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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA E MEDICINA LEGAL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA MÉDICA INGRID CORDEIRO SAMPAIO AVALIAÇÃO DO TRANSPORTE TRANSMEMBRÂNICO DE GLICOSE, GLUTAMINA E ALANIL-GLUTAMINA EM ÍLEO DE CAMUNDONGOS NUTRIDOS E DESNUTRIDOS INFECTADOS POR ESCHERICHIA COLI ENTEROPATOGÊNICA FORTALEZA 2013

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA E MEDICINA LEGAL

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA MÉDICA

INGRID CORDEIRO SAMPAIO

AVALIAÇÃO DO TRANSPORTE TRANSMEMBRÂNICO DE GLICOSE,

GLUTAMINA E ALANIL-GLUTAMINA EM ÍLEO DE CAMUNDONGOS

NUTRIDOS E DESNUTRIDOS INFECTADOS POR ESCHERICHIA COLI

ENTEROPATOGÊNICA

FORTALEZA

2013

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INGRID CORDEIRO SAMPAIO

AVALIAÇÃO DO TRANSPORTE TRANSMEMBRÂNICO DE GLICOSE, GLUTAMINA

E ALANIL-GLUTAMINA EM ÍLEO DE CAMUNDONGOS NUTRIDOS E

DESNUTRIDOS INFECTADOS POR ESCHERICHIA COLI ENTEROPATOGÊNICA

Dissertação de mestrado apresentada ao

Programa Pós-Graduação em Microbiologia

Médica da Faculdade de Medicina da

Universidade Federal do Ceará, como requisito

parcial para obtenção do Título de Mestre em

Microbiologia Médica. Área de concentração:

Genética de fatores de virulência em

patógenos gastrointestinais.

Orientador: Prof. Dr. Aldo Ângelo Moreira

Lima

Co-orientador: Prof. Dr. Alberto Melo Soares

FORTALEZA

2013

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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

Universidade Federal do Ceará

Biblioteca de Ciências da Saúde

S181a Sampaio, Ingrid Cordeiro.

Avaliação do transporte transmembrânico de glicose, glutamina e alanil-glutamina em íleo de

camundongos nutridos e desnutridos infectados por Escherichia coli enteropatogênica / Ingrid

Cordeiro Sampaio. – 2013.

92 f. : il., enc. ; 30 cm.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,

Departamento de Patologia e Medicina Legal, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia

Médica, Mestrado em Microbiologia Médica, Fortaleza, 2014.

Área de Concentração: Genética de Fatores de Virulência em Patógenos Gastrointestinais.

Orientação: Prof. Dr. Aldo Ângelo Moreira Lima.

Coorientação: Prof. Dr. Alberto Melo Soares.

1. Desnutrição. 2. Escherichia coli Enteropatogênica. 3. Absorção Intestinal. I. Título.

CDD 612.30832

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A Deus, que por sua luz, glória e amor

infinito, desperta no coração do homem o

desejo de aprender sempre mais e me

concedeu a perseverança para desenvolver este

projeto.

Aos meus pais, Paulo Roberto e Antonia, que

vivem a alegria dos meus sonhos

concretizados, compartilhando comigo todos

os momentos, com imensurável amor.

À minha avó, Raimunda Neuza (in

memoriam), que sempre acompanhou todos os

passos de nossa família carinhosamente

mesmo com dificuldade, com emoção e amor.

Às minhas primas, Jaqueline e Érika que me

apoiaram desde o início deste meu objetivo.

Aos meus tios, José Neto, Maria Helena e

Veríssima pela força transmitida com suas

palavras e orações.

AGRADECIMENTO

Aos Profs. Dr. Aldo Ângelo Moreira Lima e Dr. Alberto Melo Soares, pelo

incentivo, transmissão de conhecimentos e valiosa orientação durante a pesquisa e execução

deste projeto, com grande admiração e respeito.

Ao Prof. Dr. Alexandre Havt Bindá, pelo auxílio nos experimentos de Biologia

Molecular.

Ao Prof. Ms. Said Gonçalves da Cruz Fonseca, pela amizade que nasceu a

partir do desenvolvimento do projeto pedagógico desenvolvido junto ao CAPES-REUNI e

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seu precioso apoio. Além de ter possibilitado a produção da ração para os animais utilizados

neste projeto no Laboratório de Farmacotécnica.

À cara colega e colaboradora Dra. Marjorie Moreira Guedes pela sua

cooperação nas atividades no laboratório e conhecimentos em microbiologia compartilhados.

À Dra. Ila Fernanda Lima, pelo auxílio nos experimentos microbiológicos.

À Sra. Teresinha Freire França por seu fundamental auxílio técnico, ao Sr.

Jose Amadeus Souza pelo apoio, amizade e por não deixar faltar material para que este

trabalho fosse realizado, e ao Sr. Jociê Andrade da Silva que garantiu o suprimento de

animais.

À Sra. Kátia Lima Nogueira e ao Sr. Charles Melo pela administração e

responsabilidade na garantia da compra dos materiais e pelas inúmeras vezes que me

ajudaram na cópia e impressão de documentos dos experimentos.

Aos estudantes de iniciação científica Cássia Roque e Pedro Henrique Quintela

pelo apoio e cooperação nos experimentos e momentos de alegria.

Aos colegas Ms. Paloma Araújo, Ms. Vinícios Alves pela amizade e partilha de

conhecimentos.

Às mestrandas Rosa Elayne Freitas e Ana Carolina Santos pelos ensinamentos

em extração, pela amizade e pelos momentos de descontração.

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“Não se deve julgar a pessoa alguma, porque

julgar pertence só a Deus. E quando se notar

alguma coisa que nos leve a reprovar o

próximo, não o imitemos; porém, vendo a

parte boa que a pessoa tem, não incriminemos

e a remetamos a Deus dizendo:

‘Deus é quem sabe’.”

Santo Antonio de Sant’Anna Galvão

RESUMO

A Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) e a desnutrição são uma das maiores causadoras

de morbidade e mortalidade infantil em países subdesenvolvidos. Este estudo propõe avaliar o

transporte de Na+-glicose, Na+-glutamina e H+-alanil-glutamina através da medida da corrente

de curto circuito (CCC) e da resistência transepitelial (Rt) no íleo de camundongos nutridos e

desnutridos infectados com EPEC. Camundongos albinos de 28 a 35 dias de idade foram

submetidos a uma dieta padrão ou a uma dieta multideficiente em proteínas, lipídeos e

minerais, a DBR. Parte desses animais foi submetida à infecção aguda por 3 horas de contato

direto com a bactéria em alça ligada. Para comparações, o mesmo foi feito utilizando a

bactéria comensal Escherichia coli HS. Foram anestesiados com ketamina e xilazina por via

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intramuscular. O íleo foi removido, dissecado da membrana serosa, aberto com bisturi,

segmentado e montado em câmaras de Üssing. O mRNA total foi extraído e, a partir deste, foi

feito o cDNA a fim de observar, por PCR em tempo real, se a desnutrição causou alteração na

transcrição dos genes SGLT-1, SN-2, CAT-1, PEPT-1, CFTR, ZO-1, Claudina-1 e Claudina-2

e Ocludina. Em paralelo, análise por microscopia confocal das proteínas SGLT-1, SN-1, SN-2

e PEPT-1 foi realizada. Os resultados mostraram que a EPEC reduziu a área dos vilos apenas

durante a desnutrição (1,339 ± 0,1 mm²). Mesmo assim, não alterou a CCC basal (67,41 ± 2,0

µA/cm²), enquanto que a EPEC, a E. coli HS e a desnutrição, quando isoladas, reduziram a

CCC basal (65,96 ± 5,1 µA/cm², 72,51 ± 7,7 µA/cm² e 74,23 ± 5,7 µA/cm²). Porém, a

desnutrição não alterou os sistemas de transporte de glicose (ΔCCC = 324,7 ± 45,42 µA/cm²),

glutamina (ΔCCC = 236,7 ± 43,32 µA/cm²) e alanil-glutamina (ΔCCC = 282,6 ± 39,10

µA/cm²) devido ao aumento na expressão da transcrição gênica de SGLT-1 e PEPT-1 e ao

aumento da síntese de SGLT-1, SN-1, SN-2 e PEPT-1. Já a EPEC alterou o transporte de

glicose (ΔCCC = 102,6 ± 38,3 µA/cm²), e a E. Coli HS diminuiu o transporte de glicose

(ΔCCC = 103,5 ± 106,6 µA/cm²) e de glutamina (ΔCCC = 123,4 ± 106,5 µA/cm²), enquanto

que, nos animais desnutridos, a EPEC reduziu o transporte de glutamina (ΔCCC = 62,10 ±

42,7 µA/cm²), e E. Coli HS reduziu os níveis de absorção de glicose (ΔCCC = 84,40 ± 178,3

µA/cm²). Portanto, é possível que esses substratos favoreçam a recuperação da membrana e

aliviem o ciclo vicioso de desnutrição, infecção e diarreia através do aumento da absorção

(CCC) e recuperação da normalidade da permeabilidade intestinal (Rt). Porém, deve-se

avaliar o estado nutricional do hospedeiro e se há presença de patógenos associados, a fim de

eleger o melhor substrato para cada caso.

Palavras-chave: Desnutrição. Escherichia coli enteropatogênica. Absorção intestinal.

ABSTRACT

Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and malnutrition are a major cause of morbidity

and mortality in developing countries. The purpose of this study was to evaluate the transport

of Na+-glucose, Na+-glutamine and H+-alanyl-glutamine by measurement of short circuit

current (Isc) and transepithelial resistance (TR) in the ileum of nourished and malnourished

mice infected with EPEC. Albino mice of approximately 35 days of age were subjected to a

standard diet or a diet deficient in proteins, lipids and minerals, the Regional Basic Diet

(RBD). Of these animals was submitted to acute infection for 3 hours of direct contact with

bacteria in isolated intestinal loop. For comparison, the same was done using the commensal

bacterium Escherichia coli HS. They were anesthetized with ketamine and xylazine

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intramuscularly. The ileum was removed, dissected the serous membrane, open with a scalpel,

segmented and mounted in Üssing chambers. The total mRNA was extracted and, from this,

cDNA was done to analyze if malnutrition caused alterations in gene transcription of

transporters as SGLT-1, SN-2, CAT-1, PEPT-1 and CFTR and related proteins to cell

junctions such as ZO-1, Claudin-1 and Claudin-2 and occludin. At the same time,

immunofluorescence analysis of proteins SGLT-1, SN-1, SN-2 and PEPT-1 were performed.

The results showed that EPEC reduced the area of the villi only during malnutrition (1,339 ±

0,1 mm²). But, the basal CCC did not alter (67,41 ± 2,0 μA/ cm²), while EPEC, E. coli HS and

malnutrition, when isolated, reduced the basal CCC (65,96 ± 5,1 μA/ cm ², 72,51 ± 7,7 μA/

cm ² and 74,23 ± 5,7 μA/ cm²). However, malnutrition did not change the transport systems of

glucose (ΔCCC = 324,7 ± 45,42 µA/cm²), glutamine (ΔCCC = 236.7 ± 43.32 μA/ cm²) and

alanyl-glutamine (ΔCCC = 282,6 ± 39,10 μA/ cm²), because occured an increase in gene

expression of SGLT-1 and PEPT-1 and increased synthesis of SGLT-1, SN-1, SN-2 and

PEPT-1. Already EPEC altered glucose transport (ΔCCC = 102,6 ± 38,3 μA/ cm²), and E. coli

HS decreased transport of glucose (ΔCCC = 103,5 ± 106,6 μA/ cm²) and glutamine (ΔCCC =

123,4 ± 106,5 μA/ cm²), whereas in undernourished animals EPEC reduced transport of

glutamine (ΔCCC = 62,10 ± 42,7 μA/ cm²), and E. coli HS reduced levels of glucose

absorption (ΔCCC = 84,40 ± 178,3 μA/ cm²). Therefore, these substrates may facilitate the

recovery of the membrane and alleviate the vicious cycle of malnutrition, infection and

diarrhea by increasing absorption (CCC) and the maintenance of normal intestinal

permeability (Rt), but before using them for the treatment it is essential to evaluate the

nutritional status of the host and the presence of pathogens in their intestinal epithelium.

