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UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
Facultad de Ciencias
Grado en Bioquímica
Trabajo Fin de Grado
ANÁLISIS METABOLÓMICO DE VARIEDADES DULCES Y AMARGAS
DE BELLOTA (QUERCUS ILEX.L) Có digó del TFG: BQ17-17-BBM
Autor: Macedonia Trigueros Peña
07/09/2018
(QUERCUS ILEX.L)
Agradecimientos
En primer lugar me gustaría agradecer a mi tutor Jesús. Ya hace dos años que
me acogistes en tu grupo y me hiciste formar parte de esta preciosa familia. Gracias
por guiarme, por aconsejarme, por apoyarme y animarme tanto a nivel académico
como a nivel personal. Nunca tendré suficientes palabras de agradecimiento para ti.
A Cristina por dedicar su tiempo enseñarme, ayudarme, corregirme y guiarme
en la elaboración de este trabajo con todo el esmero posible. Ese mismo esmero que
pone en su trabajo y que tanto admiro.
A todos los miembros del departamento: Jesús Miguel, Victor, Álvaro, Rosa,
Mari Carmen, Ana Maldonado, Manolo, Lola, Mª Ángeles y Fabiola. Por el buen
ambiente de trabajo, el apoyo recibido y los momentos compartidos.
No me puedo olvidar de quienes han pasado por aquí: Conchi, Kamila, Patricia,
Eugenia, Silvia, Dani, Jeffrey, Maria Luce e Isabel. De todos vosotros me llevo preciosos
recuerdos de los momentos compartidos.
A mis padres, las personas que más adoro en esta vida, por inculcarme el valor
del esfuerzo y el trabajo, y por alentarme siempre a seguir sin mirar atrás. A mi
hermano y a Macarena, por cuidarme, por su apoyo incondicional y por ser dos
alegrías en mi vida.
A mis compañeros de carrera, por convertir esta esta etapa en una de las más
maravillosas de mi vida. En especial a Andrés, por convertirse en la persona más
especial de mi vida.
A mis “estrellás”, el mejor grupo de amigas que cualquiera pueda imaginar. Por
ser mis compañeras en las interminables tardes de biblioteca, por alegraros de corazón
de mis logros, por confiar siempre en mí y por esperarme con los brazos abiertos cada
vez que vuelvo.
Y en definitiva gracias a todas esas personas que han pasado por mi vida y me
alentaron a luchar, a no rendirme y sobre todo, a perseguir mis sueños. Es por vosotros
que hoy estoy aquí.
pág. 2
Índice general
Índice de Ilustraciones ............................................................................................................ 3
Índice de tablas. ...................................................................................................................... 3
Resumen ................................................................................................................................. 4
Palabras clave ......................................................................................................................... 4
Abstract ................................................................................................................................... 5
Key words ................................................................................................................................ 5
Introducción ............................................................................................................................ 6
Materiales y métodos ........................................................................................................... 12
Material vegetal ............................................................................................................ 13
Morfometría y sabor ..................................................................................................... 14
Obtención harina de bellotas ....................................................................................... 15
Análisis por Espectroscopía de Inflarrojo Cercano ....................................................... 15
Extracción de metabolitos ............................................................................................ 16
Análisis por Espectrofotometría Visible (Métodos colorimétricos) ............................. 17
Análisis por Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas ............... 18
Presentación de resultados y discusión ................................................................................ 20
Morfometría y sabor ..................................................................................................... 20
Análisis por métodos colorimétricos ............................................................................ 21
Análisis por Espectroscopía de Inflarrojo Cercano ....................................................... 22
Análisis por Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas ............... 26
Conclusiones ......................................................................................................................... 35
Conclusions ........................................................................................................................... 36
Bibliografía ............................................................................................................................ 37
pág. 3
Índice de Ilustraciones
ILUSTRACIÓN 1.FLUJO DE TRABAJO DE UN EXPERIMENTO METABOLÓMICO 11
ILUSTRACIÓN 2. ETAPAS DEL FLUJO EXPERIMENTAL DEL PRESENTE TRABAJO 13
ILUSTRACIÓN 3 ASPECTO VISUAL DE LOS TRES TIPOS DE BELLOTA EMPLEADOS 14
ILUSTRACIÓN 4. PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE METABOLITOS 16
ILUSTRACION 5. RECTAS DE CALIBRADO 18
ILUSTRACIÓN 6. DIAGRAMAS DE CAJAS DE LOS DISTINTOS PARÁMETROS DETERMINADOS POR NIRS DE LAS
VARIEDADES ANALIZADAS 24
ILUSTRACIÓN 7. MATRIZ DE CORRELACIONES ENTRE LA CARACTERÍSTICA ORGANOLÉPTICA SABOR (DULZOR), LA
CARACTERÍSTICA MORFOMÉTRICA PESO Y LOS DATOS DE COMPOSICIÓN QUÍMICA OBTENIDOS MEDIANTE
NIRS 25
ILUSTRACIÓN 8. CROMATOGRAMAS DE GC-MS DE LAS TRES VARIEDADES DE BELLOTAS ANALIZADAS 27
ILUSTRACIÓN 9. ANÁLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES (PCA) 32
ILUSTRACIÓN 10.HEAT MAP (MAPA DE CALOR) DE LOS METABOLITOS RELACIONADOS CON EL SABOR DULCE
ASIGNADOS A LAS TRES VARIEDADES. 33
Índice de tablas
TABLA 1 PLATAFORMAS TECNOLÓGICAS UTILIZADAS PARA IDENTIFICAR Y CUANTIFICAR METABOLITOS,
VENTAJAS Y LIMITACIONES. 10
TABLA 2. DATOS MORFOMÉTRICOS DE LAS DIFERENTES VARIEDADES ANALIZADAS 20
TABLA 3. CONTENIDO DE AZÚCARES, FENÓLICOS Y AMINOÁCIDOS LIBRES EN EL EXTRACTO DE HARINA DE
BELLOTAS 21
TABLA 4.ANÁLISIS DE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA DE DIFERENTES VARIEDADES DE BELLOTAS MEDIANTE
NIRS 22
TABLA 5. RECOPILACIÓN DE PICOS ELUIDOS, COMPUESTOS ANOTADOS (IDENTIFICADOS Y NO IDENTIFICADOS)
EN CADA VARIEDAD DE BELLOTA 26
TABLA 6 METABOLITOS IDENTIFICADOS POR DIFERENTES BASES DE DATOS CORRESPONDIENTES A LA
FRACCIÓN POLAR 28
TABLA 7. METABOLITOS ASIGNADOS POR LAS DIFERENTES BASES DE DATOS Y CLASIFICADOS EN BASE A SU
NATURALEZA QUÍMICA 34
TABLA 8. METABOLITOS ASIGNADOS POR LAS DIFERENTES BASES DE DATOS QUE TIEN POSIBLE RELACIÓN CON
EL SABOR DULCE 31
TABLA 9. RECOPILACIÓN DE COMPUESTOS DULCES JUNTO A SU VALOR DE PODER EDULCORANTE 34
pág. 4
Resumen
El presente trabajo de fin de grado, “Análisis metabolómico de variedades dulces y
amargas de bellotas (Quercus ilex)” tuvo como objetivo caracterizar el perfil metabolómico
de bellotas de encina (Quercus ilex), establecer diferencias entre procedencias y
correlacionar dicho perfil con la morfometría y sabor del fruto.
Se analizaron bellotas de tres individuos de una misma población (Aldea de Cuenca,
Córdoba). El análisis se llevó a cabo con harina (Espectroscopía de Infrarrojo Cercano) y con
extractos (Espectrofotometría Visible y Cromatografía de Gases Acoplada a Espectrometría
de Masas). Mediante NIRS se cuantificó el contenido en proteínas, grasa, almidón, azúcares,
polifenoles y ácidos grasos, entre otros. Los métodos colorimétricos se utilizaron para
cuantificar aminoácidos libres totales (método Ninhidrina), azúcares reductores (métodos
DNS) y compuestos fenólicos (método Folin-Ciocalteu). Mediante GC-MS se resolvieron e
identificaron metabolitos específicos.
El contenido en las diferentes familias de compuestos o metabolitos individuales
varió entre bellotas de diferente procedencia, morfometría y sabor. Mediante NIRS
encontramos correlaciones estadísticamente significativas tanto positivas como negativas
con el valor de peso seco; entre las primeras, se incluyeron almidón, y entre las segundas,
contenido de proteínas, azúcares y dulzor. El rango de concentración de proteínas fue de
38,89-65,98 mg/g harina, de azúcares de 102,88-131,14 mg/g harina y de polifenoles de
9,48-10,40 mg/g harina. Se encontró un mayor contenido en azúcares en la variedad más
dulce. Los métodos colorimétricos revelaron diferencias estadísticamente significativas solo
en el contenido de compuestos fenólicos.
Mediante cromatografía de gases se resolvieron aproximadamente 120 picos por
muestra, de los que se identificaron 56 compuestos pertenecientes a los siguientes grupos,
aminoácidos, azúcares y derivados, polialcoholes, ácidos grasos y ácidos orgánicos. El perfil
metabolómico varió con el tipo de bellota analizado. Se atribuyó el sabor de la variedad
dulce a la cantidad, variedad y poder edulcorante de los carbohidratos y polialcoholes. Se
observó una correlación negativa entre estos compuestos y el sabor amargo.
Palabras clave: Quercus ilex; Bellota; Metabolómica; NIRS; GC-MS
pág. 5
Abstract
The objetives of this Degree Thesis, "Metabolomic analysis of sweet and bitter
Quercus ilex acorns” was to characterize the metabolites profile of Quercus ilex’s fruits, the
acorns, and to stablish diferencies among varieties of different origin and flavor.
