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UBER DIE BLUTGRUPPENMERKMALE IM HARN DES MENSCHEN IHRE QUANTITATIVE AUSMESSUNG UND ANREICHERUNG IN TROCKENPRAPARATEN VON ERIK JORPES und GUNNAR NORLIN (Eiriyeguriyen bei dev Redaktioik am 2% September 1935). I)as Vorkommen iler Blutgruppeiiiiierkinale in Iiiirperfliis- sigkeiten rrleichtert wesentlich ihr Htucliurn, besonclers ilw Vor- laniiiieii in tleii Ex- uiid Selueteii, z. B. iiri Speichel, iiii Blageii- Raft nnd im Ham. Durch F. schiff’) ist sogar eine quantitative Sclikitzung ihrer Menge in den vei+schiecleiieii I~iirperfliissigkeiteii geinaclit worden. Reiiiherstelluiigsversuche aus Speichel untl Ilarn sind voii &&iff und Bu~im~) und aus Ham von Freudcit- berg, Bichd und DirscherP) angestellt worden. Die Resultate clieser Untersuchungen Rind sehr iiiteressant. Das gereinigte BIaterial aus Speirhel uncl besonders tlas 8x1s Haim lieinnit in sehi. kleinen IIengen die A-spezifische Schafbluthamolyse. Die Wirkiiiig sclieint an ein Polysaccharid gebulzclen zu sein. Ein ahnliclies Matei*ial mit einer hochgradigeii Speeifieitat fur A- Antisera liabeii Schiff und seine Mitarbeiter aus kauflichein Pepsin dargestellt. Diese Ergebnisse, die einen naheii Zusammeiihaiig zwischen cleii 11lutgrnppenrezeptoren und deli Polysacchariden andeuteii koniiten, beziehen sich auf die A-Giwppe. Um das B-Merkmal zu verfolgeii, muss eine anclere Messmethode gewahlt werden, i, P. Schiff, Uber die gruppenspez. Substanzen (1. menschlichen Kor- ’) 6’. Schiff 11. B. Bralzn, Klin. Wochenschr., 11, 1592 (1929). ’) li. P’rezcdmberg, H . E’icliel u. W. Dirscherl, Naturwiss. 20, 687 (1932). pers (1931);

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UBER DIE BLUTGRUPPENMERKMALE IM HARN DES MENSCHEN

IHRE QUANTITATIVE AUSMESSUNG UND ANREICHERUNG IN TROCKENPRAPARATEN

VON

ERIK JORPES und GUNNAR NORLIN (Eiriyeguriyen bei dev Redaktioik am 2% September 1935) .

I)as Vorkommen iler Blutgruppeiiiiierkinale in Iiiirperfliis- sigkeiten rrleichtert wesentlich ihr Htucliurn, besonclers ilw Vor- laniiiieii in tleii Ex- uiid Selueteii, z. B. iiri Speichel, iiii Blageii- Raft nnd im Ham. Durch F. schiff’) ist sogar eine quantitative Sclikitzung ihrer Menge in den vei+schiecleiieii I~iirperfliissigkeiteii geinaclit worden. Reiiiherstelluiigsversuche aus Speichel untl Ilarn sind voii &&iff und B u ~ i m ~ ) und aus Ham von Freudcit- berg, Bichd und DirscherP) angestellt worden. Die Resultate clieser Untersuchungen Rind sehr iiiteressant. Das gereinigte BIaterial aus Speirhel uncl besonders tlas 8x1s Haim lieinnit in sehi. kleinen IIengen die A-spezifische Schafbluthamolyse. Die Wirkiiiig sclieint an ein Polysaccharid gebulzclen zu sein. Ein ahnliclies Matei*ial mit einer hochgradigeii Speeifieitat fur A- Antisera liabeii Schiff und seine Mitarbeiter aus kauflichein Pepsin dargestellt.

Diese Ergebnisse, die einen naheii Zusammeiihaiig zwischen cleii 11lutgrnppenrezeptoren und deli Polysacchariden andeuteii koniiten, beziehen sich auf die A-Giwppe. Um das B-Merkmal zu verfolgeii, muss eine anclere Messmethode gewahlt werden,

i , P . Schiff, Uber die gruppenspez. Substanzen (1. menschlichen Kor-

’) 6’. Schiff 11. B. Bralzn, Klin. Wochenschr., 11, 1592 (1929). ’) li. P’rezcdmberg, H . E’icliel u. W. Dirscherl, Naturwiss. 20, 687

(1932).

pers (1931);

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weil H-Antisera niclit leicht tlarznstellen sincl, namlit~li (lie W i l l -

dnng zn 13-Isoagglutinin. na die Isoagglutininbindung clir Mijfi- lielikeit gibt, die beiden Blutgrnppeneigenschaften mit c1ersell)en Methodik zn iinteiwichen, nalimen wii. tins vor, die Blixtgi.iipprn- rezeptoren in1 Harn zn verfolgen, znnachst in der Absicht, ein I(o1ilenhyclrat-Praiparat aus B-EIarn herzustellen und wenn iiiiig- lich niit dernjenigen von Frerdenberg, Eichel untl Dir.scho.E aiis A-Ham zn vergleichen. Die wahrentl rler Arbeit gemacliteii lie- obachtungen verursachten wesentliche Abanderungen.

