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Arch. exper. Path. u. Pharmakol., Bd. 212, S. 255--267 (1951). Aus der Chirurgischen Klinik Heidelberg, und dem Institut fiir medizinische Forschung, Heidelberg. (~ber die Aufnahme yon 0rtho- und Pyrophosphat dureh die Herzmuskelzelle, gepriift mit Radiophosphor 3.2p,. Von OSKAR EICHLER** und KURT SCHMEI$ER. Mit 4 Textabbildungen. (Eingegangen am 10. Juli 1950.) Es ist bekannt, dab o-Phosphat nicht durch einen einfachen Diffu- sionsprozel~ in die Zellen des Muskels eindringt, sondern dal~ ein biolo- gischer Vorgang damit verbunden sein mull. Zum eingehenderen Studium solcher Fragestellungen hat sich die Verwendung radioaktiver Stoffe in der Tracertechnik als sehr niitzlich erwiesen. Ffir die Aufnahme yon Phosphat in die Zelle von Skelett- und Herzmuskel sind vor ahem die Untersuchungen yon SACKS1 zu erw/~hnen. Hiernach wird a2p in der Zellwand zuerst einer Phosphorylierung, einem Einbau in Hexose-6-phosphat unterzogen, ehe es ins Innere gelangt und dem Spiel des Stoffwechse|s fiberantwortet wird. Unser Vorhaben ging dahin, die Gesetzm/~13igkeiten der Aufnahme yon 32p durch das Verschwinden aus der Umgebung herzuleiten. Da eine Reaktion mit der Oberfli~che zu erwarten war, sollten neue Daten fiber die Reaktionsf~thigkeit der Zellgrenzen und ihren Aufbau erhalten werden. Methodik. Fiir unsere Untersuchungen schien uns der isolierte, in gleichm/~l~igenZeit- abst~nden gereizte Ventrikel des Froschherzens besonders geeignet. Das so vor- liegende Versuchsobjekt ist nahezu unbelastet mit anderen Geweben als den Herz- muskelzellen. Diese sind fast gar nicht geschfitzt durch eine Zellage und ein Raum- system, das extravasal ist, aber noch nicht zu den Zellen gehSrt. Durch die Be- wegungen des Herzens zirkuliert die Speisefliissigkeit in s/~mtlichen Spalten des Organs, so daft eine mOgliche Reaktion an den Zelloberflgchen unbehindert und rasch eintreten kann. Zudem lagen schon eine Reihe yon Beobacbtungen vor 2, 3, an die angeknfipft, und die erweitert werden konnten. Die das Herz tragende Kanfile war eingebaut in ein doppelwandiges Gefafl. s3 da{3 die Anwendung verschiedener Temperaturen mSglich war. Wit w~hlten 5° und 25°, um eventuelle Ausschlage mSglichst groB werden zu lassen. Die Reize durch Kondensatorentladungenerfolgte nur alle 5--6 sec, damit auch bei 5° das l~ngsamer schlagende, vor allem tr~ger erschlaffende Herz folgen konnte. * Herrn Prof. K. H. BAu~]~zum 60. Geburtstag zugeeignet. ** Mit Unterstfitzung der Stiftung ffir Krebs- und Scharlachforschung.

Über die Aufnahme von Ortho- und Pyrophosphat durch die Herzmuskelzelle, geprüft mit Radiophosphor 32P

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Page 1: Über die Aufnahme von Ortho- und Pyrophosphat durch die Herzmuskelzelle, geprüft mit Radiophosphor 32P

Arch. exper. Path. u. Pharmakol., Bd. 212, S. 255--267 (1951).

Aus der Chirurgischen Klinik Heidelberg, und dem Institut fiir medizinische Forschung, Heidelberg.

(~ber die Aufnahme yon 0rtho- und Pyrophosphat dureh die Herzmuskelzelle, gepriift mit Radiophosphor 3.2p,.

Von

OSKAR EICHLER** und KURT SCHMEI$ER.

Mit 4 Textabbildungen.

(Eingegangen am 10. Juli 1950.)

Es ist bekannt , dab o-Phosphat n icht durch einen einfachen Diffu- sionsprozel~ in die Zellen des Muskels eindringt , sondern dal~ ein biolo- gischer Vorgang dami t ve rbunden sein mull.

Zum eingehenderen S tud ium solcher Frages te l lungen ha t sich die Verwendung radioakt iver Stoffe in der Tracer technik als sehr nii tzlich erwiesen. Ffir die Aufnahme yon Phospha t in die Zelle von Skelett- und Herzmuskel sind vor ahem die Un te r suchungen yon SACKS 1 zu erw/~hnen. Hiernach wird a2p in der Zel lwand zuerst einer Phosphoryl ierung, einem

E i n b a u in Hexose-6-phosphat unterzogen, ehe es ins Innere gelangt und dem Spiel des Stoffwechse|s f iberantworte t wird.

Unser Vorhaben ging dahin, die Gesetzm/~13igkeiten der Aufnahme yon 32p durch das Verschwinden aus der Umgebung herzuleiten. Da eine Reak t ion mi t der Oberfli~che zu erwarten war, sollten neue Da ten fiber die Reaktionsf~thigkeit der Zellgrenzen und ihren Aufbau erhal ten werden.

Methodik.

Fiir unsere Untersuchungen schien uns der isolierte, in gleichm/~l~igen Zeit- abst~nden gereizte Ventrikel des Froschherzens besonders geeignet. Das so vor- liegende Versuchsobjekt ist nahezu unbelastet mit anderen Geweben als den Herz- muskelzellen. Diese sind fast gar nicht geschfitzt durch eine Zellage und ein Raum- system, das extravasal ist, aber noch nicht zu den Zellen gehSrt. Durch die Be- wegungen des Herzens zirkuliert die Speisefliissigkeit in s/~mtlichen Spalten des Organs, so daft eine mOgliche Reaktion an den Zelloberflgchen unbehindert und rasch eintreten kann. Zudem lagen schon eine Reihe yon Beobacbtungen vor 2, 3, an die angeknfipft, und die erweitert werden konnten.

