Uber die Katalaseaktivitat und deren Abhangigkeit vom Hamoglobingehalt im Blute von o bis 10 Jahre

alten Kindern Von

Bent Andetsen (Aus dem Kinderspital Fuglebakken, Kopenhagen)

Chef: Dr. med. Vald. Poulsen

Einleitung Die biochemische Entwicklung der letzten zehn Jahre hat eine

Reihe wichtiger Arbeiten gezeitigt, welche unserc Kenntnisse uber die chemische Natur der Katalase wescntlich gefordert haben. Zei le und He l l s t rom (1930) haben gezeigt, daI3 die aktive Gruppe der Ka- talase ein Hamin ist, und S te rn ( I 936) wies nach, daI3 dieses Hamin mil dem Protohamatin des Hiimoglobines identisch sei. SchlieDlich gelang es vor kurzem Sumner und Dounce (1937a,b), krystalli- nische Katalase darzustellen. Die Katalasc enthalt also als aktivc Gruppe den gleichen Eisenkomplex \vie die Respirationsenzymc Peroxydase und die Cytochrome. Der Spezifitatsunterschd beruht auf der Verschiedenheit der eiweiaartigen kolloidalen Trager.

Wahrend also in chemischer Beziehung unsere Kenntnisse uber die Katalase in letzter Zeit wesentlich vermehrt wurden, ist unser Wissen uber die physiologische Funktion dieses Enzyms nach wie vor sehr gering. Die Katalase wird im allgemeinen als ein Respira- tionsenzym angesehen und man n h m t an, daD ihre Aufgabe darin besteht, das bei der Zellatmung durch Hydrierung von Sauerstoff entstehende Wasserstoffperoxyd zu spalten und so die Anhaufung dieses fur den Organismus giftigen Stoffes zu verhindern. Diese An- nahme entbehrt jedoch der experimentellen Bestatigung. Zur Auf- klarung der Funktion der Katalase scheint wohl vor allem die me- dizinisch-physiologische Forschung berufen, und es sind denn auch zahlreiche medizinische Arbeiten uber die Katalase, besonders die

1 Der Redaktion am 23. Mai 1938 zugegangen.

UBER DIE KATALASEAKTIVITAT U N D DEREK ABHANGIGKEIT usw. 241

Blutkatalase, erschienen. Klarstellung oder wesentlich tieferes Ver- st&dnis wurde hierb.ei jedoch nicht erzielt, und das Problem der physiologischen Funktion der Katalase muD h m e r noch als unge- lost bezeichnet werden.

Im folgenden sollen verschiedene Grunde besprochen werden, die an der Ungeklartheit dieser Verhaltnisse mitgewirkt haben diirf- ten. Hierbei wird jedoch nur die Blutkatalase berucksichtigt werden.

Die Katalase findet sich in den Formelementen des Blutes; das Plasma ist katalasefrei. Die Katalascaktivitat der Erythrocyten und Leucocyten liegt innerhalb der gleichen GroDenordnung (Stern, I 932), wahrend die d,er Thrombocyten etwa I oomal geringer sein sol1 ( Ig l aue r u. Weber , 1931). Hieraus folgt, daD d ie k a t a l a - t i sche A k t i v i t a t des B l u t e s p rak t i s ch v 011s t a n d i g du rch dessen G e h a l t a n ro t en B l u t k o r p e r c h e n best immt wird, wenn das Blut nicht abnorm viele weiDe Blutkorperchen enthalt. Da auch dem Hamoglobin eine gewisse Katalaseaktivitat zukommt, setzt sich die Gesamtaktivitat der roten Blutkorperchen zusammen aus der des Hamoglobins und der der eigentlichen Katalase. Die Katalase- aktivitat des Hamaglobins ist jedoch so gering, daD sie im Vergleich mit der der eigentlichen Katalase vernachfassigt werden kann.

Der Umstand, daD die Katalaseaktivitat an die Formelemente des Blutes gebunden ist, muD bei der Untersuchung von Variatio- nen der Katalaseaktivitat des Blutes unter verschiedenen auDeren Bedingungen stets im Auge behalten werden. Zahlreiche Autoren geben an, daO sie derartigk Anderungen als Folge korperlicher An- strengung, Ruhe, Nahrungsaufnahme, Hunger, Durst, Einnahme ver- schiedener Medikamente, Vitamine usw., oder als Folge verschiedener Krankheiten gefunden hatten. Mehrere dieser Befunde sind zweifel- 10s darauf zuruckzufiihren, da5 das Blut unter d'en Bedingungen des Versnches Wasser abgegeben oder aufgenommen hat, wodurch die Zahl der roten BlutkGrperchen pro m m 3 Blut veriindert wurde. An- dere Befunde konnen zweifellos dadurch erklart werden, daD das bei der Blutentnahme angewendete Verfahren mangelhaft war. Es wurde schon oft darauf hingewiesen, daO man, wenn man 2.B. den H h o - globingehalt oder di,e Zahl der roten Blutkorperchen in Kutanblut bestimmen will, sehr darauf zu achten hat, da5 die Blutung frei und lebhaft vor sich geht. Drucke r (1923, 1924) hat diese Verhalt- nisse an einer Reihe von Kindern im ersten Lebensjahre systematisch untersucht. E r bestimmte den Hamoglobingehalt von Blut, das ent- weder durch Incision mit ))den gewohnlichen in der Abteilung gek brauchten mehr oder weniger scharfen Lanzettencc oder durch In- cision (mit einem sehr scharfen Kataraktmesser) g e w m e n worden

Skandinav. Archiv. 79. 16

242 BENT ANDERSEN

war. Hierbei fand er ))in fast allcn Fallen einen vcrhaltnismal3ig nicd- rigen Hamoglobinwert nach der Incision rnit dem scharfen Katarakt- messer, wobei die mechanische Irritation der Kapillaren die gcringst mogliche gewesen war, wogegen die Incision mit eincm wenigcr schar- fen Instrument, das eine groDere Irritation verursacht hattc, relativ hohc Werte verursachte>c. Die von D rucke r beobachteten Unter- schiede beliefen sich auf bis zu 1800. Meine eigenen Erfahrungcn bestatigen durchaus D rucke r s Ergebnisse. Dicse Bcobachtungcn sind ohne Zweifel allzuwenig beachtet worden und viele experimcntcll gefundenen Unterschiede der Katalascaktivitat des Blutes bei cin und demselben Individuum sind auf mangelhafte Technik bei der Blut- entnahme und die darauf beruhende, aber nicht bemerkte Vcrschic- bung des Verhaltnisses zwischen Blut und Plasma zuruckzufuhren. F. v. K r u g e r ( I 929) hat in einer ausgezeichneten Kritik einer Arbeit von Bischoff (1927) gezeigt, wie groR die Irrtumer sind, denen man sich durch mangelnde Berucksichtigung der erwahnten Fehler- quellen aussetzt.