Trotz cles gesingen Gehalts an A und B ist der Hnrn f u r tliesbeziigliche Praiparationen eiii geeignetes Material, wril er wenig Eiweiss enthalt. Re in Eindampfen und Entfei-nen tlrs IIaimtoffs nnd der Salze durch Dialyse kann die Aktivitiiit aiif das zwanzig- bis fiinfzigfaclie konzentriert werden. Weil 0,25 ccin B-Harn etwa dieselbe Wirknng auf P-Isoagglutinin ansiibt wie 0,004-0,008 ccm B-Blut beim Aclsorptionsvei.siicli, wird der l Iarn nach der Konzentration eine sehr geeignete Ma- terialquelle. Deshalb wurde Harn nach den Vorschriften roil Pchiff, bezw. Frcudenbei-y, Eichel nnd Dir*schei*l bearbeitet his zn der voii diesen Antoren verwendeten Reinigung niit 13leiacr- tat. ER zeigte sich nanilich, dass die isoagglutininbindentleii Rr- aeptoren sowohl ails A- als auch am R-Ham mit Blei gefallt wui-den, so (lass (lie weitere Bearbeitnug abgeandert wertleii iiiusste. Znerst riiiisste jedoch cler quantitative Verlauf der Iso- i~gglutiniiihiiidiiiig etwas naher studiert werden, um ein fir- iiaiies Verfolgen tler Agglutinogene wahi*end cler Praiparatioii zii ermoglichen.

/ l i e quantitutivc UPstinznzung von A mad B rnit rneiischliclioi Nomalse ia .

Die Illutfi.rnI,pen~i~enschaften binden auch in weniger reinen Liisun- gen qiimtitativ die entsprechenden Isoagglutinine, unter AhschwXchung tles Ti tws der Normalsera. Die iibriggebliebene Isoagglutininmenge kann tlcrch ACglutinRtionsversnche nustitriert werden. Die Agglutination wird direkt ohne Lnpe abgelesen. Zur Fixation der Rezeptoren wurde die Mischung von Serum nnd RezeplorlGsung M Stunde bei 38’ gehalten. IAngeres Stehen veriinderte die Resultate nicht wesentlich. Beim Verdiin- nen des Serums mit Kochsalzliisung 1 :2 wird die hgglutinationszeit ge- wiihnlich verdoppelt. Dasselbe wird auch erreicht, wenn das Serum init einer doppelt so grossen Rezeptormenge versetzt wird. Bei der Aus-

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wertung der A- iind B-Priiparate wurde dieses I'rinzii) 1)enutzt. In einrr Ileihe w n Kiihrchen wurde die Konzentration der Rezeptorlosung so ;ihgemessen, (lass eine geometrische Progression vorlag. Eineni Volunirn I~ezrptorliisung mnrde ein Volumen Normalseruin mit (Y ocler p oiler beiden xugesetzt. Von jetlem Kiihrchen wurden nach Bindung des S g - glutinins Vertliinnnngen geniacht und die Agglutinationszeiten diesrr Verdunnungm iihgelesen. I hirch tlieses koinplettierende Verfahren erhiilt inan ein recht giites Bild tler Starke des auf 9 oder H zu iintersnchendrn I1I:iterials. Einr Verdoppelung drr Reaeptorstiirke verursiicht eine Ver- schirlning tler Agglutinationseeiten in den rerschiedenen Verdiinnungrn uul eine Stufr nach links (s. Tab. 11). Bei einer AbschwLchung der llezeptorstiirke uin 28 To kann eine Verkiirzung der Agglutinationszeiten wahrgenommen wertlen ; ein Abstnmpfen bis zu 50 % verursacht einp Versehiebung nach rechts in der Tabelle. Als Einheit des Rezeptors kvnnte diejenige RIenge gewlhlt werden, welche den Titer des Sei*iinis his eur Hiilfte abstunipft oder eine Versehiellung der Agglutinationszriten uni einen Schritt nach links gibt. Diese hfenge wechselt mit den1 Titer des verwendeten Serums, wie BUS den Tabellen I nnd I1 hervorgeht. E'olglich Biinnen nur (lie mit eineni untl demselben Serum ausgefiihrten Titrationen initrinander verglichen werden. Von der verwendeten Rlut- 1~iirpercIiensus;I)ension muss auch ein bestiinmtes Volumen, am bestrn v o n rineiii I)estimmtm Menschen um Titerschwankungen zu vermeidm, geiioninieii werden. Es werdrn jeden Tag frische Blutkorperchen genon- Inm. L)irse Technik Itisst pin genaues Verfolgen cler Agglutinogene zu, \vie am den in der folgenilrn Arbeit vorkoniruenden Tabellen heworgelit. 1)ie Ziffrrn geben (lie Zeit d w niakroskopisch wahrnehn~b~ren Axgliit~n~i- t ion an.