Die das Herz tragende Kanfile war eingebaut in ein doppelwandiges Gefafl. s3 da{3 die Anwendung verschiedener Temperaturen mSglich war. Wit w~hlten 5 ° und 25 °, um eventuelle Ausschlage mSglichst groB werden zu lassen. Die Reize durch Kondensatorentladungen erfolgte nur alle 5--6 sec, damit auch bei 5 ° das l~ngsamer schlagende, vor allem tr~ger erschlaffende Herz folgen konnte.

* Herrn Prof. K. H. BAu~]~ zum 60. Geburtstag zugeeignet. ** Mit Unterstfitzung der Stiftung ffir Krebs- und Scharlachforschung.

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256 OSKAR ]t~ICHLER und KVRT ~CHMEISER:

Die Speiseflfissigkeit war eine RINCER15sung mit der fiblichen Zusammensetzung : 0,02% CaC12, 0,01% KC1 und 0,01% NaHCO~. Dieser L6sung wurden verschiedene Konzentrationen des markierten Phosphats zugesetzt. Vor der Beschickung der Herzkanfile mit dieser LSsung erfolgte stets eine 3malige, bei Pyrophosphat eine 6malige Spfilung des Herzens mit RI~GERI6sung, um die letzten Plasmareste und damit etwa vorhandenes inaktives Phosphat und die noeh vorhandenen oder 16s- lichen Phosphatasen~ mit einiger Sicherheit zu beseitigen.

Das tterz schlug zu Beginn des Versuchs mit einem Drnck yon 4 cm Wasser. Dieser Druck hatte sich schon frfiher 3 als optimal ffir die Heranbef6rderung der Speiseflfissigkeit ergeben. Mit Blutzuckerpipetten, deren Inhalt mit Hg ausgemessen war, wurden in geeigneten Zeitabst/~nden Proben zur Analyst - - in den entscheiden- den Punkten und Versuchen jeweils 2 - - entnommen und die Radioaktivit/~t im GEIGER-M/)LLER-Z/~hlrohr gemessen. Bei 1/ingerenVersuchen nahm die Flfissigkeit in der Kanfile etwas ab. Das wurde bei der Auswertung der MeBergebnisse berfick- sichtigt. Da bei der Einffillung der die Aktivit/it enthaltenden LSsung stets ein Rest im tterzen zurfickblieb, der eine Verdfinnung der radioaktiven LSsung verursacht und damit eine Aufnahme durch das Herz vort/~uschen konnte, wurden eingehende Versuche fiber diesen Verdfinnungseffekt und zwar durch Kongorot {siehe folgende Arbeit) und gleichzeitig mit Pyrophosphat zu ehemiseher Bestimmung in aus- reichender Konzentration angestellt. Der Effekt fibertraf meist nicht die natfirliche Fehlergrenze und wurde im fibrigen, wenn notwendig, berficksiehtigt. Die Versuche wurden vom Januar bis M/~rz 1949 ausgeffihrt.

Der radioaktive Phosphor ~2p wurde durch Beschu[] von Schwefelkohlenstoff mit sehnellen Neutronen hergestellt, die durch Bestrahlung yon Beryllium mit Deuteronen im Heidelberger Zyklotron entstanden. Der Schwefel wander sich in radioaktiven Phosphor urn. Ein anderes Herstellungsverfahren verbot sich uns. weil jede Verunreinigung durch Metall, besonders Cu, wegen Gefahr der Sch/~digung des Herzens vermieden werden mul]te. Der Schwefelkohlenstoff wurde einfach mit Wasser ausgeschfittelt, dem Spuren yon Na~HP04 zugesetzt war. Das ist der fiblichen, in der Literatur (auch bei KAMEN 4) ZU findenden Vorschrift mit ver- dfinnter Salpeters/iure vorzuziehen. Denn mit vcrdiinnter Salpeters/~ure ergibt sich reiehliche Ausscheidung von Schwefel, die die Trennung st5rt. Sehr viel Mfihe machte uns die Beimengung kleiner Mengen yon Eisen, die eine Senkung des Zu- satzes unter 0,184 7 31p je cm ~ verbot. Reinigung des Schwefelkohlenstoffes durch mehrmalige Fraktionierung fiber eine lange Kolonne unter einer Schicht von Wasser vet der Neutronenbestrahlung ist notwendig.

Die Aulnahme im Verlaui der Zeit und der Temperaturkoe~fizient. Der Verlauf der Aufnahme geben wir auf Abb. 1 bei einer Vorlage

von n u t 0,184 7 P /cm s bei Beginn des Versuehs.

Die lV[essungen sind fiir die beiden Tempera tu ren 5 ° und 25 ° durch- gef/ihrt worden. Es ist deutl ieh ersiehtlich, dab die P-Aufnahme bei 25 ° durchweg grSBer ist als bei 5 °. Bei Beginn des Versuehes bis e twa nach 1 Std ist dieser Temperatureinf luB noch zu vernachl/issigen, weil sich andere Prozesse, wie wir noch sehen werden, i iberlagern. I n der zweiten S tunde jedoeh erhal ten wir dureh Vergleich der Aufnahmegeschwindig- kei t e inen Tempera turkoeff iz ienten Q10 yon etwa 1,57. Dieser ist fiir e inen ehemischen Vorgang sehr klein, wenn er auch ungefahr den Wer ten entspr ieht , die frfiher ~ ffir die Pyrophospha t spa l tung erhal ten wurden,

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Uber die Aufnahme von Ortho- und Pyrophosphat durch die Herzmuskelzelle. 257

die aber e inem einfachen f e rmen ta t iven Vorgang angemessen w~tren. Wir k 6 n n t e n ihn auf den ak t iven ProzeB der Phospha t au fnahme nach SACKS 1 beziehen, der nach den Versuchen yon WILBRAND bei E r y t h r o z y t e n einen sehr hohen Koeff iz ienten besitzt, der sich allerdings erst bei Tempera tu ren bei 25--37 ° voll auswirkt . Es m6gen noch StSrungen u n b e k a n n t e r Art hineinspielen, yon denen wir hier nu r aufz~thlen: 1. die prim~re B indung an der Oberflgche, die yon der Tempera tu r als solcher n ich t beeinfluBt wird. 2. die ver~nderte Herzmechanik bei 5 ° mi t ihrem mehr systolischen, tr~tgen Verlauf k a n n den Zu- gang zu den reagierenden Ober- f l~chen vermindern . Dami t wiirde der zuerst genann te Vor- gang in die zweite S tunde hineinreichen u n d den Nenner

in Q10 vergr6Bern.

