UJI TOKSISITAS SENYAWA HASIL ISOLASI RUMPUT

MUTIARA (HEDYOTIS CORYMBOSA (L.) LAMK.) DENGAN

METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST (BST)

Skripsi

Untuk memenuhi sebagian persyaratan

guna memperoleh gelar Sarjana Sains

Oleh:

Dinah Giyanti Ruwaida

M.0406006

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA

2010

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Penyakit kanker merupakan penyebab kematian terbesar kedua setelah

kardiovaskuler. Salah satu cara yang dipilih sebagian penderita penyakit ini adalah

dengan memanfaatkan bahan alam yaitu dengan menggunakan tanaman obat

sebagai obat tradisional (Sukardiman dkk., 2004). Indonesia merupakan negara

tropis yang kaya dengan berbagai tumbuhan. Sekitar 30.000 spesies tumbuhan

berkhasiat obat. Tumbuhan tersebut telah banyak dimanfaatkan masyarakat

sebagai sumber pangan maupun obat-obatan. Penggunaan tumbuhan sebagai obat

di Indonesia telah berlangsung sejak lama dan masyarakat menggunakannya

secara turun temurun berdasarkan pengalaman, masih terbatas tradisional dan

belum banyak diketahui kandungan senyawa dan manfaat lainnya (Aryanti dkk.,

2005).

Salah satu tumbuhan yang berpotensi untuk komoditas obat tradisional ini

adalah rumput mutiara (Hedyotis corymbosa (L.) Lamk.). Rumput mutiara

termasuk famili Rubiaceae dan merupakan salah satu tanaman yang berpotensi

sebagai antikanker. Tanaman ini mengandung senyawa asam ursolat (Murdiyono,

2008) dan asam oleanolat yang diduga dapat menghambat kanker (Asyhar dkk.,

2008), mampu menurunkan proliferasi sel kanker payudara (Mutiara dkk., 2008),

serta memiliki efek antiproliferatif terhadap sel kanker hepar (Febriansyah dkk.,

2008). Di negara China, H. corymbosa juga telah banyak dimanfaatkan sebagai

obat penderita hepatitis dan tumor (Liang dkk., 2009).

Berdasarkan penelitian Murdiyono (2008), uji toksisitas fraksi teraktif dari

fraksi larut etil asetat ekstrak kloroform daun rumput mutiara menunjukkan hasil

toksisitas paling tinggi terhadap A. salina Leach dengan nilai LC50-24 jam = 281,77

µg/mL dan berpotensi untuk diteliti lebih lanjut ke arah senyawa antikanker. Pada

fraksi teraktif, selain terdapat ursolic acid juga mengandung senyawa golongan

alkaloid, flavonoid, terpenoid. Oleh karena itu, perlu dilakukan kajian lebih lanjut

terhadap H. corymbosa untuk mendapatkan senyawa aktif tersebut dengan

melakukan isolasi dan uji toksisitas isolat-isolat dari fraksi teraktif hingga

didapatkan isolat aktif terpilih, serta dilakukan penentuan golongan senyawanya.

Senyawa yang diduga memiliki aktivitas antikanker ini harus diujikan

terlebih dahulu pada hewan percobaan. Salah satu metode yang digunakan untuk

menentukan ketoksikan senyawa adalah Brine Shrimp Lethality Test (BST)

dengan menggunakan larva udang Artemia salina Leach sebagai hewan uji.

Artemia ini merupakan organisme sederhana, mudah berkembang biak dan

menetas dalam kondisi normal laboratorium. Uji BST ini merupakan salah satu

metode uji yang sederhana dan cepat pada pengujian biological dan toxicological

untuk semua penelitian, khususnya yang berkaitan dengan skrining senyawa aktif

ekstrak tanaman (Kanwar, 2007).

Metode BST merupakan salah satu metode yang banyak digunakan untuk

pencarian senyawa antikanker baru yang berasal dari tanaman. Senyawa dari suatu

tanaman dapat dikatakan berpotensi sebagai antikanker apabila senyawa tersebut

memiliki sifat toksik terhadap sel (sitotoksik). Hasil uji toksisitas dengan metode

ini telah terbukti memiliki korelasi dengan daya sitotoksis senyawa anti kanker.

Selain itu, metode ini juga mudah dikerjakan, murah, cepat dan cukup akurat

(Shahidur dkk., 2006; Meyer, 1982). Berdasarkan penelitian Adoum (2008)

terhadap 20 jenis tanaman dari 15 famili yang telah banyak digunakan sebagai

pengobatan penyakit kanker, 11 di antaranya toksik terhadap larva udang laut.

Metode BST digunakan sebagai bioassay guided fractionation and

isolation untuk memperoleh senyawa aktif. Setiap tahap pemisahan senyawa akan

dimonitor menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan dipantau

aktivitasnya menggunakan BST.

Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan senyawa aktif hasil isolasi

rumput mutiara dan efek toksisitasnya terhadap A. salina dengan metode BST.

B. Perumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang tersebut di atas, maka dapat dibuat rumusan

masalah sebagai berikut :

1. Berapakah LC50 isolat senyawa rumput mutiara terhadap A. salina?

2. Termasuk golongan senyawa apakah senyawa hasil isolasi dari rumput

mutiara?

C. Tujuan Penelitian

Berdasarkan permasalahan, dapat dirumuskan tujuan penelitian sebagai

berikut :

1. Menentukan LC50-24 jam isolat senyawa rumput mutiara terhadap A. salina.

2. Menentukan golongan senyawa hasil isolasi dari rumput mutiara.

D. Manfaat Penelitian

Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah :

1. Secara umum diharapkan dapat menambah informasi ilmiah, pengetahuan

serta gambaran kepada penulis dan masyarakat luas terutama dalam eksplorasi

dan penemuan senyawa aktif dari bahan alam.

2. Secara khusus dapat memperoleh senyawa bioaktif dari hasil isolasi rumput

mutiara. Kajian lebih lanjut diharapkan dapat memberikan kontribusi dalam

penggunaan dan pengembangan tanaman obat.

BAB II

LANDASAN TEORI

A. Tinjauan Pustaka

1. Rumput Mutiara (H. corymbosa (L.) Lamk.)

a. Klasifikasi Rumput Mutiara

Division : Spermatophyta

Subdivision : Angiospermae

Class : Dicotyledoneae

Order : Rubiales

Family : Rubiaceae

Genus : Hedyotis

Species : Hedyotis corymbosa (L.) Lamk.

(Hutchinson, 1959).

b. Morfologi Tanaman

Herba atau perdu yang tegak. Bunga berbentuk bongkol/bertangkai

atau tidak bergabung ke dalam panicula. Klasifikasi Hedyotis ini kuncinya

berdasarkan cara pecahnya buah. Buah yang telah masak pecah pada

bagian loculicidal sampai kemudian bagian bijinya terlihat. Bunganya

terdiri dari 4 bagian, jarang yang 5 bagian. Semua atau kebanyakan bunga

tersusun dalam bentuk bongkol atau dengan tangkai bunga yang pendek;

tabung kelopak gundul, cuping kelopak pada buah berjauhan. Semua atau

kebanyakan daunnya berukuran lebih dari 1 cm, gundul. Pada setengah

bagian pucuk atau ujung tabung mahkota, atau bagian dasar cuping

mahkota berbulu. Anther dan stigma menyatu dengan tabung mahkota,

ditutupi oleh rambut-rambut panjang. Buah panjangnya sekitar 1,75–2 mm

dan lebar sekitar 2–2,5 mm (tidak termasuk cuping kelopak), tanpa adanya

sayap. Pangkal dan ujung daun runcing, dengan permukaan bagian bawah

daun hijau pucat, panjang 1-3,5 cm dan lebarnya 1,5-7 mm dengan sedikit

bulu pada bagian atas tepi daunnya. Tangkai daun sangat pendek (Backer

& Bakhuizen van den Brink, 1965).

Karangan bunga tersusun bertangkai, yang terletak di bagian ketiak

2-8 helai bunga tersusun cymosa (terletak pada ibu tangkai bunga yang

panjangnya 2-6 mm), atau 1-3 aksiler pada 4-8 mm panjang ibu tangkai

bunga, cuping kelopak sebesar bakal buah; mahkota berwarna putih

hingga ungu sangat pucat dengan panjang sekitar 2 mm. Stamen terselip

sedikit di atas dasar tabung mahkota. Batangnya segi empat, gundul atau

dengan bulu sangat pendek (Backer & Bakhuizen van den Brink, 1965).

Tumbuh merayap/naik dan sering kali bercabang dari bagian

pangkal batang. Tumbuhan musiman, dengan tinggi 0,05-0,6 m dan masa

berbuah Januari sampai November, banyak ditemukan hampir di seluruh

Jawa, dengan ketinggian letak tumbuh tanaman sekitar 1425 m dpl,

menyukai cahaya, dan tanah yang tidak terlalu basah, serta seringkali

tumbuh melimpah di area yang keras, taman, atau jalanan berbatu (Backer

& Bakhuizen van den Brink, 1965).

Nama lokal dari H. corymbosa L. (Lamk.) adalah rumput siku-

siku, bunga telor belungkas (Indonesia), daun mutiara, rumput mutiara

(Jakarta), katepan, urek-urek polo (Jawa), Pengka (Makasar), Shui xian

cao (China) (Ipteknet, 2005).

Gambar 1. Rumput mutiara (Crusson, 2007)

c. Kegunaan dan Kandungan Kimia

Rumput mutiara dikenal sebagai tumbuhan yang memiliki rasa

manis, sedikit pahit, lembut dan agak dingin. Dalam farmakologi Cina

tumbuhan ini berkhasiat menghilangkan panas, antiradang, diuretik,

menyembuhkan bisul, menghilangkan panas dan racun, dan juga

mengaktifkan sirkulasi darah (Liang dkk., 2009). Tumbuhan ini juga telah

lama digunakan dalam pengobatan berbagai penyakit, diantaranya tonsilis,

bronkitis, gondongan, pneumonia, radang usus buntu, hepatitis, radang

panggul, infeksi saluran kemih, bisul, borok, kanker limpa, kanker

lambung, kanker leher rahim, kanker payudara, rectum, fibrosarcoma dan

kanker nasopharynx (Ipteknet, 2005; Febriansah, 2008).

Rumput mutiara adalah salah satu tanaman yang berpotensi sebagai

antikanker (Mishra dkk., 2009). Tanaman ini memiliki kandungan

senyawa asam oleanolat dan asam ursolat yang diketahui dapat

menurunkan proliferasi sel kanker payudara (Mutiara dkk., 2008).

Penelitian Asyhar dkk. (2008) terhadap ekstrak etanolik rumput mutiara

sebagai agen anti proliferasi pada kanker hepar tikus, mampu

meningkatkan pemacuan ekspresi N-ras sel normal sehingga

mempunyai prospek sebagai hepatoprotektif.

Berdasarkan penelitian Noiarsa dkk. (2007) diketahui bahwa

Oldenlandia corymbosa L. (basionym Hedyotis corymbosa (L.) Lamk.)

yang berasal dari daerah Thailand, memiliki 10 komponen penyusun kimia

yang telah diisolasi dan diuraikan, yaitu geniposide, 6a-

hydroxygeniposide, scandoside methyl ester (6b-hydroxygeniposide),

asperulosidic acid, deacetylasperuloside, asperuloside, 10-O-

benzoylscandoside methyl ester, 10-O-p-hydroxybenzoylscandoside methyl

ester, (+)-lyoniresinol-3a-O-b-glucopyranoside, dan rutin.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada herba H. corymbosa

ditemukan paling sedikit 5 senyawa iridoid, satu di antaranya adalah

asperulosid (Sudarsono, 1999). Iridoid, alkaloid, triterpen, steroid, saponin

banyak dibentuk dalam tumbuhan suku Rubiaceae. Golongan senyawa

iridoid dapat digunakan untuk pencirian suatu tumbuhan suku Rubiaceae.

Golongan senyawa iridoid dapat merupakan senyawa kunci dalam

biosintesis golongan metabolit lain dalam suku Rubiaceae. Di Jawa Barat,

Jawa Tengah dan Jawa Timur terdapat 21 jenis Hedyotis (Backer &

Bakhuizen van den Brink, 1965).

Sadasivan dkk. (2006) telah meneliti ekstrak metanol dari seluruh

bagian tanaman H. corymbosa. Hasilnya menunjukkan bahwa ekstrak

metanol tanaman tersebut memproduksi efek hepatoprotektif yang

signifikan, sehingga tanaman tersebut dapat digunakan sebagai agen

hepatoprotektif. Hsu (1998) meneliti tiga senyawa dari H. corymbosa yaitu

ursolic acid, oleanic acid dan geniposidic acid. Hasilnya, ursolic acid dan

oleanic acid lebih jelas dalam menghambat pertumbuhan sel hep-2B dan

perbesaran tumor sub cutan. Penelitian dari Lin dkk. (2002) menunjukkan

adanya efek anti inflamasi dari ekstrak tanaman H. corymbosa.

2. Teknik Penyarian (Ekstraksi)

Penyarian merupakan peristiwa perpindahan masa zat aktif yang semula

berada dalam sel, ditarik oleh cairan penyari sehingga zat aktif larut dalam

cairan penyari. Pada umumnya penyarian akan bertambah baik bila

permukaan serbuk simplisia yang bersentuhan dengan penyari semakin luas.

Metode ekstraksi antara lain maserasi, perkolasi dan sokhletasi. Pemilihan

terhadap ketiga metode tersebut disesuaikan dengan kepentingan dalam

memperoleh sari yang baik (Padmawinata dan Soediro, 1996).

Maserasi dipilih sebagai metode ekstraksi pada penelitian ini. Istilah

maceration berasal dari bahasa latin macerase yang berarti melunakkan.

