Arch. Toxicol. 34, 3t5--324 (1975) �9 by Springer-Verlag 1975

t)ber den Stoffwechsel von 3-Amino- 1,2,4-triazol in Ratten W. Grunow, H . - J . A l t m a n n u n d Chr. BShme

Bundesgesundheitsamt, Max-von-Pettenkofer-Institut, Abteilung Toxikologie, Berlin

Eingegangen am 18. August 1975

Metabo l i sm of 3 -Amino- l ,2 ,4 - t r i azo le in R a t s

Abstract. 3-Amino-l,2,4-triazole[5-14C] was administered orally to rats as a single dose of 50 mg/kg body weight. Excretion in urine and feces was followed during a period of 3 days. Within the first 24 hrs the main part of the radioactivity was found in the urine as unchanged amitrole. 3-Amino-5-mercapto-l,2,4-triazole and 3-amino-l,2,4-triazolyl-(5)-mercapturic acid were isolated from urine and identified by comparison with synthetic compounds. The total amount of these metabolites in the urine was about 6 % of the dose. The metabolic pathways of amitrole and the possible relations between biotransformation and toxicity are discussed.

Key words: Amitxole -- Herbicides -- Urinary excretion -- Metabolism.

Zusammen[assung. 3-Amino-l,2,4-triazol[5-1~C] wurde in einer einmaligen Dosis yon 50 mg]kg K6rpergewicht an Rat~en oral verabreicht und seine Ausscheidung mit Ham uncl Kot fiber 3 Tage verfolgr Der Hauptteil der Radioaktivitiit wurde im Ham bereits in den ersten 24 Std in Form yon unver~ndertem Amitrol ausgeschieden. Als Metaboliten wurden 3-Amino-5-mercapto-i,2,4-triazol und 3-Amino-l,2,4-triazolyl-(5)-mercapturss aus dem Ham isoliert und durch Vergleich mit synthetisiertem Material identifiziert. Die Menge dieser Stoffwechselprodukte im Ham betrug znsammen etwa 6 % der Dosis. Der Bildungsmechanis- mus der Metaboliten und m6gliche Zusammenh~,nge zwischen der Biotransformation des Amitrols und seiner Toxizit~t werden diskutiert.

Schli~sselw6rter: Amitrol - - Herbicide -- Harnausscheidung -- Metabolisierung.

3 -Amino- l ,2 ,4 - t r i azo l (Amitrol) i s t ein s t a rk wirksames sys temisehes B la t t - herbiz id . Es wird als E n t l a u b u n g s m i t t e l bei de r Baumwol l e rn t e und zur U n k r a u t - beks im Ackerbau , a u f Wiesen, We iden und Brachfl i ichen, im Obst- u n d W e i n b a u sowie in der Fo r s tw i r t s cha f t verwende t .

Die Ursache ftir seine phy to tox i s ehe W i r k u n g is t noch n ich t endgt i l t ig gekl/irt . Wich t ige pflanzl iche E n z y m e werden gehemmt , die Pu r in syn these wi rd beein- t r~ch t ig t u n d der R ibof lav ingeha l t de r Pflanzenzel le he rabgese tz t (Carter, 1969). Vor a l lem wi rd jedoch d ie Chlorop las tenen twick lung und d a m i t die Chlorophyl l - b i ldung gest6r t , was zu einer s t a rken Chlorose u n d zur WeiBf/ i rbung naeh. wachsender Pf lanzente i le f i ihr t (Wegler, 1970).

I m Vorde rg rund des Einflusses y o n Ami t ro l au f den t ie r i schen Organismus s t eh t die W i r k u n g a u f die Sehilddrfise. D u r c h H e m m u n g der Sehi lddr i isen- Pe rox idase (Alexander , t959; S t r u m u. K a r n o v s k y , 1971) und die d a m i t ver- minde r t e T h y r o x i n b i l d u n g wi rd eine ve rmehr t e Ausschf i t tung des t h y r e o t r o p e n H y p o p h y s e n h o r m o n s verursaeh t , wodurch die Schi lddrt ise s t imul ie r t wird.