U m sicher zu gehen, haben wir n u n m e h r in mehreren Ver- suchen das g e r z bei 5 ° mi t der iiblichen, p32-markierten L6-

sung beschickt u n d einige Stun- den schlagen lassen, bis keine Phospha t -Aufnahme mehr er- folgte und d a n n die Tempera tu r im Verlau£ yon 20- -30 min au f 25° erh6ht. Mit der Tempera tur -

• steigerung fanden wir eine deut- liche weitere Aufnahme von anhiel t .

Wit geben ein Zahlenbeispiel.

h~o~ o,78¢/P/cC I d5 ~.. .

/"" t ,,. # 45 7,0 7,5 S'td z,o

Abb. 1. Abszisse: Zei t in Stuaden, Ord ina te : Auf- nahme. ~ P / g H e r z Ausgangskonzcn t ra t ion 0,184 y P /cm = K u r v e n - D u r c h s c h n i t t yon 4 und 6 Herzen 0 - - - - t P 0 4 b e i 5 ° , q - - - - q - PO4be i 250 , o - o

P~07 bei 25 °.

Phosphat , die allerdings n icht lange

Bei derVersuchstemperatur yon 5 ° wurde nach 7 Std kein Phosphat mehr auf- genommen. Nach Erh6hung der Temperatur auf 25 ° waren es jedoch in der ersten Stunde 0,0042 ;~ P/g/rain, in der zweiten 0,0023 ~, P/g/min, in der dritte n Stunde nut noch 0,00176 y P/g/min.

Man k6nnte daran denken, dieses Ergebnis folgendermaBen zu erkliiren: Die innerhalb der Muskelzelle vorhandenen Phosphate werden sich hinsichtlich

ihrer Aktivitgt allmghlich ausgleichen. Nach Analysen yon CLARK U. EGGLETON 5 sowie denen von Mi)GGE ~, die sich erg~tnzen, sind in einem Herzen von 50 mg (wie das bei uns mindestens der Fall war) 15,1 y Phosphor als o-Phosphat, Kreatin- Phosphat und ,,Pyrophosphat" vorhanden, die in unmittelbarem Austausch mit- einander stehen. In unseren Versuchen waren durchschnittlich 0,736 7 P in der Vorlage, davon wurde nur ein kleiner Bruchteil tats&chlich vom Froschherzen auf- genommen, selbst bei einer Versuchszeit yon 12 und mehr Stunden. Von einer An- n~iherung an ein Gleichgewicht im obigen Sinne kann demnach keine Rede sein. Bei dieser Absch&tzung ist noch gar nicht einmal beriicksichtigt, dab der s~iurel6sliche Gesamt-P bei dem Standardherzen 84,5 y betr~tgt. Nach SACKS 1 haben manche

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258 O S K A R E I C H L E R u n d K U R T S C H M E I S E R :

Teile dieser Fraktion sogar eine hShere spezffische Aktivit/it als selbst o-Phosphat. Dazu kommt noch die Menge der anderen Phosphatfraktionen, die den See (pool), in dem sich die kleinen Mengen des aktiven Phosphats der Kaniile verlieren kSnnten, noch weiter vergrSBert. Diese eben gemachte Erkl&rung kann also zur Deutung unserer Ergebnisse nicht genommen werden. Wir miissen demnach nach einem anderen Vorgang Ausschau halten.

Es gelingt nicht, den Temperaturkoeffizienten bei hSheren vorgelegten Konzentrationen wiederzufinden. Die Kurven nehmen dann dieselbe Form an, wie sie auf Abb. 1 bei Pyrophosphat gegeben wird, d. h. spi~ter-

f t t

0 z - Plongel

0 8 ,9 70 77 Sfd 2Z

Abb. 2. A u f n a h m e v o n P h o s p h a t durch den isol ier ten Froschven t r ike l , d e m anfangs eine K o n z e n t r a t i o n yon 40 r P / c m 3 angebo ten wurde. Abszisse : Zeit in S tunden seit Beginn des Versuchs. T e m p e r a t u r : 25 o, Ord ina t e : oben : Aufnahme y/g Herz bzw. Impulszah l i m Z~hlrohr. u n t e n : Aufnahmegeschwind igke i t in r /g /Minute . 0be r - ste K u r v e : Xrerhalten der Ak t iv i t~ t bei P robeen t - nahmen . Mit t lere K u r v e : Aufnahme des Phospha t s in das Herz pro G r a m m gerechnet . Untere K u r v e : Auf- nahme r /g /Minute . Mit der Anox~mie s t e ig t die Auf-

nahme rap id an (siehe Text) .

2qO

hin h6rt die Aufnahme auf, es bildet sich ein volles Gleich- gewicht aus. Das ist jedoch keinesfalls auf ein Fehlen dieses aktiven Prozesses zu beziehen, sondern nur darauf, dab er eine begrenzte Kapaziti~t besitzt. In unseren Versuchen wurde pro Gramm Herz und Minute nur 0,008--0,04 ~ P befSrdert. Etwa derselbe Wert ist auch bei der n/~chsthSheren Konzen- tration yon 0,608 7 P/cm3 zu beobachten gewesen. Bei hShe- ren Konzentrationen f/~llt er in den Bereich der Ungenauig- keit der Methodik. Nur so er- kli~rt sich die Kurvenform bei den hSheren Konzentrationen.

Beim Pyrophosphat ist das zugteich ein Hinweis auf die

fehlende Penetration dieses Anions durch die Zellgrenzen. Wenn jedoeh die yon der Oberfliichenphosphatase bewirkte Spaltung fortschreitet, muB sekund~r die aktive Phosphataufnahme deutlich werden, wie es auf Abb. 4 sichtbar wird.

St6rungen der Au/nahme.

Bei diesen Verh~ltnissen gibt es eine Reihe yon Bedingungen, die das Phosphat aus der Kaniile rascher zum Verschwinden bringen. Darin besteht eine groBe Einf6rmigkeit, so dab wires nicht fiir notwendig h alten, alle Bei- spiele abzubilden. Wir haben folgende Zustande daraufhin geprtift :

1. Sinken des osmotischen Drucks. 2. Verschiebung der Aziditi~t nach der sauren Seite. Auf Abb. 3 ist das Gleichgewicht bei 2 derart behandelten Herzen

wiedergegeben. Die Herzen erhielten eine LSsung mit dem p~ 6,9--7,0.

