Zbl. Vet. Med. A, 20, 624-630 (1973) @ 1973 Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg ISSN 0044-4294/ASTM-Coden: ZVRAAX

Aus dem Schoubra Humanmedizinischen Labor Direktor: Ass. Prof. Dr. M . K . Soliman

und dem Physiologischen Institut der Veterinarmedizinischen Fakultat Kairo, V . A. R.

Direktor: Pro f . Dr. H . Nasr

Uber die Blutveranderungen bei Ratten nach Verfuttern einer Tocopherol- und Ubichinon-Mangeldiiit

1. Zytologische und biochemische Veranderungen im Blut von Vitamin-E-Mangelratten

Von

M. K. SOLIMAN

Mit 3 Tabellen

(Eingegangen am 26. Mai 1972)

Im Vitamin E-Mange1 kommt es bei weiblichen Ratten zu Unfruchtbar- keit, bei der die Ovarien noch funktionieren, die Foten aber im Verlaufe der Graviditat resorbiert werden. Bei mannlichen Ratten treten degenerative Veranderungen an den Keimdrusen auf (LANG, 1962).

Untersuchungen bei Nagetieren und anderen Tierarten zeigten, dai3 ein Vitamin-E-Mange1 auch mit Veranderungen an anderen Geweben verknupft ist, wobei im Vordergrund extragenitale Mangelsymptome im Bereich der Muskulatur, der Leber, der Fettdepots, des Nervensystems und der Blutgefafle stehen. Die Ausfallerscheinungen sind je nach Tierart verschieden und stehen moglicherweise mit einer unterschiedlich schnellen Verarmung der verschiede- nen Organe an Vitamin E im Zusammenhang (NIESAR, 1965).

Bei Meerschweinchen wurde ein erheblicher Anstieg der peripheren Gra- nulozyten beschrieben, der nach Applikation von Vitamin E zur Norm abfallt (DINNING, 1962). Dabei besteht eine Korrelation zwischen der Kreatinaus- scheidung und der Leukozytenproduktion. Bei Affen ist neben einer Muskel- dystrophie auch eine Leukozytose beobachtet worden, die sich auf Tocopherol- zugabe normalisiert (FITCH, 1968). Aui3erdem konnte man bei Affen eine makrozytare Anamie mit rnultinuklearen Erythroblasten nachweisen (PORTER u. Mit., 1962). MAJAJ und seine Mitarbeiter (1963) fanden auch makrozytare Anamie bei Kindern sowie Retikulozytenabfall bei Menschen und Affen.

Im folgenden sol1 uber zytologische sowie biochemische Veranderungen im Blut von Vitamin E-Mangelratten berichtet werden.

Versuchsanordnung und Methoden 1. Kontrollgruppe mit 10 unbehandelten Ratten. Die Tiere erhielten

LATZ-Standardfutter.

Ober die Blutveranderungen bei Rat ten / 1. 625

B lutwer t e

Rote Blutkorperchen I Mil l . / mm3 ) Hb [ g I 1 0 0 rnl) Hkt (‘401. %) Retikulozyten ( % I WeiOe Blutkorperchen (Tausend / rnrn3) Thrombozyten (Tausend / m m 3 I Hb, IPg) VolE (pm3 ) Hb - Konz 1 ‘10 1

2. Vitamin E-Mangelgruppe rnit 10 Ratten. Die Tiere erhielten zur Erzeugung eines Vitamin E-Chinon-Mangels wahrend 4-6 Monaten die T-Q- Mangeldiat.

Zusammensetzung der Diat: Gelatine 200 g; vitaminfreies Casein 360 g; Zucker 750 g; Maizena 1440 g; Cholinchlorid 3 g; Vit. (A, D, u. B) Q. S; Mine- ralsalzmischung 120 g; Linolsaure-Methylester 1 g in 1600 g H20. Die Tiere wurden in Chloroformnarkose durch Entbluten getotet, das Blut gewannen wir mittels Liquemin.