Keyword: Malnutrition. Enteropathogenic Escherichia coli. Intestinal absorption.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Modelo clássico das vias de transporte de glicose...................................................17

Figura 2 - Dependência indireta dos cátions Na+ no mecanismo absortivo de peptídeo H+-

dependente.............................................................................................................................19

Figura 3 - Esquema das interações proteicas nas junções celulares.........................................29

Figura 4 - Crescimento de camundongos (Mus musculus) Swiss, machos, 28 a 35 dias de

idade submetidos à ração comercial e à dieta básica regional durante 7 dias...........................46

Figura 5 - Microfotografia de íleo infectado com 108 ufc/mL de EPEC 2348/69 corado com

Giemsa....................................................................................................................................47

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Figura 6 - Microfotografia de íleo infectado com 108 ufc/mL de E. coli HS corado com

Giemsa......................................................................................................................................47

Figura 7 - Área dos vilos intestinais na presença de desnutrição e/ou infecção.......................48

Figura 8 - Variação da profundidade das criptas na presença de infecção e/ou desnutrição....49

Figura 9 - Comparação da CCC basal entre os grupos nutridos e desnutridos inoculados ou

não com E. coli enteropatogênica ou HS................................................................................50

Figura 10 – Curva dose-resposta cumulativa da glicose. A: Grupo nutrido sem infecção. B:

grupo desnutrido sem infecção...............................................................................................52

Figura 11 - Curva dose-resposta cumulativa da glicose. A: Grupo nutrido infectado com

Escherichia coli enteropatogênica (EPEC). B: Grupo desnutrido infectado com Escherichia

coli enteropatogênica (EPEC)...................................................................................................53

Figura 12 - Curva dose-resposta cumulativa da glicose. A: Grupo nutrido infectado com

Escherichia coli HS. B: Grupo desnutrido infectado com Escherichia coli HS.......................54

Figura 13 - Curva dose-resposta cumultiva da glutamina. A: Grupo nutrido sem infecção. B:

Grupo desnutrido sem infecção................................................................................................ 56

Figura 14 - Curva dose-resposta cumultiva da glutamina. A: Grupo nutrido infectado com

Escherichia coli enteropatogênica (EPEC). B: Grupo desnutrido infectado com Escherichia

coli enteropatogênica (EPEC)...................................................................................................57

Figura 15 - Curva dose-resposta cumultiva da glutamina. A: Grupo nutrido infectado com

Escherichia coli HS. B: Grupo desnutrido infectado com Escherichia coli HS.......................58

Figura 16 - Curva dose-resposta cumultiva da alanil-glutamina. A: Grupo nutrido sem

infecção. B: Grupo desnutrido sem infecção............................................................................60

Figura 17 - Curva dose-resposta cumultiva da alanil-glutamina. A: Grupo nutrido infectado

com Escherichia coli enteropatogênica (EPEC). B: Grupo desnutrido infectado com

Escherichia coli enteropatogênica (EPEC).............................................................................61

Figura 18 - Curva dose-resposta cumultiva da alanil-glutamina. A: Grupo nutrido infectado

com Escherichia coli HS. B: Grupo desnutrido infectado com Escherichia coli HS............62

Figura 19 - Variação da resistência transepitelial basal............................................................63

Figura 20 - Expressão relativa da transcrição do gene SGLT-1 nas células intestinais após

7 dias de alimentação com dieta básica regional....................................................................64

Figura 21 A - Expressão relativa da transcrição do gene SN-2 nas células intestinais

desnutridas................................................................................................................................64

Figura 21 B - Expressão relativa da transcrição do gene CAT-1 nos enterócitos desnutridos.64

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Figura 22 - Expressão relativa da transcrição do gene PEPT-1 nas células intestinais

desnutridas................................................................................................................................65

Figura 23 – Expressão relativa da transcrição do gene CFTR nas células intestinais

desnutridas................................................................................................................................65

Figura 24 – Expressão relativa da transcrição do gene ZO-1 nas células intestinais

desnutridas................................................................................................................................66

Figura 25 - Expressão relativa da transcrição do gene claudina-1 nas células intestinais

desnutridas................................................................................................................................66

Figura 26 - Expressão relativa da transcrição do gene claudina-2 nas células intestinais

desnutridas................................................................................................................................67

Figura 27 - Expressão relativa da transcrição do gene ocludina nas células intestinais

desnutridas................................................................................................................................67

Figura 28 - Imunofluorescência da proteína SGLT-1 observada através de microscopia

confocal.....................................................................................................................................68

Figura 29 - Diferença da intensidade de fluorescência da proteína SGLT-1 em íleo nutrido e

desnutrido..................................................................................................................................68

Figura 30 - Imunofluorescência da proteína SN-1 observada através de microscopia

confocal....................................................................................................................................69

Figura 31 - Diferença da intensidade de fluorescência da proteína SN-1 em íleo nutrido e

desnutrido..............................................................................................................................69

Figura 32 - Imunofluorescência da proteína SN-2 observada através de microscopia

Confocal....................................................................................................................................70

Figura 33 - Diferença da intensidade de fluorescência da proteína SN-2 em íleo nutrido e

desnutrido...............................................................................................................................70

Figura 34 - Imunofluorescência da proteína PEPT-1 observada através de microscopia

confocal....................................................................................................................................71

Figura 35 - Diferença da intensidade de fluorescência da proteína PEPT-1 em íleo nutrido e

desnutrido..................................................................................................................................71

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Composição da dieta básica regional (DBR)...........................................................25

Tabela 2 - Método de avaliação, estado nutricional dos animais, substrato testado e número de

animais normais e infectados analisados.................................................................................34

Tabela 3 - Informação nutricional das dietas............................................................................35

Tabela 4 - Nº de unidades formadoras de colônias e sua densidade ótica correspondente.......36

Tabela 5 - Oligonucleotídeos iniciadores, suas respectivas sequências e condições de PCR...43

Tabela 6 - Variação da CCC após adição cumulativa de glicose..............................................51

Tabela 7 - Variação da CCC após adição cumulativa de glutamina.........................................55

Tabela 8 - Variação da CCC após adição cumulativa de alanil-glutamina...............................59

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AA Aminoácido

A/ E Lesão attaching and effacing

Ala-Gln Alanil-glutamina

ANOVA Análise de variância

ATP Adenosina trifosfato

BFP Bundle forming pili

CAT-1 Transportador de Aminoácido Catiônico 1

CCC Corrente de Curto Circuito

cDNA Ácido desoxirubonucléico complementar

CFTR Regulador Transmembrânico de Fibrose Cística

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CLD Trocador de Cloreto-Bicarbonato

D Animal desnutrido

DAEC Escherichia coli difusamente aderente

DAPI 4'6'-diamidino-2-fenilindol

DBR Dieta Básica Regional

DE Animal desnutrido infectado com Escherichia coli enteropatogênica

DH Animal desnutrido infectado com Escherichia coli HS

D.O. Densidade Ótica

DDP Diferença de potencial elétrico

E Animal infectado com EPEC 2348/69

EAEC Escherichia coli enteroagregativa

Ec50 Concentração para metade do efeito máximo

EHEC Escherichia coli enterohemorrágica

EIEC Escherichia coli enteroinvasora

EPEC Escherichia coli enteropatogênica

Esp EPEC protein secreted

ETEC Escherichia coli enterotoxigênica

FAD Dinucleotídeo de flavina e adenina

Gli Glicose

Gln Glutamina

GLUT2 Transportador de Glicose 2 (Glucose Transporter 2)

GTP Trifosfato de guanosina

H Animal inoculado com E. coli HS.

HE Hematoxilina-eosina

i Corrente elétrica

IgA Imunoglobulina A

Km Constante de Michaelis-Menten

LEE Locus of Enterocyte Effacement

Map Proteína efetora da E. coli enteropatogênica Mitochondrion-associated

protein

mEq/ L Miliequivalência do soluto por litro de solvente

mM Milimolar

mOsm Miliosmole

N Animal nutrido

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NAD Dinucleotídeo de nicotinamida e adenina

NE Animal nutrido infectado com Escherichia coli enteropatogênica

NH Animal nutrido infectado com Escherichia coli HS

OMS Organização Mundial da Saúde

PBS Tampão salina fosfato (phosphate-buffered saline)

PEAF Fator de aderência plasmidial de E. coli

PEPT-1 Transportador de peptídeo (Peptide Transporter 1)

PPIA Peptidylprolyl isomerase A

qPCR Reação da polimerase em cadeia quantitativa

Rmáx Resposta máxima

RNA Ácido Ribonucleico (Ribonucleic Acid)

Rt Resistência transepitelial

SGLT Transportador de glicose sódio-dependente

LC2A2 Família 2 de transportadores GLUT

SLC5A Família de transportadores SGLT

SN Transportador de aminoácidos neutros (system N-specific amino acid)

SRO Solução de reidratação oral

STEC Escherichia coli produtora da toxina de Shiga

Tir Receptor translocado de intimina

ufc Unidades formadoras de colônias

ZO Zônula ocludina

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO...........................................................................................................16

1.1 Fisiologia da digestão e absorção de carboidratos e proteínas................................16

1.1.1 Glicose...........................................................................................................................16

1.1.2 Aminoácidos e peptídeos..............................................................................................18

1.1.2.1 Glutamina......................................................................................................................19

1.1.2.2 Alanil-glutamina............................................................................................................21

1.2 Desnutrição..................................................................................................................22

1.2.1 Prevalência da desnutrição infantil no Brasil...........................................................23

1.2.2 Desnutrição experimental por dieta básica regional................................................23

1.3 Infecção por Escherichia coli enteropatogênica – EPEC.........................................25

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1.4 Integridade da barreira intestinal.............................................................................28

1.5 Reidratação..................................................................................................................31

1.6 Justificativa..................................................................................................................32

2 OBJETIVOS................................................................................................................33

2.1 Objetivo geral..............................................................................................................33

2.2 Objetivos específicos...................................................................................................33

3 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................34

3.1 Origem e manutenção dos animais............................................................................34

3.2 Produção da ração de acordo com a Dieta Básica Regional...................................35

3.3 Indução da desnutrição experimental.......................................................................35

3.4 Inóculo bacteriano.......................................................................................................36

3.5 Modelo de infecção aguda por Escherichia coli enteropatogênica e a bactéria

controle Escherichia coli HS.......................................................................................36

3.6 Detecção da adesão bacteriana...................................................................................37

3.7 Avaliação histológica...................................................................................................38

3.8 Variação do transporte iônico....................................................................................39

3.8.1 O sistema das câmaras de Üssing...............................................................................39

3.8.2 Soluções perfusoras.....................................................................................................40

3.8.3 As soluções – teste com substratos.............................................................................40

3.8.4 Protocolo experimental...............................................................................................40

3.8.5 Medidas elétricas.........................................................................................................41

3.9 Avaliação da transcrição dos genes de transportadores intestinais e das junções

celulares......................................................................................................................41

3.9.1 Extração do RNA total...............................................................................................41

3.9.2 Síntese de cDNA..........................................................................................................42

3.9.3 Análise da transcrição dos transportadores e das junções celulares......................42

3.10 Reação de Imunofluorescência...................................................................................44

3.11 Análise Estatística.......................................................................................................45

4 RESULTADOS............................................................................................................46

4.1 Crescimento dos animais de acordo com a ração consumida.................................46

4.2 Detecção da adesão bacteriana...................................................................................46

4.3 Avaliação histomorfométrica.....................................................................................47

4.4 Variação do transporte iônico em íleo de camundongos.........................................49

4.5 Variação da resistência transepitelial........................................................................62

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4.6 Variação da transcrição dos genes de transportadores e junções celulares durante

a desnutrição............................................................................................................................63

4.7 Microscopia confocal...................................................................................................67

5 DISCUSSÃO................................................................................................................72

5.1 Controle geral dos experimentos...............................................................................72

5.1.1 Crescimento dos animais com DBR..........................................................................72

5.1.2 Inóculo bacteriano.......................................................................................................72

5.1.3 Câmaras de Üssing......................................................................................................73

5.2 Consequências da desnutrição e infecção..................................................................74

5.2.1 Desnutrição..................................................................................................................74

5.2.2 Infecção com EPEC.....................................................................................................75

5.2.3 Desnutrição e EPEC....................................................................................................76

5.2.4 Colonização da E. coli HS...........................................................................................77

5.2.5 Desnutrição e E. coli HS.............................................................................................78

5.2.6 Resistência transepitelial............................................................................................79

6 CONCLUSÃO.............................................................................................................80

REFERÊNCIAS .......................................................................................................82

ANEXO A.....................................................................................................................92

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16

1 INTRODUÇÃO

O sistema digestivo recebe diariamente grande quantidade de água através dos

alimentos, líquidos ingeridos e das secreções salivar, gástrica, biliar, pancreática e entérica

que, a cada 24 horas de intensa absorção pelo jejuno, íleo e cólon direito, cerca de 2 a 3%

desse volume são eliminados junto às fezes. No entanto, um distúrbio absortivo ou secreção

excessiva pode acarretar o aumento desse volume, devido a uma agressão à mucosa destes

segmentos gastroentéricos por agentes físicos, químicos ou biológicos (MISZPUTEN et al.,

2007).

