Über den Stoffwechsel von 2.4.5-T und 2.4-D bei Ratten und Mäusen

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    10-Jul-2016

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  • Arch. Toxicol. 32, 217--225 (1974) 9 by Springer-Verlag 1974

    tiber den Stoffwechsel von 2.4.5-T und 2.4-D bei Ratten und M~iusen*

    W. Grunow u n d Chr. BShme

    Bundesgesundheitsamt, Max-von-Pettenkofer-Institut, Abteilung Toxikologie

    Eingegangen am 2t. Mgrz 1974

    Metabolism of 2.4.5-T and 2.4-D in Ra t s and Mice

    Abstract. Following oral administration of the herbicide 2.4.5-T to rats and mice, the unchanged acid was found to be the main excretion product in the urine. The conjugates with glycine and taurine, as well as 2.4.5-trichlorophenol, were identified as metabolites. In the urine of rats the conjugates of 2.4.5-T were excreted in nearly equal amounts, whereas in mice the quantity of the taurine conjugate was increased. In rats, biotransformation of 2.4-1) to the corresponding glycine and taurine conjugate was also detected. However, this herbicide showed a remarkably reduced tendency to be conjugated, as compared with 2.4.5-T.

    Keywords: 2.4.5-T -- 2.4-D -- Herbicides -- Urinary Excretion -- Metabolism.

    Zusammen/assung. Nach oraler Verabreichung des Herbicids 2.4.5-T an Ratten und M~use wurde im Ham hauptsgchlich die unveriinderte Substanz gefunden. Daneben konnten jedoch die Conjugate mit Glycin und Taurin sowic 2.4.5-Trichlor- phenol als Stoffwechselprodukte identifiziert werden. Wiihrend bei Ratten die beiden Conjugate des 2.4.5-T in etwa gleichen ~Iengen ausgeschieden wurden, war im Ham yon Mgusen der Anteil des Taurin-Conjugates erhSht. Auch nach Verab- reichung yon 2.4-D an Ratten wurden das entsprechende Glycin- und Taurin- Conjugat im Ham nachgewiesen. Im Vergleich zum 2.4.5-T zeigte dieses Herbicid jedoch eine deutlich geringere Tendenz zur Conjugathildung.

    Schli~sselw6rter: 2.4.5-T -- 2.4-D -- Herbicide -- Harnausscheidung -- Meta- bolismus.

    I n einer frfiheren Mit te i lung wurde fiber Un te r suehungen zur renalen Ausschcidung des Herbicids 2.4.5-T (2.4.5-Trichlorphenoxyessigs~ure) bei R a t t e n ber ichtet (Grunow et al., i971). Diese Versuehe h a t t e n er- geben, dab 2.4.5-T nieht nu r in freier Form, sondern in n icht unbet r~cht - licher Menge auch in Fo rm yon Conjugaten ausgeschieden wird, die durch saute Hydrolyse in 2.4.5-T gespalten werden. Eines dieser Derivate wurde als N-(2.4.5-Trichlorphenoxyacetyl)-glycin identifiziert.

    * Herrn Prof. Dr. Dr. reed. F. B~r zum 65. Geburtstag gewidmet.

  • 218 W. Grunow und Chr. BShme

    Die Un te r suchungen wurden fortgesetzL wobei die Bemfihungen vor allem auf die Isol ierung weiterer Stoffwechselprodukte u n d ihre quant i - t a t ive Effassung gerichtet waren. I m Hinbl ick auf die teratogene Wir- kung yon 2.4.5-T, die besonders bei M~usen zu beobachten ist (vgl. u. a. Roll, 1971), wurden die Versuche auch auf diese Tierar t ausgedehnt . Zu Vergleichszwecken wurde auBerdem die renale Ausscheidung yon 2.4-D (2.4-Dichlorphenoxyessigs~ure) bei R a t t e n untersucht .