Ein weiterer Umstand, der sehr dazu beigetragen hat, Verwir- rung zu stiften, liegt in d:n zur Bestimmung der Katalaseaktivitat beniitzten Methoden. In fast allen klinischen Arbeiten wurde die von Bach und Zubkowa (1921) angegebene Methode bentitzt, welche auf der Titration des nach Ablauf des Versuches ubrig gebliebenen Wasserstoffperoxydes rnit Permanganat beruht. In Anbetracht der Wichtigkeit der Sache muD ich auf diese Methode etwas naher ein- gehen. Die Versuchsmischung wird folgendermaDen bereitet : I cm3 des rooomal verdunnten Blutes wird mit 7 cm3 Wasser gemischt. Stehenlassen bei Zimmertemperatur 30 Minuten. Hierauf setzt man 2 cm3 I 0,’o Perhydrol-Merck zu, und nach 30 Min. Stehenlassen bei Zimmertemperatur wird rnit Permanganat titriert. Gleichzeitig fuhrt man rnit durch Kochen inaktiviertem Blut gleicher Verdunnung einen Blindversuch aus. Aus der Differenz des Permanganatverbrauches wird die von I mm3 Blut gespaltene Wasserstoffperoxyd-Menge, die sogenannte uKatalasezahlc, berechnet . - Die Mange1 dieser hlethode sind offensichtlich. Erstens ist die Blutkatalase in stark verdunnter Losmg bei Zimmertemperatur sehr instabil (Andersen , 1937). Man mu6 damit rechnen, dal3 wahrend des halbstiindigen Stehenlassens vor Versuchsbeginn ein betrachtlicher Aktivitatsverlust eintritt. Ferner sol1 die Bestimmung der Aktivitat eines Enzymes selbstverstandlich bei e h e r wohldefinierten Temperatur und nicht bei G3mmerternpera- tun( vor sich gehm. Vor allem aber ist gegen die Methode einzuwen- den, da5 sowohl die Versuchstemperatur als auch die Konzentration des Wasserstoffperoxydes zu hoch sind. Das Substrat der Katalose, das

U B E R DIE KAT.4LASEAKTIVITxT UND DEREN A B H ~ G I G K E I T USW. 243

Wasserstoffpcroxyd, wirkt dcstruierend auf das Enzym ein, und m a r um so mehr, je hohcr Substratkonzcntration und Temperatur sind. Man sol1 daher bei niedrigcr Temperatur ( 0 0 ) und geringen Sub- stratkonzentrationen arbeitcn. Dal3 bei der Mcthodc von Bach und Zubkowa keine pH-Regelung vorgesehen ist, ist wahrscheinlich weniger wichtig, da das pH-Optimum der Katalase eine ziemlich breite Zone umfaI3t. Eine andere, und nicht bedeutungslosc Fchler- quelle dagegen mul3 hier noch erwahnt werdcn: es wird bei Bcrcch- nung und Definition der Katalasczahl angcnommen, da8 zwischen Katalaseaktivitat und der nach einer gewissen Zeit gcspaltenen Wasscrstoffpcrosydmengc direkte Proportionalitat bestehe. Dies ist, wie im Versuchstteil diescr z\bhandlung naher besprochen werden wird, unrichtig. - Ich glaube also, daI3 diese bisher so haufig an- gewendete Mcthodc so ernste Mangcl aufweist, dal!, sie in Zukunft nicht mehr als zur Erlangung eines brauchbaren Versuchsmatcriales gecignet angesehcn werden sollte.

Die hier besprochcncn Fehlcrqucllcn (Blutentnahme und Ver- fahren zur Aktivitatsbcstimmung) haben naturgemaI3 die Ergcbnisse jener Versuche, bei denen sie nicht berucksichtigt wurden, mit gro- fier Unsichcrheit belastct, und es ist leider nicht zu leugnen, dab wir poch heute eine wirklich, experimentell einwmdfrei begrundete Kenntnis der Funktion der Katalase im Organismus nicht besitzen. Unter diesen Umstanden ist vor allem die Sammlung eines verlaD- lichen Tatsachenmateriales notig, das dann seinerseits vielleicht als Grundlage fur neue, speziellcre Untersuchungen diencn kann. Die vorliegende und eine vorige Abhandlung (Andersen , 1937) sind in diesem Sinne aufzufassen.

Wie im Vorhergehenden dargelegt, ist die Katalaseaktivitat des Blutes vor allem von dessen Gehalt an roten Blutkorperchen abhan- gig. Man hat daher stets darauf zu achten, ob Schwankungen der Blutkatalase-Aktivitat einer Versuchsperson nicht durch entspre- chende Schwankungen der Mengc von roten Blutkorperchen bedingt sei, ehe man sie durch Xnderungen der Katalase-Konzentration in den roten Blutkorperchen zu erklaren sucht. Hierauf machte zuerst van T h i e n e n (1920) aufmerksam, der dann, um diesen Verhiltnis- sen Rechnung zu tragen, den Begriff xKatalaseindexct einfuhrte. Man versteht darunter das Verhaltnis zwischen der Katalaseaktivitat des Blutes und der Zahl der roten Blutkorperchen. Van T h i e n e n und mehrere andere Autoren haben gefunden, daI3 der Katalaseindex bei gesunden Menschen verhaltnisrniifiig wenig variiert. von Kr i iger ( I 929) betont, wime notwendig die Bestimmung des Katalaseindexes

I 6*

244 BENT AXDERSEK

ist : )>Die Bestimmung der Katalasez'ahl allein ist klinisch wertlos, die Restimmung des Katalaseindexes kijnnte dagegen - sehr wohl von diagnostischer Bedeutung sein.cc