Die t h y r e o t r o p e W i r k u n g des Ami t ro l s m a e h t sieh nach for tgese tz te r Appl ika - t ion schon bei sehr k le inen Dosen bemerkba r . So zeigten R a t t e n bere i t s nach

316 W. Grunow et al.

Verabreichung von 2 ppm im Futter fiber einen Zeitraum yon t3 Woehen ver- minderte Jod-Aufnahme der Schflddrfise und geringeren Gehalt an protein- gebundenem Jod im Serum sowie bei 50 ppm Sehilddrfisenvergr6Berung (Fregly, t968). Andere Autoren beobaehteten an Ratten erste Anzeiehen einer anti- thyreoidalen Wirkung bei Dosiertmgen yon 60 ppm im Futter fiber 2 Wochen (Jukes u. Shaffer, 1960), 20 ppm im Trinkwasser fiber 140 Tage (Hapke, 1967) und 25 ppm im Futter fiber 240 Tage (Gaines et al., 1973). Verffitterung fiber ls Zeitr~ume ffihrt sehliel31ich ~tmlich wie bei anderen Thyreostatica zu Adenomen und Adenoeareinomen der Sehilddrfise (Jukes u. Shaffer, 1960; Napalkov, 1962; Innes et al., 1969).

Neben dieser thyreotropen Wirkung wurden folgende weitere Effekte bei Warm- blfitern beschrieben: Induktion yon Lebertumoren nach langdauernder Verab- reichung hSherer Dosen bei Ratten (Napalkov, 1962) und M~usen (Innes et al., t969), Hemmung der Linsenkatalase und Kataraktbildung bei Kaninehen (Bhuyan et al., t973), teratogene Wirkung im Hfihnerembryonentest (Landauer et al., 197i), Inaktivierung der Katalase und Peroxidase der Rattenleber, jedoch keine Wirkung auf die Katalase der Erythroeyten (Iteim et al., t955 ; Heim et al., 1956 ; Kinard et al., 1956), Hemmung der Tryptophanperoxidase der Rattenleber (Auerbach et al., t959), Hemmung des Einbaus yon Eisen und ~-Amiuol~vulinsi~ure in das mikrosomale Ham der Rattenleber (Tephly, 1971), Hemmung der durch Phenobarbital in Rattenleber hervorgerufenen Enzyminduktion (Raisfeld et al., t970).

Das Schieksal yon Amitrol im tierisehen Organismus wurde bisher bei Ratten und Sehafen untersucht. Naeh oraler Verabreiehung yon ~4C-markierter Substanz an Ratten wurde sehnelle Resorption und Verteilung sowie rasehe Eliminierung aus den Geweben beobaehtet. Innerhalb yon 24 Std waren 70 bis 95 % der Aktivi- t/~t mit dem Ham ausgesehieden. Die Gesamtausscheidung erwies sich als dosis- unabh/~ngig und betrug in Ham und Kot in 3 Tagen 80 bis 104 % (Fang et al., 1964). Auch bei Schafen wurden schnelle Resorption und nur wenige Tage dauernde Ausscheidung des unver/~nderten Amitrols festgestellt (Hapke, t967).

Im Harn von Ratten wurden neben unveri~ndertem Amitrol geringe Mengen yon 2 Metabohten gefunden, deren Struktur jedoch nicht aufgekl/~rt wurde. Dureh gleiehzeitige Verffitterung yon 5-8H- und 5-1~C-markiertem Amitrol konnte lediglich festgestellt werden, dab einer dieser Metaboliten in 5-Stellung substituiert ist. Aueh in der Leber wurde aul3er unver/indertem Amitrol ein radioaktives Stoffweehselprodukt beobaehtet, das im RF-Wert mit einem der Harnmetaboliten fibereinstimmte und yon dem es ffir m6gheh gehalten wurde, dab es sich um einen ffir die toxisehe Wirkung verantwortliehen Amitrol-Katalase-Komplex handelt (Fang et al., t964; t966).

Durch autoradiographische Verteilungsstudien an M/~usen wurde neuerdings gezeigt, dab Amitrol besonders yon Geweben mit schnellem Zellumsatz (Knochen- mark, Milz, Thymus, Magen-Darm-Schleimhaut) festgehalten wird (Tj/~lve, t974a; 1975). AuBerdem wurde eine Akkumulierung in den waehsenden Teflen yon transplantierten Tumoren beobachtet (Tj/ilve, 1974b). In der Schilddriise war die Speicherung dagegen nur gering (Tj/~lve, 1975).

Die vorliegende Untersuehung wurde durehgeffihrt, um die ehemisehe Struktur der bei Ratten entstehenden Stoffwechselprodukte aufzukl~ren und zu prfifen, ob

t~ber den Stoffwechsel yon 3-Amino-l,2,4-h'iazol in Ratten 317

sich Hinweise au f einen mSgl ichen Z u s a m m e n h a n g zwischen der l~e tabol i s ie rung des Ami t ro l s und seiner tox i schen W i r k u n g ergeben.

