg fuhrt. Damit scheint nicht im Einklang zu stehen, daQ Bernsteinsaure von Hefe erheblich langsamer umgesetzt wird als Essigsanre. Es liegen dariiber ver- schiedene Versuche vor, von denen wir die Ergebnisse einer Reihe im Kurvenbild (Fig. 2) wiedergeben. Die Ansatze sind die gleichen wie auf Fig. 1, und wie dort im Falle der Essigsaure hat man auch hier die Abhangigkeit der Umsatz- geschwindigkeit von der Konzentration des Substrats untersucht.

Je 8 ccm Hefesuspension (50 mg Trockensubstanz) Stamm Rb T (18. 9. 31), 21 Stunden verarmt. T = 30°.

W e man sieht, besteht auch hier so gut wie keine KonzentrationsabhPngigkeit und, wie bei Acetat, eine deut- liche Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit. Die Sauer- stoffaufnahme erfolgt in der ersten Zeit im Sinne einer Reaktion nullter Ordnung; in je 10 Minuten werden rund 60 ccm 0, verbraucht. Die Geschwindigkeit, mit der Bern- steinsaure durch Hefe oxydiert wird, betragt im Mittel nur 30 Proc. von der der Essigsiiure.

7 0

08 GO6

8 04 & 5

az

79 20 30 40 50 60 70 dM 90 700 IIOMi? I0 20 30 40 50 60 70 80 SO 700 iYOoM/n

Fig. 2. 0,-Aufnahme mit Bernsteinsaure. Fig. 3. 0,-Aufnahme mit Fumarsgure. Konzentration I: m/4, 11: 111: Konzentration I: m/16, 11:

IV: Eigenatmung. 111: Eigenatmung.

Demnach sieht es so aus, als ob Bernsteinsgure nicht als Zwischenprodukt der Essigsaure-Oxydation auftreten konne, da ja beim zahlenmabigen Vergleich der Reaktions- geschwindigkeiten ' I , davon, nicht aber nur 5 Proc., wie wir finden, als Bernsteinsaure vorhanden sein muate. Diese Folgerung halten wir nicht fur richtig. Wir glauben, daS die Bernsteinsaure, die durch enzymatische Dehydrieruag

2 24 V i e l a n d und Sonde rho ff,

auf der aktiven Oberflache aus Essigsaure entsteht, nicht identisch ist mit derjenigen, die wir als solche mi t der Hefe in Beruhrung bringen. Jene Molekeln befinden sich im Zu- stand der Angeregtheit, in den sie durch die aktive Ober- flache versetzt sind, und demgemaD werden ihre kinetischen Verhaltnisse andere sein als die des gleichen chemischen Substrats, dem die Aktivierungsenergie seiner Entstehung fehlt. Von Beispielen ahnlicher Art sei das der enzymatischen Dehydrierung von Alkohol hier angefuhrt. Auch dort wird beim Ubergang zur Essigsaure das Zwischenprodukt Acet- aldehyd, dessen Reaktionsgeschwindigkeit der GroDenord- nung nach die gleiche ist wio die des Alkohols, auch bei kleinem Alkoholumsatz nur in geringer Menge angetroffen. DaD dabei iiberhaupt Sldehyd und im Fall der Essigsaure- Oxydation Bernsteinsaure anftritt, wird man darauf zuruck- zufuhren haben, daD wie bei vielen katalytischen Reaktionen ein Teil der angeregten Molekeln inaktiviert wird.

Wir sehen also in dem an sich unerwarteten kinetisellen Verhalten der Bernsteinsaure gegenuber der Essigsaure keinen Einwand gegen die Annahme, daa die Oxydation der Essigsaure durch Hefe uber die Bernsteinsaure fiihrt. Das ist der Weg, den wir in Ubereinstimmung mit T h u n b e r g , als den elementaren des biologischen Endabbaus ansehen, der allerdings fur hijhere Organismen noch experimentell zu beweisen ist. Das Schema des weiteren Abbaus uber Fumamaure, Ap fihaure, Oxalessiysiiure, Brenztraubensaure, er- neut Essigsazire bedarf keiner weiteren Erorterung.

Von den Versuchen, die uber die enzymatische Oxyda- tion von Sauren dieser niutmafllichen Reihe aus im Gang sind, wollen wir die vorlanfigen Ergebnisse, die mi t Punznr- saure und Apfelsaure erhalten wurden, anfuhren. Wir haben keine der beiden Sauren unter den Produkten der unvoll- standigen Oxydation von Essigsaure bisher mit Sicherheit nachweisen konnen. Trotzdem werden sie, der Hefe in Gegenwart von Sauerstoff dargeboten, ebenso wie Bern- steinsaure, erheblich langsamer als Essigsaure umgesetzt (vgl. die unter den gleichen Bedingungen wie in Fig. 1 nnd 2 erhaltenen Umsatzkurven fur Fumarsanre auf Fig. 3).