Acorns were sampled from three individuals from the “Aldea de Cuenca” (Cordoba)
provenace. The analysis was conducted with flour (Near-Infrared Spectroscopy) and extracts
(Visible Spectrophotometry and Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry). By
using NIRS, proteins, fat, starch, sugars, polyphenols and fatty acids were quantified. Amino
acids, reducing sugars, and phenols, were quantified by using colorimetric protocols:
Ninhydrin, dinitrosalycilic, and Folin-Ciocalteu. By using CG-MS, individual compounds were
resolved, identified and quantified.
The content in the different families of individual metabolites or individual
compounds varied among acorns of different sources, morphometry and flavor. By using
NIRS we found statistically significant, both positive and negative, correlations between dry
weight and starch (positive), proteins, sugars and sweetness (negative). Protein values
ranged from 38, 89 to 65, 98 mg/g flour, that of sugars 102, 88 to 131, 14 mg/g flour, and
polyphenols of 9, 48 to 0, 40 mg/g flour. Higher sugar content was found in the sweeter
variety. Colorimetric methods revealed statistically significant differences ampong varieties
only in the content of phenolic compounds.
By using gas chromatography, approximately 120 peaks were resolved of which 56
compounds were identified, they belonging to the following groups: amino acids, sugars,
polyalcohols, organic acids and fatty acids. The metabolomic profile varied with the type of
acorn analyzed. The flavor of the sweet variety was attributed to the presence of higher
quantities of carbohydrates and polyalcohols. There was a negative correlation between
these compounds and the bitter flavor.
Keywords: Quercus ilex; Acorn; Metabolomics; NIRS; GC-MS
pág. 6
Introducción
Toda investigación biológica consta de tres elementos fundamentales: el sistema
experimental, el objetivo, pregunta o hipótesis y la metodología. En la presente Tesis de
Grado dichos elementos quedan recogidos en el título de la misma “Análisis metabolómico
de variedades dulces y amargas de bellotas (Quercus ilex): la encina el sistema de estudio, su
metaboloma la pregunta y el uso de una aproximación holística de análisis de biomoléculas,
la metabolómica, la metodología.
El trabajo se encuadra dentro de la línea de investigación sobre aproximaciones
moleculares al estudio de especies forestales (Sghaier-Hammami et al., 2013, Romero-
Rodríguez et al., 2014) que lleva a cabo el Grupo de Investigación “Bioquímica Vegetal y
Agroforestal, Proteómica y Biología de Sistemas” (AGR-164). En trabajos anteriores (López-
Hidalgo, 2016) se usó esta aproximación holística (-ómicas) para caracterizar el perfil
metabolómico de la encina. En dicha aproximación, se emplearon distintas técnicas, desde
las clásicas, basadas en reacciones colorimétricas, hasta otras más actuales, como la
espectroscopía de infrarrojo cercano (NIRS), resonancia magnética nuclear (NMR) y
cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS). Como continuación de
trabajos anteriores (López-Hidalgo, 2016 y 2017) en los que se optimizaron y evaluaron las
diferentes técnicas, en este trabajo se propuso el empleo de GC-MS y NIRS, en la
caracterización del metaboloma de bellota con diferentes morfometrías y propiedades
organolépticas, en concreto sabor. Los datos de metabolómica se integrarán con los
obtenidos mediante otras aproximaciones en la dirección actual de la investigación
biológica, la Biología de Sistemas (López-Hidalgo et al., 2018).
La encina (Quercus ilex subsp. Ballota [Desf.] Samp) es la especie predominante del
bosque mediterráneo, en general, y del ecosistema agrosilvopastoral de la dehesa, en
particular. A pesar de su importancia medioambiental e interés económico, es una gran
desconocida a nivel biológico, en especial desde un punto de vista molecular. Este
desconocimiento, ha conducido a su catalogación como huérfana y recalcitrante, del mismo
modo que ocurre con un gran número de especies forestales (Abril et al., 2011). Dicho
conocimiento resulta de gran importancia de cara a establecer estrategias de conservación,
manejo sostenible y reforestación de ecosistemas forestales. La encina, en particular, y la
dehesa, en general, se ve amenazada por una serie de factores entre los que incluimos la
sobreexplotación, manejo pobre, incendios, árboles envejecidos, falta de regeneración y,
pág. 7
sobre todo, estreses de tipo biótico y abiótico, lo que se ha dado en denominar Síndrome de
la Seca (Jorrín-Novo et al., 2014). Esta situación puede verse agravada en un escenario de
cambio climático.
Esta situación constituye un reto que nos exige actuaciones a todos los niveles, entre
los que la biotecnología puede tener cabida. La biotecnología o tecnología biológica requiere
del conocimiento biológico de las especies, en especial a nivel molecular. De las
posibilidades existentes, como la mejora clásica, transgénesis, mutación y explotación de la
biodiversidad natural, esta última junto con la selección de genotipos “elite” o plus son las
más adecuadas o viables que se pueden utilizar en el ámbito forestal. Este hecho se debe a
las características de las especies forestales (ciclos de vida muy largos y no domesticadas), lo
cual dificulta la aplicación de programas de mejora clásica, así como la posición y percepción
de la sociedad europea frente a los transgénicos. En este escenario, la selección de
individuos con determinadas características fenotípicas, como las de adaptación y tolerancia
a condiciones ambientales adversas (sequía y patógenos, fundamentalmente) (Simova-
Stoilova et al., 2015), sería un logro importante. Para alcanzar dicha meta, el empleo de la
metabolómica puede resultar de especial interés ya que, además de la caracterización de la
diversidad a partir de los perfiles metabolómicos, la catalogación de procedencias y la
selección de individuos élite, podemos identificar compuestos que, por su actividad biológica
y potencial uso aplicado, pueden darle valor añadido a la especie de estudio.
En este trabajo nos centraremos en el estudio metabolómico del fruto de Q. ilex, la
bellota. Es una continuación de los trabajos de López-Hidalgo (2016, 2017), en los que se
puso a punto la metodología. Algunos estudios preliminares han sido recientemente
publicados. (López Hidalgo et al., 2018).
Cómo pregunta u objetivo se planteó conocer si el origen, características
morfométricas y propiedades organolépticas como el sabor, se correlacionan con una
determinada composición y perfil metabólico. Estudios previos han caracterizado
parcialmente la composición química de la bellota y la actividad biológica de extractos
derivados (Jung et al., 2007, Vinha et al., 2016). Un ejemplo ilustrativo son las publicaciones
de Cantos et al. (2003), Karioti et al. (2011) y Yarnes et al. (2006), en las que describe el
empleo de polifenoles para la conservación de alimentos en la industria alimentaria debido a
su carácter antioxidante.
pág. 8
Debido al importante papel del género Quercus en el sector agroalimentario, a causa
de su elevado potencial antioxidante y antibacteriano de diversos extractos alcohólicos
(Güllüce et al., 2004), y su consideración como una fuente rica en fenólicos, como
proantocianidinas y taninos, actualmente ha tornado la visión respecto al fruto de bellota,
tradicionalmente empleado para alimentar al ganado, a un potencial alimento en la dieta
humana, debido a dichas propiedades y a la necesidad de satisfacer la creciente demanda de
alimento por parte de la ascendente población mundial (Vinha et al., 2016). Así pues, la
identificación de estos compuestos empleando técnicas metabolómicas, permiten alcanzar
un mayor conocimiento de los frutos que, a su vez, se puede asociar a dicha variabilidad
fenotípica, así como conocimientos derivados como las propiedades nutricionales, calóricas,
etc.
De este modo, la aproximación experimental para alcanzar dichos objetivos, ha sido
la metabolómica, suponiendo el principal reto de este trabajo. La metabolómica, término
empleado por primera vez por Oliver Fiehn (Fiehn, 1998), es una disciplina relativamente
reciente, en comparación con otras disciplinas como la proteómica o la genómica. En ella, se
persigue abordar el estudio no sesgado de todos los metabolitos presentes en un tejido,
órgano u organismo particular en un momento del desarrollo concreto y bajo unas
condiciones ambientales particulares, permitiendo de esta forma evaluar la contribución de
los factores genéticos y/o ambientales a la modificación del metabolismo (Fiehn, 2001). En
este sentido, la composición metabólica de una planta entera o de un tejido concreto está
directamente vinculada a cambios en la expresión génica (cambios en la composición de
mRNA), y en la síntesis de proteínas y enzimas que catalizan las reacciones químicas que se
producen a nivel celular.
Al igual que el transcriptoma y el proteoma, el metaboloma es dinámico, y
experimenta cambios muy rápidos, aportándonos información sobre el estado celular. No
obstante, a diferencia que los genes y las proteínas, cuyas funciones están sujetas a la
regulación epigenética y a las modificaciones postraduccionales, respectivamente, los
metabolitos actúan como indicadores directos de la actividad bioquímica (Sheth et al., 2014)
y constituyen, por tanto, el verdadero fenotipo de un individuo (Arbona et al., 2013). Por
tanto, la metabolómica está llamada a complementar la información bioquímica obtenida de
los genes y las proteínas, facilitando las reconstrucciones genómicas actuales del
pág. 9
metabolismo y mejorando nuestra comprensión de la biología celular y fisiología de
diferentes sistemas biológicos.