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(?ber die Aufnahme yon 0rtho- und Pyrophosphat durch die HerzmuskelzeHe. 259

Dabei schlugen beide 1 Std mechanisch schw/~cher, aber die Sch~digung war bei dem einen Herzen nicht so tiefgreifend, dab es dutch Behandlung mit normalem R~NCER nicht zur vollen Aktion h/~tte zuriickgebracht werden kSnnen.

3. AnoxKmie. Wir verweisen als Beispiel des Verlaufs auf Abb. 2. Die schon seit Stunden sich nicht ,mehr gndernde Aufnahme steigt

pl6tzlich an bei Sistieren der Durchlfiftung. Zugleich wird die mechani- sche Aktivitgt schlechter, bessert sich aber nach Einschaltung der Durch- lfiftung. Die vermehrte F/ihigkeit zur Phosphataufnahme aber bleibt noch - - schw~cher werdend - - darfiber hinaus bestehen.

Es ist unwahrscheinlich, da6 es sich hier um eine VergrSl~erung des vorher besprochenen aktiven Prozesses handelt. Dieser diirfte kaum durch eine St6rung vermehrt werden, vor allem wird er einer Energie- lieferung bediirfen. Diese diirfte aber durch Sauerstoffmangel nicht ver- bessert, sondern nut verschlechtert werden. Es mul3 also ein neuer, noch nicht beschriebener Vorgang vorhanden sein, der einer besonderen Unter- suchung bedarf.

Gleichgewichte und Deduktionen.

Bei unseren Untersuchungen haben wir eine gr6l~ere Zahl yon Konzentrationen angewandt, die nach demselben in Abb. 2 wieder- gegebenen Modus durch die Zellen aufgenommen werden. Wenn nicht St6rungen auftreten, macht sich dabei ein Gleichgewicht bemerkbar. Auf Abb. 3 trugen wir in halblogarithmischem MaBstab die End- konzentrationen in der Kaniile gegen die pro Gramm Herz aufgenomme- nen }, P auf, diese unter der Voraussetzung berechnet, dab alp und 32p vom Herzen nicht unterschieden werden kSnnen.

Der Gesamtverlauf der Kurve weist wiederum auf einen Prozef] der Adsorption hin. Keineswegs kann es sich dabei darum handeln, da$ ein Ausgleich der Aktivit/~t, die wit ja alleine messen, mit dem Phosphat innerhalb der Herzmuskelfaser stattfand. Bei den niederen Dosierungen ist das unmittelbar sichtbar, wie wir schon nach CLAI~KS Analyse oben absch~tzten, selbst wenn wir nur einen Ausgleich mit dem anorganischen Phosphat der Zelle, auch nach MiiGGES Phosphagenindex zulassen wfirden. Bei hSheren Konzentrationen kgme man schon eher an die zu verlangenden Gleichgewichte, aber der Ausgleich w/~re dann zu rasch, da er nicht langsamer erfolgt als bei den kleinsten Konzentrationen. Wit sehen dabei yon dem aktiven Proze6 ab, der aber nut bei der kleinsten Konzentration sich stSrend bemerkbar macht und yon uns durch die niedere Temperatur ausgeschaltet wurde.

Zur Illustration der Verh~ltnisse fiihren wit eine kleine Rechnung durch, indem wir voraussetzen, daf] sich das Phosphat tats/~chlich in Gleichgewicht mit be- stimmten Fraktionen der Herzmuskelzelle setzt. Als Grundlage nehmen wit die Analysen yon C[~ARK U. EGGLETON 5 und zwar einerseits das reine anorganische

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260 0SKAR EICHLER und KVRT SCHMEISER:

Phosphat, andererseits zus/~tzlieh die in engem Austauseh stehenden Fraktionen des Phosphagens und Adenosintriphosphats. Die Aufnahme erfolgt rasch auch in den hier nicht genannten Fraktionen, nach SACKS z. B. in das Hexose-6-phosphat. Wenn wir jedoch die Umsatzzahlen yon Hv, vEs¥, HAH~ u. REBB~ 7 zugrunde legen, die zwar den Froschmuskel betreffen, sich aber fiber die vielfachen zeitintervalle er- streeken, wird der ¢ats/~chlich m6gliche Umsatz in der Beobachtungszeit zwischen den von uns gew~hlten Grenzen liegen. Wirlegen die Rechnung auf folgender Tab. 1 nieder.

8

.¢ ¢

707 8 ;

--pe07 6"

o ~aesahed,~ ! I / A = 2 S O , =0,05.~.. ......... - .

o - ' ' ° ° ~ • • . . ' " / ' / ~ .--- "A=785 K=0,0827

k° ( t ,# ~

7 0 /-/ 8 78 76' 20 24' 28 32 36']v

Abb. 3. Gleiehgcwichte zwischen tIerz und Konzent ra t ion in der Kaniile. Jeder P u n k t der Kurve bedeutet den Durchschni t t yon je 3 - 6 ]~inzelversuchen. Ordinate : Die pro Gramm Herzmuskel auf- genommenen 7' P im logar i thmischcn Mai~stab. Abszisse : Endkonzen t ra t ion in der Kanfile iN ~ P /cm a . . . . . . . . . . erhaltene Kurve o - - - - - o × × dutch Rechnung mitEndgle ichgewicht und Gleichgewichtskonstante wie angegeben erhaltener Verlauf der LiN(~vI~tschen Isothermen. Die Einzelpunkte bedeuten die Aufnahme yon P~O: bei den zugehSrigen Werten der Abszisse bzw.

Durchschni t t von 2 gesch~digten t terzen (n/iheres siehe Text).

Aus der Tab. 1 ist ohne weiteres die vSllige Abweichung der berechneten yon den e rhaltenen Resultaten abzulesen. Ein Ausgleieh kommt nieht in Frage.

Tats~chlich wfirde ein einfacher Ausgleich der Diffusion den bis- herigen E r f ah rungen widersprechen. NachCLA~K u n d EGGLETON 5 wi rdvom Froschherzen auch in 24 Std kein Phospha t in irgendeiner Fo rm an den Kan i i l en inha l t abgegeben. W e n n eine Verb indung zwischen den beiden

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(;ber die Aufnahme von Ortho- und Pyrophosphat dutch die Herzmuskelzelle. 261

Tabelle 1.