Methodik

Verabreivhte Substanzen 3-Amino-i,2,4-triazol (Bayer AG., Reinheitsgrad mind. 98 %, umkristallisiert aus ~ii.thanol,

F. 155 bis 156 ~ C). 3-Amino-l,2,4-triazol[5-1tC] (New England l~uclear, Boston, Mass., spezifische Aktivit~t 1,17 mCi/mmol).

Versuchstiere und Doslerung Als Versuchstiere dienten m~nnliche Wistar-Ratten aus der zentralen Versuchstieranlage

des Bundesgesundheitsamtes mit einem K6rpergewicht yon ca. 200 g. Die Tiero wurden einzein in Stoffwechselki~figen (Firma Stisse & Schmidt KG, Kassel) gohalten und erhielten Futter (Herilan HAN-MR3, Eggersmarm KG, Rintoln) und Trinkwasser ad libitum.

Zur prgparativen Isolierung der Metaboliten wurde 14C-markiertes Amitrol (2,07 ~Ci/mmol) in einer einmaligen Dosis yon 50 mg/kg K6rpergewicht an 40 Ratten oral verabreicht und der Ham der Tiere fiber einen Zeitraum yon 24 Std aufgefangen. Fiir quantitative Messungen warden 5 Ratten verwendet, die Amitrol (16,0 ~Ci/mmol) in derselben Dosierung erhielten. Ham und Kot dieser Tiere wurde fiber 3 Tage gesammelt.

Radioaktiviti~tsmessung Zur Bestimmung der Aktivit~t des Hams und der bei der s~ulenehromatmgraphischen

Harnauftrenuung erhaltonen Fraktionen wurden aliquote Teile entnommen, mit 10ml Szintillatorl5sung (Toluol mit 0,4% w/v PPO und 0,04 % w/v Dimethyl-POPOP im Gemisch mit Triton X-100 2:1 v/v) vermischt und in einem Flfissigkeits-Szintillationsz~hler (Packard Tri-Carb, Liquid Scintillation Counter 3380) gemessen. Ffir die Messung im Kot wurde dieser getrocknet, zerkleinert und in Proben yon 200 mg in einem Verbrennungsautomaten verbrannt (Packard Tri-Carb, Sample Oxidizer 305).

Diinnschivht. und Papierchromatographie Die diinnschichtchromatographischen Trennungen erfolgten an Schichten aus Kieselgel

PF2~. Fliel3mittel (v/v) : (1) Chloroform/~thanol 90:10, (2) Chloroform/J~thanol/25 %ig. Ammoniak 90: t0: 5, (3) Chloroform/~thanol/Eisessig 80:15: 5, (4) n-Butanol/Eisessig/Wasser 80:20:20, (5)n-Butanol, ges~ttigt mit 5 n Ammoniak, (6) Isopropanol/Wasser 80:20. Die Papierchromatographie wurde absteigend an den Papieren Whatman No. i u n d Schleicher & Sehfill 2043b durehgefiihrt. Fliel]mittel: (7) Isopropanol/25 %ig. Ammoniak/qcVasser i0 :1 :1 . Spriihreagenzien: 5 % p-Dimethylaminobenzaldehyd in Eisessig; 2 % l~atriumnitrit in Wasser, vermiseht mit 2 n Salzs~ure i :1 ; 0,25% H-S~ure [4-Amino-5-hydroxynaphthalindisulfon- s~ure-(2.7), Mononatriumsalz] in AeetonfWasser 1 : 1 (v]v).

Isollerung und Identifizierung yon Metaboliten Der Ham yon 40 Ratten wurde vereinigt und im Vakuum unter sehonenden Bedingungen

auf ein Volumen yon 400 ml eingedampft. ])as so gewonnene Konzentrat wurde in Portionen yon 25 ml durch Ionenaustansehchromatographie an DEAE-Sephadex A-25 (Cl--Form) mit 0,04 n Salzs~ure als Elutionsmittel aufgetrennt (Siiule: 2,5 • 96era, ]ffraktionsvolumen 17,5 ml). Entspreehend der in den Fraktionen gemessenen Aktivit~tsverteilung (Abb. ~1) wurde das Eluat der einzelnen S~ulen im Bereich der drei grSl3ten Peaks zusammengefaBt, vorsichtig eingedampft nnd unter gleichen Bedingungen reehromatographiert.