Maserasi merupakan proses penyarian yang paling sederhana dan banyak

digunakan untuk menyari bahan obat yang berupa serbuk simplisia halus.

Simplisia direndam dalam penyari dan melemahkan susunan sel sehingga zat-

zat akan terlarut, kemudian di tempatkan dalam wadah bermulut besar, ditutup

rapat kemudian dikocok berulang-ulang sehingga memungkinkan pelarut

masuk keseluruh permukaan serbuk simplisia (Ansel, 1989). Waktu maserasi

adalah berbeda-beda, masing-masing farmakope mencantumkan 4-10 hari.

Kira-kira 5 hari menurut pengalaman sudah memadai untuk proses ini

(Voight, 1994).

3. Isolasi dan Pemurnian Senyawa

Prosedur kerja isolasi dan pemurnian senyawa yang belum diketahui dari

tumbuhan, sangat beragam sesuai dengan macam zat kandungan yang akan

diisolasi. Pemahaman profil fitokimia dari bahan tumbuhan dapat dilakukan

dengan pendekatan untuk memudahkan dalam pemisahan senyawa yaitu

sebelum dilakukan kromatografi, ekstrak kasar yang diperoleh sebaiknya

difraksinasi terlebih dahulu untuk memisahkan golongan senyawa kandungan

yang satu dengan golongan yang lainnya. Prosedur pemisahan ini dapat

digunakan fraksinasi yang didasarkan pada perbedaan kepolaran kandungan

senyawanya (Harborne, 1987).

Tahap isolasi dilakukan terhadap fraksi dengan aktivitas yang diinginkan

sehingga diperoleh senyawa murni dengan menggunakan teknik kromatografi

yang ada. Pemurnian diikuti oleh uji aktifitas berkelanjutan hingga didapatkan

senyawa murni selanjutnya dilakukan isolasi disebut dengan metode bioassay-

guided fractionation and isolation. Terdapat dua tipe uji yang biasa digunakan

untuk mengevaluasi ekstrak bahan alam yaitu uji berdasarkan mekanisme

(mechanisme-based assays) dan uji berdasarkan sel (cell-based assays)

(Houghton, 2000).

Kromatografi (kolom, lapis tipis, preparatif) merupakan metode terpilih

untuk memonitor hasil isolasi dan pemurnian senyawa dari bahan alam.

Pemilihan teknik kromatografi ini, sebagian besar didasarkan atas sifat-sifat

kelarutan senyawa yang akan dipisahkan. Pemisahan campuran senyawa ke

dalam fraksi-fraksi dapat dilakukan dengan kromatografi kolom

menggunakan fase gerak dan fase diam disesuaikan dengan karakter sari yang

akan dipisahkan. Modifikasi kromatografi cair yang dibantu dengan

menggunakan vakum dapat diaplikasikan untuk memperoleh fraksi-fraksi

dalam waktu yang relatif cepat dan tidak menggunakan fase diam/fase gerak

yang terlalu banyak (Padmawinata dan Soediro, 1996).

4. Kromatografi Lapis Tipis preparatif (KLTp)

Metode kromatografi ini merupakan metode populer yang banyak

digunakan untuk melakukan isolasi produk bahan alam karena mudah

aplikasinya. Walaupun penggunaan metode ini telah banyak tergeser oleh

penggunaan metode HPLC dan countercurrent chromatography namun

keuntungan KLTp yaitu pemisahannya hanya membutuhkan waktu relatif

cepat, dan isolat yang diperoleh sekitar 1 miligram hingga 1 gram sehingga

cukup untuk penentuan struktur kimianya (Padmawinata, 1995).

Ukuran pelat kromatografi biasanya 20 x 20 cm atau 20 x 40 cm.

Pembatasan ketebalan lapisan ukuran pelat sudah tentu mengurangi jumlah

bahan yang dapat dipisahkan dengan KLTp. Penjerap yang paling umum

adalah silika gel dan dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil

maupun campuran senyawa hidrofil. Pembuatan lapis lapisan tanpa retak

dianjurkan memakai penjerap niaga yang tersedia. Ukuran partikel dan

porinya kurang lebih sama dengan ukuran tingkat mutu KLT (Hostettmann

dkk., 1995).

5. Identifikasi senyawa hasil isolasi

Senyawa hasil isolasi diperoleh dalam jumlah kecil atau diperoleh

dalam bentuk kristal. Senyawa yang dapat diperoleh dalam bentuk kristal

dilakukan pemeriksaan yang lebih lengkap, yaitu pemeriksaan organoleptik

meliputi bentuk kristal, warna, bau, rasa; pemeriksaan sifat fisika meliputi titik

leleh, putaran optik dan kelarutan senyawa dalam bermacam-macam pelarut;

pemeriksaan kimia dengan mereaksikan kristal hasil isolasi itu dengan

berbagai pereaksi; pemeriksaan kemurnian dilakukan dengan titik leleh,

kromatografi lapis tipis dengan memakai bermacam-macam campuran fase

gerak dan penampak noda asam sulfat 10% yang dipanaskan, kromatografi

cair kinerja tinggi, dan secara spektrofotometri ultraviolet (Bakhtiar dkk.,

1983).

6. Penentuan Golongan Senyawa

Penentuan golongan senyawa dalam tumbuhan dilakukan setelah

dilakukan isolasi dan pemurnian senyawa. Hasil isolasi senyawa tersebut

selanjutnya diuji kemurniannya. Uji ini dapat dilakukan dengan beberapa

metode, salah satunya dengan menggunakan sistem fase gerak yang berbeda

kepolaran maupun KLT 2 dimensi (Harborne, 1998).

Berbagai pereaksi penampak bercak dapat digunakan untuk menentukan

golongan senyawa. Pereaksi Serium (IV) Sulfat digunakan untuk mendeteksi

keberadaan senyawa-senyawa organik secara umum, biasanya digunakan

untuk deteksi awal adanya senyawa yang terkandung dalam ekstrak maupun

fraksi. Selanjutnya digunakan penampak bercak yang lebih spesifik untuk

menentukan golongan senyawanya (Harborne, 1998).

7. Uji Toksisitas

Uji toksisitas merupakan bagian dari toksikologi yang didefinisikan

sebagai ilmu yang mempelajari racun, tidak saja efeknya tetapi juga

mekanisme terjadinya efek tersebut pada organisme. Sedangkan yang

dimaksud dengan racun disini adalah zat yang bila dapat memasuki tubuh

dalam keadaan cukup, secara konsisten, menyebabkan fungsi tubuh jadi tidak

normal (Soemirat, 2005).

Toksisitas merupakan sifat relatif yang digunakan dalam

membandingkan suatu senyawa dengan senyawa yang lain dengan

menunjukkan ke suatu efek berbahaya atas jaringan biologi tertentu.

Toksisitas merupakan kemampuan racun (molekul) untuk menimbulkan

kerusakan apabila masuk ke dalam tubuh dan lokasi organ yang rentan

terhadapnya (Soemirat, 2005).

8. Artemia salina Leach

a. Klasifiksasi

Kingdom : Animalia

Phylum : Arthropoda

Class : Crustacea

Subclass : Branchipoda

Order : Anostraca

Family : Atemiidae

Genus : Artemia

Species : Artemia salina (L.) Leach

(Mudjiman, 1995).

b. Lingkungan Hidup

Artemia merupakan kelompok udang-udangan dari phylum

Arthopoda. Mereka berkerabat dekat dengan zooplankton lain seperti

copepode dan daphnia (kutu air). Artemia hidup di danau-danau garam

(berair asin) yang ada di seluruh dunia. Artemia hidup planktonik di

perairan yang berkadar garam tinggi (antara 15- 300 per mil). Suhu yang

dikehendaki berkisar antara 25-300 C, oksigen terlarut sekitar 3 mg/L, dan

pH antara 7,3–8,4. Secara alamiah salinitas danau dimana mereka hidup

sangat bervariasi, tergantung pada jumlah hujan dan penguapan yang

terjadi. Apabila kadar garam kurang dari 6% telur Artemia akan tenggelam

sehingga telur tidak bisa menetas, hal ini biasanya terjadi apabila air tawar

banyak masuk ke dalam danau di musim penghujan. Apabila kadar garam

lebih dari 25% telur akan tetap berada dalam kondisi tersuspensi, sehingga

dapat menetas dengan normal (Mudjiman, 1995).

A. salina atau sering disebut brine shrimp adalah sejenis udang-

udangan primitif yang sudah dikenal cukup lama dan oleh Linnaeus pada

tahun 1778 diberi nama Cancer salinus, kemudian oleh Leach diubah

menjadi A. salina pada tahun 1819. Artemia merupakan salah satu

komponen penyusun ekosistem laut yang keberadaan sangat penting untuk

perputaran energi dalam rantai makanan, selain itu Artemia juga dapat

digunakan dalam uji laboratorium untuk mendeteksi toksisitas suatu

senyawa dari ekstrak tumbuhan (Kanwar, 2007).

Secara alami, makanan Artemia berupa sisa-sisa jasad hidup yang

hancur, ganggang-ganggang renik, bakteri dan cendawan (ragi laut).

Selama pemeliharaan makanan yang diberikan adalah katul, padi, tepung

beras, tepung terigu, tepung kedelai atau ragi (Mudjiman, 1995). A. salina

dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2. Artemia salina Leach (Abatzopoulos dkk., 1996 )

c. Perkembangan dan Siklus Hidup

Artemia dewasa rata-rata berukuran sekitar 8 mm, meskipun

demikian pada kondisi yang tepat mereka dapat mencapai ukuran sampai

dengan 20 mm. Pada kondisi demikian biomassanya akan mencapai 500

kali dibandingkan biomassa pada fase nauplii (Mudjiman, 1995).

Dalam tingkat salinitas rendah dan dengan pakan yang optimal,

betina Artemia bisa menghasilkan naupli sebanyak 75 ekor perhari.

Selama masa hidupnya (sekitar 50 hari) mereka bisa memproduksi nauplii

rata-rata sebanyak 10 -11 kali. Dalam kondisi super ideal, Artemia dewasa

bisa hidup selama 3 bulan dan memproduksi nauplii atau kista sebanyak

300 ekor (butir) per 4 hari. Kista akan terbentuk apabila lingkungannya

berubah menjadi sangat salin dan bahan pakannya sangat kurang dengan

fluktuasi oksigen sangat tinggi antara siang dan malam hari (Isnansetyo

dan Kurniastuty, 1995).

Artemia dewasa toleran terhadap selang suhu -18 hingga 40°C.

Temperatur optimal untuk penetasan kista dan pertubuhan adalah 25-30°C.

Meskipun demikian hal ini akan ditentukan oleh strain masing-masing.

Artemia menghendaki kadar salinitas antara 30 - 35 ppt, dan mereka dapat

hidup dalam air tawar selama 5 jam sebelum akhirnya mati. Variable lain

yang penting adalah pH, cahaya, dan oksigen. pH dengan selang 8-9

merupakan selang yang paling baik, sedangkan pH di bawah 5 atau lebih

tinggi dari 10 dapat membunuh Artemia. Cahaya minimal diperlukan

dalam proses penetasan dan akan sangat menguntungkan bagi

pertumbuhan mereka. Lampu standar grow-lite sudah cukup untuk

keperluan hidup Artemia. Kadar oksigen harus dijaga dengan baik untuk

pertumbuhan Artemia, dengan suplai oksigen yang baik, Artemia akan

berwarna kuning atau merah jambu. Warna ini bisa berubah menjadi

kehijauan apabila mereka banyak mengkonsumsi mikro alga

(Fahakhododo, 1996).

Artemia diperjualbelikan dalam bentuk telur istirahat yang disebut

kista. Kista ini berbentuk bulatan-bulatan kecil berwarna kecoklatan

dengan diameter berkisar 200-300 mikron. Kista yang berkualitas baik

akan menetas sekitar 18-24 jam apabila diinkubasi air yang bersalinitas 5-

70 permil. Ada beberapa tahapan pada proses penetasan Artemia ini yaitu

tahap hidrasi, tahap pecah cangkang dan tahap payung atau tahap

pengeluaran. Tahap hidrasi terjadi penyerapan air sehingga kista yang

diawetkan dalam bentuk kering tersebut akan menjadi bulat dan aktif

bermetabolisme. Tahap selanjutnya adalah tahap pecah cangkang dan

disusul tahap payung yang terjadi beberapa saat sebelum nauplii keluar

dari cangkang (Isnansetyo dan Kurniastuty, 1995). Siklus hidup A. salina

dapat dilihat pada Gambar 4.

Gambar 3. Siklus hidup A.salina (Tamaru dkk., 2004 )

9. Metode Brine Shrimp Lethality Test (BST)

Uji toksisitas dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BST)

dilakukan sebagai uji pendahuluan untuk mengetahui bioaktivitas senyawa

secara in vivo. Dasar pengujian dengan metode BST didasarkan pada

kemampuan senyawa untuk mematikan larva udang. Berdasarkan hasil

penelitian dari Yulfi dan Prita (2007), tentang isolasi senyawa α-Amirin dari

tumbuhan Beilschmiedia roxburghiana Ness (medang) dan uji bioaktivitasnya

menunjukkan bahwa senyawa α-Amirin memiliki LC50 sebesar 49,86 ppm.

Dengan menggunakan metode BST, dua senyawa yang diisolasi dari

spons Petrosia sp. adalah senyawa alkaloid yang menunjukkan tingkat

toksisitas cukup tinggi terhadap larva A. salina dengan LC50 masing-masing

sebesar 7,23 (isolat 1) dan 5,69 µg/mL (isolat 2) (Astuti dkk., 2005).