In einer fruheren Abhandlung (Anderscn , 1937) habe ich darauf lkgewiesen, daD man nicht yon vornherein absolute Bro- portionalitat zwischen Katalaseaktivitst und Erythrocytenzahl erwar- ten kann, da das Verhiiltnis dieser bciden GroBen auch von der GroDe der Erythrocyten und der Katalasekonzentration in diesen abhangen muO. Zur naheren Prufung dieser V'erhaltnisse bestimmte ich die Katalaseaktivitat des Blutes einiger Versuchspersonen und glcichzei. tilg den Hamoglobingehalt, die Zahl der roten Blutkorperchen und das Zellvolumen. Hierbei ergab sich, daD das Verhaltnis zwischen Katalaseaktivitat und Hamoglobingehalt d,es Blutes recht konstant ist. Zur Untersuchung dienten 9 Manner, 10 Kinder im Alter von 6-10

Jahren und 9 Kinder im Alter von 5-24 Monaten. Die durchschnitt- liche Katalaseaktivitat des Blutes (iiber deren Berechnung und Defini- tion vgl. spater) dieser 3 Gruppen war 339 bzw. 283 und 241, der Ha- moglobingehalt durchschnittlich 14.09 bzw. 1 2 . 1 1 und 9.08 g per I 00 cm3 Blut. Q, der Quotient von Katalas.eaktivitat durch Hamo- globingehalt, war also 24.1 bzw. 23.4 und 26.7. Angesichts des Zu- sammenhanges zwischen der Katalaseaktivitat des Blutes und dessen Hhoglobingehalt war zu erwarten, daD das Verl-dtnis der Kata- laseaktivitat zur Anzahl der roten Blutkorperchen fur Personen mit verschiedenem Hamoglobingehalt stark variieren musse, da bei zahl- reichen Anamieformen bekanntlich der Hamoglobingehalt starker ge- senkt ist als die Zahl der roten Blutkorperchen. In den 3 oben er- wahnten Gruppen von Versuchspersonen, bei denen der durchschnitt- liche Hamoglobingehalt des Blutes 14.09 bzw. 1 2 . 1 1 und 9 .08g per I 00 cm3 betrug, war der durchschnittliche Hhoglobingehalt der ein- zelnen roten Blutkorperchen 28.6 bzw. 26.0 und 16.7yy. Das Ver- haltnis der Katalaseaktivitat z u r Erythrocytenzahl variierte erwar- tungsgemal3 in ungefahr gleicher Weise; es betrug n5mlich 68.8 bzw. 60.0 und 45.1. Die geringe Grol3e dieses Quotienten fur die Grup- pen 2 und 3 ist ganz iiberwiegend auf die bei diesen Gruppen gefun: dene Mikrocytose zuruckzufuhra. Das Verhaltnis zwischen Katalase- aktivitat und Zellvolumen war fur a l h drei Gruppen nahezu gleich.

Da unser Wissen uber die Funktion der Katalase im Organis- mus so gering ist, schien es mir bedeutungsvoll, die erwahnte Pro- portionalitat zwischen Katalaseaktivitat und Hamoglobingehalt naher zu untersuchen. Der Zweck der vorliegenden Abhandlung ist es da- her, die Richtigkeit der e r w h t e n Beobachtung an einem grokren Material zu uberprufen; wobei auch Neugeborene und Kinder in den

UBER DIE KATALASEAKTIVITAT UND DEREN ABH:iXGIGKEIT USW. 245

ersten Lebensmonaten in die Untersuchung cinbezogcn werden soll- ten. Ich habe daher Q fur einige weitere Versuchspersonen bestimmt und aukrdem diese GroUe einige Zeit hindurch an derselben Ver- suchsperson verfolgt. Zu diesen Zweck wurden Kinder in den ersten Lebensmonaten untersucht, da in diescr Periode der Hamoglobin- gehalt des Blutes stark abnimmt und diese Untersuchungsobjckte daher zur Konstatierung einer eventuellen ebenso starken Ahnahrne der Katalaseaktivitat besonders geeignet erschienen.

Methodik Zu samtlichen Untersuchungen diente Blut, das in der friiher

beschriebenen Weise (Andersen , I 937) rnit Heparin stabilisiert worden war. Die Blutprobe wurde entweder durch einen tiefen, rnit einem sehr scharfen Messer gefiihrten, Stich in die Ferse oder durch Venenpunkt ur entnommen . Die H a m o g 1 o b in b e s t i m mu n g e n wur - den in einem Universalkolorimeter mit festem Leuchtkorper nach He l l ige ausgefuhrt. Hierbei wurden 20 mm3 Blut verarbeitet, die in 2.5 cm3 0.1 n Salzsaure eingeblasen wurden. Die Ablesung ge- schah nach einstundigem Stehen bei Zimmertemperatur. Der Apparat wurde in folgender Weise geeicht : Man bestimmte in einer Reihe von Blutproben mit sehr verschiedenen Hamoglobingehalten das Hamo- globin rnit Hilfe von H a l d a n e s Kohlenoxyd-Hamoglobinometer, welches im zoophysiologischen Institut der Kopenhagener Universi- tat nach H a l d a n e s Standard (rooo,'~ Hamoglobin = 18.5 vol. 010

Sauerstoff) geeicht worden war. Sodann wurden dieselben Proben in He l l ige s Kolorimeter untersucht und die den verschiedenen Hamoglobinmengen entsprechenden Kolorimeterablesungen notiert. Dann setzte man die Kolorimeterablesungen und die Hhoglobinmen- gen in einem Koordinatensystem ab und erhielt so eine Kurve (in diesem Fall eine Gerade), von welcher der jeder Kolorimeterablesung entsprechende Hamoglobingehalt direkt abgelesen werden konnte. Die Umrechnung der Hhoglobinprozente in g Hamoglobin per I 00 cm3 Blut geschah unter der Voraussetzung, daD I g Hhog lob in I .34 cm3 Sauerstoff binden kann. Aus zahlreichen Doppelbestimmun- gen geht hervor, dal3 Abweichungen von mehr als ~Hamoglobinpro- zent selten sind. Die Farbe der Vergleichsflussigkeit im Keil des Kolorimeters wurde wahrend der Dauer der hier besprochenen Ver- suche nicht geandert. Bes t immung d e r Kata laseakt iv i ta t . Die Katalaseaktivitat wurde bestimmt durch jodometrische Titration der nach verschiedenen Spaltungszeiten noch unveranderten Wasserstoff- peroxydmenge. Die Methode beruht darauf, daD durch das Wasser- stoffperoxyd in saurer Losung eine aquivalente Jodmenge aus einer

246 BENT ANDERSEN

Kaliumjodidlosung frcigemacht wird. Obwohl ich das hierbei angc- wendete Verfahren fruher ( X n d e r s e n , I 937) beschrieben habe. mu8 ich es, einiger seither eingefuhrtcn Anderungen nregcn, hier noch- mals kurz besprechen.