Los diversos metabolitos, que constituyen el metaboloma de un sistema biológico de
estudio, son pequeñas moléculas derivadas de las múltiples y diversas reacciones
enzimáticas que tienen lugar en el metabolismo de un organismo y que forman un grupo de
compuestos de bajo peso molecular (normalmente menores de 1500 Da) que incluyen:
aminoácidos, péptidos, ácidos grasos, lípidos, purinas, pirimidinas, azúcares y otras
moléculas. Esta elevada diversidad de moléculas se refleja en una amplia gama propiedades
físico-químicas diversas como: polaridad, pesos moleculares, presencia de grupos
funcionales, estabilidad, reactividad química y constantes de equilibrio, entre otras
propiedades. Este hecho obliga irremediablemente a la utilización de múltiples plataformas y
configuraciones analíticas que maximicen la cobertura del metaboloma analizado.
Se estima, mediante métodos estadísticos predictivos, que la cantidad total de
metabolitos en el reino vegetal podría variar desde unos 200000 hasta un 1000000 (Dixon et
al., 2003; Afendi et al., 2011), y que de todos ellos entre 140000 y 370000 podrían tener
cierta eficacia en humanos (Afendi et al., 2011). Además de los carbohidratos y ácidos
grasos (metabolitos primarios), se estima que cada especie vegetal concreta es capaz de
producir hasta unos 200000 metabolitos secundarios (Dixon et al., 2003; Pichersky et al.,
2011) tal y como, isoprenoides, fenoles, alcaloides y otros. La biosíntesis y la acumulación de
los metabolitos secundarios muestran una gran especificidad espacio-temporal y son, en
ocasiones, compuestos únicos en ciertas especies vegetales (Sumner et al., 2003, Schawab,
2003, Kim et al., 2015).
Por otro lado, a diferencia de las predicciones que se pueden hacer respecto a la
secuencia y estructura de las proteínas basándonos en la secuencia génica, no podemos
hacer una predicción precisa de la estructura química de los metabolitos. Esto dificulta, aún
más, la identificación. Tal complejidad supone un enorme reto analítico que va a necesitar
avanzadas y poderosas herramientas que permitan la separación y caracterización de los
metabolitos de las muestras.
De manera general, se emplean múltiples metodologías para la detección,
cuantificación y elucidación de la estructura de los metabolitos. En la Tabla 1 se recogen las
principales tecnologías empleadas, así como las ventajas y desventajas asociadas.
pág. 10
Es común emplear e interrelacionar resultados experimentales obtenidos mediante
el uso de diferentes técnicas con el fin de solventar las posibles limitaciones que puede
suponer el usar una única técnica.
Tabla 1 Plataformas tecnológicas utilizadas para identificar y cuantificar metabolitos, ventajas y limitaciones. Tabla adaptada de (Yanes, 2018).
Plataforma Ventajas Limitaciones
GC-MS Alta reproducibilidad y sensibilidad analítica Facilidad en la identificación analítica
Se requiere que los compuestos sean volátiles en el momento del análisis (se deben derivatizar los no volátiles) y térmicamente estables
LC-MS Gran cobertura de metabolitos detectados Alta sensibilidad
Importantes requerimientos bioinformáticos para el procesado de datos La identificación de metabolitos no es directa
CE-MS Bajo consumo de cantidad de muestra
Solo aplicable a compuestos polares cargados Limitada robustez y reproducibilidad analítica
RMN Altamente cuantitativa y reproducible Mínima preparación de la muestra
Poca sensibilidad
MALDI-MS
Permite estudiar la localización de compuestos en tejidos biológicos con resolución de hasta 10 µm Análisis muy rápidos
Poco cuantitativa y reproducible
NIRS
Rápida No destructivo Aporta información de componentes concretos presentes en una mezcla compleja
Se requiere de calibraciones y generación de ecuaciones previas por personal especializado y de seguimiento y actualización de los modelos Obligatoriamente son análisis mediante métodos de referencia
En este trabajo combinaremos dos plataformas analíticas: GC-MS y NIRS, junto con
las determinaciones colorimétricas. El empleo de GC-MS nos permitió realizar un estudio de
alta reproducibilidad y sensibilidad analítica, así como facilidad en cuanto a la identificación,
debido a la existencia de bases de datos espectrales. Por otra parte, NIRS nos proporciona
una visión más general de los componentes de la muestra, un estudio rápido, no destructivo
y que no requiere de separaciones previas al análisis.
El flujo de trabajo para un análisis metabolómico está formado, al menos, por 5
etapas fundamentales y no prescindibles: (1) preparación de la muestra, (2) extracción de
compuestos; (3) separación y detección; (4) adquisición y análisis de datos, incluyendo la
identificación, cuantificación y empleo de métodos estadísticos; (5) interpretación biológica
de los resultados (Ilustración 1)
pág. 11
La Espectroscopía de Infrarrojo Cercano (NIRS) analiza la absorción de energía, en la
región que comprende el segmento de luz de longitudes de ondas entre 800 y 2600 nm del
espectro electromagnético, por los grupos funcionales de las moléculas de la muestra. Su
uso generalizado se debe principalmente a que permite realizar análisis cualitativos y
cuantitativos de multicomponentes en muestras, con un mínimo de preparación. Esta
metodología, además, se caracteriza por ser no destructiva, rápida, no emplear reactivos
químicos, disminuir el error del operador y requerir menos mano de obra que los métodos
tradicionales empleados en el laboratorio. Sin embargo, se debe tener presente que es un
método secundario, lo cual significa que debe ser calibrado contra otras metodologías
(Osborne, 2006).
La Espectrometría de Masas (MS) es una técnica analítica que permite la adquisición
de datos espectrales en función de la relación masa/carga (m/z) y la intensidad relativa de
los elementos analizados. Las muestras biológicas deben ser previamente ionizadas para que
el espectrómetro pueda generar los picos de señal de cada metabolito detectado. Una vez
ionizados, estos compuestos generarán patrones de picos específicos y únicos que
Ilustración 1.Flujo de trabajo de un experimento metabolómico. Incluye las siguientes etapas: adaptado de Alonso et al; 2015).
pág. 12
constituyen la huella o el perfil de la molécula original. En metabolómica, generalmente, se
requiere un paso previo de separación debido a la elevada complejidad que presentan las
muestra, adicionalmente esto permite focalizar el análisis en un determinado conjunto de
compuestos. Las técnicas de separación comúnmente empleadas suelen ser las columnas de
cromatografía de líquidos y gases (LC y GC, respectivamente) (Theodoridis et al., 2011).
Estas técnicas de separación, altamente extendidas, se basan en la capacidad de interacción
de los diferentes metabolitos contenidos en la muestra con los materiales adsorbentes (la
fase estacionaria) de la columna cromatográfica. De este modo, los metabolitos con
diferentes propiedades químicas, y, por tanto, con diferentes afinidades por la columna,
abandonarán la columna a diferentes tiempos, denominados, tiempo de retención (RT). Este
parámetro se emplea junto a los valores de la relación masa/carga que se obtienen en el
espectro de masas, generando la información requerida para la identificación de los
metabolitos en base a la utilización de las distintas bases de datos espectrales disponibles.
(LipidBank, LIPID MAPS, Metlin Database, NIST, MetaCyc, Golm Metabolome Database, etc).
La combinación de ambas técnicas origina la denominada LC-MS y GC-MS.
Para la realización de este trabajo de investigación, desde un punto de vista
interdisciplinar, se ha requerido de conceptos científicos y aproximaciones experimentales
del campo de la biología y la química (desde aspectos fisiológicos del organismo de estudio y
propiedades físicas y químicas de los componentes moleculares) para alcanzar la
comprensión de los mecanismos moleculares en los sistemas biológicos complejos.
Los estudios metabolómicos, previamente realizados, han tenido como objetivo
identificar y cuantificar compuestos presentes en la bellota, tal y como, fenólicos y ácidos
grasos (Cantos et al., 2003). Nuestro trabajo se orienta siguiendo esta línea metodológica
preestablecida. Adicionalmente y de manera novedosa, se pretende establecer una relación
entre el perfil metabolómico de las distintas poblaciones de bellotas y sus características
organolépticas, principalmente con el sabor.
Materiales y métodos
El flujo de trabajo utilizado en la presente investigación se esquematiza en la
Ilustración 2.
pág. 13
Material vegetal
Las bellotas se recolectaron entre el 7 y 9 de diciembre de 2017, de 3 encinas
diferentes de una misma población de Q. ilex (Aldea de Cuenca, Córdoba) (coordenadas
38°20.960'N 5°29.145'O; 38°12.093'N 5°19.277'O; 38°19.750'N 5°33.282'O). Tras su transporte al
laboratorio se procedió a su clasificación, limpieza y almacenamiento.
Siguiendo el protocolo previamente establecido (Bonner et al., 1987), los frutos se
sumergieron en agua y se descartaron aquellos que flotaban ya que estos eran frutos
dañados. Seguidamente para su esterilización, se sumergieron en una solución de agua:
hipoclorito de sodio al 2,5 % (1:1; v:v) conteniendo unas gotas de Tween 20, dejándose en
dicha solución durante 20 minutos. Finalmente, se lavaron con abundante agua, se secaron a
temperatura ambiente, se empaquetaron en bolsas de polietileno cerradas herméticamente
y se almacenaron a 4 oC en una cámara frigorífica (Caliskan, 2014, Corbineau et al., 2014).
