Naunyn-Schmiedeberg's Arch. exp. Path. u. Pharmak. 236, 492--502 (1959)

Aus dem Pharmakologischen Institut der Universit~t Wfirzburg

(~ber Zusammenh~inge zwischen esterolytischen und pharmakologischen Wirkungen

yon jararacagift, Kallikrein und Thrombin* Von

ERNST HABERMANN

Mit 5 Textabbildungen

(Eingegangen am 13. April 1959)

In den letzten Jahren land man, dab Ester und Amide yon Amino- s/iuren nicht nut dutch altbekannte proteolytische Enzyme (NEuRAT~ U. SC~WERT) gespalten werden, sondern auch durch pharmakologisch bzw. biochemisch interessante Stoffe oder Stoffgemische, wie Thrombin (SHERRY U. TROLL), Plasminpr/iparate (TROLL, SHERRY U. WACHMAN), Urokinase (Plasminogenaktivator aus Ham; PLOUGH tl. KJELDGAARD), Sekret akzessorischer Geschlechtsdrfisen (FR]~UND), Bothrops jararaca- Gift [HE•RIQUES u. Mitarb. (1), (2)] und eine h/imostyptische Fraktion hieraus (HoYdEN). Auch Zusammenh'/inge zwischen der C'l-Komponente des Komplements und Esterase-Effekten werden diskutiert [LEPow u. Mitarb. (1), (2), (3)].

Vermutlich bestehen enge Beziehungen derartiger biochemischer Wirkungen zu pharmakologischen Effekten yon Naturstoffen, die wir friiher untersucht haben. Ffir hitzebehandeltes Jararacagift ist schon ein Zusammenhang zwischen Esterspaltung und Bradykininbildung sowie Blutgerinnung angenommen worden (HAMBERG U. ROCHA E SILVA). Die Amidase des gleichen Giftes verh/ilt sigh bei der Reinigung [HE~RIQUES U. Mitarb. (1)] derart /ihnlieh wie das von uns isolierte thrombin/ihnlich wirkende Prinzip (HABERMANN), dab eine Identit/it der beiden Pr/iparate zu vermuten ist.

In der vorliegenden Untersuchung werden daher die esterolytisehen Wirkungen yon Jararaeagift, Kallikrein und Thrombin auf Zusammon- h/inge mit weiteren pharmakologischen und biochemischen Wirkungen geprfift.

Methodik Esterspaltung (modifiziert nach RO]3EaTS): 0,2 ml 0,05 m p-Toluolsulfonyl-

argininmethylester (kurz TAME genannt) in 0,1 m Trishydroxy-methyl-aminomethan (Tris)-HC1-Puffer p~9,0-~ 0,1 ml zu testende LSsung; die jeweils angegebene

* Herrn Professor Dr. W. S. LOEWE, Salt Lake City, zum 75. Geburtstag gewidmet.

Jararaeagift, Kallikrein und Thrombin 493

Zeit bei 37 ° halten; auf Raumtemperatur abkiihlen, 0,3 ml 2m Hydroxyl- aminhydrochlorid sowie 0,3 ml 3,5 n NaOH zusetzen, 25 min bei Raumtemperatur halten; dann 0,3 ml einer Salzs~ure (37°/o)-Wasser-Verdiinnung (1:2) sowie 5 ml 0,11 m FeC1 s in 0,04 n HC1 (PH 1,2) zusetzen. Die gefiillten Glascuvetten werden zur Entfernung yon Stickstoffblasen kurz auf etwa 20 mm Hg evakuiert, ehe bei 525 m/~ gegen Wasser gemessen wird (Schichtdieke 1 cm, Unieam-Spektrophoto- meter). Die Beziehung zwischen Esterkonzentration und Extinktion entsprieht dem Lambert-Beerschen Gesetz. Die in Abbildungen und Tabellen angegebenen Esterase- aktivit~ten beziehen sich, falls nicht gesondert vermerkt, auf 0,1 ml der getesteten LSsungen.

Thrombinghnliche Wirkung. 0,1 ml 0,50/0 Fibrinogen (Behring-Werke) in 0,85% NaC1 + 0,1 ml 0,1 m Veronal-Salzs~ure-Puffer p~ 6,8 (1:1 mit 0,85o/o NaC1 verdiinnt); einige Minuten bei 37°; dann 0,1 ml der zu testenden LSsung mit 0,1°/0 Albumin und 0,85% NaC1 zusetzen. Eichkurve mit standardisiertem Thrombin der Behringwerke. Aktivitatsangabe in NIH-Einheiten.