O conteúdo alimentar que chega ao duodeno apresenta diferença de osmolaridade

em relação ao plasma e, é essa diferença que causa o transporte osmótico a partir do lúmen

intestinal para o plasma a fim de equilibrar as concentrações nos dois meios, entretanto esse

fluxo de água também acarreta o fluxo dos solutos dissolvidos no conteúdo luminal ou no

extra vascular. Esses solutos podem ser os íons sódio (Na+), potássio (K+), bicarbonato

(HCO3-), hidrogênio (H+) e macronutrientes como carboidratos, aminoácidos, peptídeos,

lipídeos entre outros (SILVA, 2002).

1.1 Fisiologia da digestão e absorção de carboidratos e proteínas

1.1.1 Glicose

As funções principais do intestino delgado é tanto a absorção de nutrientes quanto

a prévia digestão deles em moléculas suficientemente pequenas que possam ser absorvidas

(KOEPPEN; STANTON, 2009).

Assim, a digestão dos carboidratos no intestino delgado é dividida em duas etapas.

A primeira ocorre no lúmen e a segunda, na borda em escova dos enterócitos, para só então

ser possível a absorção, pois os enterócitos conseguem absorver apenas monossacarídeos e

não carboidratos grandes (KOEPPEN; STANTON, 2009).

Após digestão dos carboidratos a monossacarídeos como glicose, frutose e

galactose, o transporte destes pela membrana apical e posteriormente pela basolateral dos

enterócitos é realizado por transportadores específicos.

O transportador de glicose sódio-dependente (SGLT-1) é responsável pela

absorção de glicose na membrana apical dos enterócitos, funcionando por transporte ativo

secundário, visto que a energia utilizada não provém diretamente do ATP, mas do gradiente

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de concentração de Na+, mantido pela bomba de Na+/K+ATPase presente na membrana

basolateral (WRIGHT; MARTÍN; TURK, 2003; WOOD; TRAYHURN, 2003).

Além do SGLT-1, no intestino delgado, há outros transportadores de glicose

dependentes do sódio (SGLT1-SGLT6, genes da família SLC5A) que foram identificados não

somente no intestino, mas em diversos órgãos (WRIGHT; MARTÍN; TURK, 2003; WOOD;

TRAYHURN, 2003).

Quando a concentração de glicose aumenta no meio intracelular, esse

monossacarídeo deixa a célula por difusão facilitada (a favor do gradiente de concentração)

pela membrana basolateral em direção à circulação sanguínea pelo transportador de glicose

GLUT2. Esse transportador independe de íons Na+, alta capacidade de transportar glicose,

porém tem baixa afinidade (Km para a glicose > 50 mM, ou seja, é preciso que haja

concentrações superiores a 50 mM de glicose no meio intracelular para que a velocidade de

transporte seja a metade da velocidade máxima) (WOOD; TRAYHURN, 2003; COSTANZO,

2007).

Paralelamente ao transporte intestinal de glicose via SGLT-1, o cloreto (Cl-) e o

bicarbonato (HCO3-) acompanham por uma via distinta o transporte de sódio, mantendo a

neutralidade elétrica (WRIGHT ; LOO, 2000; WRIGHT; MARTÍN; TURK, 2003) através do

trocador cloreto-bicarbonato (CLD) (RAFF; LEVITZKY, 2012), e a água (H2O) também vai

seguindo o gradiente osmótico passivamente gerado pelo transporte transcelular de eletrólitos

e nutrientes (GADEWAR; FASANO, 2005; KING et al., 2003), como mostra a Figura 1:

Figura 1 - Modelo clássico das vias de transporte de glicose

Fonte: Adaptado de Costanzo (2007).

SGLT 1 – proteína 1 transportadora de glicose Na+-dependente; ATP –

Trifosfato de adenosina; GLUT 2 – proteína 2 transportadora de glicose Na+-

independente; CLD – trocador cloreto-bicarbonato.

CCLLDD

Cl-

HCO3-

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Desta maneira, o cotransporte de glicose, sódio e água pelo SGLT-1 e o transporte

associado de cloreto e bicarbonato tornaram-se as bases do desenvolvimento da terapia de

reidratação oral (WRIGHT; LOO, 2000; WRIGHT; MARTÍN; TURK, 2003), pois esses

transportes não são afetados por agentes infecciosos conhecidos ou suas toxinas

(GADEWAR; FASANO, 2005; KING et al., 2003).

1.1.2 Aminoácidos e peptídeos

Com o pH neutro, a enteropeptidase presente no intestino delgado converte o

tripsinogênio em tripsina, promovendo a ativação das outras propeptidases do suco

pancreático e levando à hidrólise luminal de proteínas e polipeptídeos, produzindo

aminoácidos (AA) livres e pequenos peptídeos com 2 a 6 AA. Estes são hidrolisados pelas

peptidases da borda em escova a AA, di e tripeptídeos e são absorvidos pelos enterócitos

(FRENHANI; BURINI, 1999).

Essa absorção ocorre por mecanismos carreadores específicos para grupos de

aminoácidos que dividem características químicas semelhantes, ou seja, AA neutros, básicos e

ácidos. Mas, os AA são absorvidos através da membrana apical, principalmente por transporte

ativo secundário Na+ - dependente (FREITAS et al., 1995; YANG; DANTZIG; PIDGEON,

1999).

Já o transporte de peptídeos através da membrana borda em escova é

independente do sistema de transporte de AA e é dependente de prótons H+, pois é estimulado

pelo gradiente de pH através da membrana borda em escova. Como o gradiente de Na+

promove o antiporte de Na+/ H+ na borda em escova, ele acaba gerando também o gradiente

de H+, essencial para energizar o transporte de peptídeos (FREITAS et al., 1995), como

ilustrado na Figura 2 a seguir:

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Figura 2 - Dependência indireta dos cátions Na+ no mecanismo

absortivo de peptídeo H+-dependente

Fonte: Frenhani e Burini (2009).

1.1.1.1 Glutamina

A glutamina é um aminoácido bipolar, neutro, hidrofílico, facilmente hidrolisado

por ácidos e bases (ROGERO; TIRAPEGUI, 2003) cujo papel no metabolismo proteico e no

transporte de nitrogênio entre diversos órgãos tem sido muito pesquisado (SOUBA, 1991).

É considerado um AA não essencial. No entanto, torna-se essencial em situações

de estresse, pois a sua síntese não supre a demanda exigida pelo organismo (SANTOS;

CAPERUTO; COSTA ROSA, 2007).

Sua ação trófica sobre a mucosa do intestino delgado já é bastante conhecida

(KHAN, 1999; SOUBA et al., 1990), sendo encontrada em altas concentrações em células de

mamíferos, podendo captar a amônia e doar átomos de nitrogênio para a síntese de

nucleotídeos, mucossacarídeos e aminoácidos (SMITH, 1990). No sangue, corresponde a um

terço do nitrogênio circulante sob a forma de aminoácidos e, sua concentração varia de 600 a

800 mM, dando suporte à síntese de ureia no fígado e de amônia nos rins (SOUBA, 1987).

A mucosa do intestino delgado é importante na absorção desse aminoácido

(HANSON; PARSON, 1977). Essa absorção aumenta o influxo de água e o efluxo de íons K+,

aumentando a hidratação e o volume celular (ROGERO; TIRAPEGUI, 2003) e,

consequentemente a absorção de sódio (YANG; DANTZIG; PIDGEON, 1999).

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O transporte de glutamina através da membrana a partir da borda em escova se faz

por meio de uma via Na+ dependente e em menor grau por uma via Na+ independente. O

transporte através da membrana basolateral é dependente de Na+ e do pH (BULUS;

ABUMRAD; GHISHAN, 1989).

Ainda que parte do transporte intestinal da glutamina seja semelhante ao da

glicose, a glutamina é mais importante do que esta como fonte energética para enterócitos,

colonócitos (WINDMUELLER, 1982) e células do sistema imune (VAN DER HULST et al.,

1993), pois nos tecidos animais existem muitas enzimas que catalisam a hidrólise de

glutamina em glutamato, possibilitando a participação desse AA no ciclo de Krebs e

consequentemente a formação de ATP ou GTP após a reoxidação de NAD e FAD na

mitocôndria (RAW; KRASILCHIK; MENNUCCI, 2001).

Além disto, estudos demonstraram que a glutamina altera a expressão gênica de

proteínas participantes da sinalização celular, regulação dos fatores de crescimento e resposta

inflamatória e imunológica (CORLESS et al., 2006). Ela também promove a proliferação de

enterócitos, linfócitos e fibroblastos (LI et al., 2008) e preserva o sistema imune com a

promoção de uma maior eficácia da função da barreira intestinal (CETINBAS; YELKEN;

GULBAS, 2010), mantendo a integridade da mucosa, prevenindo alterações na

permeabilidade intestinal e aumentando a absorção de Na+ pelo jejuno (VAN DER HULST et

al., 1993).

Segundo Fukatsu e Kudsk (2011), a suplementação com glutamina aumenta o

número de linfócitos nas placas de Peyer e na lâmina própria, normaliza a concentração

tecidual de citocinas de resposta imune do tipo Th2 e melhora os níveis de IgA na mucosa

intestinal.

O uso de glutamina em pacientes com estresse pós-operatório e tratamento com

imunossupressores preserva a integridade da mucosa intestinal e previne a translocação de

bactérias e toxinas (RIBEIRO et al., 2004). Outrossim, a administração de glutamina por via

parenteral também resulta no aumento do peso corporal, melhora dos níveis nitrogenados e

aumenta as células do epitélio gastrointestinal em estados catabólicos (SMITH, 1990).

Em ratos com isquemia intestinal há melhora da sobrevida com a suplementação

parenteral com glutamina (FUKATSU; KUDSK, 2011).

Em uma avaliação da permeabilidade intestinal através de lactulose/manitol em

camundongos com lesão intestinal induzida por 5-fluorouracil e suplementados com

glutamina e alanil-glutamina, demonstrou-se que apenas a glutamina foi capaz de restaurar a

permeabilidade intestinal, enquanto que a suplementação com alanil-glutamina reduziu a

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recuperação de lactulose e de manitol individualmente ainda que a razão lactulose/manitol

tenha sido igual à do grupo com lesão (MONTEIRO, 2006).

Em 2011, Silva, Costa e Burgos relataram um caso de paciente HIV positivo com

desnutrição severa e diarreia (8 a 10 evacuações/ dia) tratada com 35 g de fibra solúvel

(goma-guar parcialmente hidrolisada), fracionados em sete porções de 5 g e 30 g de L-

glutamina, durante 10 dias. A partir do segundo dia de suplementação, o número de

evacuações diárias foi reduzido para três, sem alteração de consistência. No 4º dia, a paciente

apresentou uma evacuação líquida em 24 horas e, a partir do 5º dia, ocorreu a normalização da

função intestinal, com fezes pastosas uma vez ao dia e melhora do estado clínico geral. Essa

suplementação foi mantida durante 10 dias e, a partir do 20º dia, após a intervenção, a

paciente permanecia com função intestinal normal. Depois, a fórmula elementar foi

substituída por dieta polimérica (nutrientes intactos) associada à alimentação por via oral,

conforme aceitação diária da paciente.

Van der Hulst et al. (1993) afirmaram sobre a importância da suplementação com

glutamina para a manutenção da integridade do trato gastrintestinal, aumento da capacidade

absortiva intestinal e síntese proteica em condições de estresse prolongado, como na infecção

pelo HIV.

No entanto, características químicas desse aminoácido desfavorecem o seu uso

rotineiro, tais como instabilidade térmica, baixo coeficiente de solubilidade (3g/ 100 mL a

20ºC), velocidade de hidrólise dependente de temperatura, pH e concentração iônica

(MEISTER, 1956). Além disto, a glutamina decompõe-se em amônia e ácido piroglutâmico

(LIMA, 2006). Por isto, tem-se buscado desenvolver dipeptídeos com resíduos de glutamina

ligados às terminações C- ou N- como L-alanil-glutamina e glicil-L-glutamina (FÜRST;

POGAN; STEHLE, 1997).

1.1.1.2 Alanil-glutamina

É um dipeptídeo muito utilizado em experimentos devido à sua maior absorção

pelo intestino, alta hidrossolubilidade e termoestabilidade, além de ser possível o seu

armazenamento por até 2 anos (FÜRST; POGAN; STEHLE, 1997). Ademais, estudos

revelaram que a competição entre AA livres é evitada ou reduzida quando eles estão sob a

forma de dipeptídeos (GARDNER, 1975; TEMPLE et al., 1998).