TABELLE 1. A. HarnprBparal.

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TABELLE 11. A. dasselbe Hamprciqarai mit eiriem

anderen Serum gegriift.

Serumverdiinnung (Serum Nr. 5; B-Gruppe) ==r

1 A (45 0,25

Kon trolle

I1 et a te 1 lu ny i>o n T t*oclcenpt.upcr t .a t m CI u s a w n . Hierzu murcle die vim 8chi f f nnd Uralm verwendete Methodik henutet.

Hliender ohne Rezeptoren irn Harn (CJriippe A-Blein) wurden ausgeschal- tet. Der Harn wurcle iin Vakuuin eingedampft und die Salze wegdialy- siert. Bis zii dieseni Stadiiini konnte die Prliparation ohne griissere Ver- liiste geschehen.

Die 9- untl B-Eigenschaften sind nicht besonders labil. Nach drei- tiitigein Aufbewahren tles H a m s bei Zimmertelnperatur ohne Konser- vierungsmittel war (lie Aktivitiit viillig beibehalten. Nocli nach 2 WoChell war die Wirkung nicht ganz erloschen.

Es ist auch niclit niitig, den Htirn vor tleni Eindampfen zu nrntra- lisieren, wenn dies geniigencl schnell geschieht. Die Hurnmengen wurtlen fiir tins in der Insulinahteilung der Firma Vitrnm, Stockholm eingr- tlamgft. In 2 Htiintlen bei 25" lionntrn etwa 60 Liter Harn auf etwa 4 Liter konzentriert werclen. Die ausgefallenen Salze, die viillig inaktiv waren, murtlen :iuf einer Nutsche filtriert. Die syru1):rrtige Fliissigkeit murtle cl;inn 3 1 Tage unter Toluol in 1 Liter f:issentlen rotierenden I'ergamenthiilsen bis ziim spez. Gewicht 1 , O l gegen fliessendes Wasser tlialysiert. In der Zwischenzeit wurde das Volunien ein paar Ma1 konzen- triert und am Ende his auf 200 ccm (aus 60 Liter Harn) eingedampft, iiiit 10 Volumina abs. Alkohol nusgeflillt und der Niederschlag mit Al- Boliol und Ather getrocknet.

Nach dem Verfahren von SclLiff nnd I?rnhn, wird zweclrs Reinigung init Bleiacetat gefgllt iind der Niederschlag als unwirkstiui weggeworfen. Alit clemselben Verfaliren konnten wir nacli Entfernen cles Bleies RUS der Mutterlauge nur sehr schlecht wirksarne Prliparate erhalten. I )ie :ig- glntininhintlende Fiihigkeit betrug etwa 3 yo clerjenigen cler entsprechen- den ,Harnmenge. Dies konnten wir wieclerholt sowohl niit A- als iliich

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mit B-Harn heobachten. E x war glrichgiiltig, ob (lie Fiillnng init Blei- acetat bei neutralrr otler saurer Reaktion vorgenommen wurtle. Wir waren cleshalh gezwungen, die Bleifiillnng fortzulassen nnd die Inneii- fliissiglieit nach Konzentrieren mit Alkohol zu fLllen. Das ttuf tliese Weise erhaltene Trockenpriiljarat enthiilt bis zu 50 70 der A- und H- Aktivitiit des Harns. Gewicht des Trockenprgparates aus 180 Liter A- Harn 120 g Iind aus 240 Liter B-Harn 155 g. (036 und 0,65 g pro Liter). Die Priiparate hatten eine hraune Fiirbung nntl enthielteri allerlei nicht-dialysable, wasserliisliche Harnbestandteile.

Da s 1 ‘r ,.?La 1 tc.n d et. 13 1 utgr.up peneigenschnffelL !leyp,t ?i 611 P re Tempemtwen, Saure icizd Rllxcli.