ErhShung der Ge/g[3permeabilit~it. In die mit scharfer Schere enthaarte I~iicken- haut eines wei•en Kaninchens werden 0,1 ml der zu priifenden LSsungen mit 0,85°/0 NaC1 injiziert. AnschlieBend 1 ml/kg einer 0,5°/0igen filtrierten Evansblue- LSsung i.v.

Bildung yon Bradykinin bzw. Kallidin. 0,1 ml Giftverdiinnung in Kochsalz- 15sung -~ 0,1 ml Cystein (l°/0ig in Phosphatpuffer PH 6,8) ÷ 0,9 ml t~inderserum. Inkubation bei 37 °, bei reihenweisen Testungen fiir 5 min. Jeweils 0,2 ml werden am isolierten Meerschweinchenfleum ausgewertet.

Proteinbestimmung. Nach LOWRY und Mitarb. mit Folin-Ciocalteu-Reagens. Wegen der yon Protein zu Protein etwas unterschiedliehen Extinktion pro Gewichts- einheit wurde auf deren Umrechnung in Milligramm Protein/ml verzichtet; doch wurde zur Orientierung der theoretisehe Proteingehalt beim jeweiligen Maximum in den Abbildungen wiedergegeben.

Elektrophorese. Vorversuche auf der gekiihlten St~rkeplatte hatten ergeben, dai~ die gesamte uns interessierende Aktivit~t anodisch wanderte. Bei den an~lytischen Experimenten verwendeten wir St~rkes~ulen (0,9--1,0 × 55 cm, Fritte G 3), in die wit von oben her das zu analysierende Material in 0,5 ml PufferlSsung (0,025 m Veronalnatrium-Salzs~ure-Puffer pH 9,0) und anschliel~end 0,5 ml Puffer eindringen lieBen. Die Kathode war durch eine Pufferbriicke mit dem oberen S~ulenende ver- bunden, die Anode auf gleiche Weise mit der die S~ule umgebenden Fliissigkeit und so mit dem unteren S~ulenende. Die Spannung wurde so reguliert, dab bei etwa -{-2°2 Milliamp. flossen. Die Elektrophoresedauer wurde der gewiinsehten Wan- derungsstrecke angepa~t.

Ergebnisse 1. Yersuche mi t Jararacagif t . Bei der Gewinnung des th rombin-

ahnl ichen Prinzips (HABERI~IANN) war aufgefallen, dab die ak t ivs ten F rak t i onen auch die GefaBpermeabil i tat s tark erhShten u n d - - wie naeh den mi t anderer Methodik yon HOLTZ u. ]:~AUDONAT erha l tenen Befunden zu e rwar ten - - B radyk in in bfldeten. Neuerdings fanden wir, dab sich die esterspaltende Fabigkei t bei schrittweiser Aeetonfal lung in den naml ichen Frak t ionen anreicher t wie die F ib r inogenspa l tung u n d dal~ sie ebenso wie diese durch Albuminzusa tz ak t iv ier t wird (vgl. Tab. 1). Doch ist das Verhal tnis Es te rase /Thrombinwirkung nicht bei allen F rak t ionen d a s gleiche wie bei beim Ausgangsmater ia l , was gegen eine Gleichsetzung d e r beiden Akt iv i t~ ten sprieht.

4 9 4 E R N S T H A B E R M A N N :

Bei analytischer Siiulenelektrophorese der durch S~uredenaturierung und Acetonfiillung gewonnenen Frakt ionen wanderte das Maximum yon thrombiniihnlicher und bradykininbildender Aktivi t~t verschieden schnell, gleichgfiltig ob m a n diese Frakt ionen aus mehrere Jahre (Abb. 1) oder wenige Wochen altem Trockengfft hergestellt hatte. Die Esterase- akt ivi t~t wanderte niemals in einem einzigen Maximum, sondern stets mi t je einem Gipfel schneller oder langsamer als die thrombiniihnliche

Tabellel. Verhalten von thrombinghnlicher Wirkung und Esterspaltung bei /raktionierter A ceton/dllung nach selektiver Sduredenaturierung

200 mg Jararacagift, Vorbehandlung und FMlung wie bei HABERMA~N

Frak t ion Nr.

mgTrockengewicht . . . . . . Thrombin (NIH)-E/mg . . . . . NIH insgesamt . . . . . . . . Ausbeute (°/0) . . . . . . . . . Esterase-Aktivit/~t

(A/~M/mg u. 30 min) . . . . Gesamtaktivit/~t . . . . . . . Ausbeute (°/o) . . . . . . . . . Esterase-/Thrombinakt . . . . .