Der erste Fraktionsbereich (Peak I) enthielt unver~indert ausgeschiedenes Amitrol und in geringen Mengen (etwa 0,06% der Dosis) 3-Amino-5-methylmercapto-l,2,4-triazol, dessen Identit~t mit authentischer Subst~nz durch diinnsehiehtehromatographisehen Vergleieh in vier verschiedenen lfliei]mitteln (R~ in FlieBmittel i : 0,08; Fliel3mittel 2: 0,10; Fliel3mittel 3: 0,48; Fliellmittel 4: 0,60) sichergestellt wurde.

318 W. Grunow et al.

Der zweite Fraktionsbereich (Peak III) wurde diinnschichtchromatographisch mit den FlieBmitteln 5 und 6 gereinigt. Die dabei erhaltene Substanz zeigte FluorescenzlSschung auf der Dfinnschichtplatte und ebenso wie Amitrol positive Reaktion auf aromatische Amino- gruppen (gelbe F~rbung mit p-Dimethylaminobenzaldehyd, violette F~rbung nach Diazotieren und Kuppeln mit H-S~m'e). Das dfimlschicht- und papierchromatographische Verhalten (RF in FlieBmittel 3: 0,36; FlieBmittel 4: 0,65; Flie~mittel 5: 0,i2; FlieBmittel 6: 0,65; Whatman No. 1, Fliel3mittel 7: 0,19) sowie das IR-Spektrum (Beckman IR5A, KBr-Prel31ing, Absorption bei 3350 bis 2610, t640, 1590, 1540, 1480, 1235, 1140, 1065, t030, 860, 760, 750, 710, 640 cm -1) und Massenspektrum [Varian MAT 3tl , 70 eV, m/e (relative Intensitiit): 116 (I00), 85 (7), 74 (18), 57 (25), 43 (17)] waren identisch mit dem chromatographischen Verhalten und den entsprechenden Spektren von synthetisch hergestelltem 3-Amino-5-mercapto-l,2,4-triazol.

Der dritte :Fraktionsbereich (Peak IV) wurde diinnschichtchromatographisch durch Mehrfachentwicklung mit FlieBmittel 3 gereinigt. Dabei wurden zwei dicht benachbarte, nur unvollst~ndig getrennte fluorescenzlSschende Zonen mit etwa gleicher Aktivit~t isoliert, die sich ebenso wie der vorstehend beschriebene lYletabolit mit Reagenzien auf aromatische Amine anfarben liel3cn. Die dfinnschicht- und papierchromatographischen RF-Werte dieser Zonen waren in verschiedenen FlieBmitteln bei einmaliger Entwicklung nicht zu unterscheiden (:FlieBmittel 3: RF 0,08; FlieBmittel 4: R~ 0,40; Whatman No. t, FlieBmittel 7: RF 0,16) und stimmten mit den RF-Werten yon synthetisch gewonnener 3-Amino-l,2,4-triazolyl-(5)- mercapturs~'ure fiberein. Die IR-Spektren (KBr-Prei31ing, Absorption bei 3220 bis 2600, 1720, 1680, 1640, 1530, t405, 1370, 1303, 1208, t130, 1050, 985 cm -1) der beiden Zonen waren unter- einander gleich und deckten sich mit dem IR-Spektrum der authentisehen Probe. Das Massen- spektrum der oberen Zone [70 eV, Quarztiegel, 250 ~ m/e (Intensit~ wegen thermischer Zersetzung sehwankend): 227 (M-18), t68,157, 141,140, 130, t29, 1t6, 112, 11t, 87, 84, 74, 59, 44, 43] erwies sich als identisch mit dem der synthetisierten Mercapturs~ure.

Synthese yon Vergleichssubstanzen 3-Amino-5-mercapto-l,2,d-trlazol wurde nach Arndt u. l~Iilde (i921) aus Hydrazin-N.N'-

