Aus dem Institut fur Milchwirtschaft und Garungswesen der Landw. Hochschule Hohenheim (Direktor: Prof. Dr. G. SCHWARZ)

tfber einige Beobachtungen bei der Phosphatase- Bestimmung in Milch1

G. SCHWARZ, J. LUDWIG und A. FRICKER

A . Ulztersuchungen Gber delz Ausfall der Phosfihatasefirobe in hocherhitzter Milch

Schon vor einiger Zeit wurde von verschiedenen Seiten vorgeschlagen, fur den Nachweis eines Rohmilchzusatzes zu ordnungsgemHB hocherhitzter Milch die Phos- phataseprobe heranzuziehen. Hierzu glaubte man sich berechtigt, da ein Zusatz von etwa 0,5% Rohmilch ohne weiteres nachgewiesen werden kann, unter der Voraussetzung, daB in hocherhitzter Milch nicht mit einer Wiederkehr der Phos- phatasereaktion zu rechnen ware.

Bereits 1953 berichteten aber WRIGHT und TRAMER [I], daB Milch, die sie in einem kleinen H.T.S.T.-Pasteurisierungsgerat (Stundenleistung ZOO 1) auf 161 O F (72 "C) erhitzt hatten, eine Wiederkehr der Phosphatasereaktion zeigte, wenn die pasteuri- sierte Milch 18 Std. bei 26 "C aufbewahrt wurde. Die H.T.S.T.-Pasteurisierung ent- spricht hinsichtlich der Erhitzungstemperatur etwa der in Deutschland iiblichen 1< urzzeiterhitzung.

Bei Untersuchungen von SCHOLZ [z] an Milchproben, die im Normalerhitzer ord- nungsgemaB kurzzeiterhitzt worden waren, konnte eine solche Reaktivierung der Phosphatase nicht beobachtet werden. Diese Befunde stehen in Ubereinstimmung mit denen von KIERMEIER und MEINL [3], wonach in kurzzeiterhitzten Milchproben nur ganz selten und dann unter praxisfremden Bedingungen eine Reaktivierung der Phosphatase festgestellt werden konnte. Dagegen fanden die gleichen Autoren bei der Untersuchung von Milchproben, die in einem Laboratoriumserhitzer hoch- erhitzt und bei verschiedenen Temperaturen aufbewahrt worden waren, eine Regene- ration der alkalischen Phosphatase.

Auch wir hatten vor einiger Zeit die Beobachtung gemacht, daB hocherhifzfe Milch nach einigem Stehen bei erhohter Temperatur eine positive Phosphatasereaktion liefern kann, obgleich die Milch, direkt nach, der Erhitzung untersucht, negativ reagierte. Wegen der Bedeutung, die dieser Erscheinung im Hinblick auf den Nachweis eines Rohmilchzusatzes zu ordnungsgemaa hocherhitzter Milch zu- kommt, haben wir uns in einer Reihe von Versuchen bemiiht, zu klaren, unter welchen Erhitzungs- und Aufbewahrungsbedingungen hocherhitzte Milchprobe eine positive Phosphatasereaktion geben.

1 Herrn Prof. Dr. Dr. h. c. K. T~~UFEL zum 70. Geburtstag gewidmet.

Phosphatase-Bestimmung in Milch 689

Zu diesem Zweck erhitzten wir frische Milch in einem Plattenerhitzer der Firma ROTH, Stuttgart, (Stundenleistung 750 1) unter Hocherhitzungsbedingungen auf Temperaturen von go, 88, 86, 85 und 84 "C. Sofort nach der Erhitzung wurde die Phosphatasewirksamkeit der Milchproben nach der Methode von SCHWARZ und FISCKER [4] bestimmt und aul3erdem die Phosphataseprobe mit ,,Lactognost" durchgefuhrt. AnschlieSend stellten wir jede Milchprobe, auf zwei Flaschen ver- teilt, in Wasserbader von 15 bzw. 30 "C ein. Nach 2-4-6-8-10 Std. wurden die Proben erneut wie oben beschrieben untersucht.