8,5 8,1

< 42,5 61 < 2 2

30 77 255 I 620

i 1 ,5 4

- - I 10

~ u

l I I IV

9,5 5,0

1740 175 58 6

- - 590 98O 930012950

57 1~

I--;5-

m I I I ohne

Ausgangs- Albu- mater ia l min-

zusatz

2OO 43

Komponente , auBerdem waren auch die dazwisehenliegenden Frakt ionen esterasehaltig. Es k6nnte also ein Tell der Esteraseaktivi t~t in Beziehung zur Bradykininbi ldung stehen, ein anderer zur thrombin~hnlichen Wirkung ; die Beobachtungen bei Elektrophorese widersprechen aber einer Gleichsetzung yon Esteraseaktivit i i t und Bradykinin- bzw. Fibrinbildung.

ttAMBV, RG U. ROCHA ~ SILVA erhitzten Jararacagif t in physiologischer Kochsalzl6sung kurz (3--5 vain) auf 98 °, um bradykininzerst6rende Prinzipien auszuschalten. Wenn man die durch S~urebehandiung und anschlieBende Aeetonf~llung gewonnenen Frakt ionen entsprechend erhitzt , f~llt die thrombiniihnhche und esteratische Aktivit/it um etwa 200/0; die Restaktivit~tt verteilt sich jedoch bei Elektrophorese ~hnlich wie die des Gesamtmaterials (Abb. 2).

2. Yersuche mit Kallikrein. Best immte elektrophoretisehe Frakt ionen yon Jararaeagff t spalten p-Toluolsulfonylargininmethylester und bilden zugleich Bradykinin ; dieses ist seinerseits nicht von dem dureh Kallikrein gebfldeten Kallidin unterscheidbar. Die danach zu vermutende ester- olytische Aktivi t~t des Kallikreins fand sich in der Tat (Abb.3). Die Zeitabh~ngigkeit der Reakt ion ist unter unseren Bedingungen nieht ganz

Jararacagfft, Kallikrein und Thrombin 495

linear, wolff wegen des zu geringen Substratiiberschusses. Mit steigendem pH Dimmt die esterolytische Wirkung zu, doch weist dann (]as Substrat auch betrRchtliche Eigenhydrolyse auf(Tab.2). Cystein (Endkonzentration

I %/m.t Zg

75

70 - - - -

5

ZO I

°h/~t

75

70

,F /

0

6 8 70 7Z

[

~0... -r

[

..\

X 4 £ 7O 72

Abb. 1. Elektrophorese vorgereinigten Materials (F I I l ) aus Jararacagi# in der S~rkes~ule. a 2,18 rag, 9 8td bei 800 V u n d 2 Mill iamp. Ordinate: Ausbeute (°/o/ml) bez . thrombini ihnl icher (* *) und Esterase-(~ o)Akt iv i t~t sowie E x t i n k t i o n ( x - - - - x ) der P r o t e i n b e s t i m m u n g mi t t e l s Fol inscher Reak t ion . Abszi~se: EIua t (ml). B r a d y k i n i n b e s t i m m u n g : wie un t e r Methodik, jedoch ke in Cyste in- zusatz . Der le tz te Ausschlag en tspr ich t 1 ~, H i s t a m i n , P ro t e ingeha l t /ml ( au f E i c h k u r v e m i t vor - ge re in ig t em Mate r ia l bezogen) : (1) = 0,15 rag ; (2) = 0,80 rag; (3) = 0,81 m g . b wie a, jedoch

18 S td Elektrophoresedauer~ ~ = M a x i m u m tier B radyk in inb i l dung

496 E~sm HA~R~A~N:

1:4000) erh6ht zwar den in vitro erzielbaren KaUidinspiegel, vormut- lich dutch Hemmung des Abbaus, beoinfluBt jodoch dio Esterspaltung nicht. M6glicherweise hi~ngt die Esterolyse durchunser Kallikreinpriiparat mit dessen proteolytischer Wirkung (Tab. 3) zusammen, doch haben wir digs wegen Substanzmangel noch nicht untersucht.