Ausgangs- konzentration y / c m 3

Soll/bei PO 4 anorg. Bei PO a anorg. -k

Kreatinphosphat A- Adenosintri- phosphat

0,184 0,608

0,0206 0,18

0,0096 0,084

Tats/~chliche Beobachtung 0,164

* 2 gesch/idigte Herzen.

0,52

0,704

0,230

0,111

0,592

1,68

0,90

0,57

1,45

4,97

3,38

2,22

16,0

14,7

12,9

4,04 14,5

40,0

38,6

36,4

37,0

12,4.

11,1

9,5 (4,63)

5,36

Niveaus innerha lb und au6e rha lb der Kani i l e bes teht , dann k a n n das nur dureh eine , ,Aus tausehdi f fus ion" (exchange diffusion), wie sie yon UssI~G 8 ffir Bewegungen yon N a + in der F r o s e h h a u t in B e t r a e h t gezogen wird, gesehehen. P h o s p h a t w0rde danaeh sich in F o r m einer komplexen B indung an e inem E l e m e n t der Zellgrenze ve ranke rn und mi t den W/~rmebewegungen k6nnte , ana log einer Drehbfihne, das Anion an die andere Seite der Grenze k o m m e n und so die Gelegenhei t er langen, sich dem zellul/£ren Stoffwechsel mi tzute i len . Man sieht, dab es durehaus ein andere r Vorgang ist als der anfangs erw/~hnte ak t ive ProzeB. W e n n solehe Bewegungen mSglieh s ind - - und das Bi ld seheint p laus ibel - - d a n n werden wi t diese Aus tausehfo rm immer dann annehmen k6nnen, wenn dureh Loekerung der S t r u k t u r solehe Drehbewegungen groBer E inhe i t en der Ze l lwand m6glich werden. Man wird fOr die gegensei t ige Verankerung der Baus te ine der Grenzs t ruk tu ren sowohl Wassers toffbrOeken, als auch VA~ bEg WAALSsehe Kr/~fte annehmen d0rfen (AsTBURY bei Myosin). W e n n sie in ihrer W i r k s a m k e i t gesehw/~eht werden, werden wir eine Besehleunigung dieses Aus tausehes e rwar ten dfirfen. So k6nn te m a n eine Erkl~irung ffir die ve rmehr t e Aufnahme yon a2p nach den verseh iedens ten Seh/~digungen des Herzens versuehen.

Dal~ aueh diese Vorstellung dafiir nicht ausreieht, sieht man an der letzten Kolonne der Tabelle, die den Durehsehnitt von 2 geseh/~digten Herzen gibt. Hier ist die Aufnahme betr/~ehtlieh st/~rker als man erwarten kann. Erst wenn man in der kurzen Zeit yon 3 0 ~ 5 rain eine v611ige Verteilung in den gesamten s/~urel6sliehen Fraktionen annehmen wollte, erg/~be sieh ein brauehbarer Wert yon 4,63. Wenn man nicht annehmen will, dab hier 32p yore Herzen st/~rker aufgenommen und trans- portier~ wird als 31p, ist man dazu gezwungen, unspezifisehe Bindungen an Zell- strukturen heranzuziehen.

Als bes te Beschre ibung soleher Vorg/~nge i s t heu te die LANGMUIRsehe

Adsorp t ions i so the rme anzusehen. K x A - - y . . . . . x ~ Endkonzen t r a t i on , Y

y = adsorb ie r te Menge. Die Ab le i tung der Gleichung is t for die En t - wicklung unserer Vors te l lungen n ich t ohne Bedeutung . Sie geht v o n d e r

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262 OSKAR EICHLER und KURT ~CHMEISER:

Annahme aus, da$ die Oberfl/£che nur eine begrenzte Zahl von besetz. baren Punkten besitzt ' . Gegen diesen Wert miiftte die Kurve konver- gieren. Diese Grenze wird dutch unseren Parameter A repr~sentiert, wahrend K tier Gleichgewichtskonstanten entspricht.

Nach dem Verlauf der Messungen werden wit die GrSl~e von A versuchsweise mit etwa 250 y ansetzen kSnnen. Dieser Wef t ist ein Minimum. Auf der Abb. 3 ist die Kurve eingezeichnet, die man mit diesem Einsatz und dem Durchschnitt tier Punkt flit Punkt errechneten GrSSe K erh~lt. Die ~bereinst immung ist, abgesehen yon den Werten bei 4 und 38 y, ausreichend. Jedoch haben wir uns zur Gewinnung eines weiteren ~berblicks die Frage vorgelegt - - wie schon friiher 3 - - wie dicht die Besetzung der zur Verfiigung stehenden Oberfl~che der Herz- muskelfasern anzusetzen sei. Wir setzten dabei den t~adius des Phosphats nach den Volumeninkrementen mit 2,09 X und mit der Packung in geordneten Quadraten an. Das Resultat war unerwartet, denn bei An- nahme einer monomolekularen Schicht konnten hSchstens 165 y P auf tier Oberflache untergebracht werden. Wit haben auch diese theoretisch mSghche Grenzkurve mit der besten Gleichgewichtskonstante auf unserer Abbildung wiedergegeben. Bei niederen Konzentrat ionen sieht man den Vorgang der Adsorption wirksam. Von etwa 4 y pro cm 3 P beginnt ein zweiter Effekt sich bemerkbar zu machen, also noch weit bevor die volle einmolekulare Schicht ausgebildet worden ist. Da es sich beim Phosphat um Einzelionen mit definierter Ladung, nicht um komplizierte polare KSrper, wie die sp~ter untersuchten sauren Farb- stoffe 1° handelt, ist die Vorstellung einer polymolekularen Schicht un- befriedigend. Dagegen finder sich ein gewisser Hinweis durch die Unter- suchungen yon POHLE 11, zugleich mit Anschluft an physiologische Be- obachtungen. POHLE stellte fest, da$ man durch Zugabe yon Phosphat zur Kaniilenfliissigkeit des schlagenden Froschherzens die fiir die Funktion notwendige Kalziummenge einsehr/~nken kSnne. Dieser Effekt beginnt sich in derselben GrSSenordnung bemerkbar zu machen, wit die tats~chliche Phosphataufnahme yon der theoretischen Kurve sich ablSst. POnLE schlieftt aus seinen Versuchen (~hnlich friiher HEUB~R), daft komplexe Kalziumphosphatverbindungen wirksam sind.