Zur Zahlung der Erythrozyten und Leukozyten mit der Neubauerkam- mer verdiinnten wir das Blut rnit Hayem’scher bzw. Turk’scher Losung in der iiblicher Weise. Von jedem Tier difierenzierten wir 2 nach Pappenheim gefarbte Blutausstriche je 500 weil3e Blutkorperchen. Den Hamoglobingehalt bestimmten wir als Hamoglobinzyanid photometrisch (Zeiss, 1961) in g/100 ml Blut, den Hamatokrit (Hkt) in Hamatokrit-Glasrohrchen. Aus den Erythro- zyten-, Hb- und den Hkt-Werten errechneten wir den mittleren Hb-Gehalt (HbE) der einzelnen Erythrozyten in pg, das mittlere Volumen (Vok) der einzelnen Erythrozyten in ,urn3 und die mittlere Hb-Konzentration (Hb-konz.) in den einzelnen Erythrozyten in O/o. Die Retikulozyten wurden nach Vor- behandlung mit Brilliantkresylblau mit dem Miller’schen Okularmikrometer, und die Thrombozyten nach FONIO (1952) gezahlt. Den Ca-, K- und Na- Gehalt bestimmten wir im Serum mit Hilfe des Flammenphotometers. Die Messung des Magnesiumgehaltes im Serum erfolgte spektrophotometrisch nach der Methode von HAURY und NAUMANN (1965), die der Phosphorkon- zentration photometrisch nach WEIL-MALHERBE und GREEN (1951). Blut- Kreatin und -Kreatinin wurden nach den modifizierten Methoden von TAUSSKY (1954) sowie von BONSENS und TAUSSKY (1945) bestimmt. Das Blut- glutathion (GSH) bestimmten wir mit der Nitroprussid-Methode von SHAKER und SOLIMAN (1966). Die Plasma-Cholesterinmessungen erfolgten anschliei3end rnit Hilfe der Farb-Testkombinationen Boehringer.

Ergebnisse Die Ergebnisse sind den folgenden Tabellen zu entnehmen. Tabelle 1 zeigt

die bei Normal- und Vitamin-E-Mangelratten gefundenen Werte fur Erythro- zyten, Leukozyten und Thrombozyten. Dabei ergeben sich zwischen Normal- und Mangelratten signifikante Unterschiede. Bei Vitamin-E-Mange1 im Futter kommt es bei Ratten zu einer deutlichen Anamie und Herabsetzung des Hb-

Versuchsratten

Nor ma1 Vit.- E - Mange1

10.20 t 0.25 8.72 f 0.29+ 17.80 2 0.46 16.22 t 0.27 *’ 51.06 2 0.92 46.20 f 0.26 +

4.68 2 0.50 7.20 2 0.32 11.17 t 0.28*

502.00 2 1.07 370.00 t 1.16 +

17.45 f 0.09 18.60 2 0.08 50.06 2 0.70 52.98 ? 0.62 34.86 2 0.45 35.1 1 2 0.35

3.65 2 0.41

Tabelle 1

626 M. K. SOLIMAN

Blutwerte lrng I 1 0 0 rnl Serum)

Na K Ca P Mg Na : K Verhaltnis Ca : P Verhaltnis Ca : Mg Verhaltnis

Gehaltes und des Hkt-Wertes. Es wurde eine signifikante Leukozytose beob- achtet. Die ubrigen weiflen Blutzellen waren absolut erhoht, das Verhaltnis Lymphozyten zu Neutrophilen (L/N) blieb jedoch ziemlich konstant. Die Thrombozyten- und Retikulozytenzahl ist vermindert.

Ver suc hsra tte n

Nor ma1

354.80 f 2.74

Vi t . - E - Mangel

375.50 f 3.53' 19.65 C 0.18* 11.40 ? 0.25 3.42 t 0.20'

17.22 f 0.20 10.68 ?. 0.19 5.08 t 0.25 2.66 f 0.06 1.50 ?: 0.40'

20.60 19.11 2.10 3.33 4.01 7.60

Tabelle 2 bringt die Elektrolytwerte von normalen und Vitamin-E- Mangelratten. Es kommt zu einer signifikanten Hyperkaliamie. Die Mag- nesium- und Phosphorwerte sind erniedrigt. Schlief3lich wurde eine signifi- kante Erhohung von Kreatin, Kreatinin, Cholesterin und Glutathion im Blut beobachtet (Tab. 3).

Tabelle 3

Kreatin 2.02 f 0.05 4.00 ? 0.13' Kreatinin 0.73 f 0.06 2.17 2 0.14* Glutathion 79.80 t 3.81 125.00 ? L.55*

k Mittlere Fehler des Mittelwertes + Signifikante Abweichung vom Norrnalwert (P = 0,Ol)

Diskussion Dem Vitamin E wurden verschiedene Wirkungen zugesprochen. So soll

es als Antioxidans wirken (WITTING u. HORWITT, 1964), ferner als Schutz gegen eine Autooxidation von Fettsauren und gegen die Bildung von Peroxy- den und das Vorkommen von Pigment in den verschiedenen Geweben dienen (BERSIN, 1966). Das Vitamin E soll auch eine spezifische metabolische Wirkung haben. Nach SCHWARZ (1962) spielt es eine wesentliche Rolle bei der intra- zellularen Respiration.