- - G

0 , / 0 0 , - - - - ~ ~

g ~ g g 8 1o lg ~ L N

Abb.2 . Elektrophorese yon vorgereinigtem, erhilztem Material aus Jararaeagi]t. 9,5 m g F I I l -~ 9,5 m g F IV in 1,9 nil 0,85'/0 NaCI; 5 rain im siedenden Wasserbad , abgeki ihl t , zent r i fugier t , yore ~ b e r - s tehenden 0,5 ml f i i r 28 Std der Elekt rophorese (vgl. l~ethodik) unterworfen . Ordinate: Este r spa l tung der zl~ 0 verdf inn ten F rak t i onen (o o) und thrombin~ihnliche Wi rkung (. o) sowie Ex t i nk t i on (× × ) der P r o t e i n b e s t i m m u n g mi t te l s Fol inscher Reak t ion . Abszisse: Elua t (ml). Bradyk in in - b e s t i m m u n g : siehe B[ethodik. Der le tz te Ausschlag en tspr ich t 0 ,1~ t t i s t amin . P ro te ingeha l t /ml :

(1) -- 0,18 rag; (2) = 0,23 m g

Die thrombin~lmliche Komponente aus Jararacagfft erh6ht die Gef~13- permeabilitiit sehr stark. Auch unser Kallikreinpr~parat war in dieser Hin- sicht hoch akt iv (Tab. 4) ; noch 0,01 Einheit lie]en am Oft der i.c. Injek- tion Evansblue aus den Gef~13en austreten, nach 1 Einheit r6teten sich die Quaddeln stark. Ob diese Gef~13wirkung auf Bradykininfreisetzung aus oder an der Gef~i3wand oder auf , ,direkter" Kallikreinwirkung beruht, mul3 vorl£ufig often bleiben. Eine enge Verbindung zwischen Esterase- aktivit~t, Kallidinbildung und der yon ROCHA E SILVA erstmals beobach- teten Erh6hung der Gef~13permeabiliti~t ist auf Grund des elektrophore- tischen Bfldes nicht ausgeschlossen (Abb. 4). Unter Entfernung offenbar

Jararacagfft, Katlikrein und Thrombin 497

i n a k t i v e r P ro to insubs tanzon h a b e n die pha rmako log i schen und enzyma- t i schen W i r k u n g e n ikr M a x i m u m in derse lben F r a k t i o n , die - - u n t e r Zugrunde legung gleieher E x t i n k t i o n al lot F r a k t i o n e n - - nur 13% des wiedererha l tenon Gesamtpro te ins en tspr ich t , abe r mindes tens 6 0 % der e ingesetz ten Es te ra seak t iv i t / i t enth/i l t . I n Wi rk l i chke i t dfirf te die Ausbeu te hSher liegen, weil un t e r den bier gew/ihlten, a u f grebe Trennsch/irfe zielenden Bedingungen ein Teil dor Akt i - v i t / i t aus der Saule heraus- wander te .

3. Yersuche mit Thrombin. T h r o m b i n ff ihrt n i eh t nur F i - br inogen in F i b r i n fiber, sondern spa l te t , wie e ingangs erw~hnt , auch spezielle Ester . Als Gegen-

I

v jT

O0 7Y 30 6'0 mln 720

Abb. 3. ZeitabTffingigkeit der l~sterspaltung durch Kall i- krein. Ansatz: 0,1 ml Pad utin (20 E/ml) in 0,85°/0NaCI + 0,2 ml 0,05 m TAME in 0,1 m Tris-Puffer pT~ %0

versuch zur Auf t r ennung der Es teraseakt iv i t /~ t yon J a r a r a c a g i f t unter - warren wi t T h r o m b i n (Hoffmann-La Roche) der e lek t rophore t i schen Ana lyse (vgl. Abb .5 ) , f anden jedoch nu t ein einziges E s t e r a s e m a x i m u m und - - d iesem genau en t sp rechend - - das K o a g u l a t i o n s m a x i m u m .

Tabelle 2. ptt.AbMingigkeit der Esterspaltung dutch Kallikrctin. Ansatz: 0,1 ml Padutin (10 KE/ml) + 0,2 ml TAME 0,05 m in 0,1 m Tris-Puffer

mit dem angegebenen pH; 2 Std/37 °

pu . . . . . . . . 7,2 7,8 8,4 9,0 /I TAME (/~M) . . . 1,2 3,9 4,2 4,4

Tabelle 3. Proteolytische Aktivitdit des Kallikreinprdiparates. Ansatz: lmlKallikreinlSsung in 0,85°/o•aC1 + lml0,1 m Phosphatpuffer pr~ 7,6 + lml 1°/o Rinderserumalbumin (Behring-Werke, trocken) in 0,850/o l~aC1; 1 Std bei 37 °.

Weiterbehandlung wie bei P~NTLITSCHKO U. Mitarb.