Das R e a k t i o nsge,mis c h hat folgende Zusammensetzung : 35 cm3 Wasserstoffperoxydlosung (aus I cm3 3ogewichtsprozentigeni Perhydrol Merck durch Verdunnen rnit Wasser auf I ooo cm3 berei- tet) + 1ocm3 Phosphatpuffer (5 cm3 prim. f 5 cm3 sek. Phosphat. pH 6.81) + 4cm3 Wasser f I cm3 Enzymlosung; im ganzen 50 cm". Das Reaktionsgemisch ist etwa 0.01 3 n an \Vasserstoffperosyd.

Die E n z y m l o s u n g wurde unmittelbar vor Versuchsbeginn durch Verdunnung und darnit Hamolyse von I o mm3 Blut mit Wasser auf 20 cm3 im Me8kolben hergestellt. Zu den Versuchsansatzen diente je I cm3 dieser Losung.

Die Versuch.e wurden bei O'J ausgefuhrt. Substrat und Enzym- losung wurden vor dem Vermischen auf 00 abgekuhlt. Zur Verdunnung des Blutes diente stets eiskaltes Wasser, da die Katalaseaktivitat bei Verdunnung mit Wasser von Zimmertemperatur rasch und stark ab- nimmt. Die Enzymlosung wird rnit einer I cm3-Pipette unter starkem Umschwenken in das Substrat einpipettiert. Das vollstandige Aus- laufen der Pipette dauerte 6-7 Sekunden. Die Spaltungszeit wird von dem Augenblick gerechnet, in dem die Pipette sich zu entleeren be- ginnt. Nach dem Vermiscben wurde die Losung in Eiswasser gesetzt und 5, 10, 1 5 und 2 0 Minuten nach Versuchsbeginn Proben von je 5 cm3 entnommen. Diese Proben wurden in Erlenmeyerkolben ein- pipettiert, die I o cm3 I O/O Kaliumjodidlosung und zur Sistierung der Enzymreaktion 3 cm3 einer 330bigen Schwefelsaure enthielten, welcher pro cm3 I Tropfen gesattigter wassriger Molybdansaurelosung zuge- setzt word,en war, um die Freisetzung des Jods zu beschleunigen. Ti- triert wurde mit 0,02 n Natriumthiosulfatlosung, und jede Titration wurde in genau 7 Minuten beendet. Als Indikator dknte eine 10:n

Starkelosung in gesattigter wassriger Katriumchloridlosung. Der Um- schlag war ungemein scharf. Als Nullwert diente die Menge Natrium- thiosulfatlosung, die von einer Reaktionsmischung verbraucht wurde, welche I cm3 durch Koch,en inaktivierter Enzymlosung enthielt.

B e r e c h n u n g d e r K a t a l a s e a k t i v i t a t . Als MaD fur die Ka- talaseaktivitat habe ich in diese.r Abhandlung, ebenso wie friiher, die Geschwindigkeitskonstante dcr monomolekularcn Spaltungsreaktion benutzt. Wie fruher erwahnt ( A n d e r s e n , 1937), 1aDt sich diese Re- aktionskonstante nicht unmittelbar anwenden, da sie wahrend der Ver- suchszeit so stark abnimmt, daD das Mittel der Konstanten nach ver- schiedenen Spaltungszeiten nicht als zufriedenstellendes Ma0 der En- zymaktivitat betrachtet werden kann.

UBER DIE KATALASEAKTIVITXT UND DEREN ABHANGIGKEIT USW. 247

Zeit in Minuten

0

5

15 20

I 0

Tabelle I

cm3 Na-Thiosulfat k . lo4

3.435 I 23 (extrapoliert) 3.010 11.5 2.681 I08 2.420 I01 2.207 96

Tabcllc I zeigt ein typisches Beispiel fur die Abnahme der Ke- aktionskonstante unter den hier vorliegenden Versuchsbedingungen. Die Abnahme ist, wie man sieht, so regelrnaaig, daD es moglich ist, durch graphische Extrapolation brauchbare Werte fur ko (den Wert zur Zeit 0) zu erhalten. Ich habe daher diesen Wert, welcher der re- lativen Enzymkonzcntration proportional ist (Ander sen , I 937), als Ma6 fur die katalatische Aktivitat verwendet 1.

Die Extrapolation auf o ist natiirlich mit einer gewissen Un- sicherheit behaftet. Diese graphische Bestimmung von k,, der wahren Geschwindigkeitskonstante, wurde aber durch die folgenden, von Dr. K. L inde r s t ro m - L a n g , Carlsberg Laboratorium, vorgenommenen Berechnungen, gestutzt und kontrolliert.

Die eben erwahnte Abnahme der Geschwindigkeitskonstanten der Wasserstoffperoxydzersetzung bedeutet, dab ein Teil des die Reaktion katalysierenden Enzyms wahrend der Reaktion inaktiviert, wahr- scheinlich destruiert wird. Macht man die wahrscheinliche Annahme, dab die Destruktion der Katalase ebenfalls monomolekular verlaufi, mit einer Geschwindigkeitskonstanten KD fur die Destruktions- reaktion, so kann die scheinbare Geschwindigkeitskonstante der Was- serstoffperoxydzersetzung K, (berechnet wie oben, z. B. Tabelle I ) zu einem beliebigen Zeitpunkte t, folgendermaDen als Funktion von KO, der Geschwindigkeitskonstanten bei Beginn des Prozesses, und von t, ausgedruckt werden :

Diese Gleichung ermoglicht es, KD und KO zu finden, wenn man z Punkte der Wasserstoffperoxyd-Spaltungskurve kennt, da K, und t, ja experimentell gefundene Werte sind. Bez,eichn,et man die den beiden gewahlten Punkten der Spaltungskurve entsprechenden GroDen mit ’ und ”, so erhalt man aus ( I ) :