Wit haben bei der Kri t ik dieser Versuche 12 auf die MSglichkeit eines I-IOFMEISTER-Effektes hingewiesen, vor allem auch, weil im homogenen Milieu, d. h. in LSsung wirkliehe Komplexe nut bei st~rkeren Aziditaten nachgewiesen wurden. Nach der oben dargestellten Durchreehnung unserer Befunde miissen wit die Festlegung yon Phosphat an bestimmten Punkten in grS$eren Komplexen, wahrscheinlich mit Kalzium postu- lieren, jedenfalls derart, daft dickere Schichten mSglieh sind (mit Kalzium als Briieke ?). Damit verlieren wir vorerst die ~Sgliehkeit einer rechnerisehen Prazisierung. Keineswegs kSnnen wit uns eine Vorstellung

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()ber (tie Aufnahme von Ortho- und Pyrophosphat durch die Herzmuskelzelle. 263

fiber die tatsgchlichen Verhgltnisse bilden. Aber wir halten es ffir m6glich, da6 unsere oben erwghnten Versuche fiber die Aufnahme yon 32p dutch die Herzmuskelzelle nach Anoxgmie usw. auch nicht als tatsgchliche Aufnahme, sondern als die Vergnderung der Herzoberflgche mit vielleicht regulativer Begfinstigung einer Anlagerung aufzufassen sind, als erster chemischer Ausdruck der Schgdigung einer Funktion.

Eine besondere Schwierigkeit geben die Befunde an den beiden Herzen der Tab. l, bei denen die Aufnahme selbst die der grS]3eren Konzen- trat ionen fiberscbritt. Ihre Schgdigung erfolgte aber durch Sgure, wobei die Bedingungen zu einer Fgllung yon Kalziumphosphat ungfinstiger sind. Auch die auf Abb. 2 dem Sauerstoffmangel folgende Mehraufnahme pfropft sich der maximalen Phosphatspeicherung auf. Man kSnnte dabei die Vorstellung versuchen, dab POa als Kalziumsalz gefgllt, in den Spalten des schlechter durchspiilten I-Ierzens festgehalten wird. Aber gerade hierbei sieht man das Unzureichende solcher Erklgrungen, denn trotz vSllig wiederhergestellter mechanischer Aktiviti~t hglt der Phos- phatschwund aus der LSsung an. Wie sich Partikel verhalten, zeigen fibrigens Farbstoffversuche 10.

Wghlt man zum Vergleich die Fgllungsgrenzen, wie sie bei der Ver- kn6cherung in Bildung und tteilung der Rachitis empirisch in dem Ca • P des Blutplasmas in Erscheinung treten, dann wird man unter Beriieksichtigung der teilweise komplexen Bindung des Kalziums die Bedingungen daffir erst bei Phosphatkonzentrationen yon fiber 10 y P pro cm 3 ab linden. Auch im Liquor cerebrospinalis sind die Konzentra- tionen an Ca und P hSher, so dai~ man die einfache ~berschreitung eines LSslichkeitsproduktes ffir diese Grenzen aussehlie6en kann. Wir haben damit das Problematische unserer Befunde nach einigen Seiten heraus- gestellt.

Die Bindung des Pyrophosphats.

Zur Prtifung des Bindungstyps dieses Anions stehen uns nieht die gesamte Gleichgewichtskurve, sondern nur einige Punkte aus 8 gelun- genen Versuchen zur Verffigung (Abb. 3). Selbst wenn man berficksich- tigt, da~ mit einem Ion die doppelte P-Menge gebunden wird, sieht man die grS~ere Bindungsfestigkeit des Pyrophosphats, nur zum Teil auf einer grSl]eren Reaktionsgeschwindigkeit beruhend.

Wir kSnnen die LANGMU~Rsehe Isotherm~ zur Formulierung einer kinetischen Gleichung verwenden und wfirden nach unserer frfiheren Bezeichnung erhalten :

dx at= = --K1 (A- -y ) ~- Key. (1)

mit K2, der Dissoziationskonstanten. Man sieht sofort, daI~ im Gleich- gewicht die Isotherme resultiert. Wir kennen in unserem Falle die GrSBe

Arch. exper. Path. u. Pharmakol . , Bd. 212. ] 8

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264 OSKAR EICtILER und KURT SCHMEISEP~:

A, also auch A-y nicht. Jedoch nehmen wir probeweise an, dal~ die ZahI der an der Oberfl~che besetzten B indungen (wir kehren zur Able i tung yon LA_WGMUIR 9 zurfick) im Verhi~ltnis zu der tatsi£chlichen Auf ladung bei unseren Konzen t r a t i onen so gering ist, dab wir den 2. S u m m a n d e n der Gleichung, d . h . die Bedingung der Reversibi l i t~t der Reakt ion, ver- nachliissigen. Wir formulieren j etzt etwas anders :

dC dt : - -KI (C~-- C) (C o -C) . (2)

C~ entspr icht dem Endgleichgewicht, das bei der un te r such ten Konzen- t r a t ion zu erwar ten ist. C O : Anfangskonzent ra t ion . Wir rechnen nicht mi t Molarit£ten, sondern ~,/cm a. Die In teg ra t ion wurde ausgeffihrt, wobei wir sowohl als Grenzen die Zeiten 0 und t, als auch t,, bzw. t~+~ ver- wandten . Wir erhiel ten so 2 verschiedene K o n s t a n t e n (mit x : der auf- genommenen Menge) z. B. ffir die letzte Ar t der In t eg ra t ion

1 (Co - - x2) ( C ~ - - xl) K'I -- (A2 - - Ai) (Cc~ - - Co) l~t (C o _ Xl) (Cc~-- x2) " (3)

Die so erhal tenen Resul ta te geben wir auf Tab. 2 wieder.

Tabelle 2.

Ausgangs- konzentrat ion 2 rain 4 rain 7 min 15 rain 30 rain 60 rain

0,1847 K1 i 2,39 3,02 2,03 1,27 1,461 ~,' K t i 0,347 0,287 0,278 0,200 0,143 0,129

K'11 0,347 0,235 0,267 0,130 0,087 0,114

Wit kOnnen aus der Tabelle eine ausreiehende (Tbereinstimmung der Kon- stanten in jeder Versuchsserie in bestimmtem Zeitintervall entnehmen. Die (~ber- einstimmung wird systematisch bei Anniiherung an das Gleichgewicht schlechter.