KE/Ansatz . . . . 2 0,2 0,02 0 E (1 era, 285 m/~)z . 0,066 0,014 0,010 0,001

1 Nach Subtraktion der Extinktion eines gleichartig zubereiteten, jedoch nicht inkubierten Ansatzes.

4. Zur Frage der Hemmwirkung einiger Pharmaka auf die Esterspaltung. H i r u d i n h e m m t die Ger innungsfSrderung durch T h r o m b i n und auch dessen E s t e r a s e a k t i v i t ~ t (MARKWARDT und Mitarb. ) . Die Angaben fiber die t t e m m b a r k e i t der th rombin i ihn l ichen W i r k u n g von J a r a r a c a g i f t s ind widerspreehend (vgl. N E U M A ~ u. HAB~MA~N). Es lag daher nahe, den Einf lu$ yon H i r u d i n und sonst igen ge r innungshemmenden Stoffen auf

Naunyn-Schmiedeberg's Arch. exp. Path. Pharmak. , Bd. 236 33

4 9 8 E R N S T H A B E R M A N N :

cs tera t i sche und pharmakologische Effekte der uns hier in teress ierenden Wirkstoffe zu untersuchen, zumal dies Einbl icke in den Zusammenhang zwischen de ra r t igen Wi rkungen br ingen konnte .

Die auf Inhibitoreigenschaften zu prfifenden Substanzen wurden bei den Ver- suehen zur Fibrinogenko~gulation im Veronalpuffer des Ansatzes (vgl. Methodik) gel6st; bei der Estersp~ltung wurde sie in 0,1 ml Kochsalzl6sung zugesetzt. Die ~tngegebenen Konzentrationen geben die Endverdiinmmg wieder.

Tabelle 4. Erhghung der Ge/d[Jpermeabilitiit dutch Kallikrein, Fraktio~ I l I yon Jararacagi/t und Thrombin

K~llikrein IE 0,1 E 0,01 E

Fraktion [][ 10 ~,

0,1 7

Thrombin 100 ~, I0 ,,

l ;,

i

J

0

K a n i n c h e n 1

a [ b

, ! ( + )

t . . . . .

o

K a n i n

a b

12'

:;: r i (~) ( I ) (~) (~) (5 ) 0

Methodik. ,,a" wurde i.c. 5--1 rain vor de*' i.v. Injektion von 5 mg/kg Evansblue ~ppliziert, .,b" 1--5 rain d~mach. Ablesung nach 30 rain - [ - + + ausgedehnte. intensive Blauf/irbung, + :: engbegrenzte, schwache Blauf/irbung, 0 := kein Effekt.

Hirudin*, Hepa r in 2 und ein ha lbsyn the t i sches Ant ikoagu lans auf Po lysacchar idbas i s a s tel len zwar Inh ib i to ren tier thrombini ihnl ichen Wi rkung yon J a r a r a c a g i f t da r ; die noch deut l ich hemmcnde End- konzen t r a t i on lag ftir H i rud in und Thromboz id bei 1:3000, fiir Hepa r in bei 1:15000. Th rombin wird jedoch (lurch t t i r u d i n und Thromboz id sehr viel s t a rke r gehemmt .

Die Es t e r spa l tung durch J a r a r acag i f t wurde woder durch Hi rud in (1:4000) noch du tch Hepa r in (1:2000) s ignif ikant beoinfluBt, cbcnso wenig h e m m t e Hi rud in (1:4000) die Es te ra seak t iv i t i i t yon Kal l ik re in oder (lie Ka l l id inb i ldung , obwohl es nach MAEKWARDT die es tera t i schc Th rombinwi rkung ill wesent l ich ger ingerer K o n z e n t r a t i o n hemmt .

Der T r y p s i n - I n h i b i t o r aus So jabohnen (kr is ta l l is ier t , Sigma) hemmte weder die Es t e r spa l tung durch Ka l l ik re in ( Inh ib i to r -Endkonz . 1:400) oder J a r a r a c a g i f t (1:4000) noch die Ka l l id inb i ldung durch Kal l ikre in

1Von Herrn Dr. MARKWARDT, Greifswald, freundlicherweise zur Verfiigung gestellt. 1 mg 1250 Antithrombin-E.