1 Samtliche in dieser Arbeit angegeb.ene Aktivitatswerte bezisehen sich auf 1000 ma1 verdunntes Blut.

248

I 2

3 4.5 6

- I

3 4.5 6

BENT ANDERSEN

0.40 0.40 0.77 0.385 1.082 0.360 1.45 0.323 1.695 0.283

0.195 0.195 0.568 0.189 0.820 0.182 1.060 0.177

Zur leichteren Berechnung wLhlt man zmeckmafiig ein fur alle Ma1 zwei Werte von t, ( 2 Punkte der Spaltungskurve), z. B. 5 und I 5 Minuten, und berechnet ein fur alle Ma1 die Werte des Bruches

fur eine Reihe von Werten fur KD zwischen o und O , I . Die gefundenen Wekte von (3) werden in einem Koordinatensystem gegen K D als zweite Koordinate abgesetzt. Von der so gewonnenen Kurve liest man leicht fiir einen willkurlichen Wert des Bruches (3 ) das entsprechende K D ab und findet dann durch Einsetzen in ( 3 ) den gesuchten Wert fur K,. Der Vorteil dieses Bestimmungsverfahrens fur KO besteht darin, das man eine Extrapolation durch eine Interpolation (wenn z. B. die Probenahmezeiten eines willkurlichen Versuches 3, 8, 13 und 18 Minuten sind) ersetzt. Andererseits beruht die Richtigkeit des Ergeb- nisses auf der Richtigkeit der Annahmen, die der Berechnung zu- grundeliegen. Dab diese mit guter Naherung richtig sind, zeigt sich darin, daD K D wahrend des Spaltung konstant gefundeii wurde.

Ein Vergleich der Ergebnisse dieser Berechnungsweise mit den durch die oben beschriebene Extrapolation gefundenen Werten hat ge- zeigt, daD die beiden Verfahren in allen Fallen innerhalb der Vmersuchs- fehler ubereinstimmende Ergebnisse lieferten.

In der einleitungsweise gegebenen Kritik der Mlethode von Bach und Zubkowa ( 1 9 2 1 ) wurde envahnt, daIj eine direkte Proportionali- tat zwischen der relativen Enzymkonzentration und der nach einer bestimmten Zeit gespaltenen Wasserstoffperoxydmenge nicht besteht.

Tabelle 2

Versuch Nr .

I

2

Spaltung ausge- driickt in yo des

Blindwertes

11.8 22.7 31.9 42.8 50.0

5.8 16.8 24.2 31.4

UBER DIE KATALASEAKTIVITAT UND DEREN ARH~SGIGKEIT usw. 249

Nach den1 eben gcsagten ist dies auch nicht Z L ~ erwarten. Die prakti- sche Reichweite dieses Umstandes wird durch die in Tabelle 2 wieder- gegebenen Versuche illustriert.

Wie man sieht, ist die nach einer Reaktionszeit von 10 Minuten erreichte Spaltung der relativen Enzymkonzentration nicht propor- tional, oder rnit anderen Worten : das Verhaltnis zwischen Spaltungs- ausmal3 und relativer Enzymkonzentration ist nicht konstant. Ta- belle 2 zeigt, dal3 der Fehler, den man bei der Annahme direkt,er Pro- portionalitat zwischen relativer Enzymkonzentration und der nach I o Minuten gespaltenen Wasserstoffperoxydmenge begdht, nur dann ver- haltnismaDig bedeutungslos ist, wenn der Versuch so gefuhrt wird, dal3 weniger als 20010 des im Reaktionsgemisch vorhandenen Wasser- stoffperoxydes gespalten werden. Bei hoh,eren Spaltungen hingegen fuhrt man bei der direkten Berechnung der Katalaseaktivitat aus dem AusmaB der Spaltung grobe und mit der Spaltung schnell wachsende Fehler ein. Diese Betrachtungen beziehen sich naturlich nicht nur auf die Methode von Bach und Zubkowa, sondern auf jedes auf dem gleichen Prinzip beruhende Verfahren.

Versuchsergebnisse Die Versuchspersonen wurden in 3 Gruppen geteilt: Gruppe I

umfaDt Kinder im Alter v m 4 Monat,en bis 1 0 Jahren, Gruppe z Neygeborene und Kinder im Alter bis zu 3 Moaaten, und Gruppe 3 Friihgeborene in den ersten Lebensmonaten. Diese Einteilung wird irn folgenden b,cgrundet werden. Einige Kinder der Gruppen z und 3, sind mehrmals rnit geeigneten Zwischenraumen untersucht worden, urn, wie in der Einleitung erwiihnt, festzustellen, ob die Katalaseaktivi- tat des Blutes in den ersten Lebensmonaten parallel rnit dem iun gleichen Zeitraum stark sinkenden Hamoglobinge.ha1t des Blutes ab- nimmt.

Tabelle 3 zeigt die an Gruppe I gewonnenen Ergebnisse. Ich habe I 9 schon fruher veroffentlichte Untersuchungen an Kinder der- selben Altersklassen der Ubersicht halber in die Tabelle mit aufge- nommen. Die 29 neuen Befunde bestatigen, was das Verhiiltnis zwi- schen Katalaseaktivitat und Hamoglobingehalt betrifft, durchaus die fruheren. Wie man sieht, besteht keine absolute Proportionalitat zwi- schen diesen beiden GroDen, aber im allgemeinen entspricht doch einem hohen Hamoglobingehalt eine groDe Katalaseaktivitat und um- gekehrt. Ordnet man namlich die Versuchspetsonen in 4 Gruppen nach dem Hamoglobingehalt pro I 00 cm3 Blut (7,5-9,5 g, 9,5-1 I g , I 1,o-12,s g , 12,5-14,0 g ) und berechnet man den durchschnitt- lichen Hamoglobingehalt jeder Gruppe und die ihm entsprechende

250

Nr .

I 2

3 4 5 6 7 8 9

I0 I1 I 2

I 3 14 15 16 17 18 19 20 21

22

23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48

BENT AXDERSEK

Tabelle 3 K i n d e r von 4 Monaten bis zu 10 J a h r e n .