Ilustración 2. Etapas del flujo experimental del presente trabajo. En primer lugar, se realizó una cata ciega para asignar sabor a las bellotas y se determinaron los parámetros morfométricos. Se preparó harina para el análisis por NIRS y la obtención de extractos. En dichos extractos se determinó el contenido en aminoácidos, azúcares reductores y fenólicos por métodos colorimétricos. El perfil metabolómico se analizó, finalmente, por GC-MS.
pág. 14
Morfometría y sabor
Se determinaron una serie de parámetros morfométricos de los frutos: longitud,
volumen, peso fresco y peso seco (Ilustración 3). Se emplearon 5 bellotas de cada grupo, en
buen estado y presentando un tamaño homogéneo. La longitud se determinó colocando las
bellotas sobre papel milimetrado y realizando fotos individuales a cada una. El volumen se
obtuvo a partir del agua desplazada tras la inmersión del fruto en una probeta de 20 mL. El
peso fresco de las bellotas se determinó con una balanza analítica (Mettler AJ150). Para
medir el peso seco, se depositó el fruto previamente en una estufa a 65 oC durante 96 horas.
Respecto al análisis estadístico de los datos morfométricos, se realizó un estudio de
normalidad mediante el test de Kolmogorov-Smirnov Shapiro-Wilk, empleando SPSS (Pasw
Statistics 2018 versión 18.0.0) (Park, 2008), y a continuación, con Metaboanalyst, 4.0
(http://www.metaboanalyst.ca/) un test paramétrico (ANOVA) (Cuevas et al., 2004) y otro
test no paramétrico (test de Friedman) (Sheldon et al., 1996), para elucidar posibles
diferencias significativas entre variedades.
Para determinar el sabor más o menos dulce, se realizó una cata ciega con 20
personas. Se estableció una escala numérica de 0 a 5, siendo 5 la más dulce.
Ilustración 3. Aspecto visual de los tres tipos de bellota empleados. Las tres variedades de bellotas recolectadas procedían de tres árboles de la población Aldea de Cuenca (Córdoba). De derecha a izquierda se muestran las imágenes de los frutos de mayor a menor sabor dulce. (Amarga-Neutra-Dulce).
pág. 15
Obtención de la harina de bellotas
Los cotiledones (incluyendo embriones) se trituraron con un molino de cuchillas
(Molino seco IKA A10), con nitrógeno líquido y realizando 3 pulsos de 5 segundos de
duración para evitar que la muestra se calentara, hasta la obtención de un polvo fino
homogéneo. A continuación, el material molido obtenido se congeló con nitrógeno líquido y
posteriormente se liofilizó (Liofilizador de mesa LABOTEC) durante 24 horas. Las muestras se
almacenaron en una estufa a 30 oC (Valero et al., 2010). Este material se utilizó
directamente para el análisis NIRS.
Análisis por Espectroscopía de Infrarrojo Cercano
Mediante NIRS se obtuvo la siguiente información sobre cada muestra: contenido de
ceniza, proteína, grasa, almidón, azúcares, ácido palmítico (C16:0), ácido esteárico (C18:0),
ácido oleico (C18:1), ácido linoleico (C18:2), digestibilidad y energía. Para el análisis se
empleó un espectrofotómetro Foss-NIRSystems 6500 System II (Foss-NIRSystems Inc., Silver
Spring) (Unidad de Espectroscopía NIR/MIR en el Servicio central de apoyo a la Investigación
(SCAI) de la Universidad de Córdoba (http://www.uco.es/servicios/scai/nir.html) constituido
por un módulo transportador rectangular de muestra de ¼ y dos detectores que analizan dos
regiones del espectro (visible e inflarrojo cercano). Los datos espectrales se adquiriendo
cada 2 nm y se registraron y analizaron con el software WinISI 1.50 (Infrasoft International,
Port Matilda, PA, USA). Finalmente para la cuantificación de los compuestos se emplearon
algoritmos descritos en el trabajo de Valero (Valero et al., 2010).
El análisis estadístico consistió en un estudio poblacional de normalidad, mediante el
test de Kolmogorov-Smirnov Shapiro-Wilk con SPSS (Pasw statistics 2018 versión 18.0.0)
(Park, 2008). A continuación, se realizó un análisis paramétrico (ANOVA) (Cuevas et al.,
2004) y un análisis no paramétrico (test de Friedman) (Sheldon et al., 1996) empleando el
software online Metaboanalyst, 4.0 (http://www.metaboanalyst.ca/) para verificar si
existían diferencias estadísticamente significativas entre los diferentes tipos de bellotas
analizados. Adicionalmente, se realizó un test de Tukey para conocer entre qué variedades
(agrupadas de dos en dos) existían diferencias estadísticamente significativas (Xia et al.,
2011).
pág. 16
Extracción de metabolitos
Para los análisis mediante GC-MS y por métodos colorimétricos, se realizó una
extracción mediante un procedimiento clásico de dobles solventes y siguiendo la
metodología descrita por el Dr. Luis Valledor (Universidad de Oviedo), con algunas
modificaciones especificada en López-Hidalgo (2016, 2017). El proceso de extracción se
detalla en la Ilustración 4.
Ilustración 4. Protocolo de extracción de metabolitos.
pág. 17
Resumidamente, se añadieron 600 µL de la mezcla de extracción (cloroformo:
metanol: agua) a 50 mg de tejido liofilizado. Se agitó con vortex y se sometió a tres pulsos de
sonicación y 10 minutos en baño de ultrasonidos. Las muestras se centrifugaron a 4 oC
durante 4 minutos a 14000 rpm y el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo. Al pellet
resultante se le añadieron 400 µL de mezcla de extracción y se realizó el mismo
procedimiento.
Análisis por Espectrofotometría Visible (Métodos colorimétricos)
Mediante métodos colorimétricos se realizó la cuantificación en placa de tres grupos
de moléculas: azúcares reductores, aminoácidos libres y polifenoles (Ilustración 5).
Para la cuantificación de azúcares se utilizó la prueba del ácido 3,5-dinitrosalicílico
(DNS) (Miller, 1959), para aminoácidos libres Ninhidrina (Smith y Agiza, 1951) y para
compuestos fenólicos el método de Folin-Ciocalteu (Ainsworth et al., 2007).
Como compuestos patrones de referencia para la realización de la recta de calibración se
utilizaron: glucosa (para azúcares), ácido clorogénico (para compuestos fenólicos) y treonina
(para aminoácidos libres). Las medidas de absorbancia (570, 575 y 725 nm para azúcares,
aminoácidos libres y compuestos fenólicos, respectivamente) se transformaron en valores
de concentración utilizando los coeficientes de extinción (ε) obtenidos a partir de su
respectiva curva de calibrado con los patrones reseñados (ε glucosa = 0,0106 mM; ε ácido
clorogénico = 0,0071 mg/mL; ε treonina = 23,574 µM).
Se llevó a cabo un tratamiento estadístico de los datos, incluyendo test de
normalidad Kolmogorov-Smirnov Shapiro-Wilk (Park, 2008), seguido de un análisis
paramétrico ANOVA (Cuevas et al., 2004) para comprobar si existían diferencias
estadísticamente significativas entre las diferentes variedades de bellotas analizados.
pág. 18
Análisis por Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas
Los extractos de metabolitos obtenidos se secaron empleando el concentrador
SpeedVac (Concentrator plus, Eppendorf). El residuo seco se resuspendió en metanol,
seguido de un pulso en el vortex o baño de ultrasonidos para favorecer la disolución. La
derivatización se llevó a cabo añadiendo 20 µL de mezcla de metoximación (10 mg
clorhidrato de metoxiamina en 250 µL de piridina). La mezcla se incubó durante minutos
a una temperatura de C en un agitador térmico. Para la sililación de las muestras se
añade 60 µL de MSTFA (N-metil-N-(trimetilsilil) trifluoroacetamida, Sigma-Aldrich) a cada
una y se incuban durante 60 minutos a 37 oC en un agitador térmico. A continuación, se
sometieron las muestras a centrifugación durante 3 minutos a 20000 g y finalmente, se
transfiere el sobrenadante a los microviales de GC.
Para el análisis de los extractos, se siguió el procedimiento y metodología
previamente descrita por el grupo del Dr. Luis Valledor (Meijón et al., 2016, Furuhashi et al.,
2012), realizando algunas modificaciones, tal y como se especifican en López-Hidalgo (2016,
2017).
Ilustración 5. Rectas de calibrado. A) Recta de calibrado de glucosa. Se empleó para determinar la concentración (mM) de azúcares reductores en los extractos de metabolitos. Las ecuaciones de las rectas se obtuvieron a partir de la media y desviación estándar de 3 réplicas técnicas. Las ecuaciones resultantes se indican en la figura. Para azúcares reductores (A) (mM), y=0,0106X; R2=0,9479, compuestos fenólicos (B) (mg/mL), y=0,0071X; R2=0,9432 y aminoácidos libres (C) (μM), y=23,574x; R2=0,9936.
pág. 19
Las medidas de GC-MS se realizaron en un triple cuadrupolo (TSQ Quantum GC,
Thermo) disponible en el servicio de metabolómica del Servicio Central de Apoyo a la
Investigación (SCAI-UCO, http://www.uco.es/probiveag/proyectos.html). El volumen de
inyección de cada muestra fue de 1 µL y se realizó la separación por cromatografía de gases
mediante una columna capilar de tipo HP-5MS (30m x 0,25 mm x 0,25 mm, Agilent
Techonologies). La temperatura del inyector fue de 230 oC y el caudal del proceso
cromatográfico fue de 1,2 mL/min. Para la fracción polar analizada y durante la separación
cromatográfica, la temperatura del horno se incrementó paulatinamente de 70 oC a 310 oC.
Posteriormente, tras la separación, los valores de temperatura ascendieron a 320 oC durante
10 minutos. El intervalo de tiempo de detección fue de 6,16 a 38,92 minutos. El análisis de
masas (m/z) se llevó a cabo con un método de ionización de impacto electrónico (EI) a 70 eV
en intervalos de escaneado de 40-800 m/z.