Banyak penelitian uji toksisitas yang telah dilakukan dengan

menggunakan metode BST, dan umumnya senyawa yang diujikan adalah

senyawa yang berpotensi sebagai senyawa antikanker. Berdasarkan penelitian

Meyer terhadap jenis Euphorbiaceae, dari 24 jenis yang aktif terhadap 9 PS

(sel leukimia secara in vitro), 14 diantaranya toksik terhadap larva udang laut

(Erma dkk., 2004).

Penelitian dengan menggunakan BST sebagai bioassay guided

fractionation and isolation pada tumbuhan Phryma leptostachya L.

(Phrymacaceae) diketahui memiliki 2 komponen aktif phrymarolin II dan

ursolic acid berpotensi sebagai senyawa anti kanker (Lee dkk., 2002).

A. salina mempunyai peranan yang penting dalam aliran energi pada

rantai makanan dan biasa digunakan dalam laboratorium bioassay untuk

menentukan toksisitas terhadap perkiraan pada medium Lethal Concentration

(LC50). Penentuan nilai LC50 pada komponen aktif dan ekstrak pada kondisi

salinitas medium dalam mg/mL, digunakan dalam penelitian yang dilakukan

terhadap tanaman obat-obatan di berbagai negara seperti kadar toksisitasnya.

Dalam beberapa kasus berhubungan dengan penelitian farmakologi terhadap

perbedaan komponen-komponen senyawa kimianya, menjadi metode skrining

utama terhadap produk dari tanaman aslinya (Anubha, 2007).

Hasil uji toksisitas terhadap hasil fraksinasi ekstrak kloroform biji

mahkota dewa terhadap A. salina dapat ditunjukkan bahwa senyawa

antikanker yang ditemukan termasuk senyawa alkaloid, terpenoid, dan

polifenol (Mursiti, 2002). Isolasi dan identifikasi senyawa bioaktif yang telah

dilakukan oleh Rakhmawati (2006) terhadap daun laban (Vitex pubescens

Vahl.) berhasil menemukan suatu senyawa yang mempunyai kerangka

kumarin yang toksik dengan uji BST ternyata juga toksik terhadap sel

mieloma dengan nilai LC50 sebesar 12,73 µg/mL. Nilai LC50 merupakan

angka yang menunjukkan konsentrasi suatu bahan yang menyebabkan

kematian sebesar 50% dari jumlah hewan uji.

Penelitian uji toksisitas ekstrak Eucheuma alvarezii terhadap A. salina

sebagai studi pendahuluan potensi antikanker yang dilakukan oleh Puji dkk.

(2006) diketahui bahwa penggunaan metode BST terhadap ekstrak metanol

dan kloroform dari jenis alga E. alvarezii diuji menunjukkan senyawa

metabolit sekunder dari E. alvarezii bersifat toksik terhadap Artemia. Nilai

LC50 dari ekstrak E. alvarezii yang terlarut dalam metanol adalah 23,3346

ppm dan LC50 dari ekstrak E. alvarezii yang terlarut dalam kloroform adalah

89,7429 ppm. Bioaktifitas pada ekstrak kasar Euphorbia kamerunica

menggunakan metode BST diketahui ekstrak E. kamerunica yang terlarut

dalam air diperoleh nilai LC50 sebesar 13,87 µg/mL dan ternyata berdasarkan

uji skrining juga berpotensi sitotoksik (Ogunnusi dan Dosumu, 2008).

Penelitian uji toksisitas ekstrak Clitoria ternatea terhadap A. salina

yang dilaporkan telah banyak digunakan sebagai pengobatan tradisional

penyakit kanker dilakukan oleh Shadidur dkk. (2006) diketahui bahwa

penggunaan metode BST terhadap ekstrak metanol daun, biji, dan batang C.

ternatea diuji menunjukkan senyawa metabolit sekunder dari C. ternatea

bersifat toksik terhadap Artemia dengan nilai LC50 sebesar 25,82 µg/mL. Hasil

uji toksisitas ekstrak metanol daun saga ternyata juga dilaporkan mempunyai

efek sitotoksik terhadap A. salina dengan nilai LC50 606,736 ppm (Juniarti

dkk., 2009).

Metode BST diterapkan dengan menentukan nilai LC50 setelah

perlakuan 24 jam. Melalui metode BST maka pelaksanaan skrining dengan

biaya yang relatif murah, sederhana, dan relatif cepat terhadap standarisasi

bioaktifitas pada produksi tumbuhan heterogen (McLaughlin, 1998). Menurut

Anderson dkk. (1998) selain metode BST ada beberapa metode lain yang

dapat digunakan untuk mendeteksi adanya senyawa bioaktif suatu tanaman,

antara lain inhibition of crown gall tumor on discs of potato tubers dengan

menggunakan bakteri Agrobacterium tumefaciens (bioassay untuk antitumor),

inhibition of frond proliferation in duckweed (bioassay untuk herbisida dan

stimulasi pertumbuhan tanaman), dan yellow fever mosquito larvae lethality

test (bioassay untuk pestisida).

B. Kerangka Pemikiran

Kanker merupakan penyakit berbahaya penyebab kematian terbesar kedua

setelah kardiovaskuler. Salah satu cara yang telah banyak dilakukan oleh

penderita penyakit ini adalah memanfaatkan bahan alam sebagai obat tradisional.

Indonesia merupakan negara tropis yang kaya dengan berbagai tumbuhan.

Hedyotis corymbosa atau dikenal dengan nama daerah rumput mutiara merupakan

salah satu dari sekian banyak tumbuhan liar yang terabaikan. Padahal tumbuhan

ini secara turun-temurun banyak dimanfaatkan oleh masyarakat, seperti untuk

berbagai pengobatan penyakit, termasuk kanker. Terkait dengan nilai penting

rumput mutiara ini maka diperlukan adanya studi ilmiah tentang senyawa aktif

yang berperan penting dalam pengobatan penyakit kanker.

Berdasarkan hasil penelitian sebelumnya oleh Murdiyono (2008),

diketahui bahwa nilai LC50-24 jam hasil fraksi teraktif terhadap A. salina daun

rumput mutiara adalah sebesar 281,77 µg/mL. Menurut Meyer dkk. (1982)

melaporkan bahwa jika ekstrak atau senyawa uji dikatakan toksik jika nilai LC50-24

jam < 1000 µg/mL dan berpotensi sebagai antikanker. Berdasarkan hasil penelitian

ini, maka perlu adanya studi lanjutan terhadap rumput mutiara hingga didapatkan

isolat aktif terhadap A. salina. Hasil dari isolat aktif ekstrak rumput mutiara

dengan metode BST ini dapat digunakan sebagai dasar acuan untuk penelitian

lebih lanjut hingga nantinya didapatkan obat antikanker. Kerangka pemikiran

secara skematis dapat dilihat pada Gambar 4.

Kanker

Penemuan obat antikanker

Gambar 4. Diagram Alir Kerangka Pemikiran BAB III

METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan pada bulan November 2009-Februari 2010 di Sub

Lab.Biologi dan Sub Lab. Kimia, Laboratorium Pusat Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret Surakarta.

B. Alat dan Bahan

1. Alat

a. Alat untuk ekstraksi : bejana tertutup, pengaduk, corong kaca, gelas beker,

kertas saring, rotary evaporator, dan alat-alat gelas.

b. Alat untuk uji toksisitas : alat timbang, mikropipet, flakon, aerator, vortex,

refraktometer, kipas angin, wadah untuk penetasan telur, lampu dan alat-

alat gelas.

c. Alat untuk Kromatografi Lapis Tipis : bejana pengembang, pipa kapiler,

gelas arloji, oven, alat penyemprot bercak dan lampu UV

d. Alat untuk Vacuum Liquid Chromatograhy (VLC): sinterglass,

erlenmeyer, pompa vakum, statif, dan alat gelas.

e. Alat-alat untuk isolasi senyawa

Spray dryer/alat penyemprot bercak, lampu UV, Plate silika gel GF 254,

silika gel PF254, chamber dan alat-alat gelas.

2. Bahan

a. Bahan utama : daun dan batang rumput mutiara (Hedyotis corymbosa (L.)

Lamk.)

b. Bahan ekstraksi : kloroform dan metanol berderajat teknis.

c. Bahan untuk Vacuum Liquid Chromatograhy (VLC) : sebagai fase diam

digunakan silika gel 60 GF254 (E. Merck) dan fase gerak wash-benzene,

etil asetat, kloroform dan metanol berderajat teknis.

d. Bahan untuk Kromatografi Lapis Tipis (KLT) : sebagai fase diam

digunakan lempeng silika gel 60 GF254 (E. Merck) dan fase gerak yang

digunakan yaitu n-heksana dan etil asetat berderajat pro analisis dengan

perbandingan tertentu. Pereaksi semprot serium (IV) sulfat, dragendorff,

vanilin-asam sulfat dan uap amonia.

e. Bahan untuk KLT Preparatif adalah silika gel PF254, pereaksi semprot

serium sulfat, dan berbagai pereaksi semprot khusus.

f. Bahan untuk uji toksisitas : telur A. salina Leach., air laut dengan salinitas

3% , suspensi ragi (Fermipan®) 3 mg/10 mL air laut.

C. Cara Kerja

1. Pengambilan sampel

Sampel yang digunakan adalah daun dan batang rumput mutiara yang

diambil di sekitar kampus Universitas Sebelas Maret, Surakarta.

2. Penentuan jenis tumbuhan

Rumput mutiara yang telah dikoleksi kemudian dideterminasi di

Laboratorium Biologi Fakultas MIPA Universitas Sebelas Maret. Determinasi

dilakukan berdasarkan buku Backer & Bakhuizen van den Brink (1965).

3. Pengeringan dan pembuatan serbuk

Batang dan daun rumput mutiara yang telah dibersihkan kemudian

dikeringkan di bawah sinar matahari secara tidak langsung dengan cara ditutup

dengan kain hitam. Batang dan daun rumput mutiara tersebut selanjutnya

dioven pada suhu 600C selama 24 jam, kemudian dihaluskan dengan cara

manual (diremukkan) hingga berbentuk serbuk.

4. Ekstraksi dan partisi

Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi. Serbuk direndam dalam

kloroform selama 24 jam (3 kali). Maserat dikumpulkan kemudian diuapkan

dengan rotary evaporator dan diperoleh ekstrak kloroform. Ekstrak kloroform

rumput mutiara ini kemudian dipartisi menggunakan etil asetat, diperoleh

fraksi larut etil asetat dan tidak larut etil asetat, dipisahkan kemudian diuapkan

hingga kering.

Masing-masing fraksi hasil partisi dilakukan uji toksisitas terhadap

larva A. salina. Fraksi yang aktif kemudian difraksinasi menggunakan metode

Vacuum Liquid Chromatography (VLC) dengan sistem fase gerak bertingkat.

5. Fraksinasi dengan metode Vacuum Liquid Chromatography (VLC).

a. Penyiapan Sampel

Fraksi teraktif hasil partisi, yaitu yang larut etil asetat diambil

kurang lebih sebanyak 7 gram, kemudian dicampur dengan silika gel GF254

sebanyak 50 gram sampai homogen dan semuanya terikat pada silika.

b. Persiapan kolom

Silika gel GF254 ditimbang kurang lebih 50 gram dan dimasukkan

sedikit demi sedikit ke dalam sinterglass sambil diketuk-ketuk dengan

batang pengaduk. Sinterglass yang digunakan berdiameter 7 cm, tinggi 6

cm. Selama pengisian kolom ini, vakum terus dalam keadaan menyala

agar diperoleh pengisian kolom yang kompak, sambil kolom kacanya

diketuk-ketuk dengan batang pengaduk bersalut. Jika vakum mati akan

terjadi perubahan tekanan yang tiba-tiba sehingga silika akan terdorong ke

atas menyebabkan terjadinya cracking dalam pengisian kolom. Permukaan

kolom dibuat serata mungkin. Fase diam yang telah jadi kemudian dielusi

dengan pelarut organik yang kepolarannya paling rendah diantara pelarut-

pelarut yang digunakan sebagai fase gerak (dalam penelitian ini digunakan

wash-benzene) untuk memperbaiki kekompakan kolom sehingga tidak

banyak rongga udara dalam kolom.

c. Penyiapan fase gerak

Fase gerak yang digunakan pada sistem VLC ini menggunakan

sistem fase bertingkat menurut kepolarannya. Fase gerak dibuat dengan

perbandingan tertentu yaitu campuran antara wash-benzene, etil asetat,

kloroform dan methanol. Perbandingan antara larutan tersebut tergantung

dari tingkat kepolaran yang diinginkan, yaitu wash-benzene 100%, wash-

benzene:etil asetat (12:1; 10:1; 8:1; 6:1; 4:1; 3:1; 1:1(v/v)), etil asetat

100% dan kloroform:metanol (1:1(v/v)).

d. Elusi

Sampel ditambahkan ke permukaan fase diam yang telah dibuat

kemudian ditutup dengan kertas saring. Hal ini bertujuan agar permukaan

kolom tidak rusak saat dialiri fase gerak. Selanjutnya dielusi dengan fase

gerak yang sudah disiapkan. Elusi dimulai dengan pelarut yang

kepolarannya paling rendah. Kolom dihisap pada setiap pengumpulan

fraksi dan ditampung dalam wadah penampung.

e. KLT fraksi-fraksi

Masing-masing fraksi yang diperoleh diuapkan sampai kering.

Profil kandungan kimia masing-masing fraksi dipantau dengan

kromatografi lapis tipis menggunakan fase gerak n-heksan:etil asetat

(2:1(v/v)). Berdasarkan hasil KLT tersebut, fraksi-fraksi dengan profil

kromatogram yang hampir sama dijadikan satu fraksi. Fraksi hasil

penggabungan selanjutnya diuji dengan metode BST untuk mengetahui

fraksi mana yang paling aktif.