Hamoglobin g in IOO cm3

11.87 11.50 11.18 10.83

9.80

12.42 9.80

12.70 10.21

11.18 11.59 11.04

11.73 9.66 8.14

10.63 9.93 8.83 8.14

11.45 8.14

8.83 7.73 9.23 7.59

I I .04 10.07 9.94

12.83 11.04 8.28

10.63 12.70

12.42

I I .87 11.32

I 2.42 13.65 12.69 10.76 13.11

11.11

11.59

10.35

10.21

11.59

11.59

11.59

k, . TO*

296 268 256 256 234 256 260 320 244 306 248 232 2 60 228

280 244 208 226 268

250 250 238 269 258 187 237

290 252

2 2 0

2 2 1

2 20

236 276 276 184 246 304 300 280

296 264 270 236 304 330 252 266 298

Q ~

24.9 23.1 22.9 23.6

26.1 22.4 25.8 24.9 24.1 24.3 20.8 22.4 20.7 21.3 23.9 25.3 25.G 21.3 27.0 25.0 30.7 21.8 29.2 26.3 29.2 24.2 25.7 29.0 26.3 25.0 23.7 21.5 25.0 22.2 23.1 23.9 25.9 22.5 25.5

23.9 20.4 24.5 24.2 19.9 24.7

21.1

22.2

22.7

Mittel 24.2

~ B E R DIE KATALASEAKTIVIT~T USD DEREN ABH~NGIGKEIT usw. 251

0 0 o o o 0

durchschnittliche Katalas'eaktivitiit, so erhalt man folgende Werte : 8,32 g-ko = 223 (9 Falle), 10,22 g-ko = 249 (13 Falle), 11,58 g - ko = 2 7 0 ( 2 0 Falle) und 12,95g-k, = 294 (6 Faille). Q, das Ver- haltnis Katalaseaktivitat : Hamoglobingehalt ist in den 4 Gruppen 26,7, 24,4, 23,3 und 22,7, also am hochsten in der hamoglobinarmsten Gruppe, was wiederum besagt, daD die Katalaseaktivitat bei dieser Gruppe wveniger herabgesetzt ist als der Hamoglobingehalt. Das Ma- terial ist indes nicht awreichend, um diese Erscheinung als gesichert zu. betrachten. I

Der Umstand, daD die Einzclobservationen von dem Mittelwert von Q mehr oder weniger abweichen, kann verschiedene Grunde haben. Vor allem mu.R man die Moglichkeit bedenken, daD Q individuelle Va- riationen zeigen kann: das von mir untersuchte Materia'l ist ja nicht homogen, sondern umfaBt Sauglinge und groDere Kinder, deren viele auDerdem nicht gesund waren. Das Material ist naturlich vie1 zu klein als das man entscheiden konnte, ob eine Bezie'hung zwischen der GroBe vcm Q und dem Alter oder Gesundheitsstand der Versuchsper- sonen besteht; eine solche Entscheidung ivurde in der vorliegenden

Nabel- schnur- blut

Tabelle 4 Neugeborene b i s 3 Monate a l t e Kinder .

Nr .

I 2

3

4

5 6 7

8 9

I0 I1 I 2

13 I4 55 16 17 I 8 I 9

Hgb., g in 1oocm3

17.60 20.56 21.39 16.70 13.25 16.84 13.11 18.77 13.25 15.87 11.18 12.14 10.90 10.63 11.32 10.63

11.32 17.11 15.73 15.73 15.18 15.04 13.80

12.97

k, . 104 Q

18.6 16.1 18.7 21.6 20.8 20.8 20.0 21.0 21.6 16.0 17.4 15.6 16.0 20.5

'7.3 19.9 '7.4 18.9 16.1 16.5 18.6 19.1 18.4 18.1

252 BENT ANDERSEN

Tabelle 5 Fri ihgeborene. - ._

Nr . - -

I

3 4

5 6

7

8 9

I0

I1

I2

I3 I4 I5 16 I7

I8

Geburts- gewicht in g

-1lter Hamoglobin in Tagen g in 1oocm3

2000

900

I 300 2000

2200 I 800

2000

I950 1850

2000

2400

1400

1800 1870 1250 1860 2000

1600

49 79 I1 2 0

I3 15 26

I9 81 25 44 67 26 28 35 29 44 33 72 33 60 84 36 53 57 58 71

119 127 107

2 0

17.10 8.83 9.66

18.49 16.28

1 1 .59 10.07

13.66 8.56

19.18

18.77

19.87 12.97 9.94

17.94 11.45 10.14 16.84 12.42 14.08 10.07 12.28 8.00 7.31

11.87 8.41 9.11

8.42 11.59 11.59 7.31

9.38

k, . 104

300

I 80 240 240 288

I45 245 204 132 392 264 214 2 78 I 68 150 300 234 270 184 218 136 136 I 86 I54 I 60 142 128 I94 I 80 128

167

I78

Q

17.5 18.9 18.6 13.0 14.7 15.0 15.4 14.4 13.1 14.9 15.4 19.7 20.4 21.5 15.5 14.7 14.8 17.8 18.8 19.2 18.3 17.8 17.0 18.6 15.7 18.3 17.6 15.1 15.2 16.7 15.5 17.5

Abhandlung auch gar nicht angestrebt. SchlieDlich mu13 bei der Be- urteilung von Q mit dem moglicherweise bei der Kxtalaseaktivitiits- bestimmung begangenen Fehler von bis zu 50/0 und mit dem mog- lichen Fehler der Hamoglobinbestimmung (bis zu f I o/o) gerechnet werden. Hierzp kDmmen noch Fehler unbekapnter Art. Innerhalb der Werte 22,8-25,7 liegende Abweichungen von Q vom Mittelwert konnen daher ohne weiteres durch die bekannten Fehkrquellen er- kla rt waden.

Ich will nun die Versuche der Gruppen 2 und 3 besprechen. Die Versuchwgebnisse sind in den Tabellen 4 und 5 wiedergegeben. 1 3 der Kinder dieser Gruppen wurden 2- oder mehrmals mit gewissen Zeitabstanden untersucht. Der Wert von Q variiert in diesen Fallen

UBER DIE KATALASEAKTIVITAT UND DEREN ABHANGIGKEIT IJSW. 253

etwas, ist jedoch bei Berucksichtigung der methodischen Fehlerbreite fur jedes Kind als recht konstant zu betrachten, trotz der groBen Schwingungen im Hamoglobingehalt des Blutes. Die oben ausge- sprochene Vermutung, daI3 Q moglicherweise bei verschiedenen In- dividuen variiert, ist somit bestatigt worden. Vergkicht man die Mit- telwerte von Q in den Tabellen 3, 4 und 5, so sieht man, daI3 Q bei Kindern im Alter von 4 Monaten bis 1 0 Jahren bedeutend hoher ist d s bei Friihgeborenen, Neugeborenen und Sauglingen in den ersten Lebensmonaten. Ich betone ausdrucklich, daI3 alle uberhaupt ange- stellten Versuche in diese Zusammenstellung aufgenommen wurden, und da8, abgesehen von dex Ordnung nach Altersklassen, keinerlei Auswahl getroffen wurde. Die Versuche wurden absichtlich in ganz zyfalliger Reihenfolge awgefiihrt. Es liegt daher keinerlei Grund vor, 2u glauben, daI3 die Unterschiede der Q-Werte auf einem unentdeckten systematischen Fehler beruhen. Auch liegt die Fehlerbreite der me- thodischen Fehlerquellen weit unterhdb der gefundenen Unterschiede von Q. In Tabbelle 6 sind einige Versuche zusammengestellt, die