Wahrend die bei 15 "C aufgestellten Milchproben selbst nach 10-stiindiger Auf- bewahrung noch negativ mit ,,Lactognost" reagierten, lieferten die bei 30 "C ge- haltenen Proben bereits nach zwei Std. eine schwach positive Reaktion. Nach 10- stundiger Aufbewahrung bei 30 "C wurde mit ,,Lactognost" bereits die Farbstufe I der Farbskala dieses Reagenzes erreicht. Eine solche Phosphatasewirksamkeit in hocherhitzter Milch konnte von uns stets beobachtet werden, wenn die Milch langere Zeit bei 30 "C aufbewahrt wurde, wobei die Farbintensitat der Reaktion weitge- hend unabhangig von den oben genannten Erhitzungstemperaturen war.

Die photometrische Ausmessung der nach SCHWARZ und FISCHER [4] erhaltenen Blaufarbung ergab eine deutliche Verstarkung der Farbintensitat, je langer die hocherhitzten Milchproben vor der Untersuchung bei 30 "C aufbewahrt wurden. Erfolgte die Aufbewahrung bei 15 O C , so war keine Farbvertiefung zu beobachten.

In Abb. I entspricht die Lange der eingetragenen senkrechten Striche dem Be- reich, innerhalb dessen die bei unseren Versuchen ermittelten Extinktionskoeffi- zienten lagen.

Auch bei entsprechenden Versuchen mit dem Normalerhitzer (Stundenleistung 60 1) wurden analoge Ergebnisse erzielt, so daB auf deren Wiedergabe verzichtet werden kann.

Aus unseren Versuchen geht eindeutig hervor, daB eine positive Phosphatase- reaktion in hocherhitzter Milch, die etwa der Farbstufe I von ,,Lactognost" ent- spricht, nicht unbedingt die Anwesenheit von Rohmilch beweist, zumal nicht im- mer mit Sicherheit festzustellen sein durfte, ob die auf einen etwaigen Zusatz von Rohmilch zu untersuchende hocherhitzte Milch nach der Pasteurisierung bei er- hohter Temperatur gestanden hatte.

B. Quantitative Untwsuchungen iiber den Phosfihatasegehalt von klcrzzeiterhitzter Milch

(Grundlage : Methode von ASCHAFFENBURG und MULLEN) In einer fruheren Veroffentlichung [5 ] berichteten wir iiber unsere Erfahrungen

beim Nachweis der Kurzzeiterhitzung von Milch vermittels Dinatrium-p-nitro- phenylphosphat nach der Methode von ASCHAFFENBURG und MULLEN [6]. Den Hauptvorteil dieser Methode erblicken wir darin, daB p-Nitrophenol, welches wah- rend der Bebriitung der Milch durch die Phosphatase abgespalten wird, infolge seiner Gelbfarbung in alkalischer Losung direkt erkennbar ist, wahrend bei anderen Phosphataseproben das Spaltprodukt erst nach Zusatz eines weiteren Reagenzes nachgewiesen werden kann. Mit Hilfe der p-Nitrophenol-Methode ist es moglich,

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eine Unterschreitung der Mindesterhitzungstemperatur (71 "C) urn 3 "C mit Sicher- heit bereits nach einer Bebriitungszeit von nur einer halben Stunde festzustellen. An die qualitative Beurteilung der bebruteten Proben la& sich ohne Schwierigkeit unter der Verwendung derselben Reaktionsansatze eine quantitative Bestimmung des p-Nitrophenol-Gehaltes in den Proben anschlieoen.

I A Aufbewohrungs - ""1

Aufbewahrungs - temperatur: W C

Abb. I . Phosphatase-AktivitLt von hocherhitzter Milch in Abhangigkeit von Aufbewahrungszeit und -temperatur

Arbeitsvorschrift fiir die quavztitative PhosPhatasebestimmung Nach entsprechenden Vorversuchen wahlten wir die von RITTER [7] angegebene

Arbeitsvorschrift, wobei wir fiir unsere weiteren Versuche an Stelle der dort be- schriebenen Puffersubstrat-Losung eine solche unter Verwendung von Carbonat- Hydrogencarbonat als Puffer benutzten.