6. Isolasi senyawa aktif dengan KLT preparatif

Setelah dilakukan fraksinasi, dilanjutkan dengan melakukan isolasi

pemurnian senyawa aktif, berdasarkan hasil BST terhadap fraksi yang teraktif.

a. Persiapan plat KLTp

Satu set alat pembuatan plat kaca KLTp disiapkan, kemudian silika

gel PF254 ditimbang kurang lebih 8 gram untuk digunakan per plat kaca

KLTp, kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer tertutup, setelah itu

ditambahkan dengan akuades sebanyak 18,5 mL lalu digojok, kemudian

dituangkan ke dalam cetakan pembuat plat KLTp secara merata. Setelah

semua cetakan plat kaca selesai, segera dikeringanginkan dan dimasukkan

ke dalam oven kurang lebih selama 3 jam, kemudian didinginkan dengan

dikeringanginkan kembali.

b. Penyiapan Sampel

Sampel fraksi teraktif hasil fraksinasi disiapkan, ditimbang berat

isolatnya, lalu dilarutkan dengan kloroform:metanol (1:1(v/v))

secukupnya.

c. Penyiapan fase gerak

Fase gerak yang digunakan pada sistem KLT preparatif ini

menggunakan fase gerak n-heksan:etil asetat (2:1(v/v)).

d. Elusi

Sampel yang sudah disiapkan kemudian ditotolkan pada plat kaca

KLTp seperti membuat pita sepanjang kurang lebih 20 cm, setelah

sebelumnya ditandai jarak dari bawah plat sebesar 1 cm ke atas untuk

pelarut pengembangan. Penotolan diulang sampai kurang lebih sebanyak 3

kali, kemudian plat kaca hasil penotolan dikeringkan. Bejana pengembang

kemudian disiapkan, dan selanjutnya elusi plat kaca KLTp dengan fase

gerak yang sudah disiapkan.

e. Pemurnian hasil KLT preparatif

Setelah selesai dilakukan pengembangan dan terjadi elusi terhadap

sampel, dalam satu fraksi plat yang diisolasi akan terbentuk beberapa

fraksi isolat, yang kemudian masing-masing diambil dengan dikerok dan

dimurnikan dari silika gel yang masih terikat. Isolat yang masih terikat

silika gel ini kemudian dilarutkan dalam kloroform:metanol (1:1(v/v))

secukupnya, kemudian dihomogenkan dengan stirrer, sekaligus untuk

membantu melepaskan ikatan dengan senyawa silika gel, selanjutnya

dipisahkan dengan corong vakum atau bisa juga dengan corong pisah

biasa, yang diberi kertas saring. Sampel yang sudah disaring kemudian

ditampung dalam cawan porselen, lalu diuapkan. Setelah kering atau

mengkristal, kemudian isolat dikerok dan dimasukkan ke dalam tabung

eppendorf.

f. KLT isolat

Masing-masing isolat yang diperoleh diuapkan sampai kering.

Profil kandungan kimia masing-masing isolat dipantau dengan

kromatografi lapis tipis menggunakan fase gerak n-heksan:etil asetat

(2:1(v/v)). Isolat hasil pemurnian ini selanjutnya diuji dengan metode BST

untuk mengetahui isolat mana yang paling aktif.

7. Uji toksisitas senyawa metode Brine Shrimp Lethality Test (BST)

Senyawa uji dikatakan toksik jika mempunyai harga LC50 < 1000

µg/mL (Meyer dkk., 1982). Berdasarkan hal tersebut maka dilakukan

pengujian dengan metode BST dengan konsentrasi 100, 75, 50 µg/mL pada

masing-masing isolat. Uji dilakukan dengan 3 replikasi, masing-masing

replikasi menggunakan 5 flakon untuk tiap konsentrasi dan hal ini juga

dilakukan terhadap kontrol.

a. Preparasi Sampel

Semua sampel dibuat larutan stok yaitu masing-masing dengan

cara melarutkan 10 mg masing-masing sampel dalam 1 mL masing-masing

pelarut yang sesuai sehingga diperoleh larutan stok dengan konsentrasi 10

mg/mL. Pelarut yang digunakan disesuaikan dengan sifat kelarutan

sampel. Seri konsentrasi sampel uji dibuat dengan pengambilan volume

tertentu dari larutan stok menggunakan mikropipet dan dimasukkan dalam

flakon. Pembuatan kontrol uji dilakukan dengan hanya memasukkan

pelarut dalam flakon. Kontrol diperlukan untuk mengoreksi kemungkinan

timbulnya efek karena pelarut yang belum menguap sempurna dan

pengaruh lain selain pelarut terhadap uji yang dilakukan. Flakon-flakon

yang telah berisi sampel dan kontrol diangin-anginkan hingga kering dan

tidak berbau pelarut lagi.

b. Penetasan Telur A. salina

Telur A. salina ditetaskan dalam wadah penetas telur dengan dua

bagian ruang bersekat, satu bagian ruang gelap dan yang satu terang. Sekat

dibuat berlubang dengan diameter 2 mm. Air laut yang telah diukur kadar

garamnya dengan menggunakan refraktometer dimasukkan ke dalam

wadah, serta diaerasi menggunakan aerator. Sejumlah telur A. salina

dimasukkan ke dalam satu ruang, kemudian ruang ini ditutup. Sisi yang

lain dibiarkan terbuka dan diberi lampu untuk menarik A. salina yang telah

menetas melalui lubang sekat. Telur akan menetas setelah kira-kira 24 jam

menjadi larva. Larva yang berumur 48 jam dapat digunakan untuk uji

toksisitas (McLaughlin, 1991).

c. Pengujian Sampel

Flakon berisi sampel yang sudah diuapkan pelarutnya diisi air laut

1 mL, kemudian divortex kurang lebih selama 1 menit. Sepuluh ekor larva

A. salina umur 48 jam yang sehat (bergerak aktif) dipilih secara acak,

dimasukkan ke dalam flakon kontrol dan flakon uji yang berisi sampel

dan bebas pelarut menggunakan pipet tetes dan ditambahkan air laut

sampai 5 ml. Satu tetes suspensi ragi Saccharomyces cerevicease (3 mg/10

mL air laut) ditambahkan ke dalamnya sebagai makanan larva A. salina.

Larutan uji dibuat dengan berbagai konsentrasi (50, 75, 100

µg/mL) dalam kloroform:metanol (1:1 (v/v)) kemudian dimasukkan dalam

flakon. Flakon-flakon tersebut diletakkan di bawah lampu penerangan

selama 24 jam kemudian dihitung jumlah larva A. salina yang mati (tidak

bergerak aktif). Selanjutnya dihitung persentase larva A. salina yang mati

setelah 24 jam, dibandingkan dengan kontrol dan hasilnya dianalisis untuk

menentukan nilai LC50-24 jam. Setiap kadar uji dilakukan pengujian dengan

replikasi lima kali.

Uji toksisitas dianalisis dengan menghitung jumlah A.salina yang mati

dengan rumus:

% Kematian =

Jumlah larva A. salina mati

jumlah larva uji _______________________ x 100%

Berdasarkan hasil tersebut, nilai LC50-24 jam dapat dihitung dengan

membuat persamaan garis regresi linier. Bila ada kematian pada kontrol dapat

dikoreksi dengan rumus Abbot’s yaitu:

Meyer et al. (1982), menyatakan bahwa bila harga LC50-24 jam di bawah

1000 µg/mL, dinyatakan toksik dan memiliki aktivitas antikanker menurut

BST.

8. Penentuan golongan isolat aktif terpilih

Penentuan isolat teraktif dilarutkan dalam pelarut untuk dianalisis

kandungan kimianya dengan ditotolkan pada lempeng KLT dengan

menggunakan pipa kapiler. Pengembangan dilakukan dalam bejana

kromatografi dengan jarak pengembangan 7,5 cm dan fase gerak yang sesuai.

Hasilnya dideteksi dengan sinar UV254 dan UV366 nm dan disemprot dengan

pereaksi penampak bercak serium (IV) sulfat, dragendorff, vanilin-asam

sulfat dan uap amonia serta dihitung nilai Retardation factor (Rf) yang

didapat. Skema cara kerja penelitian secara keseluruhan dapat dilihat pada

Gambar 5.

% Kematian = Jumlah larva A. salina (mati – kontrol)

jumlah larva uji _______________________________ x 100%

Serbuk daun dan batang rumput mutiara

Maserasi dengan kloroform sampai seluruh serbuk terendam selama 24 jam (3 kali)

Wadah ditutup rapat, maserasi selama 24 jam (3 kali)

Maserat dipisahkan dengan disaring, lalu diuapkan dengan rotaevaporator

Ekstrak kloroform (39,7 g)

Dipartisi dengan etil asetat Fraksi larut etil asetat (23,8 g) Fraksi tidak larut etil asetat (4,2 g) Uji toksisitas dengan BST

Isolasi dengan KLT Preparatif

Uji toksisitas dengan BST

Isolat I.4 dan I.5 teraktif

Gambar 5. Skema kerja penelitian secara keseluruhan

F1 (3 g)

I1 (15mg)

Fraksi larut etil asetat (teraktif)

Fraksinasi dengan VLC

F10 (1 g)

F2 (0,9 g)

F3 (0,8 g)

F5 (0,7 g)

F8 (0,8 g)

F9 (1,2 g)

F6 (0,7 g)

F7 (0,6 g)

F4 (0,7 g)

F11 (0,6 g)

Fraksi (IV) teraktif

Uji toksisitas dengan BST

I2 (11mg)

I3 (3 mg)

I5 (25 mg)

I6 (4 mg)

I4 (15 mg)

Nilai LC50 I.4= 55,87 µg/mL Nilai LC50 I.5= 47,76 µg/mL

Kandungan kimia : I.4 = belum diketahui

I.5 = terpenoid

D. Analisis Data

1. Data persentase kematian larva A. salina dibuat persamaan regresi linier :

y = bx + a

dimana : y = persentase kematian, dan x = konsentrasi

2. Dengan menggunakan persamaan tersebut dihitung LC50-24 jam ekstrak rumput

mutiara dengan memasukkan 50% kematian ke persamaan tersebut sehingga

diperoleh konsentrasi yang menyebabkan 50% kematian.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pengumpulan dan Identifikasi Bahan

Pengumpulan bahan dilakukan di sekitar daerah Surakarta pada bulan

April 2008. Sampel yang digunakan dikumpulkan dari tempat dan waktu tertentu

untuk menghindari adanya variasi kandungan kimia tumbuhan yang terlalu besar

karena perbedaan kondisi tempat tumbuh. Setelah bahan terkumpul kemudian

dilakukan determinasi untuk menghindari kesalahan pengambilan sampel.

Determinasi dilakukan dengan mengacu pada Backer dan Bakhuizen van den

Brink (1965).

B. Penyiapan Bahan

Rumput mutiara yang telah dikumpulkan kemudian dicuci bersih dengan

air mengalir untuk menghilangkan kotoran dan debu yang mungkin terikut pada

saat pengambilan sampel. Bagian yang digunakan dalam penelitian ini adalah

bagian batang dan daun. Selanjutnya daun dikeringkan terlebih dahulu di bawah

sinar matahari secara tidak langsung yaitu dengan cara ditutup kain hitam agar

kandungan kimia yang ada di dalam daun tidak rusak oleh adanya radiasi

ultraviolet dari sinar matahari. Pengeringan bahan ini bertujuan untuk mengurangi

kadar air dan menghentikan reaksi enzimatik sehingga dapat mencegah kerusakan

sampel. Setelah dikeringkan dengan dijemur, sampel dikeringkan lagi dengan di

oven pada suhu ± 600C selama 24 jam, tujuannya supaya sampel benar-benar

kering dan mudah diserbuk (Hargono dkk., 1986).

Hasil pengeringan batang dan daun rumput mutiara setelah dijemur dan

dioven didapatkan serbuk simplisia kering sebesar 1248,6 gram berwarna hijau

kecoklatan. Bahan yang sudah kering kemudian diserbuk dengan menggunakan

manual (diremukkan). Pembuatan serbuk bertujuan untuk memperluas permukaan

partikel yang berinteraksi dengan pelarut sehingga proses penyarian dapat

berlangsung efektif. Selain itu penyerbukan dapat merusak sel sehingga

memudahkan larutan penyari menarik senyawa yang terkandung di dalam sel.

Serbuk tidak boleh terlalu halus karena akan mempersulit penyarian, butir-butir

yang terlalu halus akan membentuk suspensi yang sulit dipisahkan dengan

penyarian. Dengan demikian hasil penyarian tidak murni lagi tetapi bercampur

dengan partikel-partikel yang terlalu halus tadi (Harborne, 1987).

C. Ekstraksi

Penelitian isolasi senyawa bioaktif dari rumput mutiara ini mengacu dari

penelitian sebelumnya Murdiyono (2008). Pada penelitian ini, metode ekstraksi

yang digunakan adalah maserasi, karena metode ini tidak menggunakan

pemanasan sehingga rusaknya senyawa-senyawa yang tidak tahan panas dapat

dihindari. Selain itu cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana.

Maserasi dilakukan dengan menggunakan pelarut kloroform (ekstrak

kloroform). Hasil ekstrak kloroform yang diperoleh sebanyak 39,7 gram berwarna

hijau tua.

D. Partisi dan Uji Toksisitas Ekstrak Aktif

Ekstrak kloroform yang merupakan ekstrak aktif dipartisi dengan etil asetat

hingga diperoleh fraksi larut etil asetat (23,8 gram) dan fraksi tidak larut etil asetat

(4,2 gram). Partisi ini dimaksudkan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang

bersifat non polar agar masuk dalam fraksi tidak larut etil asetat sedangkan

senyawa-senyawa yang bersifat lebih polar masuk dalam fraksi larut etil asetat.