Para el análisis y procesamiento de datos obtenidos por GC-MS se empleó el software
AMDIS (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System;
http://www.amdis.net/). Se realizó un alineamiento de los cromatogramas y se filtraron los
espectros de masas estableciendo un límite de intensidad de 6E03. Adicionalmente se
suavizaron los picos y se deconvolucionaron empleando el algoritmo de Local Minimum
Search. Seguidamente, mediante el software MZmine 2.24 (http://mzmine.github.io/), se
alinearon los cromatogramas empleando el algoritmo de RANSAC con una tolerancia de 3
ppm y 0,1 minutos de tiempo de retención. A continuación, se extrajeron las áreas de picos
de los archivos espectrales empleando el software OPENChrom
(https://www.openchrom.net/) y se realizó la cuantificación relativa de los metabolitos
anotados mediante sus áreas de pico ion cuantificador. Picos correspondientes a las 3
réplicas técnicas de cada tipo de bellota. Los valores de áreas de pico para cada metabolito
fueron normalizados con el sumatorio del valor de área de picos total en cada muestra.
Posteriormente, se aplicó una transformación por logaritmos.
Para la identificación de los metabolitos se compararon los espectros con los
disponibles en bases de datos (Alkane, Fiehn library 1 y 2, Gölm Metabolome Database, GC-
TSQ, MoSys y NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library), empleando el motor de búsqueda
AMDIS). Los compuestos anotados se registraron junto a sus tiempos de retención, masas
espectrales (ion cuantificador y 2 iones cualificadores) y áreas de picos.
pág. 20
Para el análisis estadístico se utilizaron dos plataformas: SPSS (Pasw statistics 2018
versión 18.0.0) y el software online Metaboanalyst 4.0 (http://www.metaboanalyst.ca/).
Ambos programas se emplearon para estudios de normalidad (Park, 2008), test
paramétricos (Cuevas et al., 2004) y test no paramétricos (Sheldon et al., 1996).
Adicionalmente, Metaboanalyst permitió realizar análisis de componentes principales (PCA),
heat maps (mapas de calor) y matrices de correlación (Xia et al., 2011).
Presentación de resultados y discusión
Mediante técnicas de bioquímica clásica de cuantificación de compuestos y las
modernas aproximaciones holísticas de, NIRS y GC-MS, se ha pretendido analizar el perfil
metabolómico de bellotas de diferente origen, morfometría y sabor. Se pretendió
correlacionar el fenotipo de la bellota con la composición química, tanto desde un punto de
vista cuantitativo como cualitativo. Se emplearon frutos procedentes de árboles de la
población Aldea de Cuenca (Córdoba) que tenían diferente tamaño, forma, peso y sabor
(Tabla 2).
Morfometría y sabor
El análisis estadístico de los parámetros analizados (Tabla 3) rebeló que existían
diferencias estadísticamente significativas de todos ellos, entre las diferentes variedades.
Tabla 2 Datos morfométricos de las diferentes variedades analizadas. Se muestran los resultados en valores medio ± desviación estándar correspondiente a 5 réplicas biológicas para cada variedad. Los parámetros determinados fueron peso fresco (g), peso seco (g), longitud (mm) y volumen (mL). Para determinar la existencia de diferencias significativamente estadísticas se realizó un análisis estadístico mediante un test paramétrico (ANOVA). Las variables con diferencias estadísticamente significativas entre variedades (p ≤ . 5) se anotaron con *.
Variedad de bellota Peso Fresco (g) Peso Seco (g)¹ Longitud (mm) Volumen (mL)
Neutra 6,09 ± 0,77* 20,77 57,4 ± 4,77* 5,4 ± 0,55*
Amarga 12,36 ± 2,31* 38,83 58,2 ± 2,77* 10,4 ± 1,14*
Dulce 3,33 ± 0,62* 10,36 35,2 ± 1,30* 3,2 ± 0,45* (1) No se tienen datos de peso seco individual porque las muestras se pesaron agrupadas y por tanto no se realizó análisis estadístico de este parámetro.
El análisis estadístico de los parámetros analizados (peso fresco, longitud y volumen)
rebeló que existían diferencias estadísticamente significativas de todos ellos, entre
variedades (Tabla 2). Las bellotas de la variedad amarga son las que presentaron mayor peso
y tamaño, mientras que, las dulces resultaron ser las de valores más bajos. La variedad
neutra exhibió características morfológicas intermedias entre las otras dos variedades.
pág. 21
Longitud, ancho, diámetro y peso fueron los parámetros seleccionados en algunos estudios
morfométricos similares (Barzdajn, 2002; Valero et al., 2012).
Análisis por métodos colorimétricos
En el análisis colorimétrico se determinó el contenido (µg equivalentes de compuesto
de referencia/g harina) en azúcares, fenólicos y aminoácidos libres (Tabla 3).
Tabla 3. Contenido de azúcares, fenólicos y aminoácidos libres en el extracto de harina de bellotas. Se muestran los resultados en valores medio ± desviación estándar correspondiente a tres réplicas por variedad (dulce, amarga y neutra). Unidades de azúcares (μg equivalentes de glucosa por g harina liofilizada), compuestos fenólicos (μg equivalentes de ácido clorogénico por g harina liofilizada) y aminoácidos libres (μg equivalentes de treonina por g harina liofilizada). Para determinar la existencia de diferencias significativamente estadísticas se realizó un análisis estadístico mediante un test paramétrico (ANOVA). Las variables con diferencias estadísticamente significativas entre variedades (p ≤ . 5) se anotaron con *.
Variedad de bellota
Azúcares
(µg equ. Glucosa/g Harina)
Fenólicos
(µg equ. A. Clorogénico /g Harina)
Aminoácidos libres
(µg equ. Treonina/g Harina)
Neutro 431,23 ± 53,35 184,28 ± 23,04* 0,021 ± 0,006
Amarga 439,23 ± 45,05 186,50 ± 8,16* 0,018 ± 0,004
Dulce 424,20 ± 92,36 240,99 ± 24,14* 0,024 ± 0,004
Los compuestos mayoritarios presentes en todas las variedades fueron los azúcares,
con un rango de valores medio de 424,20 - 439,23 μg equivalentes de glucosa por g de
harina, seguido por los fenólicos con un rango medio de 184,28 - 240,99 μg equivalentes de
ácido clorogénico por g de harina. Finalmente, los aminoácidos libres son el compuesto
minoritario en el extracto con un rango de valores medios de 0,018 - 0,024 μg equivalentes
de treonina por g de harina.
El análisis estadístico mostró diferencias estadísticamente significativas (p ≤ . 5) en
el contenido de compuestos fenólicos entre las tres variedades analizadas, siendo la
variedad dulce la que presentó la mayor cantidad de estos compuestos. Por otra parte, no se
encontraron diferencias estadísticamente significativas, entre variedades, en el contenido de
azúcares y aminoácidos libres. Los valores de fenólicos obtenidos son similares a los
descritos previamente por otros investigadores, como Cantos et al. (2003) que obtuvo
valores comprendidos entre 574,7 y 2,4 µg/g y López-Hidalgo (2016) que registró valores
comprendidos entre 518,0 a 296,0 µg equivalente de ácido clorogénico /g Harina. Sin
embargo, respecto al contenido en azúcares se observaron valores superiores a los
pág. 22
publicados previamente por Midilli (2008), que fueron de 94 µg/g y valores inferiores en la
cantidad de aminoácidos en comparación a los presentados por Özcan (2006), 1,93 - 0,46
µg/g. Estas diferencias pudieron deberse al protocolo de extracción empleado, al método
empleado para el análisis, al material de partida e incluso a errores en el desarrollo analítico.
Análisis por Espectroscopía de Infrarrojo Cercano
Mediante el análisis NIRS se determinó el contenido (mg/ g de harina) de ceniza,
proteína, grasa, almidón, azúcares, fibra, polifenoles, varios ácidos grasos (ácido palmítico,
ácido esteárico, ácido oleico y ácido linoleico), así como, la digestibilidad y la capacidad
calorífica (Kcal/g) (Tabla 4). Esta determinación se realizó a partir de valores de absorbancia
procedentes de la harina de bellota, en un rango de longitud de onda entre 400 nm y 2500
nm, y mediante el empleo de algoritmos obtenidos a partir de ensayos de valoración previos
(Valero et al., 2010).
Tabla 4: Análisis de la composición química de diferentes variedades de bellotas mediante NIRS. Se muestran los resultados en valores medios ± desviación estándar correspondiente a doce réplicas biológicas por individuo, neutra, dulce y amarga. Todos los datos están expresados en mg por g de harina liofilizada (exceptuando ácidos grasos, expresados en mg por g de ácidos grasos totales). Para el análisis estadístico de los datos se realizó un test paramétrico (test de ANOVA) y otro test no paramétrico (test de Friedman) con la finalidad de determinar la existencia de diferencias estadísticamente significativas. Las variables con diferencias estadísticamente significativas entre variedades (p ≤ . 5) se anotaron con *.