Erfovderliche Reagensien :

a) Pufferlosung : 3.5 g Natriumcarbonat (wasserfrei) und 1.5 g Natriumhydrogencarbonat mit destilliertem Wasser zu 1000 ml gelost.

In einem MeDkolben werden o,15 g Dinatrium-p-nitrophenylphosphat mit Pufferliisung auf IOO ml aufgefullt. Die Losung ist farblos und hat einen pH-Wert von I O , ~ .

z8yoige wasserige Losung von Trichloressigsaure.

b) Puffersubsftat-Ldsung :

c) EiweiPfillung&nittel:

d) Alkalisierungsmittel: I) 14 g Natriumhydroxyd in dest. Wasser zu IOO ml gelost. 11) 5 g Natriumhexametaphosphat in dest. Wasser zu IOO ml gel6st.

z ml Milch werden mit 10 ml Puffersubstrat-Losung versetzt, gemischt und zwei Std. bei 37 "C bebrutet. Nach Zugabe von z ml Trichloressigsaurelosung schiittelt man die Proben durch, laBt

Phosphatase-Bestimmung in Milch 691

sie zehn Min. stehen und filtriert dann durch ein Faltenfilter (SCHLEICHER und SCHULL 605 h). 10 ml des klaren Filtrates werden mit einer frisch bereiteten Mischung aus I in1 Alkalisierungs- mittel I und z ml Alkalisierungsmittel I1 versetzt. Die auftretende Gelbfkbung wird im Photo- meter bei einer Wellenlhge von 420 nm gemessen (pH-Wert der Reaktionsfliissigkeit: 11.7).

Bei der Aufstellung einer Eichkurve unter Verwendung von gepufferten p-Nitrophenol-lijsun- gen @H I I , ~ ) bekannten Gehaltes erhielten wir im Bereich von 0-zopg p-Nitrophenol je 5 mi Pufferltjsung eine Gerade. Der Extinktionskoeffizient K fur I pg p-Nitrophenol war 0,016.

Wendet man die angegebene Arbeitsvorschrift an, so ergibt sich fur die Berech- nung folgendes : Das Fliissigkeitsvolumen betragt nach Zugabe der Trichloressig- saurelosung 14 ml. Nach der Filtration werden 10 ml des Filtrates mit 3 ml Al- kalisierungsmittel versetzt, so da8 in den 13 ml Fliissigkeit noch 1,43 ml Milch ent-

I,OO

1943 halten sind. Zur Umrechuung auf I ml Milch dient der Faktor ~ = 0,699. Der

Gehalt an p-Nitrophenol, bezogen auf I ml untersuchte Milch, ekichnet sich dem- nach aus dem gefundenen Extinktionskoeffizienten K nach folgender Formel :

K .13 - 0,699 0.016 . s pg p-Nitrophenol/ml Milch = = K . 113,6.

- Diese Gleichung gilt nur fur den oben genannten Bereich von 0-20 pg p-Nitro-

phenol.

Tabel le I

Gehalte an p-Nitropheuol in kurzzeiterhitzter Milch

Erhitzungstemperatur der Milch

OC

74 72 71 70 69

Rohmilchzusatz 0,5%

Gehalt an p-Nitrophenol/ml Milch

Mittelwert Pg

Unter Kurzzeiterhitzungsbedingungen im Normalerhitzer auf Temperaturen zwischen 74 und 69 "C erhitzte Proben frischer Milch wurden sofort nach der Ab- kiihlung auf ihre Phosphatasewirksamkeit gemaB der angegebenen Arbeitsvor- schrift untersucht. Zur Bestimmung des Blindwertes diente eine auf 85 "C/I Min. erhitzte Milch, die in der gleichen Weise wie die anderen Proben aufgearbeitet wurde.

Die unter Beriicksichtigung des Blindwertes in 14 Einzelversuchen gefundenen Gehalte an p-Nitrophenol sind in Tab. I wiedergegeben.

Unter den von uns gewahlten Versuchsbedingungen wurden in ordnungsgemau kurzzeiterhitzter Milch (74-71 "C/40 Sek.) stets weniger als 3 ,ug p-Nitrophenol/ml Milch freigemacht.