Tabelle 6

Spaltung (in cm3 Na-Thiosulfat) nach Hlmoglobin

5 I 10 115 Minuten I 1 1 -

I 36Tage I I .87 0.343 0.638 0.858 2 I 4Monate 1 11.87 I :::: 1 0.508 1 0.888 1 1.218

3 4 4 T W 12.42 16.9 0.420 0.753 I .008 4 I 6Monate 1 12.42 I 21.6 I 0.52 1 0.91 I 1.21

am Kindern mit gleichem Hamoglobingehalt, aber mit verschiedenen Q-Wertem ausgefuhrt wurden. Ein Vergleich von Nr. I mit Nr. 2 und von Nr. 3 mit Nr. 4 gibt einen guten Eindruck davon, wie sehr ver- schieden die bei den Titrationen verbrauchten Natriumthiosulfatmen- gen sind, auf welchen die entsprechenden Werte von Q beruhen. Wie man sieht, kommen Titrationsfehler zur Erklarung der Variationen iiberhaupt nicht im Fktracht.

AUS der Gesamtheit der Versuche kann geschlossen werdan: I . daD die einem bestimmten Hihoglobingehalt entsprechende Ka-

talaseaktivitat bei ausgetragenen Neugeborenen sowie bei Fruh- geborenen und ausgetragenen Kindern in den ersten Lebensmo- naten wesentlich (in meinen Versuchen etwa 25%) niedriger liegt, als bei Kindern im Alter von 4 Monaten bis 10 Jahren;

254 BEXT .~NDERSEN

2. daI3 die Katalaseaktivitat im allgemeinen dort am grofiten ist, wo der Hiimoglobingehalt an hiichsten ist;

3. daD keine absolute Proportionalitat zwischcn Katalaseaktivitat und Hamoglobingehalt besteht, da Q individuelle Variationen zeigt ;

4. daD Q bei wiederholter Untersuchung derselben Versuchsperson sich als recht konstant erweist.

Die nachstliegende Erkliirung der gcfundenen alngenaherten Pa- rallelitat ware die, dab die Katalaseaktivitat des Blutes dem H" am o - globin selbst zuzuschreiben sei. Diesc Erkliirung ist jedoch auf Grund unseres gegenwartigen Wissens zuruckzuweisen. Zwar hat das H" amo- globin, wie von Haurowi t z ( I 93 I ) gezeigt, katalatische AktiiAat.. sie ist aber verschwindend im Vergleich mit der der eigentlichen Ka- talase. DaB Katalase und Hamoglobin verschiedene Stoffe sind, geht akn klarsten daraus hervor, daI3 es mehrfach gegluckt ist, sie prapara- tiv zu trennen. Die beiden Stoffe sind zwar insofern nahe mit einander verwandt, a l s die aktive Gruppe der Katalase rnit dem Protohamatin des Hamoglobins identisch ist (S t e rn , I 936), aber der kolloidale Trager der Katalase ist verschieden von der Globinkomponente des Hamoglobins. Auf dieser Verschiedenheit des kolloidalen Tragers mu13 die ungeheuer verschiedene Katalaseaktivitat der beiden Sub- stanzen beruhen. Es ist moglich, daD die Erklarung der Parallelitat von Katalaseaktivitat und Hamoglobingehalt d'es Blutes irgendwie mit der Verwandtschaft der beiden Substanzen zusammenhangt. Es ist aber auch moglich, daI3 ein funktioneller Zusammenhang zwischen Katalase und Hamoglobin in den rot,en Blutkorperchen besteht. Als Beispiel fur eine derartige Annahme sei die von Ewald ( I 907) aus- gesprochene Hypothese erwahnt, daD die Funktion der Blutkatalase in der Katalyse der Sauerstoffabspaltung aus dem Oxyhamoglobin be- stehe. Obwohl E w a l d s V,ersuche nicht einwandfrei sind und ihre Deutung unsicher ist, glaube ich doch, daD diese Hypothese eine er- neute Prufung mit mod.erner Methodik verdient.

Eine Erklarung fur den Umstand, daD die einem gewissen Ha- moglobingehalt entsprechende Katalaseaktivitat bei Neugeborenen und Kindern in den ersten Lebensmonaten verhdtnismaDig niedrig ist, kann gegenwartig wohl kau.m gegeben werden. Mit Rucksicht auf nicht medizinische Leser sei auf einige andere Eigentumlichkeiten des Blutes in dieser Lebensperiode hingewiesen. - Bei der Geburt ist der Hamoglobingehalt des Blutes durchschnittlich hoher als spater. Die roten Blutkorperchen sind durchschnittlich betrachtlich groI3er als bei Erwachsenen, ihre Hsmoglobinkonzentration aber ist dieselbe. Im Laufe der ersten Lebensmonate nimmt der Hamoglobingehalt des Blutes stark ab, erreicht in der Regel im Alter von 3 Monaten ein

OBER DIE KATALASEAKTIVITAT UND DEREN ABHANGIGKEIT usw. 255

Minimum, steigt schwach bis zum Xltcr von 6 Monaten und liegt so- dann fur den Rest des crstcn Lcbcnsjahrcs recht konstant. Die bei der Geburt bestehende Megalocytose verschwindet allmahlich. Gleichzei- tig mit dem Abfallen des Hamoglobingchaltes vollzieht sich eine qua- litative Veranderung des Hamoglobins. Das Hamoglobin der Neuge- borenen ist namlich verschicden von dem der Erwachsenen. Bei Jonxis (1935) findct man cinc ausgezcichnete Ubersicht iiber die diesbezugliche Lheratur, aus welcher hervorgeht, daR das Hamoglo- bin der Seugeborenen sich von dem der Erwachsenen in folgenden Punkten unterscheidet : Stabilitat in alkalischem Medium, Krystall- form, isoelektrischer Punkt, AminosauregehaJt und Sauerstoffbin- dungskurve. In einer spateren Arbeit hat Jonx i s (1937) gezeigt, daB bei der Geburt alles uberhaupt vorhande.ne Hamoglobin foetalen Cha- rqkter hat. Gleichzeitig mit dem Abnehmen des Hamoglobingehaltes im Blute nimmt auch der relative Gehalt an foetalem Hamoglobin ab,. unid nqch etwa 4 Monaten i,st es durch das fur das spatere Leben typi- sche Hamoglobin ersetzt. Aus Untersuchungen von H a u r o w i t z ( I 935) scheint hervorzugehen, daR die groRere Stabilitat des H h o - globins der Xeugeborenen in alkalischem Medium darauf beruht, daR die Globinkomponente von der der Erwa,chsenen verschieden ist. Die prosthetische Gruppe ist die gleiche.