2 Thrombovetren (Promont.~). 1 mg : 100 IE Heparin. a Thrombozid (Benend).

Jararacagift, Kallikrein und Thrombin 499

(1 : 12000) oder die Bradykininbfldung durch Jararacagift (1 : 12000). Die Esterspaltung durch Trypsin (kristallisiert) wurde dagegen noch durch Inhibitor-Verdiinnung 1:400000 komplett gehommt. Die Esterolyse durch unser Kallikreinprgpara¢ beruht also nicht auf einer Verunreini- gung mit Trypsin.

0,5 ] ~ /×\

o,1 e ', ,' ; q~ • . . . . . , \ 5

. E 2 o

feemeva.+# +++ +(+) (+) 6" ~ g g g ~" 8~"

Abb.4. Elektrophorese eines handelsi£blichen Kallik~einprdparates. Bedingungen: 80 E, 38 Std wte tinter Me~hodik, jedoch 90 x 1 cm Sgule. Ordinate: Extinktion ( × - - - - × ) tier Proteiubestimmung mittels Folinscher Reaktion, Esterspaltung (~ :) dutch 0,1 ml der jeweiligen Eluatfraktion sowie Hfhe des dureh Kallidin (Bildung und Testung siehe ~ethodik) erzielten Aussehlags m - - n .

Abszisse: ~Iilliliter Eluat sowie Permeabilit~ttserhShung dureh die jeweilige Fraktion

25 ! . . . . . ZSO I

• ZO , I ZOO

~15~ 150~..7~5~

"vTe ~e = l,e F

.~. 5 ' 50 0,5

0 .o 0 0 0 Z ¢ 8 8 10 IZ I¢ 1£

(~ "-- I 5'/aPl Abb.5. Blektrophorese yon Thrombin. Bedlngungen: 9,6 mg Thrombin, 21 Std bei 2 liflliamp., sonst wie unter lY[ethodik. Ordinale: Esterspaltung (a ~), Fibrinbildung (, o) und Extinktion

( x - - - - x ) der Proteinbestimmung. Abszisse: Eluat (m])

Bespreehung der Ergebnisse Jararacagfft, Kallikrein und Thrombin spalten Amiaosgureester und

sind gleichzeitig pharmakologisch aktiv. Beim Vergleich iln'er Effekte fallen gewisse Gemeinsamkeiten auf (Tab. 5), aber auch grundsgtzliche Unterschiede, so das Fehlen einer gerinnungsfSrdernden Wirkung beim Kallikrein oder die bisher noch nicht erwiesene Kallidin- bzw. Bradykinin- bildung durch Thrombin, daneben die verschieden starke t temmbarkei t dutch I-l_irudin.

33*

500 ERNST HABERMANN :

Noeh deutlieher werden die Differenzen naeh elektrophoretiseher Auftrennung. Zwar wandert beim Thrombin und Kallikrein die pharma- kologisehe mit der enzymatisehen ~Virkung in einem einzigen Maximum. Vorgereinigtes Jararaeagift ergibt jedoeh bei Elektrophorese mehrere Maxima der Esterspaltung; in dieser relativ breiten Zone liegen die ebenfalls unterseheidbaren Maxima der Fibrin- und der Bradykinin- bildung. Ein strikter Parallelismus zwisehen Esterspaltung, Fibrin- und

Tabelle 5. Gegeni~berstellung einiger Wir]cungen der untersuchten Pharmaka

Bildung des Permeabilitiits- Esterspaltung Fibrinogen- peptidartigen erh6hung t temmbarkcit

koagulation Spaltstfleks (IIaut) I dureh Itirudin

Jararacagift -t- Kallikrein -l- Thrombin i

0 +

Bradykinin Kallidin Fibrinopeptid

+ ( t ) 1 0

(~) I +

Bradykininbildung besteht also nicht. M6glicherweise ist aber ein Teil tier Esteraseaktivit/it ganz oder vorwiegend mit Thrombinwirkung, ein anderer mit Bradykininbildung, ein dritter mit keiner der genannten Wirkungen verknfipft. Aueh yon anderer Seite wurde naeh Absehlug unserer Untersuchungen fiber eine Trennbarkeit der Maxima yon thrombin/ihnhcher Wirkung und Benzoylargininamid-Spaltung beriehtet [HENRIQUES und Mitarb. (2)]. Bis jetzt besteht allerdings kein Anhalt fiir die Hypothese, dab die genannten pharmakologisehen Wirkungen des Jararacagifts eventuell unabh/~ngig yon der Esterase sein k6nnten; alle pharmakologiseh aktiven Fraktionen waren esterasehaltig.