bis-thiocarbons~ureamid durch Erhitzen mit Kalilauge gewonnen. Nach der Vorschrift dersel- ben Autoren wurden durch Methylierung des 3-Amino-5-mercapto-l,2,4-triazols mit Dimethyl- sulfat 3.Amino.5-methylmercapto-l,2,4-triazol und durch Oxydation mit Kaliumhexacyano- ferrat(III) Bis.[3-amino.l,2,4-triazolyl.(5) ]-disulfid hergestellt. 3-Amino-5-hydroxy-l,2,4-tri- azol wurde aus Semicarbazidhydrochlorid und Ameisensiiure fiber 3-Hydroxy-l,2,4-triazol und 3-Hydroxy-5-nitro-l,2,4-triazol durch Reduktion dcr letztgenannten Verbindung mit Zinn-(II)- chlorid (Cipens et al., 1966) sowie durch Umsetzung yon Phenylisocyanat mit Isopropyliden- aminoguanidin und Cyelisierung mit Salzs~ure nach Godfrey u. Kurzer (1960) synthetisiert. Hydrazin-N.N'-bis-thiocarbonsdureamid wurde aus Ammoniumrhodanid und Hydrazinsulfat (Beyer, 1949) und Diacetyl-3-amino-l,2,4-triazol (lurch Acetylierung yon Amitrol (Birkofer, 1943) erhalten.

3-Acetylamino-5-nitro-l,2,4-triazol. 3,36 g Diacetyl-3-amino-l,2,4-triazol (20 mmol) warden in einer Misehung aus 20 ml Eisessig und 2 ml Acetamhydrid gel5st, mit 4,2 ml (ca. 100 mmol) rauchender 100 %iger Salpeters~ure (D. 1,513) versetzt und 30 rain im siedenden Wasserbad erhitzt. Die nach dem Einengen der L5sung erhaltenen Kristalle wurden abgesaugt, mit Eis- essig gewaschen und aus Eisessig umkristallisiert iF. 230 bis 235 ~ C; Analyse: berechnet ffir C4HsNsO a 28,08 % C, 2,95 % H, 40,93 % N; gefunden: 28,03 % C, 2,83 % H, 41,07 % N).

3-Amino.5-nitro-l,2,4.triazol. 2 g der vorstehenden Verbindung wurden mit 7,5 ml 2 n Salzsiiure 30 rain im siedenden Wasserbad erhitzt. Die beim Kfihlen im Eisbad erhaltenen Kristalle wurden abgesaugt und aus Wasser umkristallisiert (F. 225 bis 235 ~ C; Analyse: berechnet fiir C~HaNsO 2 18,61% C, 2,34% H, 54,26% N; gefunden: 19,14% C, 2,18% H, 53,67 % N). Dutch Umsetzung mit Zinn-(II)-ehlorid in konz. Salzs~ure wurde die Nitrogruppe reduziert und eine Substanz erhalten, die mit 3,5-Diamino-l,2,4.trlazol identisch war, das aus Dicyandiamid und 80%igem Hydrazinhydrat nach ttofmann u. Ehrhart (i912) gewonnen wurde.

3-Amino-l,2,4.triazolyl-(5)-mercaptursgiure. Eine L5sung yon i,63 g N-Aeetyl-L-cystein (10 retool) in 25 ml 2 n Schwefels~ure und 5 ml Wasser wurde mit einer Suspension yon Kupfer-(I)-oxid versetzt, die aus i g Kupfer-(I)-chlorid in konz. Salzs~ure dutch Fallen mit 5 n Natronlauge, Abfiltrieren, Neutralwaschen und Aufschl~mmen des Niederschlages in

Uber den Stoffwechsel yon 3-Amino-i,2,4-triazol in Ratten 319

20 ml Wasser erhalten wurde. 1,29 g 3-Amino-5-nitro-l,2,4-tr/~zol (10 mmol) in 40 ml t n Schwefelsgure wurden unter Eiskiihlung mit 0,8 g Natriumnitrit in 20 ml Wasser diazotiert. Die dabei erhaltene LSsung wurde nach 30 rain im Eisbad langsam unter Riihren in die gekiihlte Mercaptid-Suspension eingetropft. Nach zweisti~ndigem Riihren wurde die Schwefel- s~ure mit der berechneten Menge Bariumhydroxid gef~llt und das Kupfer durch Einleiten yon Schwefelwasserstoff entfernt. Nach dem Einengen wurde das Reaktionsprodukt, das grSBere Mengen yon 3-Nitro-l,2,4-tri~zol enthielt, durch S~ulenehromatographie an DEAE-Sephadex A25 (C1--Form) mit 0,05 n Salzs~ure gereinigt und mit einem Salzs~uregradienten (0,01 bis 0,05 n) reehromatographiert. Die dabei erhaltene 3-Nitro-l,2,4-triagolyl-(5)-r~ercc~pturs~iure wurde mit Zinn-(II)-chlorid in Eisessig reduziert. Nach Entfernung des Zinns mit Schwefel- wasserstoff wurde das Reaktionsprodukt dureh preparative Diinnschiehtehromatographie an Kieselgel mit FlieBmittel 4 aufgetrennt. Die im RF-Bereich 0,5 bis 0,7 liegende Zone wurde mit Wasser eluiert, das gel6ste Kieselgel dureh S~ulenehromatographie an Sephadex G-I 0 entfernt und das S~iuleneluat eingedampft. Der dabei erhaltene Rfickstand erwies sich bei der diinn- schicht- und papierchromatographischen Priifung als einheitlich, konnte jedoeh nieht zur Kristallisation gebracht werden.