Variedad de bellota
Cenizas (mg/g harina)
Proteína (mg/ g harina)
Grasa (mg/g harina)
Almidón (mg/g harina)
Azúcares (mg/g harina)
Neutra 14,47 ± 0,86* 60,03 ± 4,07* 130,66 ± 5,24* 575,22 ± 9,13* 102,88 ± 10,75*
Amarga 16,05 ± 1,92* 38,89 ±4,03* 115,18 ± 12,44* 612,85 ± 15,55* 107,54 ± 13,48*
Dulce 18,22 ± 1,08* 65,98 ± 2,04* 95,25 ± 7,24* 566,61 ± 6,38* 131,14 ± 15,51*
Continuación tabla 4
Variedad de bellota
Fibra Bruta (mg/ g harina)
Polifenoles (mg/ g harina)
Á. Palmítico (mg/g de grasa total)
Á. Esteárico (mg/g de grasa total)
Neutra 22,78 ± 0,18* 10,49± 0,77 201,95 ± 9,57* 29,20 ± 3,43*
Amarga 21,82 ± 0,34* 10,44 ± 1,88 193,03 ± 14,24* 27,33 ± 1,92*
Dulce 21,92 ± 0,20* 9,48 ± 0,20 217,12 ± 6,70* 31,72 ± 2,12*
Continuación tabla 4
Variedad de bellota
Á. Oleico (mg/g de grasa total)
Á. Linoleico (mg/g de grasa total)
Digestibilidad (mg/g harina)
Energía (kcal/g)
Neutra 615,35 ± 25,32* 188,51 ± 13,11* 616,76 ± 28,09* 4,83 ± 0,03*
Amarga 645,78 ± 23,66* 162,04 ± 32,44* 569,77 ± 34,43* 4,73 ± 0,07*
Dulce 591,97 ± 22,65* 186,30 ± 10,73* 671,03 ± 16,06* 4,66 ± 0,07*
El análisis estadístico rebeló diferencias estadísticamente significativas (p ≤ . 5)
entre muestras en la cantidad de cenizas, proteína, grasa, almidón, azúcares, fibra bruta,
pág. 23
polifenoles, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, digestibilidad y
energía. Esto se puede apreciar en la Ilustración 6 (marcada con *). Estos resultados
concuerdan con los reportados previamente por Valero et al. (2010) y López-Hidalgo (2016),
esto confirma la precisión de la técnica.
Los componentes mayoritarios en las tres variedades fueron el almidón y los
azúcares. Respecto al contenido graso, el ácido graso mayoritario en los frutos fue el ácido
oleico y el minoritario el ácido esteárico.
La variedad dulce posee el mayor contenido de cenizas, azúcares, proteínas, ácido
palmítico y ácido esteárico; y el menor contenido en polifenoles, almidón y ácido oleico. La
variedad amarga posee el mayor porcentaje de almidón y ácido oleico; y el menor
porcentaje de proteínas, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico.
Se observaron diferencias estadísticamente significativas (p ≤ . 5) entre variedad
dulce y amarga, en el contenido de proteínas, de grasa, de almidón, de azúcares, de ácido
palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, y digestibilidad. Adicionalmente, el
análisis de la cantidad de azúcares, mediante el test de Tukey (Xia et al., 2011), reveló
diferencias estadísticamente significativas en la variedad dulce respecto a las otras dos.
pág. 24
Se realizó una matriz de correlaciones (Ilustración 7) para mostrar posibles relaciones
entre el parámetro morfométrico peso seco, el perfil metabolómico obtenido por NIRS y el
dulzor.
Ilustración 6. Diagramas de caja de los distintos parámetros medidos por NIRS de las variedades de bellotas analizadas. A) Cenizas, B) Proteína bruta, C) Almidón, D) Azúcares, E) Fibra bruta, F) Digestibilidad, G) Energía, H) Grasa bruta, I) Ácido Esteárico, J) Ácido Linoleico, K) Ácido Oleico, L) Ácido Palmítico. El diagrama de caja nos informa, mediante las líneas que sobresalen, del límite superior e inferior. La línea horizontal transversal a la caja, corresponde a la mediana. La caja, en sí, está constituida por los valores localizados entre el primer y tercer cuartil. Los valores atípicos aparecer representados por los símbolos “o” (atípicos medios) y por “O” (atípicos extremos). Los casos estadísticamente significativos se han marcado con *.
* *
*
*
*
*
*
* *
* * *
pág. 25
Previamente, otros autores han establecido correlaciones entre características
morfométricas y composición química (Valero et al., 2010; Valero et al., 2011 y López-
Hidalgo , 2016).
Existe cierta correlación positiva entre el sabor dulce y el contenido de azúcares (r2 =
0,42926), así como, una correlación negativa entre la dulzura y la presencia de polifenoles (r2
= -0,14684). En contraste a lo encontrado en estudios previos (Valero et al., 2010; Valero et
al., 2011 y López-Hidalgo et al., 2016) se observó una correlación negativa entre el peso y la
cantidad de proteína (r2 = -0,88637) y una correlación positiva entre el peso y el almidón (r2 =
0,83376). Este último fenómeno puede deberse a diferencias en las condiciones climáticas
en un determinado año de cosecha, así como a su diferente procedencia.
En contraste con los datos colorimétricos, mediante NIRS no se detectaron
diferencias estadísticamente significativas en el contenido de compuestos fenólicos.
Respecto al contenido de azúcares, mediante colorimetría no se observaron diferencias, sí se
encontraron dichas diferencias mediante NIRS.
Ilustración 7. Matriz de correlaciones entre la característica organoléptica sabor (dulzor), la característica morfométrica peso y los datos de composición química obtenidos mediante NIRS. Los valores de la escalan van de -1 a 1. Los valores de r2 próximos 1 indican una correlación positiva (azul), mientras que, los valores de r próximos a -1 indican una correlación negativa (rojo). Los valores de r2 próximos a 0 indican ausencia de correlación. Los valores de r2 fueron obtenidos mediante el test de correlación de Pearson entre las variables.
pág. 26
Análisis por Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas
Ni los métodos colorimétricos, ni el análisis mediante NIRS aportan información
sobre los compuestos individuales presentes en las muestras. La identificación de
metabolitos individuales requiere de una etapa previa de purificación de los mismos, tal y
como la cromatografía líquida o cromatografía de gases, que puede acoplarse a una etapa
posterior de identificación y cuantificación, tal y como, la espectrometría de masas. En este
estudio, partiendo de los extractos de la harina se realizó un análisis por GC-MS. Mediante
los tiempos de retención, los datos espectrales m/z y de la búsqueda en bases de datos, se
identificaron algunos compuestos presentes en las muestras.
A partir de los tiempos de retención y valores m/z se detectó un promedio de 120
picos en cada variedad (Tabla 5). Se eliminaron los picos presentes en la muestra blanco
(picos correspondientes a los compuestos de extracción y a residuos de la columna). A
continuación, mediante la búsqueda en bases de datos (Alkane, Fiehn library 1 y 2, Gölm
Metabolome Database, GC-TSQ, MoSys y NIST), empleando algoritmos de búsqueda
integrados en el programa AMDIS, se asignó un total de 67 compuestos (56 identificados y
11 no identificados) (Tablas 5 y 6). Algunas de estas moléculas fueron comunes entre
variedades y otras exclusivas. Tras este filtrado, el porcentaje de los metabolitos anotados
fue de un 48 %. De los metabolitos anotados, un 15 % se identificaron en las bases de datos,
como no identificados. Este porcentaje refleja la necesidad de la mejora y refinamiento de
las bases de datos de metabolitos (Schymanski et al., 2017).
Tabla 5. Recopilación de picos eluidos, compuestos anotados (identificados y no identificados) en cada variedad de bellota.
Variedad de
bellota
No de picos
eluidos
Compuestos
anotados
Compuestos
identificados
Compuestos no
identificados
Neutra 119 57 50 7
Amarga 120 59 53 6
Dulce 127 61 56 5
El total de los picos eluidos de cada variedad analizada se aprecian en los
cromatogramas de GC-MS mostrados en la Ilustración 8.
pág. 27
Ilustración 8. Cromatogramas de GC-MS de las tres variedades de bellotas analizadas. En el eje x se representa el tiempo de retención en minutos, de 0 a 46 minutos), y en el eje y los valores de intensidad de 0 a 4.0E9.
pág. 28
En los cromatogramas se encontraron diferencias en los perfiles metabolómicos de
las variedades de bellota. Destacando, la fracción de tiempo de 14 a 16 minutos. En dicho
sector del cromatograma se observaron diferencias en el número e intensidad de picos, esto
sugiere variaciones en la presencia y cantidad de ciertos metabolitos como, ácido fosfórico,
leucina, prolina, isoleucina, ácido γ-lactona-D-eritrónico y ácido málico. De forma similar,
entre los minutos 20 a 24 se observan diferencias que corresponden a variaciones en el
contenido de ácidos orgánicos (AÑADIR ÁCIDO) entre las variedades.
En la Tabla 6 se muestra el total de metabolitos anotados, con sus respectivas
características definitorias, como el tiempo de retención, los iones detectados (ion
cuantificador e iones cualificadores), la fórmula y la masa exacta del compuesto.
Tabla 6 Metabolitos identificados por diferentes bases de datos correspondientes a la fracción polar. Para cada compuesto se recoge el tiempo de retención (RT) en la columna cromatográfica, los iones mayoritarios, la fórmula y la masa exacta en Daltons. La asignación de metabolitos se realizó por comparación de los perfiles espectrales de los compuestos con bases de datos (Alkane, Fiehn library 1 y 2, Gölm Metabolome Database, GC-TSQ, MoSys y NIST). La fórmula y masa exacta de los compuestos se obtuvo de la base de datos KEGG.