Wir nehmen an, dab mit dem Nachweis von Es~eraseakt.ivit/~t nur ein Hinweis auf einen enzymatischen Grundprozeg gegeben ist. Welche pharmakologisehen Wirkungen (allein oder vorzugsweise) ein derartiges Enzym besitzt, hiingt von seiner Spezifit~t ab. Selbstverst/~ndlieh mug man zur Beur~eilung dieser Frage die geinheit der verwendeten Pr/~parate kennen. Das Jararaeagift hat ein breites Wh'kungsspektrum (Bradykinin- bildung, Fibrinogenkoagulation, Permeabilit/itserhShung). Die elektro- phoretisehe Analyse maeht es jedoch wahrseheinlich, dab es mehrere Esterasen enth/ilt, denen jeweils eine Spezifit/~t gegenfiber den pharma- kologiseh interessanten Substraten (Bradykininogen, Fibrinogen) zu- geschrieben werden kann. Ob sieh diese Spezifit/~t aueh in der Spaltbarkeit ehemiseh besser definierter niedermolekularer Substrate ~ugert, kSnnte Gegenstand weiterer Untersuehungen sein.

Bezfiglich ErhShung der Gef/~Bpermeabilit/it erseheint beim Kallikrein ein Zusammenhang mit Esteraseaktivit/~t und Kallidinbfldung wahr- seheinlieh, weil aueh naeh Elekt, rophorese die Wirkungsmaxima zu- sammenfallen. Im Falle des Jararaeagifts konnten wit die genaue Lage

dararaeagift, Kallikrein und Thrombin 501

des Aktivit/itsmaximums dor Permeabilit/£tserhShung noch nicht ermitteln, well dor Farbaustri t t subjektiv beurtoilt wird und seine Abh/ingigkeit yon der Giftkonzentration zu flach ist. Alle esterasehaltigen Fraktionen erhShten aueh die Gef/~Bpermeabilit/it. Ob beim Thrombin die Gef/iBwirkung auf einer Verunroinigung beruht oder dem Wirkstoff selbst zuzuschreiben ist, konnte wegen der vergleichsweise sehr sehwachen Aktivit/it (vgl. Tab. 4) noch nicht festgestellt werdon. Eino quantitative Beziehung zwischen Esteraseaktivit/it und Permeabilit/itserhShung verschiedener Wirkstoffe besteht nicht; denn sonst mfiBte Thrombin die Gef/~Bdurchl/~ssigkeit st/irker ver/indern als unser Kallikreinpriiparat.

Zusammenfassung Bei E|ektrophorese yon Bothrops ]araraca-Gi/t wandert die thrombin-

fi.hnliche und die bradykininbildende Komponente verschieden schnell anodisch. Esterasowirkung finder sich nicht nut in allen pharmakologisch aktiven Fraktionen, sondern auch welter anodisch hiervon.

Kallikrein spaltet p-Toluolsuffonylargininmethylester. Die Re- aktionsgeschwindigkeit steigt mit dem pmWert bis 9,0 and wird dutch Cystein oder Trypsininhibitor aus Sojabohnennich~ signifikantbeeinflu6t.

Bei Elektrophorese wandert die Fraktion mit der F~higkeit zur Esterspaltung, zur ErhShung der Gef~Bpermeabilitiit und zur Kallidin- ffeisetzung gleich schnell anodisch; sic li~13t sich auf diese Weise yon inaktiven Begleitproteinen trennen.

Esterspaltende und fibrinbildende Aktivit~t yon Thrombin-Pr~paraten wandern gleich schnell anodiseh.

W~hrend die Esterspaltung nur als Hinweis auf einen gemeinsamen biochemischen Grundprozel~ gewertet werden kann, hi~ngt die pharma- kologische Wirkung derartiger Enzyme yon ihrer Spezifit£~ ab.

Herrn Professor Dr. Dr. W. WIRT~, Farbenfabriken Bayer, Elberfeld, danken wir ffir die ~berlassung des Kallikreinpr~parates ,,Padutin", Herrn Dr. F. MARK- W~DT, Greifswald, ffir ein Hirudinpr~parat. Der Deutsehen Forschungsgemein- schaft danken wir fiir eine Sachbeihilfe.

Anmerkung bei der 2. KorreIctur: W~hrend der Drucklegung berichteten CO~TZEN, HOLTZ und RAVDONAT [Naturwissenschaften, 46, 402 (1959)], da[~ im Ultrafiltrat und Dialysat yon Jararaca-Gift das bradykininbildende und ester- spaltende Prinzip frei yon coagulierender Wirkung vorliegt und dab Kallikrein TAME spaltet.