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Fei et al. (1994) relataram que o transportador intestinal PEPT-1, presente

exclusivamente na membrana apical dos enterócitos, possui ampla especificidade e transporta

ativamente di e tripeptídeos. Essa proteína está presente exclusivamente na membrana apical

dos enterócitos (THAMOTARAN et al., 1999; ADIBI, 2003).

A PEPT-1 é a principal via de absorção dos peptídeos oriundos das proteínas

digeridas, pois na membrana apical quase não há atividade das hidrolases (apenas 5 a 12% do

total). Por isto, em 1992, Minami, Morse e Adibi verificaram que L-alanil-glutamina era

especificamente transportada através dos enterócitos sem sofrer hidrólise. Assim, essa

proteína permite que dipeptídeos atinjam o citosol, no qual as peptidases apresentam 80 a

95% da atividade celular (FRENHANI; BURINI, 1999; YANG; DANTZIG; PIDGEON,

1999; ADIBI, 2003). Após essa digestão, os AA são aproveitados pela célula ou liberados

para a circulação portal, através de transportadores na membrana basolateral (DÉCHELOTTE

et al., 1991; D’SOUZA; TUCK, 2004).

Os peptídeos resistentes à hidrólise pelas peptidases intracelulares, são

transportados através da membrana basolateral via transportadores de peptídeos por transporte

facilitado, pois o antiporte de Na+/H+ gera e mantém o gradiente de prótons no lúmen

enquanto que a bomba de Na+/K+ (ATPase) mantém reduzida a concentração de Na+ no meio

citoplasmático (YANG; DANTZIG; PIDGEON, 1999).

1.2 Desnutrição

O estado nutricional infantil adequado requer o consumo satisfatório de nutrientes

para que haja um apropriado desenvolvimento físico e mental. Todavia, a desnutrição decorre

do consumo inadequado de nutrientes ou de frequentes infecções (UNITED NATIONS

CHILDREN’S FUND, 2006), associando-se geralmente às precárias condições de vida e de

assistência à gestante e às crianças, sendo que, na faixa etária de até 5 anos, há maior

vulnerabilidade biológica à desnutrição, à morbidade e à mortalidade (IBGE, 2010),

prejudicando o desenvolvimento psicomotor, o aproveitamento escolar e a diminuição da

altura e da capacidade produtiva na idade adulta (BLACK et al., 2008; VICTORA et al.,

2008).

Segundo o Fundo das Nações Unidas para a Infância (UNITED NATIONS

CHILDREN’S FUND), cerca de 165 milhões de crianças em todo o mundo são

subdesenvolvidas pela desnutrição quando bebês e enfrentam um futuro de enfermidades,

déficit educacional, baixa renda e pobreza (KELLAND, 2013).

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Entre 2000 e 2003, a taxa de mortalidade infantil por desnutrição era de 53%.

Além disto, Wolrd Health Organization (WHO) - Global Database on Child Growth and

Malnutrition mostrou que a desnutrição contribui em 52,2% nos casos de morte infantil por

diarréia, sarampo e malária (CAUFIELD et al., 2004). No entanto, no Brasil, a ocorrência da

mortalidade por desnutrição tem diminuído devido a implementação de políticas de saúde e

distribuição de alimentos e pela melhoria das condições de saúde e de alimentação das

crianças, embora esta não tenha sido homogênea para todas as regiões (IBGE, 2010).

Portanto, a sobrevivência das crianças de países subdesenvolvidos depende da

prevenção e controle da desnutrição e morbidades associadas.

1.2.1 Prevalência da desnutrição infantil no Brasil

Atualmente, o estado nutricional infantil é avaliado antropometricamente através

dos índices peso / altura (P/A), altura / idade (A/I) e peso / idade (P/I) e, os indicadores podem

ser expressos em escore z (IBGE, 2010; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1995).

Assim, quando os valores de P/A são inferiores a -2 escores z, a criança apresenta peso baixo

em relação à altura e quando esse valor varia entre -2 e -1 escore z há risco para baixo peso

para a altura. Entretanto, se esse valor for de +1 a +2 escore z, a criança apresenta sobrepeso.

Em caso de obesidade, tal valor é superior a +2 escores z. Em relação aos índices A/I e P/I, há

retardo no crescimento e baixo peso para a idade, respectivamente, quando a criança apresenta

valores menores que -2 escores z; quando esse valor varia entre -2 e -1 escore z, há risco para

retardo de crescimento e risco nutricional para peso baixo para a idade, respectivamente

(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1995).

A partir disto, a Pesquisa Nacional de Demografia e Saúde da Criança e da

Mulher (2006) informou que 7% das crianças brasileiras apresentavam déficit de crescimento

em relação à altura, sendo 15% delas do Norte, 6% do Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste, e

8% do Sul do Brasil. Enquanto que, apenas 1,5% das crianças menores de 5 anos tinham

deficiência de peso em relação à altura (BRASIL, 2008b).

1.2.2 Desnutrição experimental por dieta básica regional

Como já dito anteriormente, as deficiências alimentares podem acarretar à criança

um grave estado de desnutrição que se reflete em seu desenvolvimento físico, mental e

intelectual, além de provocar desequilíbrios morfológicos e funcionais que, dependendo da

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intensidade e duração, poderão ser irreversíveis (UNITED NATIONS CHILDREN’S FUND,

1998), pois a desnutrição nos primeiros anos de vida de um ser humano pode ter efeitos

devastadores e irreversíveis, considerando que neste período ocorre um rápido crescimento

(MORGANE et al., 1993) e consequentemente uma grande necessidade calórica e nutricional

(BROWN; POLLIT, 1996).

Por isto, para possibilitar futuros estudos sobre a desnutrição, os fisiologistas

Nelson Ferreira de Castro Chaves e Naíde Regueira Teodósio, ambos do Instituto de Nutrição,

da Universidade Federal de Pernambuco, realizaram um estudo para obter uma dieta,

denominada Dieta Básica Regional (DBR), que reproduzisse, no rato, carências dietéticas

qualitativa e quantitativamente.

Então, esses pesquisadores selecionaram alimentos de maior consumo pela

população do nordeste brasileiro tais como feijão mulatinho – Phaseolus vulgaris (SILVA et

al., 1987); charque (COSTA, 1995; FERREIRA et al., 1993); batata doce - Iponaea batatas

(PINHEIRO et al., 2000); farinha de mandioca – Manihot esculenta (BARRETO-

MEDEIROS et al., 2004) e compararam essa dieta com uma dieta padrão.

A DBR revela-se deficitária no teor e qualidade das proteínas, calorias, gordura,

vitaminas e minerais, como mostra a tabela 1, seus aminoácidos são extremamente limitantes

(TEODÓSIO et al., 1990), o que permitiu consolidar a DBR como um modelo experimental

de desnutrição, pois esta provoca, no rato, um tipo de desnutrição proteico-calórica,

associando o nanismo nutricional com alguns sinais clínicos de marasmo (TEODÓSIO et al.,

1990; COSTA, 1995).

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Tabela 1 - Composição da Dieta Básica Regional (DBR)

Alimentos Quant. (g) Prot.(%) Carb. (%) Gord. (%) Sais (%) Fib. (%) Cal.

Feijão

mulatinho 16,41 3,86 7,27 0,24 0,68 0,29 46,68

Farinha de

mandioca 47,01 0,75 39,30 0,16 0,54 1,10 161,64

Charque 7,09 2,49 - 0,89 0,49 - 17,97

Batata

doce 20,62 0,34 16,18 0,05 0,42 0,84 66,53

Óleo de

algodão 6,87 - - 6,87 - - 61,83

Minerais 2,00 - - - 2,00 - -

Total 100,00 7,44 62,75 8,21 4,13 2,23 354,65

Fonte: Coutinho (1976).

A DBR vem sendo estudada em animais, sob vários aspectos, tais como:

crescimento (TEODÓSIO et al., 1990); desenvolvimento do sistema nervoso (MORGANE et

al., 1993); longevidade (LAGO et al., 1997); gerações sucessivas (PESSOA et al., 2000)

entre outros.

1.3 Infecção por Escherichia coli enteropatogênica - EPEC

Desde 1920, a Escherichia coli tem sido caracterizada como agente diarreico

especialmente em crianças (NATARO; KAPER, 1998).

Cepas de E. coli colonizam o trato gastrointestinal poucas horas após o

nascimento, e passam a constituir a microbiota intestinal de seus hospedeiros. Pertencente à

família Enterobacteriaceae, geralmente causa doença em seu hospedeiro quando há

imunocomprometimento ou quando as barreiras do sistema digestivo são rompidas

(NATARO; KAPER, 1998).

Atualmente, existem seis tipos patogênicos de Escherichia coli conhecidos:

a) E. coli enteroinvasora (EIEC);

b) E. coli enterotoxigênica (ETEC);

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c) E. coli enteropatogênica (EPEC) que, dependendo da presença ou ausência do

fator de aderência plasmidial de E. coli (PEAF) (KAPER, 1996), é subdividida

em:

- Típica;

- Atípica;

d) E. coli produtora da toxina de Shiga (STEC);

e) Subgrupo E. coli enterohemorrágica (EHEC);

f) E. coli enteroagregativa (EAEC);

g) E. coli difusamente aderente (DAEC) (NATARO; KAPER, 1998).

Dentre os microrganismos mais patogênicos está a Escherichia coli

enteropatogênica (EPEC), causando um amplo espectro de doenças intestinais e extra

intestinais, incluindo diarreia, infecções do trato urinário, septicemia e meningite neonatal em

muitos países, principalmente nos subdesenvolvidos (MÜLLER et al., 2006).

A EPEC foi reconhecida pela primeira vez em 1940, e foi associada a surtos de

diarreia infantil em hospitais e creches do Reino Unido (BLANCO et al., 2006). Mesmo com

o desaparecimento dos grandes surtos de diarreia infantil por EPEC na maior parte dos países

industrializados, essa bactéria continua a ser um importante agente diarreico nos países em

desenvolvimento (NATARO; KAPER, 1998).

O seu mecanismo de patogenicidade relaciona-se à capacidade de provocar a lesão

adesão e apagamento (attaching and effacing - A/E) na mucosa intestinal do hospedeiro

(KENNY; FINLAY, 1995; NATARO; KAPER, 1998), causando destruição das

microvilosidades e aderência da EPEC à mucosa. Além disto, podem ser observadas

modificações no citoesqueleto celular logo abaixo das bactérias aderidas, como o acúmulo de

actina polimerizada, formando uma estrutura de pedestal (NATARO; KAPER, 1998).

Os fatores que levam à lesão A/E são codificados pelos genes presentes na ilha de

patogenicidade cromossômica denominada Lócus de Apagamento do Enterócito (Locus of

Enterocyte Effacement - LEE) (ELLIOTT et al., 1998). O contato inicial entre a EPEC e a

célula hospedeira é mediado por fímbrias do tipo IV denominadas pili formadores de feixes

(bundle forming pili - BFP) da superfície bacteriana. Essas fimbrias promovem a formação de

microcolônias com aderência localizada em culturas de células epiteliais (GIRÓN; HO;

SCHOOLNIK, 1991). Porém, é a proteína EspA, codificada pelo gene espA, a responsável

pela adesão inicial da EPEC e formação de um tubo de translocação bacteriana. Este, quando

em contato com os enterócitos, transloca proteínas codificadas ou não pela região LEE

(HERNANDES et al., 2009). Dentre as proteínas translocadas estão o receptor de intimina

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translocado (Tir) que funciona como um receptor da adesina intimina codificada no LEE

(KENNY et al., 2002), responsável pela firme aderência bacteriana às células epiteliais do

intestino. Outras proteínas também são translocadas atuando na desestruturação do

citoesqueleto (EspB), perda da resistência transepitelial (EspF) e desregulação mitocondrial

(Map) (NATARO; KAPER, 1998).

Após estes processos de ataque, essas bactérias ligam-se às células membranosas

das placas de Peyer e rompem o gel mucoso suprajacente da célula do hospedeiro, causando

uma diarreia líquida com muco, febre e desidratação que pode ser severa e prolongada em

crianças (WALDER, 2006). As complicações geralmente decorrem da desidratação e do

desequilíbrio hidroeletrolítico e quando não tratadas adequada e precocemente podem levar a

óbito. Os casos crônicos ou repetidos acarretam desnutrição crônica, com retardo do

desenvolvimento estato-ponderal, ou seja, do peso e altura (BRASIL, 2008a).