Analisis profil kandungan kimia terhadap hasil partisi dilakukan untuk

mengetahui kesempurnaan partisi. Pada kromatogram tampak beberapa bercak

dengan harga Rf yang sama pada ekstrak kloroform dan fraksi larut etil asetat

tetapi tidak tampak pada fraksi tidak larut etil asetat. Hal ini menunjukkan bahwa

senyawa-senyawa yang bersifat non polar telah terpartisi ke dalam fraksi tidak

larut etil asetat, sedangkan senyawa yang lebih polar larut dalam fraksi etil asetat.

Profil KLT hasil partisi dapat dilihat pada Gambar 6.

0,5

0

0,25

0,75

Rf 1

A B C Gambar 6. Profil kromatogram fraksi larut etil asetat dan tidak larut etil asetat

ekstrak kloroform rumput mutiara dengan deteksi (A) UV254, (B) UV366, (C) serium (IV) sulfat

Fase diam : Silika gel 60 GF254 Fase gerak : kloroform:etil asetat 3:1 (v/v) Jarak Pengembangan : 7,5 cm

Keterangan : 1. Ekstrak CHCl3

2. Fraksi larut etil asetat 3. Fraksi tidak larut etil asetat

Langkah selanjutnya dilakukan uji toksisitas fraksi larut etil asetat dan

fraksi tidak larut etil asetat terhadap A. salina. Rata-rata persentase kematian

fraksi larut etil asetat adalah 72% dan diketahui lebih besar daripada fraksi tidak

larut etil asetat yang hanya sebesar 37%. Fraksi larut etil asetat diketahui lebih

aktif daripada fraksi tidak larut etil asetat. Fraksi larut etil asetat selanjutnya

difraksinasi untuk diuji lebih lanjut.

E. Fraksinasi dan Uji Toksisitas Fraksi

Fraksinasi dilakukan dengan menggunakan metode Vacuum Liquid

Chromatography (VLC). Tujuan dari fraksinasi ini diharapkan dapat

mengeliminir senyawa-senyawa yang tidak dikehendaki dan dapat diperoleh

konsentrasi senyawa aktif yang lebih tinggi. Metode ini mempunyai keuntungan

bekerja sangat cepat, sederhana dan dapat digunakan secara luas. Selain itu

pemisahan dengan metode ini efisien dalam waktu, banyaknya adsorben dan

volume solven yang digunakan (Coll dan Bowden, 1986).

Fraksi larut etil asetat sebagai fraksi aktif selanjutnya difraksinasi untuk

memisahkan kandungan senyawa-senyawa di dalamnya berdasarkan polaritasnya.

Fraksi larut etil asetat dielusi dengan berbagai komposisi pelarut berdasar gradien

polaritas, dimulai dari yang polaritas rendah ke polaritas tinggi. Pemisahan

dengan fraksinasi menghasilkan sepuluh fraksi yang dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Fase gerak yang digunakan dalam fraksinasi fraksi larut etil asetat ekstrak kloroform untuk rumput mutiara dengan metode VLC dan berat kering fraksi yang diperoleh

Fraksi Fase gerak Berat kering yang diperoleh (mg)

1 wash-benzena 100% 3000

2 wash-benzena: etil asetat (12:1) (v/v) 900

3 wash-benzena: etil asetat (10:1) (v/v) 800

4a wash-benzena : etil asetat (8:1) (v/v) 700

4b wash-benzena : etil asetat (8:1) (v/v) 700

5 wash-benzena : etil asetat (6:1) (v/v) 700

6 wash-benzena : etil asetat (4:1) (v/v) 600

7 wash-benzena : etil asetat (3:1) (v/v) 800

8 wash-benzena : etil asetat (1:1) (v/v) 1200

9 etil asetat 100% 1000

10 kloroform : metanol (1:1) (v/v) 600

Pada fraksi keempat dibagi menjadi fraksi 4a dan 4b, hal ini dikarenakan

dengan perbandingan pelarut (fase gerak) yang sama, namun warna hasil

fraksinasinya berbeda, sehingga lebih baik dipisahkan. Kesebelas fraksi yang

diperoleh kemudian dianalisis dengan KLT. Fase gerak yang digunakan adalah n-

heksana:etil asetat (2:1 (v/v)) yang dapat memberikan pemisahan yang cukup baik

terhadap fraksi larut etil asetat. Profil kandungan kimia dideteksi dengan

menggunakan sinar UV254 dan sinar UV366 dan pereaksi semprot serium (IV)

sulfat. Profil KLT masing-masing fraksi hasil fraksinasi dapat dilihat pada

Gambar 7.

0,5

Rf

0

0,25

0,75

1

0,5

Rf

0

0,25

0,75

1

A B

C

Gambar 7. Profil kromatogram masing-masing fraksi hasil fraksinasi dari fraksi larut etil asetat ekstrak kloroform rumput mutiara dengan deteksi (A) UV254, (B) UV366, (C) serium (IV) sulfat

Fase diam : Silika gel 60 GF254 Fase gerak : n-heksana:etil asetat 2:1(v/v) Jarak pengembangan : 7,5 cm

Keterangan : Fraksi P = fraksi larut etil asetat Fraksi 1 = fraksi larut wash-benzena 100% Fraksi 2 = fraksi larut wash-benzena:etil asetat (12:1) (v/v) Fraksi 3 = fraksi larut wash-benzena:etil asetat (10:1) (v/v) Fraksi 4a = fraksi larut wash-benzena:etil asetat (8:1) (v/v) Fraksi 4b = fraksi larut wash-benzena:etil asetat (8:1) (v/v) Fraksi 5 = fraksi larut wash-benzena:etil asetat (6:1) (v/v) Fraksi 6 = fraksi larut wash-benzena:etil asetat (4:1) (v/v) Fraksi 7 = fraksi larut wash-benzena:etil asetat (3:1) (v/v) Fraksi 8 = fraksi larut wash-benzena:etil asetat (1:1) (v/v) Fraksi 9 = fraksi larut etil asetat 100% Fraksi 10 = fraksi larut kloroform:metanol (1:1) (v/v)

Selanjutnya fraksi-fraksi tersebut diuji potensi ketoksikannya terhadap A.

salina untuk mengetahui fraksi mana yang paling toksik.

Tabel 2. Hasil uji toksisitas fraksi-fraksi hasil fraksinasi dari fraksi larut etil asetat ekstrak kloroform rumput mutiara terhadap A. salina

Rata-rata persentase

kematian A salina (%)

Sampel Uji Konsentrasi

(µg/mL)

100 22.5 Fraksi 1

50 12.5

100 15 Fraksi 2

50 7.5

100 27.5 Fraksi 3

50 17.5

100 37.5 Fraksi 4a

50 32.5

100 47.5 Fraksi 4b

50 40

100 52.5 Fraksi 5

50 32.5

100 35 Fraksi 6

50 17.5

100 35 Fraksi 7

50 32.5

100 37.5 Fraksi 8

50 25

100 37.5 Fraksi 9

50 27.5

100 35 Fraksi 10

50 32.5

Keterangan : warna menunjukkan nilai rata-rata % kematian tertinggi

Berdasarkan Tabel 2 dapat diketahui bahwa fraksi yang paling toksik

adalah fraksi 5 dengan nilai rata-rata persentase kematian tertinggi pada

konsentrasi 100 µg/mL sebesar 52,5%. Namun fraksi 4b juga menunjukkan rata-

rata persentase kematian relatif tinggi pada konsentrasi yang sama menunjukkan

rata-rata persentase kematian 47,5%. Berdasarkan hasil kromatogram, fraksi 4b

dan 5 juga menunjukkan profil kromatogram yang hampir sama. Oleh karena itu,

fokus penelitian pengambilan isolat aktif lebih lanjut dilakukan pada fraksi 4b dan

5. Berdasarkan kromatogram 4b dan 5, diketahui bahwa ada sekitar 6 isolat yang

dapat diisolasi.

F. Isolasi dan Pemurnian Senyawa Hasil Isolasi

Isolasi dilakukan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis preparatif,

untuk melakukan analisis secara kuantitatif hasil fraksinasi untuk F4b dan F5.

Ukuran pelat kromatografi yang digunakan 20 x 20 cm. Penjerap yang digunakan

adalah silika gel dan dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil maupun

campuran senyawa hidrofil.

Setelah dilakukan KLTp, untuk memisahkan isolat dari silika dilakukan

pemurnian dengan pelarutnya, yaitu kloroform:metanol (1:1) lalu dihomogenkan

dan senyawanya lepas dari silika dengan stirer, kemudian dipisahkan dengan

corong vakum. Profil KLT hasil isolasi fraksi 4b dan 5 dapat dilihat pada Gambar

8. Berdasarkan hasil isolasi fraksi aktif tersebut, didapatkan 6 isolat yang dipantau

profilnya dengan menggunakan KLT, kemudian diberi nama isolat 1 sampai

dengan 6.

0,5

0,25

0

0,5

0

0,25

0,75

1

0,75

Rf

1

Rf

A B

C

Gambar 8. Profil kromatogram hasil isolasi F4b dan F5 fraksi rumput mutiara dengan deteksi (A) UV254, (B) UV366, (C) serium (IV) sulfat

Fase diam : Silika gel 60 GF254 Fase gerak : n-heksana:etil asetat 2:1 (v/v) Jarak Pengembangan : 7,5 cm

Keterangan : Nomor 1 = isolat 1 Nomor 2 = isolat 2 Nomor 3 = isolat 3 Nomor 4 = isolat 4 Nomor 5 = isolat 5 Nomor 6 = isolat 6

Tabel 3. Data hasil berat isolat 1 - 6 rumput mutiara

No. Keterangan Berat isolat (mg)

1 Isolat 1 15

2 Isolat 2

3 Isolat 3

4 Isolat 4

11

3

15

5 Isolat 5 25

6 Isolat 6 4

Selanjutnya dilakukan uji toksisitas terhadap 6 isolat hasil isolasi senyawa

rumput mutiara dengan uji BST.

Tabel 4. Hasil uji toksisitas senyawa hasil isolasi batang dan daun rumput mutiara terhadap A. salina (konsentrasi 100 µg/mL)

Keterangan Nilai Rf Rata-rata persentase kematian A

salina (%)

Isolat 1 0,80 58

Isolat 2 0,68 52

Isolat 3 0,58 57.5

Isolat 4 0,48 76

Isolat 5 0,40 88

Isolat 6 0,38 55

Berdasarkan hasil uji toksisitas senyawa hasil isolasi rumput mutiara

terhadap A. salina (konsentrasi 100 µg/mL), menunjukkan bahwa pada isolat 4

dan isolat 5 mempunyai potensi ketoksikan yang lebih tinggi dibandingkan

dengan isolat yang lain. Kromatogram isolat 4 dan 5 rumput mutiara dapat dilihat

pada Gambar 9.

0,5

0

0,75

Rf

0,25

1

A B C Gambar 9. Profil kromatogram isolat 4 dan 5 hasil isolasi rumput mutiara dengan

deteksi (A) UV254, (B) UV366, (C) serium (IV) sulfat Fase diam : Silika gel 60 GF254 Fase gerak : n-heksana:etil asetat 2:1 (v/v) Jarak Pengembangan : 7,5 cm

Keterangan : Nomor 1 = isolat 4 Nomor 2 = isolat 5

Selanjutnya, untuk mendapatkan nilai LC50-24 jam dari A. salina dilakukan

uji toksisitas lebih lanjut dengan menurunkan konsentrasi menjadi 75 dan 50

µg/mL. Hasil uji toksisitas isolat 4 dan 5, serta perhitungan nilai LC50-24 jam dapat

dilihat pada Tabel 5.

Tabel 5. Hasil uji toksisitas isolat 4 dan 5 dari hasil isolasi rumput mutiara terhadap A. salina

Rata-rata persentase kematian A salina (%) Sampel uji Konsentrasi

(µg/mL) Replikasi I Replikasi II Replikasi III

100 78 84 80

75 60 60 60

Isolat 4

50 44 48 50

100 88 92 88

75 66 64 68

Isolat 5

50 54 56 50

Isolat 4 dan 5 dari hasil uji toksisitas diketahui bahwa nilai LC50-24jam

terdapat di sekitar konsentrasi 50 µg/mL. Nilai rata-rata persentase kematian dari

masing-masing isolat 4 dan 5 yang diperoleh selanjutnya dibuat kurva hubungan

antara konsentrasi (x) dan persentase kematian (y) sehingga diperoleh persamaan

garis lurus yang dapat dilihat pada Tabel 6.

Tabel 6. Persamaan regresi linier dan perhitungan nilai LC50-24 jam isolat 4 dan 5 hasil isolasi rumput mutiara dengan 3 replikasi

Isolat 4 Replikasi Persamaan regresi linier LC50 (µg/mL)

I y = 0,68x + 9,6667 r2 = 0,9988

59,31

II y = 0,72x + 10 r2 = 0,9643

55,55

III y = 0,6x + 18,333 r2 = 0,9643 52,77

LC50-24jam rata-rata 55,87

Isolat 5 Replikasi Persamaan regresi linier LC50 (µg/mL)

I

y = 0,68x + 18,333 r2 = 0,972 46,57

II y = 0,72x + 16,66 r2 = 0,906 46,30

III y = 0,76x + 11,667 r2 = 0,9991

50,43

LC50-24jam rata-rata 47,76

Kurva hubungan antara konsentrasi dan persen kematian larva A. salina

dari isolat 4 dapat dilihat pada Gambar 10, 11 dan Gambar 12, dan untuk isolat 5

pada Gambar 13, 14, dan Gambar 15.