06er den Hechanismus der Oxydationsvorgange. XXXII . 225

Uagegen hat man, wie demnachst ausfiihrlich mitgeteilt werden wird, als Produkt der enzymatischen Oxydation von Mikhsaure und Brenztraubensaure durch Hefe E! sst g saure und faus Milchsaure) Bernsteinsuure erhalten, womit der oben formulierte Ring von Reaktionen experimentell geschlossen ist.

Weder Essigsaure, noch Bernsteinsaure und Apfelsaare werden von Hefe dehydriert, wenn man den Sauerstoff als U'asserstoffacceptor durch MethyZenbZau ersetzt. Wir finden in zahlreichen Versuchen die Entfarbungszeit bei Gegen- wart der Salze jener Sauren nicht kleiner als in der zusatz- freien Lasung. l)a Bernsteinsaure durch Muskelgewebe bei Gegenwart von I\iIethylenblnu energisch dehydriert wird, konnen keine Griinde energetischer Natur fur das Versagen der Hefe gegenuber der anaeroben Reaktion vorliegen. Offen- bar fehlt dem Enzym der Hefe die spezifische Sffinitat gegenuber dem Farbstoff als Wasserstoffacceptor.

Uber die Art der Bildung der Citronensiiure lassen sich nur Vermutungen aufstellen. Wir halten es fur moglich, da15 die enzymatisch aktivierte Oxalessigsaure, die j a in der obigen Abbaureihe steht, sich m i t Essigsaure aldolartig zu kondensieren vermag.

H02C-CO-CH~-CO~H f H,C-CO,H

--3 HO~C-C(OH)--CH~-CO~H I CH, . CO,H

Uafiir spricht vielleicht unsere Feststellung, da13 aus Bernsteinsaure durch Hefe keine Citronensaure entsteht. Es liegt bis jetzt zwar nur der folgende Versuch vor.

2400 ccm Hefesuspension rnit 24 g Trockengewicht, die 24 Stunden lang unter Sauerstoff vorgeschiittelt waren, wurden mit 250 mMol Natriumsuccinat (67,5 g) 34 Stunden lang bei Raumtemperatur unter zweimal erneutem Sauerstoff geschiittelt. Verarbeitung wie immer. Bei der Destillation der angesiiuerten, von der Hefe abzentrifugierten Losung ging die 25 corn "/,,-NaOH entsprechende Menge an Essigsaure (150 ma) iiber. Die erschopfende Extraktion mit Ather gab 22,3 g Bernutein- saure zuriick, so daB 7,7 g davon umgesetzt waren. Aus der Rest- losung lronnte auf die oben angegebeue Weise keine Citronensaure isoliert werden; sie kiinnte h6chstens in sehr geringer Menge ent- standen sein.

226 r i e l and und Sonde r h o f f ,

Die Oxydation der Citronensaure durch Hefe geht langsam vor sich. Vor allem ist auffallend, da5 die Reak- tion erst nach geraumer Zeit in Gang kommt.

Fig. 4. Oxydation und Decarboxylierung von Citronensaure. I 0,-Aufnahme mit m/,,-Na-citrat.

I1 Desgl. ohne Zusats (Eigenatmung). 111 GO,-Abgabe unter Stickstoff.

Da eine dehydrierende Oxydation der Citronensaure schwer zu verstehen ware, haben wir an eine ihr vorher- gehende enzymatische Abspaltung des tertiar gebundenen Carboxyls gedacht, die in der Tat anch experimentell fest- zustellen war.

Wir briugen die Belege a19 Bestandteile einer Reihe, in der gleichzeitig anch der Sauerstoffverbrauch bestimmt ist. Vgl. dazu Fig. 4.

Es sind gleichzeitig auch einige Ansatze mit Glykol- saure ausgefuhrt worden, die die fast vollige Indifferenz dieser Saure erkennen lassen. Ton der Wiedergabe der Zahlenwerte sehen wir ab.

Die Hefe war 13 Stunden lang in Pufferlasung (pR =I 6,8) verarmt. Je 44 mg Trockensubstanz. Volurnen jeweils 8 ccm. T = 30°.

1 und 2 ohne Zusatz (Selbstatmung) . 3 und 4 mit "/,,-Na-Citrat. . . . . . . . . I KOH in den Einsiitzen

Unter Sauerstoff,

5 , 6, 7 rnit m/,,-Na-Citrat. . . . . . . . . 8 und 9 ohne Zusatz (Selbstgarung) . .

ober den Mechanismus dei. Oxydationsvorgange. ZXXII. 227

T a b e l l e 5.