Estima-se que na Ásia, África e América Latina, dependendo de fatores

socioeconômicos e nutricionais, a probabilidade de uma criança morrer antes dos 5 anos por

essas causas pode chegar a 50%. As epidemias de diarreia em bebês, crianças e adultos são

geralmente causadas por microrganismos veiculados pela água ou alimentos contaminados

por fezes humanas (VILA et al., 2009). Assim, entende-se que a prevalência de doenças

causadas por enterobactérias depende de vários fatores em especial a idade e o nível

socioeconômico dos pacientes.

Acredita-se que uma das razões importantes do prolongamento diarreico, seja um

atraso na reparação da mucosa intestinal, o que aumenta o risco de um ciclo vicioso de

infecção e desnutrição (ZIEGLER et al., 2003). Esse ciclo repetitivo pode levar a diarreias,

porque a desnutrição altera a mucosa intestinal com a redução do índice mitótico,

predispondo, portanto, a mucosa a infecções secundárias e dificultando a recuperação da

membrana. A manutenção da lesão nas vilosidades dificulta a absorção de moléculas e a

função imunológica (SULLIVAN; MARSH, 1992).

A diarreia é compreendida como uma maior eliminação de água junto às fezes

(MISZPUTEN et al., 2007) e tem causado a morte de 1,5 a 2,5 milhões de crianças menores

de 5 anos a cada ano (UNITED NATIONS CHILDREN’S FUND; WORLD HEALTH

ORGANIZATION, 2009), principalmente por desidratação. Na maioria dos casos, a diarreia é

aguda com duração menor que 14 dias, no entanto pode ser classificada como persistente,

quando supera esse período (MCAULIFFE et al., 1986).

Segundo a Organização Mundial de Saúde - OMS, 80% das diarreias agudas estão

relacionadas ao uso de água imprópria para consumo, ao sistema de esgoto ausente ou

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inadequado ou ainda práticas de higiene insuficientes, especialmente em países ou áreas onde

são precárias as condições de saúde e saneamento básico.

1.4 Integridade da barreira intestinal

Se a desnutrição associada ou não à infecção intestinal pode acarretar diarreia,

devido à alteração da mucosa absortiva, então a integridade da barreira morfo-funcional

intestinal também está afetada, havendo redução da área absortiva e/ ou aumento da

permeabilidade intestinal. Esta é regulada por um contato intercelular mantido pelas junções

celulares, que são estruturas simétricas formadas entre as células, classificadas por junções de

oclusão, de adesão ou comunicantes (KIERSZENBAUM, 2007; GARTNER; HIATT, 2012).

Na zona apical dos enterócitos, as junções oclusivas controlam a permeabilidade

seletiva (MONTEIRO, 2006; GARTNER; HIATT, 2012) e determinam a polaridade dessas

células, separando a zona apical da basolateral e impedindo a livre difusão de lipídeos e

proteínas entre essas regiões (KIERSZENBAUM, 2007; GARTNER; HIATT, 2012).

Enquanto que as junções de adesão permitem a aderência célula-célula, e as junções

comunicantes ou do tipo gap possibilitam o fluxo de íons e de pequenas moléculas

(GARTNER; HIATT, 2012).

Dependendo da integridade das junções oclusivas, algumas zônulas são mais

permeáveis por possuir menos arranjos proteicos transmembranares ou menos permeáveis,

apresentando um maior número de faixas proteicas. Estas são compostas pelas proteínas

claudinas e ocludinas, como ilustrado na figura 5. Além dessas proteínas, as junções de

oclusão são reforçadas pelas proteínas citoplasmáticas ZO-1, ZO-2 e ZO-3, que asseguram o

correto alinhamento das claudinas e das ocludinas (GARTNER; HIATT, 2012).

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Figura 3 - Esquema das interações proteicas nas junções celulares

Fonte: Aktories e Barbieri (2005).

Próximo às junções de oclusão, estão as junções de adesão que se mantêm ligadas

às células por intermédio das proteínas transmembranares caderinas. A região dessas

proteínas que ficam no meio extracelular depende de Ca²+ para que haja conexão da caderina

com a célula adjacente. Enquanto que a fração intracelular das caderinas liga-se aos

filamentos de actina que correm paralelos à membrana celular (GARTNER; HIATT, 2012).

Porém, a associação dessas junções aos microfilamentos de actina é mediada pela interação da

caderina com as cateninas (α, β e γ) (KIERSZENBAUM, 2007). Desta forma, a caderina liga

o citoqueleto de células adjacentes.

Devido a essa estrutura das vias paracelulares, as zônulas de oclusão são cerca de

duas vezes mais permeáveis ao Na+, K+ e Cl- (JOHNSON, 1997), portanto a maior parte do

transporte passivo de íons e pequenas moléculas no intestino ocorre entre os enterócitos.

Exemplo disto é que 90% da absorção intestinal de magnésio livre (Mg²+) ocorre por

transporte passivo nas vias paracelulares, dependendo do gradiente de concentração e da

voltagem transepitelial, caso o soluto seja carregado eletricamente (OLIVEIRA, 2011).

Importante salientar que, o transporte paracelular é impulsionado pelo

transmembranar, como ocorre quando há absorção transmembranar de Na+, que leva à

variação da voltagem transepitelial e acarretando a absorção paracelular de Cl-. De forma

semelhante, em alguns epitélios, a saída de Cl- pelos canais transmembrânicos, aumenta a

secreção de Na+ pela via paracelular, equilibrando eletricamente a região. Além desses

transportes, a água também pode mover-se pela via paracelular, pois a absorção de cloreto de

sódio (NaCl) pela membrana apical reduz a pressão osmótica nessa região e a travessia desse

sal pela membrana basolateral aumenta essa pressão. Assim, surge um gradiente transepitelial

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de pressão osmótica que favorece o aumento da absorção de água. No epitélio do túbulo

proximal do nefrón, esse fluxo paracelular de água possibilita o transporte, pelas junções de

oclusão, de alguns solutos dissolvidos nela, processo chamado de transporte por arraste

(KOEPPEN; STANTON, 2009).

No entanto, a condutância das junções intercelulares pode ser afetada por toxinas

bacterianas (SEARS, 2000) e citocinas (NUSRAT; TURNER; MADARA, 2000), alterando a

permeabilidade intestinal. Este fato torna importante o seu estudo, pois a permeabilidade

intestinal relaciona-se à barreira funcional e à permeação de marcadores (TRAVIS;

MENZIES, 1992), o que permite o cálculo da permeabilidade e do fluxo de solutos em um

determinado intervalo de tempo (mL/mm²/min).

Assim, a permeabilidade depende do tamanho molecular da substância ou íon em

relação aos poros hidrofílicos da membrana, ou seja, ela é diretamente proporcional à

facilidade com que a superfície da mucosa intestinal pode ser atravessada por substâncias, por

difusão, sem a interferência de mediadores de constituintes específicos. Porém, para estudá-la,

é necessário o uso de moléculas com massa superior a 150 daltons (Da) para permeação, em

vez de íons, como sódio ou cloreto, pois uma mucosa intestinal saudável discrimina

acentuadamente a dimensão, configuração, solubilidade e polaridade molecular (TRAVIS;

MENZIES, 1992). Estes parâmetros são analisados em conjunto, por modelos matemáticos de

computação, com a conformação óptica e raio de Van der Waals (HOLLANNDER;

RICKETTS; BOYD, 1988).

Desta maneira, a integridade intestinal pode ser avaliada com alguns açúcares

hidrofílicos, que são pouco transportados pelo sistema de transporte de monossacarídeos da

mucosa intestinal e que não são metabolizados, pois após sua captação, circulam no sangue e

são excretados intactos na urina (LIMA et al., 1997; WYATT et al., 1993; PEARSON et al.

1982; LAKER; MENZIES, 1977). Dentre esses açúcares estão a lactose, a sacarose, o manitol

e a lactulose (CORREIA, 2007). Além destes, ramnose, xilose e arabinose foram utilizadas

por McCance e Madders em 1930 para demonstrar a taxa de absorção de uma variedade de

substâncias (HOBER, R.; HOBER, J., 1937).

Os açúcares mais comumente utilizados para tal fim são manitol (182 Da) e

lactulose (342 Da). O manitol penetra pela via transcelular e a lactulose, pela via paracelular,

testando desta maneira essas regiões, porque a perda da integridade da região intercelular

aumenta a absorção de lactulose e, a lesão das áreas absortivas diminui a absorção de manitol

(FLEMING et al., 1990). Consequentemente, a razão entre a concentração de lactulose e

manitol é uma medida quantitativa da integridade e função absortiva intestinal.

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1.5 Reidratação

Em 1940, soluções eletrolíticas começaram a ser usadas para tratamento, e a partir

dos anos 60, a glicose foi adicionada a essas soluções, pois pesquisadores verificaram a

existência de um mecanismo de transporte Na+-glicose (SCHULTZ; ZALUSKY, 1964), ou

seja, a presença de glicose no lúmen intestinal aumenta a absorção de sódio e

consequentemente de água.

Em 1975, a Organização Mundial da Saúde (OMS) e o Fundo das Nações Unidas

para a Infância (UNITED NATIONS CHILDREN’S FUND) recomendaram o uso da solução

de reidratação oral (SRO) padrão contendo 90 mEq de Na+, 20 mEq de K+, 80 mEq de Cl-, 10

mM de base e 111 mM de glicose, com osmolaridade total de 311 mOsm, pois foi

demonstrado que essa solução é segura e eficaz para reidratação e manutenção para crianças e

adultos com todos os tipos de diarreia (MOLLA et al., 1981).

No entanto, uma metanálise posterior envolvendo estudos controlados apoiou a

adoção de uma SRO com menor osmolaridade, pois tem sido associada a menor ocorrência de

vômitos e defecações, além da redução da necessidade de infusões intravenosas não

programadas quando comparada com a SRO padrão entre bebês e crianças com diarreia sem

cólera (HAHN; KIM; GARNER, 2001). Já na infecção por cólera, não houve diferença

clínica com esta solução quando comparada à solução padrão, entretanto houve aumento na

incidência de hiponatremia assintomática (ALAM; MAJUMDER; FUCHS, 1999).

Em 2002, uma nova formulação foi recomendada pela OMS, contendo 75 Na+

mEq/ L, 75 mM de glicose e osmolaridade total de 245 mOsm / L.

Considerando esse histórico, a SRO passou a ser a terapêutica indicada para

diarreia, pois simplificou o tratamento e tem contribuído significativamente para a diminuição

da mortalidade por desidratação (BRASIL, 2008a).

Segundo Barbosa e Sztajnbok (1999),

Independente da etiologia da desidratação, os princípios gerais de tratamento são os

mesmos, devendo-se avaliar o volume de água perdido (gravidade) e o nível de

sódio (tipo de desidratação), não se esquecendo de que outros distúrbios eletrolíticos

e metabólicos poderão estar presentes, merecendo atenção especial o equilíbrio

acidobásico (H+) e os níveis de potássio (K+).

Estudos sobre a fisiopatologia de diarreias severas mostram que ocorre uma

intensa secreção luminal de íons Cl- e HCO3- e redução na absorção de Na+ e Cl- nos vilos

intestinais (FIELD; RAO; CHANG, 1989). Portanto, é necessária a reposição desses

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eletrólitos perdidos através do emprego da SRO, e o processo de restituição apresenta as

seguintes etapas:

A primeira etapa da terapia de reidratação envolve restabelecimento rápido dos

níveis de água e eletrólitos. Em crianças desnutridas ou enfermas, deve-se utilizar soro

glicosado com soro fisiológico (HARRISON, 1989). A segunda etapa é de manutenção em 24

horas, envolvendo a reposição de água, eletrólitos e nutrientes necessários à normalização da

atividade metabólica (HOLLIDAY; SEGAR, 1957).Por fim, a terceira etapa é a reposição das

perdas anormais continuadas.

1.6 Justificativa

A desnutrição e a infecção por EPEC alteram a região absortiva da mucosa

intestinal, levando, às vezes, a diarreias devido à ocorrência de possíveis alterações no

transporte de nutrientes como carboidratos, aminoácidos e peptídeos e, consequentemente,

uma alteração nos mecanismos fisiológicos de transporte de eletrólitos e água, causando

desidratação, desequilíbrio eletrolítico e até a morte.

Por isto, é importante estudar o mecanismo de absorção de substratos Na+-

dependente e H+-dependente, observando as variações ocorridas durante a desnutrição e/ou

infecção, a fim de encontrar nutrientes que possam ser utilizados junto às soluções de

reidratação oral no intuito de aumentar a absorção de eletrólitos e de água e,

consequentemente, reduzir a incidência de desidratação, acidose e hipoperfusão de órgãos

vitais, visto que, por ser de baixo custo, a SRO é a terapia mais adequada no contexto de

países subdesenvolvidos, nos quais as doenças diarreicas são mais frequentes. Ademais, a

terapia de reidratação oral é não invasiva, o que possibilita uma maior adesão ao tratamento e

a dispensa de pessoal médico especializado em tempo indeterminado.