Ergebnisse N a e h ora ler Verabre ichung yon r a d i o a k t i v m a r k i e r t e m A mi t ro l a n R a t t e n

wurde die Ak t iv i t~ t sve r t e i l ung im H a m nach s~u lenchromatograph ischer Auf- t r e n n u n g an D E A E - S e p h a d e x gemessen (Abb. i ) . Aus en t sp reehend zusammen- gefaBten F rak t i onsbe re i chen wurden die ma rk i e r t e n Subs t anzen isol ier t und durch Vergleich m i t syn the t i s i e r t en A m i t r o l d e r i v a t e n identif izier t . Als H a u p t a u s - s che idungsp roduk t wurde unverEnder tes Ami t ro l gefunden (Peak I). I n derse lben F r a k t i o n lieBen sich auBerdem Spuren y o n 3 -Amino-5 -me thy lmercap to - i , 2 ,4 - t r i azo l nachweisen. Aus zwei ande ren F rak t i onsbe re i chen wurden 3-Amino-5-

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Abb. 1. Auftrennung yon Rattenharn nach Verabreichung yon 50mg Amitrol[5-14C]/kg K6rpergewicht an DEAE-Sephadex A-25 (Cl--Form) mit 0,01 n Salzs~ure. Absorption bei 254 nm, -- - - - - relative Aktivit~t. I : Amitrol, I I : nicht identifiziert, I I I : 3-Amino-5-

mercap~-l,2,4-triazol, IV: 3-Amino-i,2,4-triazolyl-(5)-mercapturs~ure

320 W. Grunow et al.

Tabelle I. Ak$ivit~tsausscheidung in Ham und Kot yon 5 Ratten nach Verabreichung yon 50 mg Amitrol[5-14C]]kg K6rpergewicht

Aktivitiit in % der Dosis Tage nach Kot Verabreichung

Ham Harn-Pe~k I II HI IV

t 1,1 78,7 71,7 0,6 2,9 2,7 2 0,2 2,1 1,4 0,1 0,3 0,2 3 0,2 0,6 0,3 < 0,1 0,1 0,1

mercapto-l,2,4-triazol (Peak III) und 3-Amino-l,2,4-triazolyl-(5)-mereaptursi~ure (Peak IV) als Metaboliten isoliert. Eine nennenswerte Ausseheidung yon Bis- [3-amino-t,2,4-triazolyl-(5)]-disulfid und 3-Amino-5-hydroxy-i,2,4-triazol, die als weitere Stoffwechselprodukte denkbar wKren, wurde nicht festgestellt. Sie kSnnten nach ihrem s~ulenchromatographischen Verhalten in dem im Fraktionsbereieh des Harnstoffes beobachteten Peak II enthalten sein. Wegen zu geringer Substanz- mengen und der schwierigen Harnstoffabtrennung konnte jedoeh eine eindeutige Identifizierung nicht durehgeffihrt werden.

Sowohl das isolierte Mereaptoderivat als aueh die Mereapturss zeigten ~hnliche papierehromatographisehe Eigensehaften wie der yon Fang et al. (i964) beschriebene Metabolit 2. Die von denselben Autoren als Metabolit i gekenn- zeichnete Substanz, die in dem angegebenen ~liel3mittel am Start zurfiekbleiben soll, wurde weder im H a m noeh in einem nach Vorsehrift dieser Autoren her- gestellten Leberextrakt beobaehtet.

Die quantitative Auswertung der im H a m und Kot ausgesehiedenen Aktivitiit ffihrte zu dem Ergebnis, dab die Hauptmenge des verabreiehten Amitrols bereits in den ersten 24Std eliminiert wird (Tabelle i). Neben 79% unvers Amitrol enthielt der H a m am ersten Tag etwa 6 % der Dosis in Form des Mereapto- derivates und der Mercapturs~ure. Am zweiten Tag wurden nur noch 2 % der applizierten Aktivit~t im H a m ausgesehieden, wobei der relative Anteil der Metaboliten gegeniiber dem ersten Tag erhSht war. Aus der hohen renalen Aus- seheidung und der geringen Aktivit~t im Kot lal~t sich die gute Resorbierbarkeit des Amitrols erkennen.