Die hier qufgezahlten Eigenschaften de; Blutes der ersten Lebens- monate liefern keine Erklarung fur den Umstand, daia bei Kindern dieser Altersklqsse die einem bestimmten Hamoglobingehalt ent- sprechende Kqtalaseaktivitat verhaltnismaiaig niedrig ist. Doch kann ich es mir nicht versagen, darauf hinzuweisen, daia der niedrige Ka- talase - Hamoglobinquotient meinen Untersuchungen nach etwa im vierten Lebensmonate von einem hoheren abgelost wird, also zur glei- chen Zeit, in der na,ch Jonx i s das foetale Hamoglobin verschwindet. Es ware denkbar, daia ebenso wie die Globinkomponente des Hamo- globins, auch die Proteinkomponente der Katalase bei Neugebrorenen von der der Erwachsenen verschieden ist. Dieses hypothetische Vor- kommen eines besonderen Tragers der qktiven Katalasegruppe d,er Neugeborenen konnte den Umstapd der verhaltnismaiaig niedrigen Aktivitat der Neugeborenen- Katalase recht wohl erklaren, da es z. B. bekannt ist, daia die katalytische Aktivitat einer Hamatingruppe bei Anderung des kolloidalen Tragers variiert. Diese Erklarungsmoglich- keit ist jedoch durchqus hypothetisch, denn meines Wissem liegen keine Unt'ersuchungen dwiiber vor, ob die Blutkatalase der Neuge- borenen sich in chemischer Beziehung von der der Erwqchsenen unterscheid'et.

256 BENT ANDERSEN

SchlieBlich mochte ich darauf aufmerksam machen, daI3 das Blut- plasma von Kindern in den ersten Lebcnsmonaten Stoffe cnthalterr konnte, welche die Aktivitat der Katalase hemmen. Diesbeziiglichme Versuche haben indessen diese Moglichkeit nicht gestiitzt. Die Varia- tion der GroDe von Q scheint also nur durch die in den Erythrocyten herrschenden Verhiiltnisse bcdingt z u sein.

Bei der klinischen Untersuchung der Kajalaseaktivitat des Blutes ist zu bea,chten, daB diese dem Harnoglobingehalt recht genau folgt. Einc Suche nach eventuellen Abweichungen von diesem B'efund ist da- her nabeliegend, wie es auch interessant ware, die Abhangigk,eit der Katalaseaktivitat von der Erythrocyrcnzahl. und dem Zellvolumen zu prufen.

Dr. phil. Heinz H o l t e r und Dr. phil. K a j L inde r s t r i jm- La ng , Carlsberg Laboratorium, Kopenhagen, danke ich herzlichst fur ihren Beista,nd hei der vorliegenden Arbeit.

Zusammenfassung Einige Ursachen fur die Luckenhaftigkeit unseres Wissens

uber die physiologische Bedeutung der Blutkatalase werden be- sprochen.

2. Die zur Bestimmung der Katalascaktivitat dienende Methodik wird beschrieben.

3. Eine Anzqhl von Untersuchungen der Rlutkatalaseaktivitat von Kindern im Alter von der Geburt bis zu 1 0 Jahren haben im we- sentlichen folgendes ergeben: Die einem bestimmten Hamoglobinge- halt entsprechende Katalaseaktivitat wurde bei vollausgetragenen Neugeborenen sowie bei Fruhgeborenen und volla,usgetragenen Kin- dern in den ersten Lebensmonaten wesentlich niedriger gefunden als bei Kindern im Alter von ca,. 4 Monaten bis I o Jahren.

Die Katalaseaktivitat ist im allgemeinen hoch Lei hohem Hamo- globingehdt. Absolute Proportionalitat zwischen Katalaseaktivitat und Hamoglobingehalt besteht jedoch auch innerhalb der beiden Hauptaltersklassen - uber und unter 4 Monaten - nicht. Der Ka- talasehamoglobinquotient zeigt individuelle Variationen. Fur ein be- stimmtes Individuum dagegen scheint dieser Quotient zu verschie- denen Zeitpunkten recht konstapt zu sein.

I .

UBER DIE KATALASEAKTIVITAT UND DEREK ABHANGIGKEIT usw. 257

Li te ra tu r

Andersen , Bent, Acta med. scand. 1937. 92. 3 7 5 . B a c h , A., und S. Zubkowa, Biochem. 2. 1921. 125. 283. B i s c h o f f , H., Arch. Kindrrheilk. 1927. 82. 189. Drucker , P., Acta Paediatrica 1923-24. 3. I .

Ewald , W., Pfliigers .Irch. 1907. 116. 334. Haurowi tz , F., 2. physiol. Chem. 1951. 198. 9. Haurowi tz , F., Ebenda 1935. 232. 1 2 5 .

I g l a u e r , K., und S. \Veber, Biochem. 2. 1931. 234. 489. J o n x i s , J. H. P., Over het roorkommen van meerdere haemoglobinesorten bij

J o n x i s , J. 11. P., Mschr. Kindergeneesk. 1937.6. 356, zit. n. Zentralbl. Kinder-

Kriiger, F. v., 2. ges. exp. Med. 1919. 64. 680. Stern, K. G., 2. physiol. Chem. 1932. 204. 259. S tern , K. G., J . biol. Chem. 1936. 112. 661. Sumner, J. B., and A. L. Dounce , Science 1937a. 85. 366. Sumner, J. B., and A. L. D o u n c e , J. biol. Chem. 1937b. 121. 417. T h i e n e n , G. J. van, Dtsch. Arch. klin. M e d . 1920. 131. 113. Zei l e , K., und H. H e l l s t r a m , 2. physiol. Chem. 1930. 192. 1 7 1 .

kinderen, Groningen 1935. Inaug. Diss.

heilk. 1937. 34. 108.

Skandinav. Archiv. 79.