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2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Pretende-se estudar o efeito da glicose, glutamina e alanil-glutamina no processo

elétrico (corrente de curto circuito – CCC) da membrana intestinal do íleo normal e

histopatológico.

2.2 Objetivos específicos

1. Comparar as consequências histomorfológicas do íleo normal com o submetido

à desnutrição experimental e à infecção aguda por EPEC na região absortiva intestinal.

2. Analisar o transporte iônico através do epitélio intestinal em condições normais

de jejum e na presença de nutrientes frente à infecção pela E. coli enteropatogênica, com o

modelo de câmaras de Üssing e com a relação da corrente elétrica, diferença de potencial e

resistência transepitelial.

3. Avaliar as alterações no transporte de substratos como glicose, glutamina e

alanil-glutamina e íons intestinais e o efeito in vitro desses substratos no transporte iônico no

íleo nutrido e desnutrido, em condições normais e infectado.

4. Estudar se a desnutrição acarretam alterações na expressão gênica dos

transportadores intestinais e de algumas proteínas das junções celulares.

5. Analisar se a desnutrição altera a síntese proteica dos transportadores.

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3 MATERIAL E MÉTODOS

Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Doenças Infecciosas e no

Laboratório Pré-clínico do Instituto de Biomedicina da Universidade Federal do Ceará, com o

auxílio financeiro do próprio instituto (Número do Processo: 573928/2008-8) e aprovado pela

Comissão de Ética em Pesquisa Animal - CEPA da mesma universidade (nº 62/2011).

3.1 Origem e manutenção dos animais

Foram utilizados camundongos (Mus musculus) albinos, da linhagem Swiss, do

sexo masculino, provenientes do Biotério do Instituto de Biomedicina da Universidade

Federal do Ceará. Os animais foram distribuídos em grupos de acordo com a dieta, tratamento

e a presença de infecção. A tabela 2 esquematiza a distribuição dos experimentos e a

quantidade de animais utilizados.

Tabela 2 - Método de avaliação, estado nutricional dos animais, substrato testado e número de

animais normais e infectados analisados

Método de Avaliação Substrato teste Normal/Infectado

Coloração Giemsa 3NE/3NH

3DE/3DH

Histomorfometria 3N/ 3E/ 3H

3N/ 3E/ 3H

Câmaras de Üssing Glicose 4N/ 4NE/ 4NH

Glutamina 4N/ 4NE/ 4NH

Alanil-glutamina 4N/ 4NE/ 4NH

Glicose 4D/ 4DE/ 4DH

Glutamina 4D/ 4DE/ 4DH

Alanil-glutamina 4D/ 4DE/ 4DH

PCR para transportadores

intestinais e junções celulares

10N

10D

Imunofluorescência 5N / 5D

5N / 5D

Fonte: Elaborado pela autora

Animal nutrido (N); Animal nutrido infectado com EPEC 2348/69 (NE); Animal nutrido

inoculado com E. coli HS (NH); Animal desnutrido infectado com EPEC 2348/69 (DE);

Animal desnutrido inoculado com E. coli HS (DH).

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3.2 Produção da ração de acordo com a Dieta Básica Regional

A Dieta Básica Regional (DBR) foi feita no laboratório de Farmacotécnica da

Universidade Federal do Ceará, utilizando-se como ingredientes batata-doce (Iponea batatas),

feijão mulatinho (Phaseolus vulgaris), farinha de mandioca (Manihot esculenta), carne de

charque e gordura da própria carne (TEODÓSIO et al., 1990).

Os ingredientes (exceto a farinha de mandioca) foram cozidos e em seguida

desidratados em estufa de esterilização e secagem com circulação de ar (60-70ºC), durante,

aproximadamente, 48 horas. Em seguida, foram moídos em moinho de facas e

homogeneizados em batedeira planetária, acrescentando-se a gordura do charque e carmelose

em gel na proporção total de 2%.

A massa foi então processada em uma extrusora para obtenção de pequenos

pedaços (pellets). Os pellets assim obtidos permaneceram em estufa com circulação de ar

(50ºC-60ºC) durante aproximadamente 24 horas até a sua secagem e solidificação.

A DBR e a ração comercial apresentam em percentagem, respectivamente, os

seguintes nutrientes:

Tabela 3 - Informação nutricional das dietas

Constituintes (%) DBR Ração comercial

Proteínas 7,87 22

Carboidratos 69,67 50,44

Lipídeos 0,8 5,0

Fibras 7,21 10,0

Minerais 1,26 10,0

Valor energético (Kcal) 317,36 338,76

Fonte: Elaborado pela autora

DBR – Dieta Básica Regional.

3.3 Indução da desnutrição experimental

Os animais foram alimentados com as rações descritas na tabela 3 por 7 dias.

Metade deles consumiu a dieta comercial e, a outra metade se alimentou com a ração

deficiente (DBR). O desenvolvimento foi acompanhado pela medida da variação do peso

corporal versus idade.

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3.4 Inóculo bacteriano

As cepas utilizadas neste estudo nos foram fornecidas gentilmente pelo Dr. James

Nataro, da Universidade de Virgínia, E.U.A.

Para encontrar o inóculo adequado para causar infecção aguda nos animais deste

estudo, semeou-se, em Agar MacConkey, amostras de Escherichia coli enteropatogênica cepa

2348/69, essa placa semeada foi incubada a 37ºC por 24 horas.

Após esse período, coletou-se diversas unidades formadoras de colônias (ufc),

transferindo-as para um tubo eppendorff de 1,5 ml contendo 1000 µL de solução salina estéril

tamponada com fosfato (PBS), a fim de obter suspensões bacterianas com densidade ótica (D.

O.) de aproximadamente 0,100 nm, 0,200 nm e 0,280 nm. Destas, semeou-se 50 µL em Agar

MacConkey pelo método de espalhamento em triplicata e incubou-se a 37ºC por 24 horas.

Feito isto, contou-se o número de ufc crescidas e, utilizando-se a seguinte equação

(HÖFLING; GONÇALVES, 2008; TORTORA; FUNKE; CASE, 2012):

Número de ufc x fator de diluição / volume semeado no meio

Obteve-se a contagem de microrganismos viáveis e a densidade ótica correspondente como na

tabela a seguir:

Tabela 4 - Nº de unidades formadoras de colônias e sua densidade ótica

correspondente

D. O. medida Nº de ufc/1 mL

0,0853 nm 6,853E7 ± 2,086E7

0,1335 nm 7,467E8 ± 4,631E7

0,2367 nm 57,67E9 ± 9,262E9 Fonte: Elaborado pela autora

Densidade ótica (D.O.); unidades formadoras de colônias (ufc).

3.5 Modelo de infecção aguda por Escherichia coli enteropatogênica e a bactéria

controle Escherichia coli HS

O modelo de infecção foi semelhante ao descrito por Silva (2002) e Soares

(1996), porém como era outro tipo de animal e de agente infeccioso era necessário saber qual

suspensão induziria uma infecção aguda e qual o período mínimo de contato da bactéria com

a célula hospedeira era necessário para isto.

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Assim, após obter uma suspensão bacteriana de 109ufc/ml, ou seja, com densidade

ótica de aproximadamente 0,23 nm, transferiu-se 100 µL desta para um segundo tubo

eppendorf contendo 900 µL de PBS estéril, repetindo-se esse procedimento até obter

suspensões com fator de diluição igual a 108, 107, 106 e 105.

Foram utilizados camundongos Swiss nutridos e desnutridos, machos, com peso

de 20 a 25 g e de 5 semanas de idade aproximadamente. Os animais foram mantidos em

ambiente fechado, devidamente refrigerado, à temperatura de 22 ºC, sob luz artificial,

recebendo água e ração ad libitum.

Para cada fator de diluição, foram utilizados 3 animais nutridos e 3 animais

desnutridos. Foram anestesiados, por via intramuscular, com cloridrato de cetamina 10% (35

mg/Kg) e cloridrato de xilazina 2% (4 mg/Kg), ambos da Syntec do Brasil Ltda., Cotia, SP,

BRA, após serem mantidos em jejum por 18 horas aproximadamente. A indução foi

conseguida em aproximadamente cinco minutos e a anestesia durou cerca de duas horas;

sendo necessário prolongar o tempo anestésico, injetando um quarto da dose inicial. Após a

anestesia, o animal foi fixado em decúbito dorsal por meio de fita adesiva em mesa cirúrgica

de 30x50cm.

A partir disto, foi feita laparotomia mediana longitudinal, desde o apêndice

xifoide do animal à porção inferior do músculo reto abdominal, identificando a região do íleo

após encontrar o ceco. Perfurou-se a região mesentérica livre de vasos sanguíneos para fazer

as ligaduras com fios de poliéster e, desta forma, isolar dois segmentos ilíacos de 3

centímetros cada.

Após isolamento das alças, injetou-se 200 µL de suspensão bacteriana com

seringa de insulina de 1mL diretamente na região isolada. Logo depois, o intestino delgado

deslocado foi reposicionado na cavidade abdominal e fez-se uma sutura com Fio de Sutura

Agulhado Nylon 3.0 Procare. O tempo foi de 2 e 3 horas de incubação bactéria-hospedeiro.

3.6 Detecção da adesão bacteriana

Depois do período de 2 ou 3 horas, a sutura foi desfeita e os dois segmentos

isolados do íleo foram removidos, limpos com PBS estéril a 4ºC. Cada alça foi armazenada

em cassete previamente identificado, posta em formol 10% por até 24 horas para fixação e,

para desidratar os tecidos, as lâminas foram transferidas para solução de álcool etílico 70% até

o momento de parafinizar, em seguida receberam banhos com sequências alcoólicas em

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concentrações crescentes (álcool 70%, 80%, 90% e absoluto). Os tecidos foram diafanizados

com banhos de xilol e parafinizados (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).

Para detectar a adesão bacteriana, cortou-se com micrótomo manual e, com

albumina, esses microssegmentos de tecido parafinizados foram aderidos a lâminas de

microscopia (CAPUTO; GITIRANA; MANSO, 2010).

Para desparafinizar a fim de corar os tecidos, procedeu-se como descrito no

manual do Giemsa Kit da EasyPath.

As lâminas coradas foram observadas em microscópio Nykon Eclipse E200, com

aumento de 1000 vezes através de lente objetiva de 100x e ocular de 10x. As mesmas foram

fotografadas com câmera NykonCoolpix 4500.

3.7 Avaliação histológica

Após detecção de adesão bacteriana apenas com a suspensão bacteriana de

108ufc/mL e após 3 horas de incubação bactéria-hospedeiro, para análise histomorfométrica,

semeou-se em Agar MacConkey colônias de Escherichia coli enteropatogênica cepa 2348/69

e de Escherichia coli HS. Essas placas semeadas foram incubadas a 37 ± 2ºC por 24 horas.

Após esse período, coletou-se diversas ufc, transferindo-as para um tubo

eppendorff de 1,5 mL contendo 1000 µL de PBS, a fim de obter uma suspensão bacteriana

com densidade ótica de aproximadamente 0,23 nm. Repetindo-se o item 3.5. apenas com essa

suspensão. Em paralelo, foi coletado tecido ilíaco de 3 animais nutridos e desnutridos que não

receberam injeção de suspensão bacteriana, sendo usados como grupo controle.

Depois de 3 horas, a sutura foi desfeita e as duas alças ilíacas foram removidas,

lavadas com PBS estéril a 4ºC para descartar as fezes e as bactérias não aderidas. Cada alça

foi armazenada em cassete previamente identificado, posta em formol 10% por até 24 horas

para fixação até o momento de parafinizar, em seguida foram banhadas com álcool 70%,

80%, 90% e absoluto. Os tecidos foram diafanizados com banhos de xilol e parafinizados

(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2005).

Os tecidos parafinizados foram cortados com micrótomo e, com albumina, esses

microssegmentos de tecido parafinizados foram aderidos a lâminas de microscopia

(CAPUTO; GITIRANA; MANSO, 2010).

Para corar com hematoxilina-eosina (HE), prosseguiu-se a desparafinização com

xilol, depois banhos alcoólicos decrescentes (álcool absoluto, 90%, 80% e 70%). Logo após,

as lâminas foram postas em água destilada, imersas em hematoxilina, lavadas com água

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corrente e mergulhadas em eosina. Depois disto, os segmentos teciduais foram desidratados

com banhos de álcool 70%, 80%, 90% e absoluto, e finalizou-se tal processo com banhos de

xilol (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).