Diskuss ion Ftir die Bildung des 3-Amino-5-mereapto-l,2,4-triazols im Stoffweehsel des

Amitrols sind versehiedene Mechanismen denkbar. Einer der m6gliehen Reaktionswege w~re die Einffihrung einer Methyl-

mercaptogruppe durch Umsetzung mit Methion]n mit ansehlieflender Abspaltung des Methylrestes. Als Beispiel ftir einen solehen Einbau der Methylmercaptogruppe ist das 3-Methylmercapto-4-hydroxyacetanilid anzuffihren, das als Metabolit des Phenacetins im H a m yon Hunden identifiziert wurde (Focella et al., 1972) und vermutlieh dureh Reaktion des als Zwisehenprodukt auftretenden N-Acetyl-p- benzoehinons mit Methionfia entsteht (Calder et al., 1974). Ein weiteres Beispiel ist die Umsetztmg yon N-Hydroxy-2-acetylaminofluoren-0-glucuronid mit Methionin in vitro, die zur Bildung yon 3-Methylmereapto-2-aeetylaminofluoren fiihrt (Miller et al., 1968). Das aus Rattenleber nach Verffitterung yon N-Methyl-4-

~ber den Stoffwechsel yon 3-Amino-i,2,4-triazol in Ratten 321

aminoazobenzol isolierte 3-Methylmercapto-N-methyl-4-aminoazobenzol, das bei der alkalisehen Extraktion des an Protein gebundenen l~arbstoffes entsteht (Scribner et al., i965), zeigt ebenfalls, dab eine Ubertragung yon l~Iethylmercapto- gruppen grundsitzlich m6glich ist. Allerdings miiBte im vorliegenden Fall die als zweiter Reaktionsschritt notwendige S-I)emethylierung fast vollstindig verlaufen, da 3-Amino-5-methylmercapto-t,2,4-triazol im Ham der Ratten nur in Spuren auftritt.

Eine andere und wahrscheinlichere M6gliehkeit ffir die Biosynthese des Mercaptoderivates besteht in der Spaltung der als weiteres Stoffwechselprodukt des Amitrols aufgefundenen 3-Amino-l,2,4-triazolyl-(5)-mcreaptursiure. Die Biotransformation yon Mercaptursiuren verliuft allerdings im allgemeinen in anderer Richtung. So wurden nach Vefffitterung yon S-arylsubstituierten Cysteinen und Mercaptursiuren an Ratten als Umwandlungsprodukte im Harn nur die entsprechenden Phenole und keine Thiophenole gefunden (West et al., 1957; West u. Miller, t962). Nur im Fall des Stoffwechsels yon 2-Benzothiazol- sulfonamid bei Ratten, Kaninchen und Hunden wurde einc Spaltung des ent- sprechenden Glutathion- oder N-Acetylcysteinkonjugates beschrieben, bei der der Schwefel am Arylrest verbleibt und damit 2-Mercaptobenzothiazol entstcht (Colucci u. Buyske, 1965).

Im Gegensatz zum seltenen Auftreten eines l~Iercapto- odor l~Iethylmercapto- derivates als l~Ietabolisierungsprodukt ist die Bildung yon Mercaptursiuren ein allgemein iiblicher Stoffwechselweg. Bei Substanzen mit beweglichen Halogen- und l~itrogruppen wird .die Mercaptursiurebildung durch direkte Umsetzung mit Glutathion eingeleitet. Aromatisehe Kohlenwasserstoffe und Amine bediirfen dagegen zunichst einer Aktivierung zu Epoxiden (Boyland u. Williams, t965) oder N-Hydroxyverbindungen (Boyland et al., 1963), bevor die enzymatiseh kataly- sierte Reaktion mit der SH-Gruppe des Glutathions einsetzen kann. Auch fib die Konjugation des Amitrols mit Glutathion diirfte die Bildung einer reaktiven Form notwendig sein. Dabei ist an eine Oxydation zum 3-Amino-l,2,4-triazolyl-Radikal oder zu dem durch Entzug eines weiteren Elektrons entstehenden Kation zu denken. Diese Zwisehenprodukte wiren einer radikalischen oder nucleophilen Substitution durch Glntathion zuginglieh. Eine derartige oxydative Aktivierung des Amitrols wird auch fiir seine nichtbiologische Zersetzung im Boden (Plimmer et al., t967) und fiir die Bildung des 3-[3-Amino-J,2,4-triazolyl-(l)]-alanins in der Pflanze (Casteffranco u. Brown, t963) diskutiert.