~5 ___ r-- ~ 18 I 23 -

23 78

195 400 830

1610

Zeit 11 0,-Aufnahme I C0,-Abgabe

T7-G- 120 430 180 540 240 650 300 750 360 850 420 950 430 I050

240 430 690

1010 1410 1860 2260 2650

2

210 330 440 540 640 730 820 910 980

__ __ ____-

220 420 665 940

1280 1650 2010 2360

Beachtenswt

540 11150 1

20

44 55 64 84

6

13 18

28 90

200 425 845

1605

_ _ ~ __

- - - - - - -

8

26 30 35 44

I -

7

16 1 3

16 70

180 390 830

1640

__ __

-

t ist die auderordentliche Steigerung der Geschwindigkeit der GO,-Abspaltung. Das vermutliche pri- mare Produkt der Decarboxylierung, die /3-Oxy-glutarsanre HOzC-CHz-CHOH-CHz- CO,H ist noch nicht isoliert. Wir mochten aber darauf hinweisen, dafl sie durch De- hydrierung in Aceton-dicarbonsanre ubergehen wird. Bei der groden Verbreitnng der Citronensaure, auch im Saugetier- stoffwechsel, wird man daran zu denken Iiaben, da13 auch von ihr aus sich ein Eingang in das Qebiet der ,,Aceton- korper", Acetessigsaure und Aceton, p-Oxybuttersaure, eben uber die Aceton-dicarbonsaure, eroffnen konnte. ')

Mit der Reobachtnng, daS die Hefe atus Essigsaure und demgemaB auch aus $Ikohol durch oxydative Garung Bern- steinsaure und Citronensaure zu erzeugen vermag, ist i h r Kohlenhydratstoflwechsel in enge Parallele geriickt zu dem der Schimmelpilze und Schleimpilze, von denen man schon seit langem we8, daS sie Zucker zu jener Saure oxydativ vergaren konnen. Gerade die Forschungen der letzten Jahre haben gelehrt, daB viele Schimmelpilze den Aufbau der hoheren Sauren auch vom Alkoho12) und von der Essig-

l) Vgl. dam K. Bernhaue r , Die oxydativen Garungen, Berlin 1932, bes. S. 103ff.

a) Mack u. Per r i e r , C. r. 139, 311 (1903); Bu tkewi t sch u. Fedorof f , Bio. Z. 219, 103 (1931); ChreasEcz, T i u k o w 11. Zako- morny, Bio. Z. 250, 254 (1932).

228 A r n d t und Mart ius ,

saure l) aus vornehmen konnen, und wir mochten uns, gestutzt auf die hier mitgeteilten Befunde, die schon von mehreren Autoren z, geBuDerte Auffassung zu eigen machen, daD der Synthese von BernsteinsLure und Citronensaure aus Kohle- hydraten - fur die Schimmelpilze schliefien sich Fumar- saure und Apfelsanre an - der enzymatische Zerfall des Zuckers, sei es zu Alkohol + CO,, sei es i n Milchsaure vorhergeht. Ton der Uberfuhrung der Milchsaure in Essig- saure durch Hefe war oben die Rede.

Ober die Beziehungen zwischen Aciditat und Enolisierung ;

von 3. Amdt und C. Martius.

(Aus dem Chemischen Institut der Universitat Breslau.)

(Eingelaufen am 19. Oktober 1932.)

Die ,,empirische Bciditat" von Verbindungen, welche 2 oder 3 der Substituenteng

am gleichen Methylen oder Methin tragen, bedeutet, daD in den Molekeln dieser Stoffe, oder einem Teil ihrer Molekeln, irgendwo ein verhaltnismai8ig locker gebundenes Proton (Wasserstoffkern) sich befindet, das von alkalischen Mitteln unter Zurucklassung eines Salzanions abgelost wird. Die Starhe der empirischen Aciditat (d. h. die Brutto-Dissoziations-

l) Takahashi u. A s a i , Proc. Imp. Ac. Tokio 3, 86 (1927); But- k e w i t s c h u. Fedoroff , Bi0.Z. 207, 302 (1929); Chreasece u. T i n - k o w , Bio. Z. 229, 343 (1930); Bernhauer u. SicbenLuger, Bio. Z. 240, 232 (1931).

2, Vgl. besonders Chrzaszcz u. Mitarb., Bio. Z. 260, 265 (1932). Weitere Literaturangaben findet man in der ausgeeeichneten Mono- graphic von K. Beruhauer.

s, Von den Substituenten CN, NO, usw. wird in dieser Mitteilung abgesehen, da ihre eingehendere Bearbeitung noch aussteht.

-CHO, -CO.R, -COOR, -SO,OR, -SO,R, -SO,NR,, -SO.R