Ao fim do processo, colocou-se as lâminas já coradas, com a secção virada para

cima sobre a superfície de trabalho, sem deixar a lâmina secar; com uma pipeta de Pasteur

aplicou-se uma gota de meio de montagem sobre a lâmina; umedeceu-se a lamínula com xilol,

e cobriu-se a lâmina.

As lâminas coradas foram observadas em microscópio Nykon Eclipse E200 e com

aumento de 40 vezes através de lente objetiva de 4x e ocular de 10x. Elas foram fotografadas

com câmera NykonCoolpix 4500 e, a área dos vilos e a profundidade das criptas foram

medidas pelo programa Image J versão 1.6.0.

3.8 Variação do transporte iônico

3.8.1 O sistema das câmaras de Üssing

Foram utilizados animais com e sem infecção. Semelhante aos trabalhos feitos por

Soares (1996) e Silva (2002), após o abdômen ser aberto na linha mediana, 6 cm do íleo distal

foi seccionado, limpo com PBS a 4ºC e varetado em bastão de vidro. A seguir, foi feita uma

incisão superficial à margem da inserção mesentérica.

O tecido foi rapidamente dissecado da membrana serosa, aberto com bisturi e

cortado em segmentos de linha mesentéricos de 0,5 a 1 cm. Todos esses procedimentos foram

realizados sobre uma placa de Petri em contato com gelo.

Cada segmento foi colocado entre duas hemicâmaras de acrílico, fixadas no

suporte das câmaras. Simultaneamente, as câmaras foram preenchidas com 5 mL de solução

de Krebs glicosado (lado seroso do tecido) e igual volume de solução de Krebs-Manitol (lado

mucoso), previamente aerada. Em seguida, as câmaras foram conectadas e, a circulação do

perfusato foi liberada.

Para a circulação e aeração dos 5mL das soluções perfusoras Krebs-Glicose e

Krebs-Manitol, foi utilizada uma mistura carbogênica de 95% de oxigênio e 5% de dióxido de

carbono. A temperatura do perfusato foi mantida em 37,8ºC pela circulação de água entre as

paredes da camisa dos tubos conectados a uma bomba de circulação termoestável.

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40

As medidas elétricas da corrente de curto circuito (CCC), diferença de potencial

elétrico (DP) e resistência transepitelial (Rt) foram feitas a cada 5 minutos durante todo o

período experimental (90 minutos).

3.8.2 Soluções perfusoras

A solução de Krebs utilizada nos experimentos foi composta por 115 mM de

NaCl, 25 mM de NaHCO3-, 2,4 mM de K2HPO4, 1,2 mM de CaCl2, 1,2 mM de MgCl2, 0,4

mM de KH2PO4 a pH 7.4 (CLARKE, 2009). Desta, 100 mL foram separados em dois

erlenmeyers e em um deles foi adicionado 0,180 g de glicose (10 mM) e no outro, 0,182 g de

manitol (10 mM).

As pontes Krebs-ágar foram feitas preenchendo cânulas de polietileno com a

solução Krebs-ágar composta por 2,4 g de ágar dissolvidos em 50 mL de solução de Krebs

fervida em banho-maria (LIMA et al., 1992).

3.8.3 As soluções – teste com substratos

Os substratos utilizados neste estudo foram:

a) Glicose - Sigma, St.Louis,Mo.,USA.

b) L-glutamina - Sigma, St.Louis,Mo.,USA.

c) L-alanil-glutamina (Rexim SA, Courbevoie, França).

As soluções desses substratos foram feitas nas concentrações de 0,7 mM, 2 mM, 7

mM, 20 mM, 70 mM e 200 mM como descrito em Soares (1996) de modo que cada uma

delas apresentasse 300 mOsm (miliosmois).

3.8.4 Protocolo experimental

As medidas elétricas feitas durante os primeiros 20 minutos foram usadas para

triagem das condições teciduais. Além disto, se, logo após a montagem, um segmento

intestinal apresentasse uma medida de CCC distante da média dos outros segmentos, ele era

substituído por outro (SOARES, 1996).

A cada 10 minutos, 100 µL das soluções perfusoras foram substituídos por 100

µL das soluções teste mencionadas no subitem anterior.

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41

Na fase final do experimento, 200 µL da solução perfusora de Krebs-glicose do

lado seroso foram substituídos por 200 µL de solução de teofilina 1mM (Sigma, St. Louis,

Mo.,USA). O teste com teofilina objetivou testar a estabilidade elétrica da membrana, e caso

o clampeador de voltagem apresentasse uma sobrecarga de corrente em uma das câmaras, os

dados obtidos dessa câmara eram eliminados (SOARES, 1996).

3.8.5 Medidas elétricas

Após as câmaras serem conectadas aos tubos de circulação, com todo o sistema de

manutenção de temperatura e aeração ligado, e as câmaras preenchidas com as soluções

perfusoras, os pré-amplificadores foram ligados e o amperímetro zerado a fim de ser medido e

registrado o potencial elétrico (DP1) espontaneamente gerado pelo sistema.

Para medir a resistência elétrica do sistema, foi aplicada uma corrente de 50 µA,

possibilitando o registro de um novo valor apresentado pelo voltímetro (DP2), com as duas

diferenças, calculou-se a resistência do sistema, usando a Lei de Ohm:

R = ΔDP / i

A seguir, o valor da resistência calculada foi imposto e assim a resistência do

sistema foi zerada, permitindo a medida apenas da R da membrana (Rt).

3.9 Avaliação da transcrição dos genes de transportadores intestinais e das junções

celulares

3.9.1 Extração do RNA total

Na análise da transcrição gênica, foram utilizados 10 animais nutridos e 10

desnutridos sem infecção, dos quais foram removidos 3 cm do íleo distal, lavados com PBS a

4ºC e abertos com tesoura. A mucosa foi raspada com o auxílio de lâminas de microscopia em

um ângulo de 45º, o raspado mucosal foi armazenado em tubo eppendorf a -80ºC até o

momento da extração de mRNA. A extração do RNA foi realizada de acordo com o protocolo

do QiagenRNeasyLipidTissue Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany).

Para lisar as células, adicionou-se 1000 µL de trizol e uma pequena quantidade de

grânulos de vidro aos tubos contendo raspado tecidual. Homogeneizou-se em batedor de

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42

grânulos. Deixou-se o tubo com o homogenato por 5 minutos à temperatura ambiente. Logo

após, centrifugou-se por 5 minutos a 14000 rotações por minuto (rpm) a 4ºC. Transferiu-se o

sobrenadante para outro tubo eppendorf de 2mL. A esse sobrenadante, foram adicionados

200µL de BCP (1-bromo-3-cloropropano, FLUKA 16720), a fim de separar a solução em fase

aquosa e orgânica após agitação por 15 s e centrifugação por 15 min a 12000G. A fase aquosa

que contém o RNA foi transferida para outro tubo e, a ele, foi acrescentado igual volume de

etanol 70%. Essa mistura foi adicionada à coluna mini spin, esta retém o RNA. Centrifugou-

se por 15 segundos a 12000 G a 4ºC e descartou-se o volume do tubo coletor. À coluna, foi

adicionado o tampão RW1. Centrifugou-se novamente e o volume do frasco coletor foi

descartado. Adicionou-se 500µL do tampão RPE e centrifugou-se duas vezes por 15 segundos

e 2 minutos, respectivamente. O frasco coletor foi trocado, repetiu-se a centrifugação por 1

minuto.

Para eluir o RNA contido na coluna, posicionou-se esta em um tubo eppendorf de

1,5 mL, previamente identificado e adicionou-se 30 µL de água RNase-free, centrifugando em

seguida. Sua concentração foi medida através de NanoDrop 2000. E o RNA extraído foi

estocado a -80ºC.

3.9.2 Síntese de cDNA

O mRNA foi transcrito reversamente em cDNA, utilizando iScript™

cDNASynthesis Kit (Bio-RadLaboratories, USA) de acordo com o instruções do fabricante. O

protocolo da reação incluiu 1 µL da enzima trasncriptase reversa, 4 µL do tampão 5x

iScriptReaction Mix (solução constituída de oligonucleotídeos e iniciadores aleatórios), 200

ng/µL de RNA extraído das amostras e completou-se o volume total até 20µL com água livre

de nuclease. Incubou-se a mistura por 5 minutos a 25ºC, 30 minutos a 42ºC e 5 minutos a 8ºC.

Armazenou-se o cDNA em freezer a -20º C até sua posterior utilização no PCR quantitativo

em tempo real (qPCR).

3.9.3 Análise da transcrição dos transportadores e das junções celulares

Como mostra a Tabela 5, foi avaliada a transcrição dos genes ZO-1, Claudina-1,

Claudina-2, Ocludina, SGLT-1, SN-2, CAT-1, PEPT-1, CFTR utilizando o iQ5 Real-Time

PCR Detection System (Bio-RadLaboratories, Estados Unidos ). O gene de referência

utilizado foi o PPIA (peptidylprolyl isomerase A).

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43

Tabela 5 - Oligonucleotídeos iniciadores, suas respectivas sequências e condições de PCR

Genes Sequencias dos iniciadores

(5´ - 3´)

Produto

(pb) Nº NCBI

TºC

anelamento

ZO-1 S – GACCATCGCCTACGGTTTGA

AS – AGGTCTCGGGGATGCTGATT 116

NM_0011

63574.1 60ºC

Claudina-1 S – TCTACGAGGGACTGTGGATG

AS – TCAGATTCAGCAAGGAGTCG 84

NM_0166

74.4 58ºC

Claudina -2 S – CCCACCACCACCAGCTTAAT

AS – GAAATGGCTTCCAGGTCAGC 170

NM_0166

75.4 60ºC

Ocludina S – AAGAGCAGCCAAAGGCTTCC

AS – CGTCGGGTTCACTCCCATTA 199

NM_0087

56.2 60ºC

SGLT-1 S – CGGAAGAAGCGATCTGAGAA

AS – AATCAGCACGAGGATGAACA 63

NM_0198

10.4 58ºC

SN-2 S – ATATCCTCGTCATCTGTGTGC

AS – CAGTAGGTACAATACGGAGGTAGA 120

NM_1724

79.2 60ºC

CAT-1 S – CTTTGGATTCTCTGGTGTCCTGTC

AS – GTTCTTGACTTCTTCCCCTGTGG 97

NM_0075

13.4 58ºC

PEPT-1 S – AGGGGAGAACGGAATCAGGT

AS – CTTTTCGCCAGAAGGGAAGA 130

NM_0530

79.2 60ºC

CFTR S – GGATGCTGAGGAAGCAACTC

AS – CCAGCCTGGAACTCTCTTTG 172

NM_0210

50.2 58ºC

PPIA S – AATGCTGGACCAAACACAAA

AS – TTCCACAATGTTCATGCCTT 117

NM_0089

07.1 58ºC

Fonte: Elaborado pela autora

S – iniciador sense; AS – iniciador antisense

Para a reação foram utilizados 10 µL de Syber Green PCR Master Mix

(AppliedBiosystems, Inglaterra), 2 µL de cada iniciador (0,2 µM) e 1 µL de cDNA das

amostras completando com água livre de nuclease até um volume final de 20µL. Todos os

iniciadores utilizados e as condições da qPCR estão na Tabela 5.

Para assegurar a especificidade das amplificações, foi realizada após cada reação

uma curva de fusão, na qual a temperatura da reação foi aumentada a cada 15 s em 0,5 °C,

começando a partir da temperatura de anelamento dos iniciadores e terminando a 95 °C.

Durante todo o processo de construção da curva, as alterações na fluorescência foram

medidas, e os dados foram obtidos com o software do sistema óptico iQ5 (versão 2,0; Bio-

Rad) e foram baseados nos valores do ciclo de limiar, em que a fluorescência observada é de

10 vezes maior do que a fluorescência basal para cada ensaio de qPCR. A expressão da

transcrição dos genes foi obtida através do software REST 2009 (QIAGEN) baseado na

aplicação do método matemático de Pfaffl (PFAFFL; HORGAN; DEMPFLE, 2002) que

utiliza um teste de significância aleatória, com intervalo de confiança de 95% e P < 0,05.

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44

3.10 Reação de Imunofluorescência

As alças de íleo nutrido e desnutrido não infectado foram removidas, limpas com

PBS estéril a 4ºC, a alça foi fixada por paraformaldeído 4% por até 24 horas e, para desidratar

os tecidos, eles foram mantidos em álcool etílico 70% até o momento de parafinizar, depois

foram banhados em álcool 70%, 80%, 90% e absoluto. O clareamento foi conseguido com

banhos de xilol. Em seguida, os tecidos foram parafinizados (CAPUTO; GITIRANA;

MANSO, 2010).