Ins Auge fallend ist die verschiedene GrSBe der Konstanten bei beiden Konzen- trationen. Man kann das darauf beziehen, dab bei den hOheren Konzentrationen eine starke Ann~herung an das Gleichgewicht A erfolgt, so dab die Fortlassung des 2. Summanden in Gleiehung 1 zu Fehlern ffihren muB, d. h. die oben fiir Phosphat geltende Art der Oberfl/ichenbeladung gilt nicht ffir Pyrophosphat, das sehr viel schw/~cher, weit unterhalb der vollen F1/~chenbesetzung aufgenommen wird. Man kann das auch dureh die LA~oMumsche Isotherme selbst nachweisen, die 2 Para- meter (A und K) enth/~lt. Mit 2 Gleiehungen kann man fiir beide einen Wert erhalten und kommt zu demselben Resultat. SchlieBlich sieht man dasselbe auf den beiden Gleiehgewiehtspunkten der Abb. 3. Wenn man beobachtet, dab um in ~quivalenten vergleichbare Werte zu erhalten, die ~-Zahlen des Pyrophosphats zu halbieren sind. Wi~hrend bei der kleineren K~)nzentration auch dann noch eine deutlich starkere Affinit/~t resultiert, fallen bei der h6heren Konzentration die Werte etwa zusammen, ein Zeiehen der rascheren Krfimmung der Kurve.

Die fast gleiche GrSBe der berechneten Assozia t ionskonstanten K 1 zeigt, dab der Verlauf der Bindung yon Pyrophosphat auch der Gesetz- mgBigkeit einer monomolekularen Reakt ion folgt, aber keinesfalls mit einer Bindung von 2 Ionen an einen Akzeptor vereinbar ist. Das scheint in Widerspruch zu unseren Beobachtungen fiber die Ordnung der

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(?ber die Aufnahme yon Ortho- und Pyrophosphat durch'die Herzmuskelzelle. 265

Reaktion 2 zu stehen, wenn wir nieht die ehemische Bindung wie hier, sondern die physiologische Funktion als Kri terium benutzen. Denn danach miissen sich 2 Molekiile an einen Akzeptor binden. Diese beiden anscheinend so differenten Erfahrungen sind aber durchaus vereinbar. Denn unsere 1V[essungen liegen unterhalb derjenigen Konzentrationen, bei denen eine funktionelle ~nderung sichtbar wird. Wenn eine Bindung aber 2 Molekiile aufnimmt, wird eine Dissoziation 2stufig erfolgen k5nnen. Es dr/£ngt sich so die Auffassung auf, daft nur soweit eine mechanische "~nderung sichtbar wird, als die Bindung der 2. Stufe erfolgt ist. Diese Beobachtung ist zu wichtig, als dab man sich mit den bisherigen Messungen beruhigen kSnnte.

Die Komplexit/~t der Pyrophosphat- Binding soll noch an folgendem Versuch eine Erl/~uterung erfahren, wie er auf Abb. 4 wiedergegeben ist.

Wit sehen auf der Abb. 4 einen raschen Abfall, dem ein sekund/~rer An- stieg folgt. Die schon aus der Kantile verschwundene Aktivit/~t wird also wiederum in der Speisefliissigkeit nach- weisbar. Wenn wir auch schon vorher mit 1)hosphat unter den verschiedensten Gesichtspunkten ableiten konnten, da6 vorwiegend eine Bindung an der Oberfl/~che erfolgt, ist hier ein eindeu- tiger und zwingender Beweis gewonnen. Denn ein in das Zellinnere aufgenom-

qoo

800

200

700 o 0,5 7,o 7,5 Sfd ~,o

k b b . 4. Wiedergabe der Z/ thl rohr impulse in P roben der Kanfilenflfissigkeit , in der P y r o p h o s p h a t ill der Menge yon 0,184 y p r o e l n a zugesetzt w<)rden war. Abszisse: Zci t in Minuten. Ord ina te : Zahl der I m - pulse in der jeweils gemesseneu Probe . J e d e r P u n k t i s t der Durchschn i t t e iner Doppe lbes t immung . Er l~u te rung s. Text .

menes Phosphat kann aus diesem relativ riesigen Reservoir inaktiven Phosphats nicht wieder ausgeschieden werden.

Wir kSnnen 2 Wege vermuten, wie der gemessene Effekt durch ein- faehe physiko-chemische Prozesse erklart werden kann - - unser wich- tigstes Anliegen bei der Erforschung der Zellchemie und Zellstruktur:

1. Dureh die Spaltung des Pyrophosphats dutch die Phosphatasen der Zelloberfl~tche, die schon friiher nachgewiesen wurden 3, werden aus einem Anion zwei, und eines wird in der Speisefliissigkeit erscheinen, wenn fiir die Bindung vor allem elektrostatische Krgfte wirksam waren. Diese Interpretat ion m6chten wir ablehnen, sehon well die Reaktion im Verh~tltnis zur Phosphatasespaltung zu rasch verlguft.

2. Als Komplexbildner binden sich bestimmte Anionen an in der Zell- grenze eingebaute Cu-Atome. Es wurde friiher nachgewiesen is, dub durch Komplexbildner Cu aus der Oberfl~che der Herzmuskelzelle herausgel6st werden kann, so daft es im Kaniileninhalt erseheint. Die auf der Abb. 4

18"

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266 OSKAR EICttLER und KURT ~CHMEISER:

s ich tbare E rhebung wfirde die Heraus l6sung von 0,048 y Cu bedeuten . ] )as is t eine Gr6l~e, die nach unseren fr i iheren chemischen Bes t immungen durchaus zu e rwar ten w~re. Desha]b bevorzugen wit diese A r t der Erkl~rung.