Aus dieser Arbeit wird ersichtlich, dai3 Vitamin E-Mange1 bei Ratten zu einer signifikanten Anamie fuhrt. Die Hb-Konzentration ist gesenkt. Dies ist in Ubereinstimmung mit den Befunden von MAJAJ (1966), der bei Menschen und Affen neben der Anamie noch eine Senkung des Hb-Gehaltes fand. BENCZE und Mitarb. (1966) berichteten auch uber einen Hb-Abfall der Ratten bei Vitamin-E-Mangel. Es ist bekannt, daB die Erythrozyten beim Absinken

Uber die Blutveranderungen bei Ratten/ 1. 627

des Vitamin-E-Gehaltes im Hamolysetest iiber 80 O/o Hamolyse zeigen (OSKI u. BARNESS, 1968). Die spontane Hamolyse von Rattenerythrozyten wird auf einen akuten Vitamin-E-Mange1 zuruckgefuhrt. Die Lebensdauer der Erythro- zyten ist verkurzt (MARVIN u. Mit., 1960).

Die Retikulozytenzahl ist bei Vitamin-E-Mange1 herabgesetzt, bei Zugabe von Vitamin E steigt sie dagegen signifikant (SOLIMAN, 1973). Ein signifi- kanter Anstieg der peripheren Leukozyten wurde bei Vitamin-E-Mangelratten beobachtet.

Aus Tabelle 1 ist zu entnehmen, dai3 bei Vitamin-E-Mange1 eine signifi- kante Thrombopenie eintritt. Diese Verminderung kann entweder durch Hem- mung der Thrombopoese oder die Anlagerung von Blutplattchen an die Gefaflinnenwand hervorgerufen werden. Das ist der erste Schritt zur Ent- stehung der Gefaflwandthrombose. Bei Vitamin-E-Mange1 ist auch der Cho- lesterinspiegel erhoht (Tab. 3). SIMIC u. Mit. (1963) stellten eine lineare Korrelation zwischen Vitamin A und E fest, wie auch zwischen den beiden Vorgenannten und dem Cholesterinspiegel und Blutdruckverhaltnissen. Toco- pherol scheint vor allem als Antioxidans die Vitamin A Reserven zu erhalten und indirekt die Synthese des endogenen Cholesterins zu hemmen.

Der Austausch von Kalium und Natrium durch die Erythrozytenmem- bran ist nicht einfach eine Diffusion, die von der Donnan Theorie abhangig ist, sondern ein metabolischer Prozei3. Die bei Vitamin-E-Mangelratten beob- achtete Hyperkaliamie entspricht dem intrazellularen K-Verlust, der schon von MCLEAN (1963) beschrieben wurde. Sie ist eine der auffallendsten Erschei- nungen des Vitamin-E-Mangels.

Bei Vitamin-E-Mangelratten ist die anorganische Phosphorkonzentration signifikant herabgesetzt, obwohl die Calciumwerte ziemlich konstant sind, demzufolge ist das Ca/P-Verhaltnis erhoht.

Magnesium ist neben K das wichtigste Kation in der tierischen Zelle. Die Mg-Werte sind erstaunlicherweise bei Vitamin-E-Mangelratten herabgesetzt (Tab. 2). Man mui3 dabei berucksichtigen, dai3 Muskeldystrophie je nach Tier- art und Fiitterung in sehr unterschiedlichem Mafl als Symptom des Vitamin-E- Mangels auftritt und bei unseren Versuchstieren nie manifest wurde.

Die Blutkreatin- und Kreatininkonzentration ist bei Vitamin-E-Mangel- ratten erhoht. Als Symptome des Vitamin-E-Mangels sind bekannt: Kreatinu- rie und Abnahme des Muskelkreatins und Kreatinins bei Ratten (WITTING u. Mit., 1965). Diese ruhrt von der Unfahigkeit des Skelettmuskels her, Kreatin zu verwerten; jedenfalls eher als von einer vermehrten Kreatinsynthese der Leber. In den beschadigten Muskeln nimmt die Aktivitat der Phosphorylase ab, ebenso ATP- und Kreatinphosphatgehalt und deshalb wird im Blut der Krearingehalt erhoht und im Harn ausgeschieden (HILL, 1957).