Nombre del compuesto
(Identificación KEGG)
Etiqueta RT (min) Fragmentos
principales (m/z)
Fórmula Masa exacta
(Da)
Ácido láctico (C00186) M1 6,27 117 191 219 C3H6O3 90,08
Glicina (C00037) M5 9,35 102 176 204 C2H5NO2 75,07
Butiro-1,4-lactámico- M7 10,01 128 142 157 C4H4O2 84,06
Ácido propanoico (C00163)
M9 10,82 177 218 233 C3H6O2 74.08
Ácido (R)-3-Hidroxibutirico (C01089)
M10 11,00 73 204 233 C4H8O3 104,10
Valina (C00183) M2 12,86 144 218 246 C5H11NO2 117,15
Acido 2-Butanoico (C00246)
M13 13,72 75 100 130 C4H8O2 88,11
Ácido fosfórico (C00009) M15 14,64 267 283 299 H3PO4 98,00
Leucina (C00123) M8 14,66 158 232 260 C6H13NO2 131,17
Piridoxamina-5-fosfato (C00647)
M16 14,72 133 227 283 C8H13N2O5P 248,17
Acetamida (C06244) M17 15,13 75 116 131 C2H5NO 59,07
Prolina (C00148) M11 15,22 142 216 244 C5H9NO2 115,13
Isoleucina (C00407) M12 15,23 158 159 232 C6H13NO2 131,17
Ácido γ-lactona-D-eritrónico
M51 15,27 101 190 219 C4H6O4 118,09
Propano-1,2-diol M67 15,30 117 176 206 C3H8O2 76,09
Butano M47 15,32 133 205 231 C4H10 58,08
Ácido málico (C00149) M4 15,53 83 148 205 C4H6O5 134,09
Ácido glicérico (C00818) M61 16,32 189 292 307 C3H6O4 106,08
Alanina (C00041) M3 16,85 188 262 291 C3H7NO2 89,09
pág. 29
Continuación tabla 6
Ácido fumárico (C00122) M56 16,88 201 215 245 C4H4O4 116,07
Serina (C00065) M14 17,09 204 278 306 C3H7NO3 105,09
Ácido treonico-1,4-lactona
M72 17,26 101 247 262 C4H6O4 118,088
Treonina (C00188) M18 17,71 117 218 321 C4H9NO3 119,12
Ácido piroglutámico (C01879)
M36 20,59 156 258 273 C5H7NO3 129,12
Oxoprolina (C01877) M66 20,60 156 230 258 C5H7NO3 129,12
Ácido aspártico (C00049) M33 20,72 232 306 334 C4H7NO4 133,1
Ácido 4-Aminobutirico (GABA) (C00334)
M43 20,83 174 288 304 C4H9NO2 103,12
Ácido treónico M71 21,40 292 379 409 C4H8O5 136,08
Ácido 2-Hidroxiglutárico M34 21,86 129 321 349 C5H8O5 148,11
Ácido 2-cetoglutarico M42 21,87 129 229 304 C5H6O5 146,1
Ácido eritrónico M54 22,12 205 438 453 C4H6O4 118,09
Fenilalanina (C00079) M64 22,69 218 266 294 C9H11NO2 165,19
Ácido glutámico (C00025) M59 22,73 246 320 348 C5H9NO4 147,13
D-Lyxono-1,4-lactona M52 22,77 129 231 259 C5H8O5 148,11
D-(+)-Ribono-1,4-lactona M50 23,21 217 349 364 C5H8O5 148,11
Ácido γ-lactona-L-arabinónico
M37 23,21 133 349 364 C5H8O5 148,114
Ácido 3-oxalo-málico (C01990)
M31 23,29 133 200 292 C6H6O8 206,11
Asparagina (C00152) M32 23,66 116 258 334 C4H8N2O3 132,12
Ribitol (C00474) M69 24,60 117 317 C5H12O5 152,00
Ácido lyxonico-1,4-lactona
M63 24,80 117 349 364 C5H9O4 132,99
Quercetin-3-beta-D-glucosido
M68 24,90 217 257 305 C21H20O12 464,38
Ácido cis-aconítico (C00417)
M48 25,14 133 346 377 C6H6O6 174,02
Pentitol M39 25,15 103 307 319 C5H12O5 152,15
Glutamina(C00064) M60 25,52 156 301 362 C5H10N2O3 146,14
Ácido Ribónico (C01685) M40 25,52 217 421 393 C5H10O6 166,05
Fucitol M62 25,65 217 333 436 C6H14O5 166,17
Ciclohexeno-1,2,3,4-tetraepoxido
M49 26,40 291 307 331 C14H30O4 369,67
Ácido cítrico (C00158) M44 26,43 273 421 465 C6H8O7 192,13
Ácido ascórbico (C00072) M46 26,77 157 264 316 C6H8O6 176,12
Viburnitol (C08259) M30 27,13 217 419 524 C6H12O5 164,07
Fructosa (C00095) M35 27,37 103 390 464 C6H12O6 180,16
Glucosa (C00031) M38 27,84 319 344 364 C6H12O6 180,06
D-glucopiranósido M55 28,64 204 317 361 C6H12O6 180,06
Ácido gálico (C01424) M57 28,98 281 443 458 C7H6O5 170,02
Mio-inositol (C00137) M29 31,63 417 432 507 C6H12O6 180,06
Ácido esteárico(C01530) M65 34,63 129 341 356 C18H36O2 284,27
pág. 30
Se observa una amplia variedad de metabolitos, que se han clasificado en las diversas
familias químicas (aminoácidos, polialcoholes, ácidos grasos, ácidos orgánicos, azúcares y
derivados, y otros) mostradas en la Tabla 7. Entre todas las familias establecidas, se destaca
la constituida por carbohidratos, polialcoholes y derivados (Tabla 8).
La composición de harina de bellota se muestra en la USDA (Departamento de
Agricultura de los Estados Unidos)
(https://ndb.nal.usda.gov/ndb/foods/show/12059?n1=%7BQv%3D1%7D&fgcd=&man=&lfac
et=&count=&max=25&sort=default&qlookup=Nuts%2C+acorns%2C+dried&offset=&format=
Full&new=&measureby=&Qv=1&ds=&qt=&qp=&qa=&qn=&q=&ing=). Con respecto a esta
base de datos, se han encontrado algunas diferencias cualitativas respecto a su contenido en
algunos aminoácidos (asparagina no está registrada) y mediante nuestro análisis de GC-MS
no hemos detectado arginina y lisina.
Otros compuestos de interés identificados en el análisis GC-MS, es el ácido 4-
aminobutírico (GABA), cuya composición resultó ser más abundante en la semilla de bellota
que en cualquier otro tejido según López-Hidalgo (2017). Este aminoácido no proteico actúa
como señalizador del estado del contenido de nitrógeno en la germinación de semillas
(Roberts, 2007).
Tabla 7. Metabolitos asignados por las diferentes bases de datos y clasificados en base a su naturaleza química. Se recogen los 57 metabolitos asignados junto a su código KEGG1 y agrupados por familias.1 Los compuestos que aparecen sin código KEGG es porque bien no lo tienen asignado o bien no se encontró.
Familia química Compuestos (KEGG)
Ácidos grasos Ácido esteárico (C01530)
Ácidos orgánicos
Ácido ascórbico (C00072) Ácido aspártico (C00049)
Ácido cis-aconítico (C00417) Ácido cítrico (C00158)
Ácido eritrónico Ácido fosfórico (C00009) Ácido fumárico (C00122)
Ácido gálico (C01424) Ácido glicérico (C00258)
Acido glutámico (C00025) Ácido láctico (C00186)
Ácido lyxonico-1,4-lactona Ácido málico (C00149)
Ácido piroglutámico (C01879)
Ácido propanoico (C00163) Ácido ribónico (C01685)
Acido (R)-3-Hidroxibutirico (C01089)
Ácido treónico Ácido treonico-1,4-lactona Ácido γ-Amino-n-Butírico
Ácido γ-lactona-D-eritrónico Ácido γ-lactona-L-arabinónico Ácido 2-Butanoico (C00246)
Acido 2-cetoglutarico (C00026) Ácido 2-Hidroxiglutárico
Ácido 3-oxalo-málico (C01990)
Alcoholes
Propano-1,2-diol
pág. 31
Continuación Tabla7
Aminoácidos proteicos
Asparagina (C00152) Alanina (C00041)
Fenilalanina (C00079) Glicina (C00037)
Glutamina(C00064) Isoleucina (C00407)
Leucina (C00123) Prolina (C00148)
Serina (C00065) Treonina (C00188)
Valina (C00183)
Aminoácidos no proteicos
Ácido 4-aminobutírico (GABA) (C00334)
Otros y no asignados
Acetamida (C06244) Mio-inositol (C00137) Butiro-1,4-lactámico Oxoprolina (C01877)
11 compuestos no presentes en las bases de datos
Piridoxamina-5-fosfato Butano
Ciclohexeno-1,2,3,4-tetraepoxido
Para el establecimiento de las correlaciones entre el perfil metabolómico y la
característica organoléptica, sabor, nos hemos centrado en la presencia tanto desde un
punto de vista cualitativo y cuantitativo.
Desde el punto de vista cualitativo (Tabla 8) destacamos la presencia de fructosa y
viburmitol en todas las variedades analizadas. En cambio, se observan diferencias como que
la variedad dulce presenta una mayor diversidad de dichos compuestos (nombrar algún
único) y la variedad amarga presentó el menor número de carbohidratos.
Tabla 8. Metabolitos asignados por las diferentes bases de datos que tienen posible relación con el sabor dulce. Se muestran los metabolitos para cada variedaad y agrupados en dos grupos que son, carbohidratos y polialcoholes (responsables de sabor dulce) y derivados de carbohidratos (posibles relacionados con el dulzor). Cada metabolito asignado queda recogido junto a su código KEGG. Los compuestos que aparecen sin código KEGG es porque bien no lo tienen asignado o bien no se encontró.