    Methodik

    Verabre~hte ~ubaanzen. 2.4.5-T (Schering AG, Reinheitsgrad 99,6 %, F. 153 bis 154 ~ 2.4-D (Schering AG, Reinheitsgrad 97,9 %, F. 136 bis 139 ~

    Versuchstiere. Als Versuchstiere dienten m~nnliche Wistar-Ratten aus der zentralen Versuchstieranlage des Bundesgesundheitsamtes mit einem K6rper- gewicht yon 200 bis 250 g sowie weibliehe M~use yore Stature l~IRI /Han mit einem Durchschnittsgewicht yon 30 g. Ratten und M~iuse wurden einzeln in Stoffweehsel- kKfigen gehalten und erhielten Futter (Altromin R, Altromin GmbH, Lage/Lippe) und Trinkwasser ad libitum. Die Substanzen wurden in ErdnuBS1 mit der Schlund- sonde verabreicht.

    lsolierung vo~ N.(2.4.5-Trichlorphermxyacetyl)-tauri~ aus Ratten- und Md'use- har~. Der Ham yon zwei Ratten wurde nach Verabreichung yon 200 mg 2.4.5-T/kg K6rpergewicht fiber einen Zeitraum yon 3 Tagen aufgefangen, anschlieBend mit Salzs~are anges~uert und viermal mit dem gleichen Volumen EssigsRure~thylester extrahiert. Obwohl ein groBer Teil des polaren Taurin-Conjugates in der w~Brigen Phase verblieb, wurde zur Reinigung und Isolierung dieser Verbindung der Essig- s~ure~thylester-Extrakt verwendet. Der Eindampfrfickstand des Extraktes wurde in l0 ml 0,1 n Natronlauge gel6st und an DEAE-Sephadex A-25 (C1--Form) mit einem Salzs~uregradienten chromatographiert (S~ule: 2,5 x 96 cm; Gradient: Auto- grad der Firma Teehnicon, gefiillt je Kammer mit 330 ml SalzsRure der folgenden Konzentrationen: Kammer I 0,01 n, 2 0,02 n, 3 bis 5 0,05 n, 6 bis 7 0,1 n, 8 0,2 n und 9 0,5 ~, danach welter mit 0,5 n; Fraktionsvolumen 17,7 ml). Die Fraktionen 58 bis 66 enthielten N-(2.4.5-Trichlorphenoxyacetyl)-glycin. Aus den Fraktionen 82 bis 90 wurde unver~indertes 2.4.5-T erhalten und durch Schmelzpunkt (F. t50 bis 154~ Dfinnschichtchromatographie (Kieselgel PF~5 ~, FlieBmittel Chloro- form/~.thanol/EssigsRure 90:5: 5, R~-Wert 0,75) und IR-Spektrum identifiziert. Die Fraktionen 167 bis t74 enthielten 2.4.5-T in gebundener Form. Nach schonen- dem Eindampfen wurde yon dem kristallinen Rfickstand ein IR-Spektrum auf- genommen. Absorptionsbanden bei 1666 und 1535 cm -x zeigten eine S~iureamid- bindung an, wEhrend eine breite Absorption bei 1170 bis 1250 cm -x und eine Bande bei 1040 cm -1 auf elne Sulfons~ure hindeuteten. Zur weiteren Strukturaufkl~rung wurde der isolierte Metabolit mit SalzsRure hydrolysiert und die hydrolysierte L6sung mit Essigs~ure~thylester extrahiert. In der w~iBrigen Phase konnte durch Diinnschichtchromatographie an Cellulose (FlieBmittel n-Butanol/Aceton/DiRthyl- amin/Wasser 30:30:6:t5, RF-Wert 0,32) und durch das IR-Spektrum Taurin nach- gewiesen werden. Durch Vergleich mit synthetischem Material wurde der Metabolit endgfiltig als N-(2.4.5-Trichlorphenoxyacetyl)-taurin identifiziert.

    Auf ~hnliche Weise wurde dieses Conjugat auch aus dem Ham yon zehn weib- lichen M~usen isoliert, denen eine Dosis yon 200 nag 2.4.5-T]kg K6rpergewieht verabreicht worden war. In diesem Fall wurde die Struktur zusEtzlich durch das Massenspektrum des Methylesters (M: m]e 375) best~tigt.