Die zur Bildung der Mercaptursiure fiihrende Umsetzung des Amitrols mit der SH-Gruppe des Glutathions liBt vermuten, dab aueh Reaktionen mit Makro- molekfilen der Zelle eintreten kSnnen. Diese Annahme wird bestitigt durch die in Gegenwart yon H~O~ bewirkte irreversible Hemmung der Katalase, die durch Bindung des Amitrols in 5-Stellung an das Imidazol-N des Histidinrestes 74 im Katalase-HaO2-Komplex-I zustande kommt (Margoliash et al., t960; Agrawal et al., t970). Die bei langdauernder Verabreichung h6herer Dosen bei Ratten und Miusen auftretenden Sehilddriisentumoren werden im allgemeinen als hormonell induziert angesehen. Die Eigenschaft des Amitrols, sich im Verlauf seiner Metaboli- sierung an bestimmte Zellbestandteile irreversibel zu binden, liBt jedoch auch eine Wirkung als primires Carcinogen, die im Zusammenhang mit der Beobachtung yon Lebertumoren zu diskutieren wire, nicht ausgeschlossen erseheinen.

322 W. Grunow et al.

Die im 3-Amino-5-mercapto-i,2,4-triazol bzw. in seiner tautomeren Form enthaltene Thioharnstoffgruppierung - - - N H - - C S - - N H - - legt den Gedanken nahe, daft dieser Metabolit an der thyreotropen Wirkung des Amitrols beteiligt sein kSnnte. Tats/~chlich wurde bereits in einer /~lteren Arbeit berichtet, daft 3-Amino-5-mercapto-l,2,4-triazol bei Rat ten thyreostatiseh wirkt. Seine relative Aktivit/~t wurde auf Grund des godgehaltes der Schilddrfisen nach Verfiitterung yon zwei Dosierungen (0,01 und 0,1% im Futter) fiber t0 Tage auf etwa 7% der Aktivit/~t des Thiouracils gesch/ttzt (MeGinty u. Bywater, 1945). Untersuehungen an Ratten, die zur vergleichenden Prfifung yon Amitrol und seinem Mercapto- derivat durchgeffihrt wurden, ergaben jedoch, daft Amitrol sehr viel wirksamer ist als sein Metabolit. Bei Verabreichung yon 20 ppm Amitrol im Trinkwasser fiber 3 Wochen zeigte sich eine statistiseh gesicherte ErhShung der Sehilddrfisen- gewichte, w/~hrend 3-Amino-5-mercapto-t,2,4-triazol selbst bei 100 ppm noch keinen Einfluft auf das Schilddrfisengewicht ausfibte (Kunde et al., 1974). Daraus kann gefolgert werden, daft dieses in der Ratte nur in geringer Menge gebildete Stoffwechselprodukt trotz seiner bei hSherer Dosis beobaehteten thyreostatisehen Aktivit/~t nieht wesentlieh zur Wirkung des Amitrols auf die Sehilddrfise beitr/~gt. Es bleibt jedoeh bemerkenswert, daft Amitrol bei seiner Metabolisierung in eine Substanz umgewandelt wird, die der Gruppe der schwefelhaltigen Thyreostatiea zuzurechnen ist und die wegen des Substituenten in 5-Stellung nieht in der ffir die Katalase-Hemmung dureh Amitrol beschriebenen Weise (Agrawal et al., 1970) wirksam werden kann, sondern einen anderen molekularen Angriffspunkt besitzen mnft.

Herrn Prof. Dr. Dr. reed. F. B~r, dem vormaligen Leiter der Abteilung Toxikologie im Max-von-Pettenkofer-Institut des Bundesgesundheitsamtes, und seinem Nachfolger, tterrn Prof. Dr. reed. H. Uehleke, danken wir fiir die freundliche Unterstiitzung dieser Untersuchung. Fiir die sorgf~ltige Durehffihrung der experimentellen Arbeiten mSehten wir Frau O. Ebert, Fraulein B. Gierszewski, Frau L Kachur, Frau R. Zimmermann und Herrn K. Kretsehmer unseren besonderen Dank aussprechen. Der Firma Bayer AG, Leverkusen, wird fiir die t~ber- lassung yon Amitrol gedankt.

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