Gambar 10. Kurva regresi linier hasil uji toksisitas isolat 4 hasil isolasi rumput

mutiara terhadap A. salina replikasi I

125.00100.0075.0050.0025.000.00

Konsentrasi

100.00

80.00

60.00

40.00

20.00

0.00

Pers

enta

se K

emat

ian

Kurva Regresi Linier Replikasi II Isolat RM 4

Linear

Observed

y = 0.72x + 10

Gambar 11. Kurva regresi linier hasil uji toksisitas isolat 4 hasil isolasi rumput

mutiara terhadap A. salina replikasi II

r2 = 0.9988

r2 = 0.9643

125.00100.0075.0050.0025.000.00

Konsentrasi

100.00

80.00

60.00

40.00

20.00

0.00

Pers

enta

se K

emat

ian

Kurva Regresi Linier Replikasi III Isolat RM 4

Linear

Observed

y = 0.6x + 18.333

Gambar 12. Kurva regresi linier hasil uji toksisitas isolat 4 hasil isolasi rumput

mutiara terhadap A. salina replikasi III

125.00100.0075.0050.0025.000.00

Konsentrasi

100.00

80.00

60.00

40.00

20.00

0.00

Pers

enta

se k

emat

ian

Kurva Regresi linier Replikasi I Isolat RM 5

Linear

Observed

y = 0.68x + 18.333

Gambar 13. Kurva regresi linier hasil uji toksisitas isolat 5 hasil isolasi rumput

mutiara terhadap A. salina replikasi I

r2 = 0.9643

r2 = 0,972

125.00100.0075.0050.0025.000.00

Konsentrasi

100.00

80.00

60.00

40.00

20.00

0.00

Per

sen

tase

kem

atia

n

Kurva Regresi Linier Replikasi II Isolat RM 5

Linear

Observed

y = 0,72x + 16,66

Gambar 14. Kurva regresi linier hasil uji toksisitas isolat 5 hasil isolasi rumput

mutiara terhadap A. salina replikasi II

125.00100.0075.0050.0025.000.00

Konsentrasi

100.00

80.00

60.00

40.00

20.00

0.00

Per

sent

ase

Kem

atia

n

Kurva Regresi Linier Replikasi III Isolat RM 5

Linear

Observed

y = 0,76x + 11,667

Gambar 15. Kurva regresi linier hasil uji toksisitas isolat 5 hasil isolasi rumput mutiara terhadap A. salina replikasi III

Berdasarkan persamaan garis lurus dari masing-masing replikasi dapat

ditentukan nilai LC50-24jam dengan cara memasukkan nilai y = 50 ke dalam

r2 = 0,906

r2 = 0,9991

persamaan persamaan garis lurus, sehingga diperoleh konsentrasi yang

menyebabkan 50% kematian. LC50-24jam menunjukkan konsentrasi yang

menyebabkan kematian pada 50% hewan uji pada paparan waktu selama 24 jam.

Nilai LC50-24jam yang diperoleh mencerminkan toksisitas bahan terhadap hewan

uji. Semakin besar harga LC50-24jam berarti toksisitasnya semakin kecil dan

sebaliknya semakin kecil harga LC50-24jam maka semakin besar toksisitasnya.

Menurut Meyer dkk. (1982), senyawa uji dikatakan toksik jika harga LC50-

24jam lebih kecil dari 1000 µg/mL. Hasil perhitungan diperoleh harga LC50-24jam

rata-rata dari ketiga replikasi berturut-turut dari masing-masing isolat 4 dan 5

adalah sebesar 55,87 dan 47,76 µg/mL. Hal ini menunjukkan bahwa isolat 4 dan 5

bersifat toksik dan berpotensi sebagai antikanker. Selanjutnya golongan senyawa

pada isolat 4 dan 5 dideteksi dengan KLT dan pereaksi semprot spesifik.

Pada penelitian uji toksisitas hasil isolasi rumput mutiara ini menggunakan

hewan uji A. salina, dimana penentuan nilai LC50-24jam dilakukan pada tahap

perkembangan nauplii instar II dan III. Menurut Sorgellos dkk. (1978), pada

perkembangan nauplii instar II dan III A. salina lebih sensitif terhadap senyawa

toksik.

Jalur pemaparan senyawa toksik rumput mutiara pada hewan uji A. salina

di mulai melalui oral dan bagian dermal. Pada bagian mulut senyawa toksik ini

diabsorbsi masuk ke dalam saluran pencernaan, sedangkan pada bagian dermal,

terjadi proses absorbsi melalui membran sel. Setelah proses absorbsi dilanjutkan

dengan proses distribusi senyawa toksik ke dalam tubuh A. salina, dan terjadi

proses reaksi metabolisme. Struktur anatomi tubuh A. salina pada tahap nauplii

instar II dan III masih sangat sederhana, yaitu terdiri dari lapisan kulit, mulut,

anthena, saluran pencernaan atau digesti yang masih sederhana, dan calon

thoracopoda (Raineri, 1981).

Senyawa toksik yang masuk ke dalam tubuh A. salina menyebabkan

perubahan gradien konsentrasi di dalam dan di luar sel. Setelah senyawa toksik ini

masuk secara oral dan dermal, kemudian terabsorbsi masuk ke dalam jaringan

tubuh, dan pada akhirnya menyerang ke dalam sel, terjadi kerusakan fungsional

dan metabolisme sel A. salina. Efek yang ditimbulkan terjadi secara cepat dalam

waktu 24 jam, hingga menyebabkan 50% kematian A. salina. Menurut Castritsi

(1984), hasil pengamatan menggunakan mikroskop elektron menunjukkan terjadi

kerusakan pada mikrovili A. salina. Kerusakan ini terjadi akibat pemaparan

senyawa toksik potassium dichromat ke dalam tubuh A. salina pada nauplii instar

II dan III melalui oral dan masuk ke dalam saluran pencernaan. A. salina pada

tahap perkembangan nauplii instar II dan III dapat dilihat pada Gambar 16 dan 17.

Gambar 16. A. salina pada tahap perkembangan nauplii instar II

Gambar 17. A. salina pada tahap perkembangan nauplii instar III

G. Deteksi Golongan Senyawa Isolat Teraktif

Golongan senyawa yang terkandung dalam isolat teraktif dianalisis

menggunakan metode KLT dengan beberapa pereaksi penampak bercak. Fase

diam yang digunakan adalah silika gel GF254 dengan fase gerak n-heksana:etil

asetat (2:1(v/v)), jarak pengembangan 8 cm. Deteksi menggunakan sinar UV254,

sinar UV366 dan beberapa pereaksi penampak bercak, yaitu serium (IV) sulfat,

dragendorff, vanilin-asam sulfat, uap amonia, dan FeCl3.

Deteksi kromatogram isolat 4 dan 5 dengan sinar UV254 (Gambar 18.2)

memperlihatkan terjadinya peredaman yang ditandai dengan adanya beberapa

zona gelap berlatar belakang fluoresensi hijau. Peredaman yang terjadi pada

UV254 ini menunjukkan adanya keberadaan suatu senyawa. Deteksi dengan sinar

UV366 (Gambar 18.3) pada bercak isolat 4 tidak mempelihatkan senyawa yang

berpendar, sedangkan pada bercak isolat 5 terjadi perpendaran kuat dan berwarna

biru. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa tersebut memiliki ikatan rangkap

terkonjugasi yang panjang sehingga dapat berpendar pada penyinaran dengan UV

gelombang panjang. Deteksi dengan sinar tampak (visibel) (Gambar 18.1)

memperlihatkan beberapa bercak berwarna kuning agak kecoklatan.

Profil KLT isolat 4 dan 5 dengan berbagai pereaksi penampak bercak

dapat dilihat pada Gambar 18.

0,5

0,25

0,75

0

1

0,75

0,5

0,25

sinar tampak UV254 UV366 Serium (IV) sulfat

(1) (2) (3) (4)

Dragendorff Vanilin-Asam sulfat Uap amonia FeCl3 (5) (6) (7) (8)

Gambar 18. Profil kromatogram isolat 4 dan 5 rumput mutiara dengan berbagai pereaksi penampak bercak

Fase diam : Silika gel 60 GF254 Fase gerak : n-heksana:etil asetat 2:1 (v/v) Jarak Pengembangan : 8 cm

Keterangan : Nomor 1 = isolat 4 Nomor 2 = isolat 5

1

0

0,5

0

0,25

0,75

Rf

0

Rf

0

Rf

1

0,5

0,25

0,75

1

0,5

0,25

0,75

1

0

Rf

Rf

0,5

0

0,25

0,75

1

0,5

Rf

0

0,25

0,75

1

0,5

Rf

0

0,25

0,75

1

Rf

Hasil uji KLT isolat 4 dan 5 dengan deteksi sinar tampak, sinar UV dan

yang telah disemprot dengan pereaksi penampak bercak spesifik disajikan pada

Tabel 7.

Tabel 7. Hasil uji KLT isolat 4 dan 5 rumput mutiara dengan berbagai pereaksi penampak bercak.

Penampak bercak Rf

Visibel UV254 UV366 SS DD VA UA FeCl3

0,82 kuning

0,93 kuning

Peredaman

peredaman

biru

-

coklat

coklat

-

-

ungu

-

- -

- -

Keterangan : SS = Serium (IV) sulfat DD = Dragendorff VA = Vanilin - asam sulfat UA = Uap ammonia FeCl3 = Besi (III) klorida

Deteksi umum untuk senyawa organik dilakukan dengan penyemprotan

menggunakan serium (IV) sulfat. Pada Kromatogram (Gambar 18.4), pada

masing-masing isolat menunjukkan bercak berwarna coklat gelap dengan nilai Rf

0,82 dan 0,93. Hal ini menunjukkan bahwa pada bercak tersebut terdapat senyawa

organik. Untuk mengetahui jenis golongan senyawa secara spesifik, maka

dilanjutkan deteksi dengan menggunakan pereaksi penampak bercak yang

spesifik.

Pemeriksaan Akaloid

Fase gerak yang digunakan pada KLT untuk analisis alkaloid adalah

n-heksana:etil asetat (2:1 (v/v)). Plat disemprot dengan pereaksi Dragendorff

kemudian dikeringkan dengan suhu 110 °C selama 10 menit. Dragendorff

merupakan pereaksi semprot untuk mendeteksi keberadaan senyawa yang

mengandung basa nitrogen secara umum dan alkaloid. Pada hasil kromatogram

diketahui bahwa ternyata isolat ini tidak memunculkan bercak yang berwarna

coklat kekuningan. Alkaloid dan basa nitrogen akan menunjukkan bercak

berwarna coklat jingga berlatar belakang kuning setelah disemprot dengan

pereaksi dragendorff (Padmawinata dan Soediro, 1996), sehingga dapat

disimpulkan bahwa di dalam isolat 4 dan 5 tidak terdapat senyawa yang

mengandung basa nitrogen dan alkaloid.

Pemeriksaan Fenolik

Fase gerak yang digunakan pada KLT untuk analisis senyawa fenol adalah

n-heksana:etil asetat (2:1 (v/v)). Besi (III) klorida dan uap amonia digunakan

untuk mendeteksi senyawa fenol. Pada hasil kromatogram diketahui bahwa

ternyata isolat ini tidak memunculkan bercak yang berwarna hijau, merah, ungu,

biru, atau hitam yang kuat (Gambar 18.7 dan 18.8). Menurut Wagner (1987)

senyawa fenol akan menimbulkan warna hijau, merah, ungu, biru, atau hitam yang

kuat berlatar belakang kuning setelah disemprot dengan pereaksi spesifik besi (III)

klorida.

Senyawa fenol terutama flavonoid dapat dideteksi pada kromatogram

berdasarkan warnanya atau fluoresensinya dibawah sinar UV, warnanya diperkuat

atau berubah menjadi kuning terang atau merah jingga bila diuapi amonia

(Harborne, 1987). Pada hasil kromatogram isolat 4 juga tidak memunculkan

perubahan warna bercak menjadi kuning terang maupun merah jingga setelah

diuapi dengan uap amonia (Gambar 18.7), sehingga dapat disimpulkan bahwa di

dalam isolat 4 bukan termasuk senyawa golongan fenol.

Pemeriksaan Terpenoid

Fase gerak yang digunakan pada KLT untuk analisis terpenoid adalah

n-heksana:etil asetat (2:1 (v/v)). Plat disemprot dengan pereaksi Vanilin-asam

sulfat dan kemudian dipanaskan dengan suhu 110 °C selama 10 menit.

Pemeriksaan terpenoid menggunakan pereaksi warna valinin-asam sulfat, bila

terdapat terpenoid maka akan menunjukkan bercak berwarna antara biru sampai

ungu (Sulistijowati dan Gunawan, 2001). Pada hasil kromatogram menunjukkan

adanya satu bercak berwarna biru pada Rf 0,82 (Gambar 18.6), sehingga dapat

disimpulkan bahwa di dalam isolat 5 terdapat senyawa golongan terpenoid.

Terpenoid disintesis dari metabolisme primer yaitu dari respirasi. Tahap

awal metabolisme konversi glukosa menjadi energi di dalam tubuh akan

berlangsung secara anaerobik melalui proses yang dinamakan glikolisis. Inti dari

keseluruhan proses glikolisis adalah untuk mengkonversi glukosa menjadi produk

akhir berupa piruvat. Pada proses glikolisis, 1 molekul glukosa yang memiliki 6

atom karbon pada rantainya (C6H12O6) akan terpecah menjadi produk akhir

berupa 2 molekul piruvat yang memiliki 3 atom karbon. Proses ini berjalan

melalui beberapa tahapan reaksi yang disertai dengan terbentuknya beberapa

senyawa antara seperti Glukosa 6-fosfat dan Fruktosa 6-fosfat. Selain akan

menghasilkan produk akhir berupa molekul piruvat, proses glikolisis ini juga akan

menghasilkan molekul ATP serta molekul NADH (1 NADH 3 ATP). Molekul

ATP yang terbentuk ini kemudian akan diekstrak oleh sel-sel tubuh sebagai

komponen dasar sumber energi (Lakitan, 1993). Skema glikolisis dan siklus asam

sitrat dapat dilihat pada Gambar 19.