Variedad de bellota Neutra Amarga Dulce
Carbohidratos y polialcoholes
Fructosa (C00095) Viburnitol (C08259)
Fructosa (C00095) Viburnitol (C08259)
Fructosa (C00095) Viburnitol (C08259)
Ribitol (C00474)
Ribitol (C00474)
Quercetin-3-beta-D-glucosido
D-glucopiranosido Fucitol
Glucosa (C00031)
Derivados de carbohidratos
D-(+)-Ribono-1,4-
lactona D-Lyxono-1,4-lactona
Una vez establecidas las características del perfil metabolómico de las variedades de
bellota, se analizó si dichos perfiles permitieron su diferenciación mediante un análisis
estadístico multivariante. De modo que, a partir de los metabolitos identificados y sus
pág. 32
valores de área cromatográfica se llevó a cabo un análisis de componentes principales (PCA)
(Ilustración 9).
El análisis de PCA (ilustración 9. A) nos permitió observar que las variedades de
bellota se diferencian en función de su perfil metabolómico descrito mediante GC-MS. A su
vez, nos mostró la existencia de similitud entre las réplicas técnicas. La similitud de las
réplicas técnicas nos informa de la consistencia del método de extracción y de la
metodología de análisis empleada. La reproducibilidad del análisis mediante GC-MS ha sido
evaluada y se obtuvieron porcentajes entre 71 % (datos sin normalizar) y 79 % (datos
normalizados) (t’Kindt et al; 2009).
La Ilustración 9. B refleja los metabolitos que definen y diferencian cada variedad de
bellota analizada. De los cuales, se destaca la mayor contribución del quercetin-3-beta-D-
glucosido (M68), en la variedad neutra, y una mayor contribución del D-Lyxono-1,4-lactona
(M52), en la variedad dulce.
Ilustración 9. Análisis de componentes principales (PCA). PCA de los 68 compuestos detectados en las diferentes variedades de bellotas. A) Representación gráfica de las componentes. Los ejes corresponden a las dos primeras componentes PC1 (66,6 %) y PC2 (32,8 %). Variedad neutra (x azules), variedad dulce (cruces naranjas) y variedad amarga (triángulos rojos). B) Representación gráfica de las cargas (Loadings). Se muestran con flechas rojas los compuestos empleados para la realización del modelo. La longitud de la flecha roja indica la relación entre las variables que componen el modelo.
A B
Dulce
Neutra
Amarga
pág. 33
Para analizar las diferencias cuantitativas entre variedades en base al contenido de
polialcoholes, carbohidratos y derivados, se realizó un heat map (mapa de calor) (Ilustración
10).
Se observa que la variedad amarga solo posee cantidades destacables de dos de los
metabolitos analizados en este mapa, pentinol (M39) y D-(+)-Ribono-1,4.lactona (M50). La
variedad neutra solo posee proporciones elevadas de D-glucopiranósido (M55) y Quercetín-
3-beta-D-glucósido (M68). La variedad dulce muestra en su composición elevadas cantidades
de viburnitol (M30), D-Lyxono-1,4-lactona (M52), fucitol (M62), fructosa (M35), ribitol (M69)
y glucosa (M38).
Comparativamente, la variedad dulce es la que posee la mayor proporción global de
los metabolitos seleccionados. Dichos metabolitos (polialcoholes, carbohidratos y derivados)
pueden correlacionarse con el sabor dulce mediante el parámetro poder edulcorante. Este
parámetro se define como la capacidad de una sustancia para producir sabor dulce al ser
disuelto en agua, tomando como referencia la sacarosa (valor 1) (Magwaza et al., 2015).
Ilustración 10.Heat map (mapa de calor) de los metabolitos relacionados con el sabor dulce asignados a las tres variedades. Este tipo de gráfico nos muestra la cantidad de un determinado compuesto en una muestra. Los valores de la escalan van de 2 (rojo) a -2 (azul). Se representan los valores de las trés replicas por variedad. El color de la celda corresponde con el valor de área de pico normalizado. Variedad dulce, naranja; variedad amarga, rojo y variedad neutra, azul.
pág. 34
La Tabla 9 muestra la puntuación de poder edulcorante para algunas de las
sustancias identificadas mediante GC-MS en alguna o en todas las variedades.
El mayor contenido de fructosa, ribitol, fucitol y glucosa observada en la variedad
dulce mediante el heat map, junto con los valores de poder edulcorante que se otorgan a las
citadas sustancias (1,5-1,8; 0,5-0,7; 0,5-0,7 y 0,5 respectivamente) permite deducir que esta
variedad debe su sabor tanto a la cantidad como al dulzor de metabolitos presentes en la
bellota.
Por otra parte, en la variedad amarga los dos metabolitos destacados por el heat map
(pentinol (M39) y D-(+)-Ribono-1,4.lactona), resultaron presentar un bajo poder edulcorante
cada uno (0,5-0,7).
Tabla 9. Recopilación de compuestos dulce junto a su valor de poder edulcorante. (Adaptación de Chattopadhyay et al., 2014). En esta tabla se recoge información sobre el poder edulcorante de ciertos metabolitos encontrados en las distintas variedades.
Compuesto Poder edulcorante
Fructosa 1,50-1,80
Glucosa 0,5
Sacarosa 1
Polialcoholes 0,5-0,7
Cabe destacar que no existió similitud entre los datos obtenidos por GC-MS y los
datos colorimétricos, pues la determinación de azúcares mediante la prueba del ácido 3,5-
dinitrosalicílico (DNS) indicó la variedad amarga era la que poseía mayor cantidad de
carbohidratos y la variedad dulce la que menor, mientras que GC-MS indicó lo contrario.
Por otra parte, los datos obtenidos mediante NIRS y CG-MS son consistentes. Los
resultados de NIRS sugieren que cuantitativamente la variedad dulce poseía una mayor
cantidad de azúcares, esto corrobora los resultados obtenidos mediante GC-MS que nos
informaron de la presencia de una variedad y cantidad mayor de carbohidratos y derivados,
en dicha variedad. Estos datos cuantitativos y cualitativos, combinados con los parámetros
de poder edulcorante sugieren que la variedad dulce debe su sabor, a la cantidad y
diversidad y al poder edulcorante de los metabolitos presentes.
Respecto a la variedad amarga, no se encontró mediante GC-MS ningún metabolito
específico responsable directamente del sabor amargo. Dicho sabor parece originarse por la
baja cantidad, variedad y poder edulcorante de compuestos responsables del dulzor, que
pág. 35
como consecuencia dejaron expuestos al paladar compuestos de naturaleza más amarga y/o
astringentes como los fenólicos detectados por NIRS (10,44 mg/g de harina) (Figura 6).
Finalmente, en contraste con las otras dos variedades, la variedad neutra poseía una
cantidad de fenólicos similar, una diversidad de metabolitos responsables del dulzor
intermedia y gran cantidad de dos carbohidratos. Esto nos lleva a pensar que en la variedad
neutra existió un equilibrio entre amargor y dulzura que culminó en un sabor neutro.
Conclusiones
I. El contenido en las diferentes familias de compuestos o metabolitos individuales
varió entre bellotas de diferente procedencia, morfometría y sabor.
II. Mediante NIRS encontramos correlaciones estadísticamente significativas tanto
positivas como negativas con el valor de peso seco; entre las primeras, se incluyeron
almidón, y entre las segundas, contenido de proteínas, azúcares y dulzor.
III. El rango de concentración de proteínas, detectado mediante NIRS, fue de 38,89-
65,98 mg/g harina, de azúcares de 102,88-131,14 mg/g harina y de polifenoles de
9,48-10,40 mg/g harina.
IV. Los métodos colorimétricos revelaron diferencias estadísticamente significativas solo
en el contenido de compuestos fenólicos.
V. Mediante cromatografía de gases se resolvieron aproximadamente 120 picos por
muestra. Se identificaron 56 compuestos pertenecientes a la familia de aminoácidos,
azúcares y derivados, polialcoholes, ácidos grasos y ácidos orgánicos.
VI. Se observaron variaciones en el perfil metabolómico entre diferentes tipos de
bellotas. Los resultados de composición química y características organolépticas
revelaron que el sabor de la variedad dulce estarían asociados a varios factores,
como la mayor presencia de carbohidratos y polialcoholes responsables del dulzor y
al poder edulcorante de estos. El sabor amargo parece ser debido a una baja
proporción y variedad de azúcares y polialcoholes. El sabor neutro aparece cuando
existe un equilibrio entre compuestos amargos y compuestos dulces.
pág. 36
Conclusions
I. The content in the different families of compounds or individual metabolites varied
among acorns of different sources, morphometry and flavor.
II. By using NIRS we found statistically significant, both positive and negative,
correlations between dry weight and starch (positive), proteins, sugars and
sweetness (negative).
III. NIRS reported protein values ranged from 38, 89 to 65, 98 mg/g flour, that of sugars
102, 88 to 131, 14 mg/g flour, and polyphenols of 9, 48 to 0, 40 mg/g flour.
IV. Colorimetric methods revealed statistically significant differences among varieties
only in the content of phenolic compounds.
V. By using gas chromatography, approximately 120 peaks were resolved of which 56
compounds were identified, they belonging to the following groups: amino acids,
sugars, polyalcohols, organic acids and fatty acids.
VI. The metabolomic profile varied with the type of acorn analyzed. The flavor of the
sweet variety was attributed to the presence of higher quantities of carbohydrates
and polyalcohols. The bitter flavor seems to be due to a low proportion and variety of
sugars and polyalcohols. The neutral flavor appears when there is a balance between
bitter and sweet compounds.
pág. 37
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