Literatur FREUI~D, J., A. A. MILES, P. J. MILL and D. L. WILHELM: Vascular permeability

factors in the secretion of the guinea pig coagulating gland. Nature (Lend.) 182, 174--175 (1958).

HAB~RMA~¢, E. : ~ber das thrombin~hnlich wirkende Prinzip yon Jararacagift. Naunyn-Schmiedeberg's Arch. exp. Path. Pharmak. 234, 291--302 (1958).

HAMBERG, U., and M. ROeHA e SILVA: Release of bradykinin as related to the esterase activity of trypsin and of the venom of bothrops jararaca. Experientia (Basel) 18, 489--490 (1957).

502 ERNST HABERMANN: Jararacagift , Kallikrein und Thrombin

HENR[QUES, O. B., A. A. C. LAVRAS, M. FICHMAN, F. R. MANDELBAUM and S .B . HE~RIQUES: (l) The proteolytie act ivi ty of the venom of bothrops jararaca. Biochem. J . 6S, 597--605 (1958).

HENRIQUES, O. B., F. R. MANDELBAUM and S. B. HENRIQUES: (2) Blood clotting act ivi ty of the venom of bothrops jararaca. Nature (Lond.) lt43, 114-: l 15 (1959).

HOItNEN, H. W.: Experimentelle Studien zur Frage der Beeinflussung der Blut- gerinnung durch Reptilase. Z. exp. Med. 12~, 427--436 (1957).

HOLTZ, P., u. H . W . RAUDONAT: Uher Beziehungen zwischen proteolytiseher Aktivit/~t und bIutkoagulierender sowie bradykinin-freisetzender Wirkung yon Schlangengiften. Naunyn-Schmiedeberg 's Arch. exp. Path. Pharmak. 229, [13--122 (1956).

KJELDGAAgD, N. 0., and J. PLOU(;: Urokinase, actiwttor of plasmiImgen fl'om human m'ine. I] . Mechanism of plasminogen activation. Biochim. biophys. Acta :]4, 283--289 (1957).

LEPOW, I. H., 0. D. RATNOFF and L. R. LEVY: (1) Studies on the aetiwttion of a proesterase associated with partially purified first component of human com- plement. J . exp. Med. 107, 451--474 (1958).

LEPOW, 1. H., O. D. RATNOFF and L. PILLE~ER: (2) Elution of an esterase fi'om ant igen-ant ibody aggregates t reated with human complement. Proc. Soc. exp. Biol. (N. Y.) 92, 111--114 (1956).

LEPOW, I. H., O. D. RAT~'OFF, IF. S. ROSEN all([ L. PILLEMER: (3) Obserw~tions on a t)ro-esterase associated with partial ly purified first component of human complement (C' 1). Proc. Soc. exp. Biol. (N. Y.) 92, 32--37 (1956).

LowRY, O. H,, N . J . ROSEBROUm~, A.L. FARE and g . J . RANDALL: Protein measurement with the folin phenol reagent. J . biol. Chem. 193, 265--275 (1951).

MARKWARDT, F., u. P. WALSMANI~" : Die Reaktion zwischcn Hirudin und Thromhin. Z. physiol. Chem. 312, 85--98 (1958).

N m rRhTn, H., and G. W. SCHWERT : The mode of action of the crystalline pancreatic proteolytic enzymes. Chem. gcv. 46, 69---153 (1950).

]~ANTLITSCHKO, ~I., l~]. KAISER U. H. ANDRES: l~ber (tie Best immung kleiner Proteo]ysegrade. Bioehem. Z. 322, 526--534 (1952).

I'Lol~(;, J., and N. 0, KJELD(,'AARD: Urokinase, act ivator of plasnlinogen fl:om human urine. I. Isolation and properties. Biochim. biophys. Acta 24, 278--282 ( l .~)57).

ROBERTS, ]). S.: Measurement of the rate of plasmin action on synthetic sub- stratcs. J . biol. Chem. 232, 285--291 (1958).

t{ocHa I,: SILVA. M. : Kallikrein and histamine. Nature (Lond.) 1940 I, 591. SHERRY, S.. and W. TROLL." The action of thrombin on synthetic substrates. J. biol.

Chem. 208, 95--105 (1954). TROLL, W., S. SHElCRY and J. WA(JHMAN: The action of plasmin on synthetic

substrates. J . biol. Chem. 2{t8, 85--93 (1954).

Pr ivat-Dozent Dr. E. HABERMANN, Pharmakol. Ins t i tu t der Universit~t, Wiirzburg, Koellikerstrage 2