Verschiedene Laboratorien berichteten, dai3 eine enge metabolische Be- ziehung besteht zwischen Vitamin-E und S- enthaltenden Aminosauren wie Cystin (TAPPEL, 1952). FEGLER (1952) fand auch eine enge Beziehung zwischen Erythrozyten-GSH und Hamolyse. Uber den Anstieg der Leber- und Muskel- GSH bei Vitamin-E-Mangelkaninchen berichteten RYERSON und Mit. (1 958). Dagegen fand TSEN und COLLIER (1960) keine Veranderung im GSH der Erythrozyten bei Vitamin-E-Mangelratten. Es erscheint jedoch aus unseren Befunden, dafl Glutathion eine grofle Rolle in der Vollstandigkeit der Ery- throzyten spielt.

Zusammenfassung Bei Normal- wie bei Vitamin-E-Mangelratten wurden das Blutbild und

die chemischen Bestandteile untersucht.

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628 M. K. SOLIMAN

I. Die Vitamin-E-Mangelratten zeigten eine deutlihe Herabsetzung der Erythrozyten und des Hamatokritwertes.

Es wurde eine signifikante Leukozytose beobachtet. Die ubrigen weii3en Blutzellen waren zwar absolut erhoht, das Verhaltnis Lymphozyten zu Neu- trophilen blieb jedoch ziemlich konstant.

2 . Bei Vitamin-E-Mange1 tritt eine signifikante Hyperkaliamie und eine Erhohung der Kreatin-, Kreatinin-, Cholesterin- und Glutathionwerte im Blut ein. Die Phosphor- und Magnesiumkonzentration ist vermindert.

Der Untersuchung dieser Blutbestandteile kommt bei Verdacht auf Vitamin-E-Mange1 der Ratten ebenfalls diagnostische Bedeutung zu.

Summary Blood changes in rats fed diets deficient in tocopherol and ubiquinone

1. Cytological and biochemical changes in the blood of vitamin E deficient rats

The blood picture and chemistry were studied in normal and vitamin E deficient rats.

1. The vitamin E deficient rats showed a marked lowering of red cells and haematocrit. Significant leucocytosis was observed. The other white cells showed an absolute increase but the relationship between lymphocytes and neutrophils remained almost constant.

2 . In vitamin E deficiency there is a significant rise in blood potassium, and an increase in creatine, creatinine, cholesterol and glutathion in the blood. Phosphorus and magnesium blood levels are reduced.

The examination of these blood constituents affords additional evidence for suspicion of vitamin E deficiency in rats.

Resume Sur les modifications sanguines chez les rats

aprits un rCgime deficient en tocopherol e t ubiquinone I. Modifications cytologiques et biochimiques dans le sang des rats avec une avitaminose E

On examine la formule sanguine et les constituants chimiques chez des rats normaux et chez des rats avec une carence en vitamine E.

1. Les rats avec une carence en vitamine E prksentent une nette diminu- tion des globules rouges e t de la valeur de l’hkmatocrite. On observe une leuco- cytose significative. Les autres globules blancs ont augmentk en valeur absolue, mais le rapport entre lymphocytes et neutrophiles resce assez constant.

2. Lors d’une carence en vitamine E, il se produit une hyperpotassiumkmie significative et une augmentation des valeurs sanguines de la crkatine, crkati- nine, du cholestkrol et du glutathion. Les concentrations du phosphore et du magnesium diminuent.

L’examen de ces constituants sanguins prend kgalement une signification diagnostique, lorsque I’on soupsonne une avitaminose E chez les rats.

Resumen Sobre las modificaciones hematol6gicas en ratas

tras administrar una dieta deficitaria en tocoferol y ubiquinona 1. Modificaciones citol6gicas y bioquimicas en sangrc de ratas carenciales de vitamina E

En ratas normales y en deficirarias de vitamina E se analizaron el cuadro hemitico y 10s componentes quimicos.

Uber die Blutveranderungen bei Ratten / 1. 629

1. Las ratas deficitarias de vitamina E mostraban una disminucibn Clara en 10s eritrocitos y en el valor hematocritico. Se observ6 una leucocitosis signi- ficante. Las cClulas hemiticas blancas restantes estaban aumentadas de forma absoluta, aunque la relaci6n de linfocitos a neutr6filos qued6 bastante cons- tante.

2. En la carencia de vitamina E aparece una hiperpotasemia significante y aumentan 10s valores de creatina, creatinina-colesterina y glutati6n en sangre. Se hallan disminuidas las concentraciones de f6sforo y magnesio.

A1 examen de estos componentes de la sangre tambikn le corresponde una importancia diagnbstica en la sospecha de una deficiencia de vitamina E en las ratas.

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Anschrift des Verfassers: Ass. Prof. Dr. M. K. SOLIMAN, Institut fur Physiologie, Vet. Med. Fakultit, Giza, V. A. R.