  • ~ber den Stoffweehsel yon 2.4.5-T und 2.4-D bei Ratten und M~usen 219

    Isolierung yon N.(2.4.Dichlorphenoxyacetyl)-glycin und -taurin aus Rattenharn. Nach Verabreiehung yon 200 mg 2.4-D]kg KSrpergewicht an Ratten wurde der fiber einen Zeitraum yon 3 Tagen gesammelte Ham in der vorstehend beschriebenen Weise aufgearbeitet. Die durch siiulenehromategraphische Trennung an DEAE- Sephadex A-25 (Cl--Form) unter den obengenannten Bedingungen erhaltenen Fraktionen 51 bis 60 enthielten N-(2.4-Dichlorphenoxyacetyl)-glycin, das nach diinn- schichtehromategraphischer Reinigung (Kieselgel PF~54, Fliel]mittel Chloroform/ Athanol/Essigs~ure 90: 5: 5, R F-Weft 0,58) dutch IR-Spektrum, Massenspektrum des Methylesters (M: m/e291) und den Vergleich mit synthetisch gewonnener Substanz identifiziert wurde. =&us den Fraktionen 68 his 81 wurde unver~ndertes 2.4-D isoliert und dutch Sehmelzpunkt (F. t36 bis 139 ~ und IR-Spektrum identi- fiziert. In den Fraktionen 140 bis 147 wurde N-(2.4-Diehlorphenoxyacetyl)-taurin gefunden. Die Identifizierung gelang dureh Vergleieh des IR-Spektrums mit dem yon synthetiseh hergestelltem Material sowie durch Naehweis des naeh Hydrolyse freigesetzten 2.4-D.

    Bestimmung yon 2.4.5-T und 2.4-D in Ha m und Kot. Zur getrennten Erfassung der freien, unver~ndert ausgeschiedenen S~iuren und ihrer Conjugate wurden die Harnproben analog dem obengenannten Verfahren an DEAE-Sephadex A-25 (Cl--Form) aufgetrennt. Die entsprechenden Fraktionen warden direkt oder nach tIydrolyse mit Essigs~ure~thylester extrahiert und in den Extrakten 2.4.5-T und 2.4-D nach der frfiher beschriebenen Methode (Grunow et al., 1971) gaschromato- graphiseh bestimmt. Im Unterschied zum 2.4.5-T wurde fiir die Bestimmung yon 2.4-D eine S~ulentemperatur yon 190 ~ gew~hlt und 2.4.5-T als innerer Standard verwendet.

    Fiir die Bestimmtmg yon 2.4.5-T im Kot war ebenfalls eine Vorreinigung der Extrakte erforderlich. Dazu wurden die Kotproben zerrieben, nach Ans~uern mit 2 n Salzs~ure und Zusatz yon 2.4-]) als innerem Standard zweimal mit Jkthanol extrahiert, die alkoholisehen Extrakte eingedampft, die Rfickst~nde mit 0,1 n ~Tatronlauge aufgenommen und an DEAE-Sephadex A-25 (Cl--Form) chromato- graphiert. Zur Bestimmung nach Hydrolyse wurde der Riickstand des alkoholischen Kotextraktes mit halbkonzentrierter Salzs~ure I Std im siedenden Wasserbad er- hitzt.

    JBestimmung und Identifizierung yon 2.4.5-Trichlorphenol in Ratten. und Mduse- ham. Gleiche Mengen Ham und 12 n Schwefels~ure wurden nach Zugabe yon 2.3.4-Trichlorphenol als innerem Standard 1 Std am l~iickflul3 im siedenden Wasser- bad erhitzt. Anschliei~end wurde das erhaltene Hydrolysat mit Wasserdampf destilliert, das Destillat mit Essigs~ure~ithylester extrahiert, der Extrakt mit Natriumsulfat getrocknet, bei Raumtemperatur im Vakuum vorsiehtig eingedampft und der Rfickstand mit Tri-Sil (Pierce Chemical Comp., Rockford, Ill.) silyliert. Die gaschromatographische Bestimmung erfolgte an einer 5' i/8"'-Stahls~ule mit 20 % SE-30 auf Chromosorb W 80/t00 mesh bei einer S~,ulentemperatur yon 165 ~ und einem Tr~gergasdurchflul3 yon 20 ml N~Jmin. Durch Vergleich der Retentions- zeit mit der yon authentischem 2.4.5-Trichlorphenyltrimethylsilyl~ther und durch Aufnahme des Massenspektrums (M: m/e 268) gelang die eindeutige Identifizierung (Gaschromategraph Varian 2740/lVIassenspektrometer MAT 311).