Es wird angegeben, (Schiff und Bt-akn), dass jedenfalls der die Schafhaniolyse hemmencle Rezeptor fur S lu re uncl Alkali nicht besonclers enipfindlicli ist und bei iieutraler Reaktioti oliw Schaden gekocht werden kann. Auch wird der Schwefelwassev- stoff durch Koclieu in1 Wasserbade entfwnt, was nicht so wenig uber die Resistenz clieses Rezeptors aussagt.

Wir koiiiiten bestatigen, dass auch eine Losung tler isoag- glutininbindenden Rezeptoren bei iieutraler Reaktion ohue Schacleii gekocht werclen kann. Einige rrobeil der a- und N- PYaparate am EIarn wurden in Wasser gelost iind niit eineni \‘oluiiien der Puffei*losuiigen nach Xoreizseiz voii pH 5, 7 und !)

versetzt mid in Probierrohrchen eingeschmolzen. Nach 15 Mi- nuten hei loo0 koiinte keine Abschwachung festgestellt wetden, iiud noch iiacli weiterer Behandlung wiihrencl einer halhen Stiintle bei looo schien die volle Aktivitat beibehalten zii sein.

Eiii sehr interessantes Verhalten zeigten diese Rezeptoren gegenuber Miiure und Alkali bei Zimrnertempei.atur. Beini schnelleii Erhitzen iiiit n HC1, bezw. NaOfI uud sofortigeiii Ab- kuhlen behielt die Probe init Ralzsaure iiocli 20 70 ihrer Aktiri- tat, wahrend clie Lauge kouplette Zerstiirnng vernrsacht hatte. Dan11 wurcleii Proben niit u / B Raure bezw. Lauge angesetzt itntl 12 Stunden bei Zilliinerteiiiperatiu. steheagelassen. Eiii Volnnien Losung (mit 20 iiig Snhstanz pro ccm) wurcle mit einein l ro lu- iiieii 11 H C l (NaOH) versetzt und die Liisung nach 12 Stuntlei1 iieu t ra 1 i siert. Die Ilea k t ion war gegeii Lac kmii s genaii l ieu t rw 1, UIII optimale Agglutininbindung zit erniiiglichen.

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Einfluss von S&um uncl Laiige nuf die A- imd B-Bigenschaften. TABELLE IJI.

A . Harnpraparat. ~~

I 3 5 118 0 3

Kontrolle

A

TABELLE IV. Dasselbe Priiparat nach 12 Stunden in n/2

HCI bei Zimmertemperatur.

Mg Blut- 1 ' SerumverdUnnung Substanz k6rper-

per ccm 11 &en 1 (Serum Nr* 1 5 ; B-Gruppe)

TABELLE V. A. Dasselbe Priiparat nach I2 Stunden in n12

NaOH bei Zimmertemperatur.

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TABELLE VI. B. Harnpraparat.

_____

Mg Substanz per ccm

7 395 198 099 0,45

Blut- kbrper-

chen

B

1 Serumverdtinnung (Serum Nr. 16; A-Gruppe)

TABELLE VII. B. Dasselbe Priiparat nach 12 Stunden in 4 2

HCl bei Zimmertemperalur.

Blut-

I1 7

3,5 198 099 0,45

B

Serumverdiinnung (Serum Nr. 16; A-Gruppe)

'12 9-10

6 S1/4

1 1314

TABELLE VIII. B. Dasselbe Praparat nach 12 Stunden in n/2 NAOH bei Zimmertemperatyr.

Mg Substanz per ccm

Serumverdtinnung (Serum Nr. 16; A-Gruppe)

B 1

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Wahreiid die Itezeptoreii sogar bei Ziinnierteiiiperatur gegeii iiJ2 Salzsiiiire 12 Stunden resistent siiid, hat die Lauge eiiieii ausgesprochenen zerstorenden Eiiifluss. (Hielie Tab. Nr. III- VII I ) .

Diese Zerstorung der isoagglutiiiillbillceiicleii Rezeptoreii bei Ziminertemperatur durch lialbnorinale Alkalilosung lasst sic11 nicht leicht mit der Vermutung vereinbaren, (lass die Blutgrnp- peneigenschaften an Polysaccharide gebundeii sind ; deiin diese Naturstoffe sind ja besonders resistent gegen Alkali. Anderei*- seits fiihrt eine Razemisation der Eiweissstoffe durch Alkali den Verlust ihrer Antigenfunktionen liwbei (siehe G. Wells, The chemical Aspects of Iinmunity, 1929).

Diese Beobachtung lasst sich auch gut niit den Befundeii der folgeiiclen Arbeiten vereinigen, in welcher der nahe Zusani- riipnhang zwisclieii den Eiweissstoffen und den Blutgruppenei- genschafteii gezeigt wild.

Dicse Unteraiicliung wurcle init Mitteln :ius Stiftelsen Therese och Johan Anclerssons ininnecc nnsgeftihrt.