Dalam kondisi aerobik, piruvat hasil proses glikolisis akan teroksidasi

menjadi produk akhir berupa H2O dan CO2 di dalam tahapan proses yang

dinamakan respirasi selular. Proses respirasi selular ini terbagi menjadi 3 tahap

utama yaitu produksi Acetyl-CoA, proses oksidasi acetyl-CoA dalam siklus asam

sitrat serta rantai transpor elektron. Sebelum memasuki siklus asam sitrat molekul

piruvat akan teroksidasi terlebih dahulu di dalam mitokondria menjadi Acetyl-

CoA dan CO. Proses ini berjalan dengan bantuan multi enzim 2 pyruvate

dehydrogenase complex (PDC) melalui 5 urutan reaksi yang melibatkan 3 jenis

enzim serta 5 jenis coenzim. Tiga jenis enzim yang terlibat dalam reaksi ini adalah

enzim pyruvate dehydrogenase (E1), dihydrolipoyl transacetylase (E2) dan

dihydrolipoyl dehydrogenase (E3), sedangkan Koenzim yang terlibat dalam reaksi

ini adalah TPP, NAD+, FAD, CoA dan Lipoate (Rubinstein, 2003).

Tiga molekul asetil-CoA kemudian bergabung menjadi asam mevalonat

yang merupakan jalur pembentukan terpenoid. Dua tahap kondensasi dan

dikatalisis oleh enzim thiolase dan hidroksi-metil-glutaril-CoA sintase

menghasilkan 3-hidroksi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA), kemudian oleh HMG-

CoA reduktase diubah menjadi asam mevalonat (MVA) (Croteau et al., 2000;

Taiz dan Zeiger, 1998).

Fosforilasi dari asam mevalonat oleh MVA kinase akan menghasilkan

asam-5-fosfat mevalonat (MVAP) kemudian fosforilasi tahap dua oleh MVAP

kinase membentuk asam-5-difosfat mevalonat (MVAPP). MVAPP mengalami

dekarboksilasi menghasilkan isopentenil difosfat (IPP) yang merupakan senyawa

prekursor pada pembentukan berbagai senyawa terpenoid. IPP dan isomernya

dimetil alil difosfat (DMAPP) membentuk terpenoid yang bergabung bersama

membentuk molekul yang lebih besar (Croteau et al., 2000; Taiz dan Zeiger,

1998). Kombinasi dari IPP dan DMAPP dikatalisis oleh enzim geranyl transferase

membentuk geranilpirofosfat dan farnesylpirofosfat. Dua molekul

farnesilpirofosfat berpasangan membentuk skualena. Skualena merupakan

prekursor dari pembentukan triterpen dan steroid (Ngan, 2005). Skema biosintesis

senyawa terpenoid dapat dilihat pada Gambar 20.

Gambar 19. Skema glikolisis dan siklus asam sitrat (Rubinstein, 2003)

2CH CSCoA2

O

2CH CSCoA2

OAsetil-CoA

Thiolase

CH CCH -C-S-CoA2 2

OAsetoasetil-CoA

2CH CSCoA2

OHMG CoA sintase

CH -C-CH -C-S-CoA3 2

CH -COOH2

OH O3-hidroksi-3-metil-glutaril-CoA (HMG-CoA)

2NADPH+2H +

2NADPH +

CH -C-CH -CH -OH3 2 2

CH -COOH2

OH

Asam mevalonat (MVA)

ATP

ADP

MVA kinase

ll

ll

ll

ll

ll

ATP

ADP

MVAP kinase

CH -C-CH -CH -O3 2 2 P

OOH ll

PO

llO

OH

OOCH -COOH2

Asam 5 PP-mevalonat (MVA-PP)

C-CH -CH -O2 2CH3

CH2

CO2

H O2

MVA-PP-dekarboksilase

P

O

O

O

O llll

P OH

Oisopentenil-PP (IPP)

C=CH2-CH2--O P

O

OO

O P OH

llll

O

CH3

CH2

IPP-isomerase isomerisasi

dimetilalil-PP (DMAPP)

Gambar 20. Skema biosintesis terpenoid (Taiz dan Zeiger, 1998)

Pemeriksaan senyawa Ursolic acid

Penelitian yang telah dilakukan oleh Hsu (1998) menyebutkan bahwa

ursolic acid dan oleanic acid dari H. corymbosa mampu menghambat

pertumbuhan sel hep-2B dan perbesaran tumor sub cutan. Senyawa ursolic acid

mempunyai efek antiproliferatif dan antivirus terhadap sel kanker servik (Yim

dkk., 2006), selain itu ursolic acid dan 2alpha-hydroxyursolic acid dapat

menghambat aktivitas pertumbuhan empat sel tumor yaitu HL-60, BGC, Bel-7402

dan Hela (Ma dkk., 2005). Senyawa ursolic acid merupakan salah satu senyawa

kimia yang terkandung dalam tanaman rumput mutiara. Senyawa ini termasuk

dalam golongan senyawa triterpenoid pentasiklik yang secara alami dapat

ditemukan pada sebagian besar dalam tanaman herba dan tanaman berbuah

(Pendleton, 2009).

Senyawa ursolic acid memiliki efek farmakologis sebagai anti-tumor (Hah

dkk., 1992; Yamaguchi dkk., 2008), anti-inflamasi (Baricevic dkk., 2001),

hepatoprotektif (Mishra dkk., 2009), anti-bisul, anti-mikrobia, anti-hiperlipidemik,

dan anti-virus (Pendleton, 2009). Rumput mutiara sebagian besar di daerah Cina

telah banyak dimanfaatkan sebagai obat antitumor. Berdasarkan hasil penelitian

farmakologi dilaporkan bahwa ternyata senyawa oleanolic acid dan ursolic acid

dapat menghambat inisiasi tumor (inhibit tumor initiation) menghambat induksi

perkembangan sel tumor (Liang dkk., 2009).

Kandungan aktif dalam tanaman rumput mutiara yang dilaporkan memiliki

efek antiproliferatif terhadap sel kanker hepar adalah asam ursolat dan asam

oleanolat. Pemberian ekstrak etanolik rumput mutiara dilaporkan mampu

menekan ekspresi c-Myc pada sel hepar secara signifikan dengan kelompok

kontrol DMBA. Hal ini menunjukkan bahwa rumput mutiara ini dapat

menghambat proliferasi sel dan dapat digunakan sebagai salah satu alternatif

pengobatan kanker hepar (Febriansah dkk., 2008).

Asam ursolat dan asam oleanoat yang terkandung dalam rumput mutiara

ini diketahui mampu menurunkan proliferasi sel kanker payudara (Mutiara dkk.,

2008). Penelitian yang dilakukan oleh Mutiara dkk. (2008) yaitu mengkaji

mekanisme molekuler ekstrak asam ursolat dan asam oleanolat pada Estrogen

Reseptor α (ERα) dan efek antiproliferasi ekstrak H. corymbosa terhadap sel

kanker payudara tikus terinduksi 7,12 dimetil benz(a)antrasen (DMBA).

Berdasarkan hasil analisis data pengamatan AgNOR diketahui secara kuantitatif

bahwa ekstrak etanolik H. corymbosa dosis 750 mg/kg BB menurunkan

proliferasi sel kanker mammae hingga 68,42% lebih besar daripada ekstrak 1500

mg/kg BB (52,63%).

Deteksi adanya kandungan terpenoid dari isolat 5 menegaskan bahwa

dalam isolat tersebut positif terdapat senyawa dari golongan terpenoid. Senyawa

ursolic acid termasuk dalam golongan senyawa triterpenoid. Oleh karena itu

dilakukan deteksi lebih lanjut untuk mengetahui apakah dalam isolat 5 ini terdapat

senyawa ursolic acid dengan menggunakan metode KLT dan senyawa ursolic

acid murni sebagai pembanding.

Deteksi senyawa ursolic acid dilakukan dengan menggunakan KLT dan

senyawa ursolic acid murni sebagai pembanding. Fase gerak yang digunakan

adalah n-heksana:etil asetat (2:1 (v/v)). Plat kemudian dideteksi dengan UV254,

0,5

0

0,75

0,25

Rf

1

UV366 dan disemprot dengan pereaksi vanilin-asam sulfat yang selanjutnya

dipanaskan dengan suhu 105°C selama 10 menit.

Profil KLT untuk deteksi ursolic acid dapat dilihat pada Gambar 21.

A B C Gambar 21. Profil kromatogram isolat 5 rumput mutiara (1) dan senyawa ursolic

acid (2) dengan deteksi (A) UV254, (B) UV366, (C) Vanillin-asam sulfat

Fase diam : Silika gel 60 GF254 Fase gerak : n-heksana:etil asetat 2:1 (v/v) Jarak pengembangan : 8 cm

Kromatogram pada isolat 5 dan senyawa ursolic acid dengan deteksi

vanilin-asam sulfat menunjukkan bercak warna yang sama (Gambar 21.C) dan

mempunyai nilai Rf yang hampir sama yaitu 0,87 dan 0,92. Namun pada deteksi

UV254 dan UV366 memberikan hasil yang berbeda. Pada isolat 5 dengan sinar

UV254 menunjukkan terjadinya fosforesensi peredaman yang ditandai dengan

adanya bercak zona gelap berlatar belakang hijau dan pada sinar UV366 terjadi

fluoresensi perpendaran kuat berwarna biru. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa

pada isolat 5 ini memiliki ikatan rangkap terkonjugasi yang panjang sehingga

dapat berpendar pada penyinaran dengan UV gelombang panjang. Sedangkan

hasil deteksi kromatogram ursolic acid dengan UV254 dan UV366 tidak

menunjukkan adanya bercak maupun peredaman ataupun perpendaran. Hal ini

karena memang struktur kimia senyawa ursolic acid tidak mempunyai ikatan

rangkap terkonjugasi (Gambar 22).

Pada kromatogram dengan deteksi ini memunculkan bercak tailing atau

pengekoran yang berwarna ungu pada senyawa ursolic acid (b), ditandai dengan

tidak terbentuk bercak utuh tetapi memanjang. Bercak tailing ini bisa disebabkan

oleh beberapa faktor, antara lain seperti jumlah sampel senyawa yang ditotolkan

terlalu banyak, sehingga fase gerak tidak mampu membawa solut dengan

sempurna, selain itu adanya interaksi yang kuat antara solut dengan fase diam

dapat menyebabkan solut sukar terelusi sehingga dapat menyebabkan tailing

(Sudjadi, 2007) .

Ursolic acid termasuk dalam golongan senyawa triterpenoid pentasiklik

yang secara alami dapat ditemukan pada sebagian besar tanaman herba dan

tanaman berbuah. Struktur kimia ursolic acid dapat dilihat pada Gambar 22.

Gambar 22. Struktur kimia ursolic acid (Febriansah, 2008).

Pemeriksaan beberapa golongan senyawa di atas menunjukkan bahwa

pada isolat 4 belum dapat ditentukan golongan senyawanya dan isolat 5 adalah

golongan senyawa terpenoid.

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh, maka dapat disimpulkan

bahwa :

1. Hasil uji toksisitas isolat 4 dan 5 dari hasil isolasi rumput mutiara fraksi

larut etil asetat ekstrak kloroform menunjukkan toksisitas paling tinggi

terhadap A. salina Leach dengan nilai LC50-24 jam = sebesar 55,87 dan 47,76

µg/mL dan berpotensi untuk diteliti lebih lanjut ke arah senyawa

antikanker.

2. Pada isolat 4 setelah dilakukan deteksi dengan berbagai pereaksi spesifik

belum dapat ditentukan golongan senyawanya dan pada isolat 5 adalah

golongan senyawa terpenoid.

B. Saran

Pada isolat 4 perlu dilakukan deteksi dengan menggunakan pereaksi

spesifik lain, seperti asam klorida (HCl 2M) mendeteksi keberadaan senyawa

tanin, atau dengan menggunakan macam pereaksi lain sehingga dapat diketahui

golongan senyawanya. Selain itu, perlu dilakukan uji pemurnian isolat lebih

lanjut, elusidasi struktur terhadap isolat 4 dan 5 sampai didapatkan senyawa yang

benar-benar murni sehingga dapat diketahui struktur senyawanya, dan dilakukan

uji sitotoksisitasnya.

68

DAFTAR PUSTAKA

Adoum. 2008. Determination of Toxicity Effects of Some Savannah Plants Using Brine Shrimp Test (BST). Int. Jor. P. App. Scs. 2(3):1-5.

Anderson, D. 1967. Larva Development and Segment Formation in The Branchiopod Crustaceans Littznadia sfatileyatra King (Conch.) and Artemia salina L. (Leach). Austral. J. Zool. 15: 47-91.

Anderson, J.E., Goetz, McLaughlin, and Suffness. 1991. A Blind Comparison of Simple Bench-top Bioassays And Human Tumour Cell Cytotoxicities as Antitumor Prescreens. Phytochem Analysis 2: 107-111.

Anderson, J.E., J.L. McLaughlin, and L.L. Rogers. 1998. The Use of Biological Assays to Evaluate Botanicals. Drug Information Journal 32: 513-524.

Aryanti, E.T.M., Mariska, dan Bintang. 2005. Isolasi Senyawa Antikanker dari Akar Berambut Artemisia Cina dan Aktifitas Inhibisinya Terhadap Sel Kanker Mulut Rahim. Majalah Farmasi Indonesia 16 (4): 192-196.

Astuti, P., Alam, Hartati, D.S. Sari, dan S. Wahyuono. 2005. Uji Sitotoksik Senyawa Alkaloid dari Spons Petrosia sp: Potensial Pengembangan Sebagai Antikanker. Majalah Farmasi Indonesia 16(1): 58-62.