    Synthese von Vergleichssubstanzen

    N-(2.4.5-Trichlorphenoxyacetyl)-taurin. 10,2 g 2.4.5-T wurden mit 12 mlThionyl- chlorid I Std zum Sieden erhitzt. Der (~bersehuB anThionylchlorid wurde im Vakuum abdestilliert und der erstarrte Rfickstand aus n-Hept~n umkristallisiert. 5,5 g des so erhaltenen 2.4.5-Triehlorphenoxyaeetylchlorids wurden langsam unter Schiitteln

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    in eine L5sung yon 2,5 g Taurin in 40 ml 1 n l~atronlauge eingetragen. Die L5sung ~urde filtriert, mit l n SalzsRure angesRuert, zweimal mit Essigs~ureRthylester extrahiert, die wRBrige Phase weitgehend eingedampft und das zur~ckbleibende Natriumsalz mehrfach aus 90%igem und absolutem Athanol um~stallisiert (F. 240 bis 245~ Analyse: berechnet ffir das Natriumsalz CxoHgCIsNNa05S 31,23 % C, 2,36 % H, 3,64 % N, 27,65 % C1; gefunden 31,27 % C, 2,27 % H, 3,60 % N, 27,94 % C1).

    N-(2.4-Dichlorphenozyacetyl)-glycin. 4,4g 2.4-D wurden mit 10 ml Thionyl- chlorid t Std zum Sieden erhitzt. Der Ubersehull an Thionylehlorid wurde im Vakuum abdestilliert und das als Riickstand erhaltene 2.4-Dichlorphenoxyacetyl- chlorid mit einer LSsung yon 1,5 g Glycin in 40 ml t n l~atronlauge krgftig ge- sehiittelt. Der beim Ans~uern ausgefallene Niederschlag wurde abgesaugt und aus Wasser und Essigsliure~thylester umkrisf~llisiert (F. 225 bis 230~ Analyse: berechnet fiir C10H~C12N04 43,19% C, 3,26% H, 5,04% N; gefunden 42,79 % C, 3,27 % H, 4,89 % N).

    N-(2.4-Dichlorphenvxyavetyl).taurin. Das aus 4,4 g 2.4-D und 10 ml Thionyl- chlorid wie vorstehend erhaltene 2.4-Dichlorphenoxyaeetylehlorid wurde mit einer L6sung yon 2,5 g Taurin in 50 ml 1 n Natronlauge kr~ftig geschiittelt. Die L6sung wurde filtriert, mit I n Salzs~ure anges~uert, eingedampft und das zurfickbleibende Natriumsalz mehrfach aus absolutem und 90%igem _~thanol umkristallisiert (F. 231 bis 233 ~ Analyse: berechnet fiir alas Natriumsalz, Hemihydrat Cx0HxaC12N'Na05.sS 33,44 % C, 3,07 % H, 3,90 % N, t9,74 % C1; gefunden 33,33 % C, 3,13% H, 4,00% N, 19,82% C1).

    Messung von pK-Werten. Die pK-Werte yon 2.4-D und 2.4.5-T wurden dutch potentiometrische Titration der l~atriumsalze mit 0,0t n Sehwefels~ure bestimmt (Albert u. Serjeant, 1962).

    Ergebnisse

    Nach oraler Verabreichung yon 2.4.5-T an Ratten wurde aus dem t tarn neben freiem, unver~ndertem 2.4.5-T und dem bereits friiher be- sehriebenen N-(2.4.5-Trichlorphenoxyacetyl)-glycin als weiterer Meta- bolit N-(2.4.5-TricMorphenoxyaeetyl)-taurin isoliert. Dieses Taurin- Conjugat kormte aueh im H a m yon M~usen identifiziert werden.

    Die naeh einer Dosis yon 50 mg/kg renal ausgesehiedenen Mengen des freien und als Glycin- und Taurin-Conjugat gebundenen 2.4.5-T wurden im vereinigten H a m yon i0 Wistar-Ratten gemessen. Die in Tabelle i wiedergegebenen Werte zeigen, dab die beiden Conjugate bei den untersuchten Ratten in etwa gleichen Mengen gebildet warden und ihr Gesamtanteil an der Ausscheidung 7% der verabreichten Dosis betrug. In frfiheren Versuchen war ein noeh hSherer Anteil an gebunde- nero 2.4.5-T beobachtet worden (Grunow et al., i97t).