Bei der Bindung an die Oberfl~che lag die F rage nahe, ob eine Para l le l i t~ t mi t der frfiher a gemessenen A k t i v i t ~ t der Phospha t a sen der Herzmuskelober f l~che nachzuweisen wKre. Desha lb haben wir an den Versuch fiber die Aufnahme yon a2p noch folgende Prfifungen des Herzens angeschlossen :

1. Es wurde die Aufn~hme von K o n g o r o t festgestel l t . Eine 0,002o" -O~/o LSsung wurde ffir 10 min eingeffillt, um das Verschwinden der F a r b e festzustel len. Diese Pr i i fung g ib t uns Auskunf t fiber die rasch zur Auf- nahme berei te Herzoberf l~che, was wir 1° ausffihrl icher untersuchten .

2. Eine m/1000 Pyrophospha t l6 sung blieb 1~ S td bei 25 ° in der Kanf i le zur Fes t s t e l lung der ind iv idue l len Aktivit~i,t des Herzens (ge- rechnet auf 1 Std). Die Resul tu tc , au f g /Herz berechnet , legen wir au f folgender Tabel le vor :

Tabelle 3.

Versuchs- Nr.-

19 20 21

32 33 34 35 36

Endaufnahmc * y P/g Herz

5,2 7,88 6,64

Freisetz. v. P04 durch

Phosphatase Kongorot-

speichcrung

65,3 394,0 392,0 831,0 284,0 663,0

614 526

1210 652 452

Phosphatase i Konfforot Endkonzentrat. Endkonzontrat.

10,0 75,6 39,8 105,0 34,2 100,0

64,0 294,0 26,4 232 63,3 400 24,0 220 26,4 270

3,77 7,0 5,05 7,33 8,18

9,60 • 19,80 19,06 27,I |7,1

* Gemessen durch die Aufnahme yon 3ep bis zum Gleichgewicht.

Aus der Tabel le is t ein gewisses Sinken und Steigen der chemischen Aufnahme mi t beiden gemessenen F a k t o r e n s ichtbar , wie m a n besonders le icht sehen kann , wenn m a n die P u n k t e in F o r m eines S c a t t e r d i a g r a m m s auf t r~gt . Bei der n iederen K o n z e n t r a t i o n (die ers ten 3 Versuche) scheint die K o n g o r o t - A u f n a h m e besser zu passen, bei der h6heren, d . h . dell l e tz ten 5 Versuchen dagegen die Phosphatase-Akt iv i t i~ t . J edoch ist das Mater ia l zur Aufs te l lung einer Kor r e l a t i on und zu s ta t i s t i scher Eu t - scheidung n ich t ausreichend, g ib t aber doch einen Hinweis .

Die Korrelation der Aufnahme yon Kongorot in Phosphataseaktivit~t ist schwaeh positiv. Korrelationskoeffizient: r -- -]- 0,33 -~ 0,052 (15 Versuche).

Zusammenfassung.

Es wurde die B indung yon PO 4 und P~O 7 durch das isolierte Frosch- herz mi t Hilfe der Phosphor i so tope a2p untersucht .

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t'Tber die Aufnahme von Ortho- und Pyrophosphat durch die Herzmuskelzelle. 267

Bei ganz kleinen Konzen t ra t ionen (0,184 y P/cm 3) wurde ein akt iver ProzeB sichtbar, der eine Kapaziti*t yon 0,008 7 - -0 ,04 y P/g Herz /min FSrderleis tung besaB. Der Temperaturkoeff iz ient war klein (Q10 ~ 1,57).

Der weitaus iiberwiegende Verlust aus dem I n h a l t der Herzkanii le ist einer Adsorpt ion zuzuschreiben. Die Gleichgewichte folgen bei kleineren Konzen t r a t i onen der LA~GMtT~Rschen Isotherme, keinesfalls k a n n hier eine 1V[ischung mit den Phospha tve rb indungen des Zellplasmas in Frage kommen.

Oberhalb 4 ~, P/cm a wird ein zweiter ProzeB sichtbar, so da6 die Ober- fli~che st/~rker beladen wird als der Raumbe a nsp r uc hung des PO~ entspricht .

Durch Sch/*digung des Herzens (Azidit~t, Anoxi~mie, osmotischen Druck) wird seine Aufnahmefghigkei t vergr56ert.

Pyrophospha t wird sti~rker aufgenommen, aber das Endgleichgewicht ist schw/*cher. Seine B indung folgt in gewissem Bereich der Aktivit/~t der Phospha tasen der Herzoberfl/iche.

Die Bindungsgeschwindigkei t folgt e inigerma6en einer einmoleku- laren Reakt ion.

In einer ersten Phase verl/~uft die Aufnahme periodisch, wahrschein- lich weil Pyrophosphat als Komplexbi ldner mi t Kupfer sich an dieses b inde t und der gesamte Komplex vori ibergehend in den Kan i i l en inha l t zuri ickkehrt .

Literatur. 1 SACKS, J. : Cold Spring Harbor Sympos. Vol. XIII, 180 (1948), Daselbst Lite-

ratur. - - 2 EICHLER, O., tl. E. WOLFF: Arch. exper. Path. u. Pharmakol. 203, 1 (1944). - - a EICHLER, O., U. W. S'IOBER Arch. exper. Path. u. Pharmakol. 205, 647 (1948). - - 4 KAME~, M.D. : Radioactive Tracers in Biology, S.184. New York 1948. - - 5 CLAttK, A . J . , M. G . EGGLETO~, U. P. J. EGGLETOI~: Physiol. 75, 25P (1932). - -

MttOGE, H.: Arch. exper. Path. u. Pharmakol. 178, 333 (1933). - - v H~v~sY, G. L. HAItN, u. O. I~EaBE: Biol. Medd. danske Vidensk, Selsk. 16, 81 (1941). - -

USSLnG, H. H. : Cold Spring Harbor Sympos. XIII, S. 193 (1948). - - 9 EUCKEN, A. : Lehrbuch der chemischen Physik II, 2, 1225ff. - - 10EICHLER, O. , R. SCtt(~TZE, U. I. APFEL: anschlieBende Arbeit. - - 11 POHLE, K. : Arch. exper. Path. u. Pharmakol. 178, 109 (1935). - - 12 EICHLER, O.: Pharmakologie anorganische Anioncn. Die Hofmeistersche Reihe. HEFFTER-HEuBNERS Handbuch der experimenteUen Pharmakologie, Erg.-W. Bd. 10. Springer 1950. - - la EICHLER, O.: Naturwissen- schaften 85, 192 (1948).

Prof. Dr. O. EICItLER, Heidelberg, Chirurg. Univ.-Klinik.