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Zusammenfassung I. Untersuchungen iiber den Ausfall der Phosphataseprobe in hochevhitdev Milch ergaben, daD

bei einer Aufbewahrung der Proben bei 30 "C schon z Std. nach der Erhitzung eine psoitive Phos- phatasereaktion auftreten kann. Eine Verlangerung der Aufbewahrungszeit fiihrte zur Erhohung der Phosphatasewirksamkeit in den Proben. Nur bei genauer Kenntnis der Aufbewahrungs- bedinguugen der erhitzten Proben kann daher eine positive Phosphatasereaktion in hocherbitzter Milch als sicherer Beweis fur eine Rohmilchbeimischung gewertet werden.

2. In ordnungsgemaB im Normalerhitzer (Stundenleistung 60 1) kuvzzeitevhitzten und nach der angegebenen Arbeitsvorschrift (Grundlage: Methode yon ASCHAFFENBURG und MULLEN) unter- suchten Milchproben wurden stets weniger als 3 pg p-Nitrophenol/ml Milch in Freiheit gesetzt.

Summary I. Investigations dealing with the result of the phosphatase test in highly heated milk show

that a positive phosphatase reaction can occur already z hours after heating when the samples are stored at 30 'C. A prolongation of storage time causes an increase of the phosphatase efficiency in the samples. Therefore, a positive phosphatase reaction in highly heated milk can only be evaluated as a sure proof of an addition to raw milk when an exact knowledge of storage condi- tions is given.

2. In milk samples being duly short-time heated in a standard heater (60 1 capacity per hour) according to the method of ASCHAFFENBURG and MULLEN and tested after the named working instruction less than 3 pg p-nitrophenol/ml milk have always been liberated.

P e a m ~ e 1. KaK n o ~ a a a n ~ O I I ~ I T ~ I no o n p e A e n e H m o ( P o c a a ~ a a b ~ B M o n o K e , n o m e p r H y T o M

g n m e n b H o M y H a r p e B a H m o , n p ~ x p a H e m M o6pa3so~ n p ~ 30°C yme sepea 2 saca IIOCJIe H W p e B a H H R MOlKHO H a 6 J I I o n a T b IIOJIOHEHTeJlbHYH) P e a H U H I o H a 4 0 C a a T a 3 y . Y n J I H H e H H e BpeMeHEi XpaHeHEIJ3 IIpUBeJIO K IIOBbIIUeHHIO @OC@aTa3HOP UTHBHOCTEI. nOJIOmHTeJlbHyKl PeaKUEIIO AJIHTeJlbHOe B p e M R H a r p e T O r O MOJIOKa H a @OC@aTaay MOWHO CqEITaTb HaDeHEHbIM nOKa3aTeJIbCTBOM IIpHMeCEI H e H a r p e T O r O MOJIOKa TOJibKO npu T o s H H x y ~ a 3 a n u ~ x o YCJIOBHHX x p a H e H m .

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Li te ra tu r [I] WRIGHT, R. C., u. J. TRAMER, J. Dairy Res. 20, 258 (1953); J. Dairy Res. 21, 37 (1954). [z] SCHOLZ, E. M., Kieler Milchw. Forsch. Ber. 8, 233 (1956). [3] KIERMEIER, F., u. E. MEINL, 2. Lebensmittel-Unters. u. -Forsch. 114, 481 (1961). [4] SCHWARZ, G., u. 0. FISCHER, Milchwissenschaft 3, 41 (1948). [5] SCHWARZ, G., u. J. LUDWIG, Dtsch. Molkerei-Ztg. 75. 566 (1954). [6] ASCHAFFENBURG, R., u. J. E. C. MULLEN, J. Dairy Res. 16, 58 (1949); Dairy Industr. 18, 396

[7] RITTER, W., Schweiz. Milchztg. (Wiss. Beilage) 79, (Nr. 3), 17 (1953).

Prof. Dr. G. SCHWARZ, J. LUDWIG und A. FRICKER, Institut fur Milchwirtschaft und Garungs- wesen der Landw. Hochschule Hohenheim, Stuttgart-Hohenheim, Postfach 56.

('953).

Eingegangen 24.4.1962.