    Auch im Kot der Tiere war neben unver/~ndertem 2.4.5-T eine geringe Menge in gebundener Form enthalten. In 3 Tagen betrug die Ausschei- dung an freiem 2.4.5-T im Kot 4,8 % der Dosis, w/~hrend in hydrolysierten Kotproben 6,4% gemessen wurden.

    Als Metabolit yon 2.4.5-T wurde im Rattenharn auBerdem 2.4.5- Trichlorphenol nachgewiesen und quantitativ erfal3t. Die renale Aus- scheidung in 4 Tagen betrug 2,3% der verabreichten Dosis. I n einer

  • ~ber den Stoffwechsel yon 2.4.5-T und 2.4-D bei Ratten und M~usen 221

    Tabelle 1. Ausscheidung yon 2.4.5-T und 2.4.5-Trichlorphenol in % der Dosis im Ham und Kot yon 10 m~nnlichen Wistar-Ratten nach oraler Verabreichung yon

    50 mg 2.4.5-T/kg KSrpergewicht

    Tage 2.4.5-T 2.4.5-Trichlorphenol nach Ham Kot Ham Verab frei Glycin- Taurin- frei gesamt gesamt reich. Conjugat Conjugat

    1 33,0 1,7 2,3 2,1 2,9 t,0 2 29,2 1,2 1,0 2,4 3,2 1,t 3 4,4 0,4 0,2 0,3 0,3 0,2 4 t,2 0,I 0,1 -- -- -- 5 0,5 . . . . .

    68,3 3,4 3,6 4,8 6,4 2,3

    Tabelle 2. Ausscheidung yon 2.4.5-T und 2.4.5-Trichlorphenol in % der Dosis im Ham yon 3 weiblichen NMRI-Mitusen naeh oraler Verabreichung yon 50 mg

    2.4.5-T/kg K6rpergewicht

    Tage nach 2.4.5-T Verabreich. frei

    2.4.5-Trichlorpheno] Glyein-Conjugat Taurin-Conjuga~ gesamt

    l 9,2 1,I 7,0 1,3 2 15,7 1,3 3,4 1,0 3 5,4 -- -- 0,2

    30,3 2,4 t0,4 2,5

    anderen Gruppe yon l0 Wistar-Ratten wurden im H a m innerhalb von 4 Tagen sogar 3,9 % der verabreichten Dosis als 2.4.5-Triehlorphenol aus- geschieden.

    Auch bei Miiusen wurden freies 2.4.5-T und seine hydrolysierbaren Conjugate im Harn bestimmt. Die in Tabelle 2 aufgefiihrten Werte deuten darauf hin, dab bei weibliehen Miiusen etwas mehr gebunde- nes 2.4.5-T ausgeschieden wird als bei m~nnlichen Ratten und dab vor allem der Anteil des Taurin-Conjugates vergr6Bert ist. Die lVlenge des im M~useharn gefundenen 2.4.5-Trichlorphenols ist dagegen mit dem bei Rat ten gefundenen Wert vergleichbar.

    Auch nach Verabreichung yon 2.4-D konnten im Rattenharn Conju- gate mit Glycin und Taurin isoliert und identifiziert werden. Jedoch zeigte sich, dab eine wesentlieh geringere Menge in Form yon Conjugaten ausgesehieden wurde als beim 2.4.5-T. Nach oraler Gabe von 50 mg/kg ergaben sieh Werte ffir gebundenes 2.4-D yon weniger als 1% der Dosis.

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    Tabelle 3. Ausscheidtmg yon 2.4-D in % der Dosis ira Ham yon 10 m~nnlichen Wistar-Ratten nach oraler Verabreichung yon 200 mg 2.4-D/kg K6rpergewicht

    Tage nach 2.4-D Verabreichung frei Glycin-Conjugat Taurin-Conjugat

    1 19,2 0,2 0,4 2 19,7 0,3 0,6 3 19,1 0,9 0,2 4 1,3 -- 0,2

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