Asyhar, A., Febriansah, A. Ashari, R.A. Susidarti, dan E. Meiyanto. 2008. Modulasi ekspresi protein n-ras ekstrak etanolik rumput mutiara (Hedyotis corymbosa) pada sel hepar tikus galur sprague dawley terinduksi 7,12-dimetilbenz[a]antra-sena). Prosiding Kongres Ilmiah XVI ISFI 2008. Cancer Chemoprevention Research Center (CCRC), Fakultas Farmasi Universitas Gajah Mada.

Backer, C.A. and Bakhuizen van den Brink. 1965. Flora of Java. Volume II. Groningen : N. V. P. Noordhof. hal.285.

Baricevic, D., S. Sosa, R. D. Loggia, A. Tubaro, B. Simonovska, A. Krasna, and A. Zupancic. 2001. Topical Anti-inflammatory Activity of Salvia officinalis L. Leaves: the Relevance of Ursolic Acid. Journal of Ethnopharmacology 75 (2-3): 125-132.

Cannel, R.J.P. 1998. Natural Products Isolation. Humana Press, New Jersey.

Castritsi, C., J.M. Loannidou, M. Katsorchis, and T. Kiortsis. 1984. Action d’un dispersant du petrole sur l’epithlium intestinal de deux souches d’Artemia, 1984. Tr. J. of Zoology 22 (1998) 259-266.

Dwiatmaka, Y. 2001. Identifikasi Simplek dan Toksisitas Akut Secara BST Ekstrak Kulit Batang Pule (Alstonia scholaris). Tesis. Program Pasca Sarjana Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Erma, N., T. Sumdari, A.K. Susanti, Palupi, Isnaeni, dan Sukardiman. 2004. Kajian Pendahuluan Uji Toksisitas Ekstrak Air Miselia dan Tubuh Buah Jamur Shiitake (Lentinus edodes) Dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BST). Berk. Penel. Hayati 10: 13-18.

Febriansah, R., Asyhar, M. Iqbal Adam, dan Sulistyorini. 2008. Rumput Mutiara (Hedyotis corymbosa (L.) Lamk.). http://ccrcfarmasiugm.wordpress.com [14 September 2008].

Hambali, J. 2005. Rumput Mutiara Obat Kanker Payudara. http://www.farmacia.ugr.es/.pdf [24 Februari 2010].

Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia. diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Iwang Sudiro, Terbitan II, 5-9, 147-155. Penerbit Institut Teknologi Bandung, Bandung.

Harefa, F. 1996. Mengenal Sifat Biologis Artemia. Swadaya, Jakarta. http://www.o-fish.com/ [21 Januari 2010].

Hostettmann, K., M. Hostettmann, and A. Marston. 1995. Cara Kromatografi Preparatif. Penerbit Institut Teknologi Bandung, Bandung.

Houghton, P. J., 2000. Use of small scale Bioassays in the Discovery of novel drugs from Natural Sources. Phytotherapy Research 14: 419-423.

Hsu, H.Y. 1998. Tumor Inhibition by Several Component Extracted from Hedyotis corymbosa and Hedyotis diffusa. Cancer Detection and Prevention (1): 22-28.

Ipteknet. 2005. Tanaman Obat Indonesia, Rumput Mutiara (Hedyotis corymbosa (L.) Lamk.). http://www.iptek.net.id/ [20 Februari 2010].

Juniarti., O.D. dan Yuhemita. 2009. Kandungan Senyawa Kimia, Uji Toksisitas (Brine Shrimp Lethality Test) dan Antioksidan (1,1-diphenyl-2-pikrilhydrazyl) dari Ekstrak Daun Saga (Abrus precatorius L.). Makara Sains 13 (1): 50-54.

Kanwar, A. 2007. Brine Shrimp (Artemia salina) Marine Animal for Simple and Rapid Biological Assays. Journal of Chinese Clinical Medicine 2(4): 236-240.

Lakitan, B. 1993. Dasar-Dasar Fisiologi Tumbuhan. Penerbit Raja Grafindo Persada, Jakarta.

Lee, S., ByungSun Min., and YungHee Kho. 2002. Brine Shrimp Lethality of the Compounds from Phryma leptostachya L. Archives of Pharmacal Research 25(5): 652-654.

Li, J., Guo W.J. and Yang Q.Y. 2002. Effects of Ursolic Acid and Oleanolic Acid on Human Colon Carcinoma Cell Line HCT15. World. J. Gastroenterol 8(3): 493-495.

Liang, Z., Z. Jiang, D.W. Fong, and Z. Zhao. 2009. Determination of Oleanolic Acid and Ursolic Acid in Oldenlandia diffusa and Its Substitute Using High Performance Liquid Chromatography. Journal of Food and Drug Analysis 17 (2): 69-77.

Lin, C.C., J.J. Yang, and H.Y. Hsu. 2002. Anti-inflammatory and Hepatoprotective Activity of Peh-hue-juwa-chi-cao in Male Rat. Am. J. Chin. Med. 30 (2-3): 225-234.

Loomis, T.A. 1978. Toksikologi Dasar. (diterjemahkan oleh Donatus). Fakultas Farmasi Universitas Gajah Mada, Yogyakarta. hal.52-79 .

CM, Ma., Cai, Cui, R.Q. Wang, P.F. Tu, Hattori, and Daneshtalab, M., 2005. The Cytotoxic activity of Ursolic Acid Derivated. Eur. J. Med. Chem. 40 (06): 582-589.

McLaughlin, J.L. 1991. Crown Gall Tumours on Potato Disc and Brine Shrimp Lethality: Two Simple Bioassay for Higher Plant Screening and Fractination. Methods in Plants Biochemistry 6 (1): 1-30.

Meyer, B.N., Ferrigni, Putnam, J.E. Jacobsen, L.B. Nichols, and McLaughlin. 1982. Brine Shrimp: A Convenient General Bioassay for Active Plant Constituents. Planta Medica 45: 31-34.

Mishra, K., P.D. Aditya, B.K. Swain, and N. Dey. 2009. Anti-malarial activities of Andrographis paniculata and Hedyotis corymbosa extracts and their combination with curcumin. Malaria Journal 2009 8: 26.

Moklas. A., N. Raudza, T. Hidayat, Sharida, F. Idayu, Zulkhairi, and Shamima. 2008. A Preliminary Toxicity Study of Mitragynine, An Alkaloid from Mitragyna Speciosa Korth and its Effects on Locomotor Activity in Rats. Journal Advances in Medical and Dental Sciences 2(3): 56-60.

Mutiara, Ulfia S., S. Embun, N. Sri, R. Asmah, M. Ikawati, dan E. Meiyanto. 2008. Kajian Molekuler Senyawa Aktif Ekstrak Etanolik Hedyotis corymbosa pada Protein ERα serta Efek Antiproliferasinya Terhadap Sel

Kanker Payudara Tikus Galur Sprague Dawley Terinduksi 7,12-Dimetilbenz(α)antrasen. Prosiding Kongres Ilmiah XVI ISFI 2008.

Murdiyono, T. 2008. Uji Toksisitas Hasil Fraksinasi Daun Rumput Mutiara (Hedyotis corymbosa L.(Lamk.) terhadap Artemia Salina Leach dan Profil Kandungan Kimia Fraksi Teraktif. Skripsi. Jurusan Biologi Universitas Sebelas Maret, Surakarta.

Mursiti, H. 2002. Uji Toksikologi Hasil Fraksinasi Ekstrak Kloroform Biji Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa Scheff. Boerl) terhadap Artemia salina Leach dan Profil kromatogram Hasil Kromatografi Lapis Tipisnya, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gajah Mada, Yogyakarta.

Noiarsa, P.S., R. Otsuko, and Kanchanapoom. 2007. Chemical Constituents from Oldenlandia corymbosa L. of Thai Origin. Journal of Natural Medicines 5: 26-32.

Ogunnusi, T.A. and Dosumu. 2008. Bioactivity of Crude Extracts of Euphorbia kamerunica Pax Using Brine Shrimp (Artemia salina) Lethality Assay. Journal of Medicinal Plants Research 2(12): 370-373.

Padmawinata, K. 1995. Cara Kromatografi Preparatif. Penerbit Institut Teknologi Bandung, Bandung.

Padmawinata, K. dan I. Soediro. 1996. Metode Fitokimia : Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, Cetakan Kedua. Penerbit Institut Teknologi Bandung, Bandung.

Pendleton, J. 2009. Ursolic Acid: Excitement in Allergy, Inflamation, and Cancer Management. http://herbalproperties.suite101.com/ [29 Oktober 2009].

Puji, Awik., N. Abdulgani, dan R. Febrianto. 2006. Uji Toksisitas Ekstrak Eucheuma alvarezii Terhadap A. salina Sebagai Studi Pendahuluan Potensi Antikanker. Akta Kimindo 2(1): 41– 46.

Raineri, M. Histochemical Localization of Chitin in Larvae of Artemia salina Leach (Phyllopoda). 1981. Italian Journal of Zoology 48 (2): 139 -141.

Rakhmawati, R. 2006. Isolasi dan Identifikasi Struktur Senyawa Bioaktif Daun Laban (Vitex pubescens Vahl.) Asal Kawasan Hutan Kalimantan Barat. Tesis. Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Remiche, C. and G. Persoone. 2005. The use of Artemia Nauplii for Toxicity Tests. Journal of Ecotoxicology and Environmental Safety 2: 249-255.

Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Penerbit Pustaka Pelajar, Yogyakarta.

Rubinstein, S. 2003. Energy Metabolism In Encyclopedia of Food Sciences & Nutrition. 2nd Edition. Academic Press, USA.

Sadasivan, S., Latha, J.M. Sasikumar, Rajashekaran, S. Shyamal, and Shine. 2006. Hepatoprotective Studies on Hedyotis corymbosa (L.) Lamk. Journal Ethnopharmacology 106 (2): 245-249.

Shahidur, A.R., I. Arslan, R. Saha, N. Talukder, S. Khaleques, and H. Ara. 2006. Bioactivity Guided Cytotoxic Activity of Clitoria ternatea Utilizing Brine Shrimp Lethality Bioassay. Bangladesh J. Physiol. Pharmacol 22(1/2) : 18-21.

Shuzo,T., Y. Masae, M. Kyoko, N. Yukie, and S. Kiyoshi. 1981. Studies on the Herb Medical Materials Used for Some Tumors. II. On the Constituen of Hedyotis corymbosa Lamk. Journal of the Phermaceutical Society of Japan 101 (7): 657-659.

Soemirat, J. 2005. Toksikologi Lingkungan. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.

Sorgeloos, P., C. Remiche, and G. Persoone. 1978. The Use of Artemia Nauplii for Toxicity Test-A Critical Analysis. Journal Ecotoxicology and Environmental Safety 2: 249-255.

Stahl, E. 1985. Analisis Obat Secara Kromatografi Dan Mikroskopi. (diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Iwang Sudiro). Penerbit Institut Teknologi Bandung, Bandung.

Sudarsono. 1999. Asperulosid, Senyawa Iridoid H.corymbosa (L.)Lamk. (Oldenlandia corymbosa L.), Suku Rubiaceae. Majalah Farmasi Indonesia 10 (3): 7.

Sudjadi. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Penerbit Pustaka Belajar, Yogyakarta.

Sukardiman, R. and N.F. Pratiwi. 2004. Uji Praskrining Aktivitas Antikanker Ekstrak Eter dan Ekstrak Metanol Marchantia planiloba Steph. Dengan Metode Uji Kematian Larva Udang dan Profil Densitometri Ekstrak Aktif. Majalah Farmasi Airlangga 4 (3): 97 –100.

Sulistijowati, A. dan D. Gunawan. 2001. Efek Ekstrak daun kembang bulan (Tithonia diversifolia) terhadap Candida albicans serta profil Kromatografinya. Cermin Dunia Kedokteran 130: 32-36.

Sunarni, I. dan Suhartinah. 2003. Uji Toksisitas dan Anti Infeksi Ekstrak Etanol Buah Brucea sumatrana Roxb. Terhadap Larva Udang Artemia salina Leach dan Staphylococcus aereus. Biosmart 5 (4): 65-67.

Tamaru, C.S., H. Ako, R. Paguirigan, Jr. Pang. 2004. Enrichment of Artemia for Use in Freshwater Ornamental Fish Production. http://www.lama.kcc.edu/CSTA/Artemia.htm/ [13 September 2009].

Voight, R. 1994. Buku Pelajaran Teknologi Farmasi Edisi V. (diterjemahkan oleh Soendani). Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.

Wahyuningsih, M.S.H., S. Wahyuono, D. Santoso, J. Setiadi, Soekotjo, Widiastuti, R. Rakhmawati, dan D. Sari. 2008. Eksplorasi Tumbuhan Dari Hutan Kalimantan Tengah Sebagai Sumber Senyawa Bioaktif. Biodiversitas 9 (3): 169-172.

Yamaguchi, H., T. Noshita, Y. Kidachi, H. Umetsu, M. Hayashi, K. Komiyama, S. Funayama, and K. Ryoyama. 2008. Isolation of Ursolic Acid from Apple Peels and its Specifics Efficacy as a Potent Antitumor agent. Journal of Health Science 54 (6): 654-660.

Yim, E.K., M.J. Lee, K.H. Lee, S.J. Um, and J.S. Park. 2006. Antiproliferatif and Antiviral Mechanism of Ursolic Acid and Dexamethasone in Cervical Carcinoma Cell Line. International Journal of Gynecological Cancer 16: 2023-2031.

Zetra, Y. dan P. Prasetya. 2007. Isolasi Senyawa α-Amirin Dari Tumbuhan Beilschmiedia Roxburghiana (Medang) Dan Uji Bioaktivitasnya. Akta Kimindo 3(1): 27 – 32.