Após síntese dos blocos de parafina, os microssegmentos teciduais foram obtidos

com micrótomo manual e aderidos às lâminas de microscopia.

A realização da técnica de imunofluorescência foi orientada pelo manual do

Immunofluorescence kit for VIP (human, porcine, rat) Peninsula Laboratories, código PENI -

IFK7161.

Prosseguindo-se inicialmente com a desparafinização através de 3 lavagens com

xileno, 5 minutos cada. Feito isto, lavou-se duas vezes, 5 minutos cada, com etanol 100% e

95%. Posteriormente, lavou-se 1 vez, por 5 minutos em etanol 80%, 70% e 50%. Por fim,

lavou-se duas vezes, 5 minutos cada, em água. Após essas lavagens, as lâminas foram

mergulhadas em recipiente contendo tampão de recuperação (citrato de sódio) e postas em

forno microondas na potência máxima, até começar a ferver. Depois, reduziu-se a potência

por 9 minutos. Retirou-se do forno e deixou-se arrefecer à temperatura ambiente durante 20

minutos. As lâminas foram lavadas três vezes com água, 5 minutos cada.

Escorreu-se as lâminas, sem deixar ressecar. Desenhou-se uma barreira

hidrofóbica ao redor de cada tecido e colocou-se as lâminas na água e depois em PBS por 5

minutos. Depois, colocou-se as lâminas em um recipiente contendo tampão de

permeabilização (0,2% Triton X-100 em PBS) por 45 minutos à temperatura ambiente.

Lavou-se com PBS por 5 minutos. O excesso de PBS foi removido com papel toalha. Logo

após, elas foram postas na horizontal em câmara umidificada. Sobre as secções teciduais,

adicionou-se tampão de bloqueio (soro de animal normal 4% mais BSA/PBS 1%), utilizando

uma pipeta. Fechou-se a câmara úmida e incubou-se durante 1 hora à temperatura ambiente.

As lâminas foram lavadas três vezes, 5 minutos cada, com PBS.

Com papel toalha, o excesso de PBS foi retirado e, as lâminas foram repostas

horizontalmente em câmara umidificada. Adicionou-se o anticorpo primário a cada secção

tecidual. Fechou-se a câmara umidificada e incubou-se durante a noite a 4°C. Os anticorpos

primários utilizados foram SGLT-1 (Santa Cruz #SC98974, diluído em 1:200), SN-1 (Santa

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Cruz #SC33445, na concentração de 1:200), SN-2 (Santa Cruz #SC50682, concentração

utilizada: 1:200), PEPT-1 (Santa Cruz #SC20653, concentração usada: 1:200), ambos diluídos

em tampão de bloqueio.

Os anticorpos secundários utilizados foram Alexa fluor 488 anti-rabbit e anti-

goat e Alexa Fluor 594 ambos da (Invitrogen) diluídos em tampão de bloqueio em 1:250. Para

adicionar o anticorpo secundário, lavou-se as lâminas 3 vezes, 5 minutos cada, com PBS e

enxugou-se o excesso com papel toalha e novamente incubou-se as lâminas horizontalmente

em câmara úmida. Os anticorpo foi posto sobre as secções, protegido da luz, durante 1 hora a

temperatura ambiente. Após esse período, lavou-se três vezes, 5 minutos cada, com PBS.

Posteriormente, as lâminas foram retiradas do recipiente contendo PBS, e o

excesso deste foi removido. Adicionou-se, sobre os tecidos, DAPI (4'6'-diamidino-2-

fenilindol) da Invitrogen (#D1306) diluído a 1:300 em Fluormount-G (Fisher, #0100-01), a

fim de corar o núcleo celular. Excluiu-se as bolhas, deixou-se secar em ambiente escuro por 1

hora. As bordas foram seladas com caneta hidrofóbica. Aguardou-se 15 minutos para secar no

escuro, depois armazenou-se a 4ºC no escuro.

As lâminas foram observadas em fotomicroscópio de campo escuro com epi-

iluminação (Zeissaxioscan) com filtro de 490 nm de comprimento de onda, acoplado à câmara

de fotografia convencional.

3.11 Análise Estatística

Todos os resultados foram analisados por análise de variância pelo teste ANOVA

e pós-teste Bonferroni, pelo teste de hipótese não pareado de t-Student unicaudal ou pelo teste

t-Student não paramétrico (Mann Whitney) através do programa GraphPad Prism 5.0. O nível

de significância do teste foi α = 0,05, ou seja, P < 0,05 e o intervalo de confiança foi de 95%.

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46

4 RESULTADOS

4.1 Crescimento dos animais de acordo com a ração consumida

As curvas de peso versus idade dos animais (Figura 4) obtidas com a dieta

comercial padrão e a dieta básica regional permitiram o estabelecimento de uma referência de

desenvolvimento dos animais utilizados nos experimentos. Assim, os resultados mostram que

os animais alimentados com a dieta básica regional tiveram um menor ganho de peso,

havendo diferença significativa de desenvolvimento entre os grupos (P < 0,05).

Figura 4 – Variação do crescimento de camundongos

Variação do peso vs. idade de animais

28 3510

15

20

25

30

Dieta padrão

Dieta básica regional*

Idade (dias)

Peso

(g

)

Fonte: Elaborado pela autora

Crescimento de camundongos (Mus musculus) Swiss, machos, 28 a 35

dias de idade submetidos à ração comercial (n = 10) e à dieta básica

regional (n = 10) durante 7 dias. A análise estatística foi realizada pelo

teste não pareado de t-Student unicaudal. (*) – P < 0,05.

4.2 Detecção da adesão bacteriana

Por microfotografia em maior aumento do material de biópsia do intestino

delgado (íleo) de camundongos nutridos e desnutridos, pôde-se observar a presença de nichos

bacterianos aderidos à superfície epitelial quando o tempo de infecção foi de 3h, após injeção

direta de 200µL de suspensão bacteriana contendo 108ufc/ mL (EPEC 2348/69) no íleo

(figura 5 A e B; figura 5 C e D). Nas figuras 8 A e B, não se visualiza adesão direta da E. coli

HS ao epitélio intestinal, mas o seu acúmulo na região central do lúmen.

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Figura 5 - Microfotografia de íleo de camundongo Swiss infectado com 108ufc/mL de

EPEC 2348/69 corado com Giemsa

Fonte: Elaborado pela autora

A e B: Grupo nutrido. C e D: Grupo desnutrido. Objetiva de 40x (A, B e D) e de 10x (C). Círculo vermelho

indica os grumos bacterianos aderidos às células epiteliais (aderência localizada). Fonte: Laboratório de

Doenças Infecciosas – UFC.

Figura 6 - Microfotografia de íleo de camundongo Swiss infectado com 108ufc/mL de E.

coli HS corado com Giemsa

Fonte: Elaborado pela autora

A: Grupo nutrido. B: Grupo desnutrido. Objetiva de 10x. Círculo vermelho indica a presença de grumos

bacterianos no lúmen intestinal. Fonte: Laboratório de Doenças Infecciosas – UFC.

4.3 Avaliação histomorfométrica

A figura 7 mostra que a área dos vilos intestinais não sofreu alteração significativa

com a presença das bactérias ou com a desnutrição (P > 0,05) quando comparados com o

B

A

A

C D

Vilosidades

Vilosidade

Vilosidade

Vilosidades Vilosidade

B

Vilosidades

Lúmen

Vilosidades

Lúmen

A

Vilosidades

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48

grupo nutrido, ademais, a E. coli HS também não altera a área absortiva durante a desnutrição.

Já a EPEC, no tecido desnutrido, reduziu significativamente a área vilositária.

A E. coli HS tem efeito similar sobre os vilos nutridos e desnutridos, enquanto

que a EPEC altera muito mais a área vilositária quando o íleo está desnutrido.

Figura 7 - Área dos vilos intestinais na presença de

desnutrição e ou infecção

ÁREA DOS VILOS

N NE NH D DE DH0

5.010-3

1.010-2

1.510-2

2.010-2

2.510-2

*

*

mm

²

Fonte: Elaborado pela autora

Nutridos sem bactérias (N); nutridos infectados com EPEC (NE);

nutridos inoculados com E. coli HS (NH); desnutridos sem bactérias

(D); desnutridos com EPEC (DE); desnutridos com E. coli HS (DH).

N = 3 animais/ grupo. A análise estatística foi realizada por ANOVA e

pós-teste Bonferroni. (*) – P < 0,05.

A figura 8 mostra que a desnutrição e a infecção com E. coli HS reduz

significativamente a profundidade das criptas (P < 0,05). No entanto, a infecção com EPEC

nos animais nutridos não alterou de forma significativa as criptas (P > 0,05). Além disto, a E.

coli HS e a EPEC também não reduziram ainda mais a profundidade das criptas intestinais (P

> 0,05) já reduzida pela desnutrição.

A E. coli HS reduz a profundidade das criptas dos desnutridos tanto quanto reduz

nos nutridos. No entanto, a EPEC reduz a profundidade das criptas somente quando o

intestino está desnutrido.

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Figura 8 - Variação da profundidade das criptas na

presença de infecção e ou desnutrição

CRIPTAS

0

50

100

150

200

N NE NH DED DH

*

*

*

m

Fonte: Elaborado pela autora

Nutridos sem bactérias (N); nutridos infectados com EPEC (NE);

nutridos inoculados com E. coli HS (NH); desnutridos sem bactérias

(D); desnutridos com EPEC (DE); desnutridos com E. coli HS (DH).

N = 3 animais/ grupo. A análise estatística foi realizada por ANOVA e

pós-teste Bonferroni. (*) – P < 0,05.

4.4 Variação do transporte iônico em íleo de camundongos

A figura 9 mostra que a desnutrição, a infecção aguda com EPEC e inoculação de

E. coli HS reduz significativamente (P < 0,05) a CCC basal no íleo.

Quando se comparou o grupo desnutrido não infectado com o grupo desnutrido

inoculado com E. coli HS, percebeu-se que essa bactéria aumenta a CCC basal

significativamente (P < 0,05). Diferentemente, a EPEC não consegue reduzir ainda mais essa

corrente já diminuída pela desnutrição (P > 0,05).

A inoculação da E. coli HS teve efeitos diferentes quando o tecido era nutrido ou

desnutrido. Enquanto que a EPEC reduz a CCC de forma semelhante nos dois estados de

nutrição.

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Figura 9 - Comparação da CCC basal entre os grupos

nutridos e desnutridos inoculados ou não com E. coli

enteropatogênica ou HS

CCC BASAL

N NE NH D DE DH0

50

100

150*

**

*

*

A

/cm

²

Fonte: Elaborado pela autora

Nutridos sem bactérias (N); nutridos infectados com EPEC (NE);

nutridos inoculados com E. coli HS (NH); desnutridos sem bactérias

(D); desnutridos com EPEC (DE); desnutridos com E. coli HS (DH).

A análise estatística foi realizada por ANOVA e teste de Bonferroni.

(*) – P < 0,05.

A tabela 6 mostra o efeito da solução de glicose em diversas concentrações sobre

a corrente de curto circuito. De acordo com a análise de variância (ANOVA), nos animais

nutridos, a glicose teve efeito significativo quando se adicionou às hemi-câmaras a solução de

70 mM (ΔCCC = 201,7 ± 42,11 µA/cm²) e 200 mM de glicose (ΔCCC = 209,7 ±

42,21µA/cm²), ocorrendo de forma semelhante entre os animais desnutridos, pois a adição da

solução de 70 mM e 200 mM de glicose no meio luminal caracterizou um aumento

significativo na CCC (ΔCCC = 199,9 ± 25,44 µA/cm² e ΔCCC = 324,7 ± 45,42 µA/cm²,

respectivamente). Todavia, entre os grupos infectados, apenas os desnutridos infectados com

EPEC responderam significativamente à 200 mM de glicose, havendo um aumento de 312,5±

62,36 µA/cm² na CCC.

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Tabela 6 - Variação da CCC após adição cumulativa de glicose

Grupo [Gli] ΔCCC µA/cm² p < 0,05 Grupo [Gli] ΔCCC µA/cm² p < 0,05

N 1mM 17,25 ± 6,946

D 1mM 8,848 ± 7,321

2mM 50,43 ± 10,21

2mM 14,15 ± 6,192

7mM 78,29 ± 12,74

7mM 39,81 ± 14,90

20mM 127,4 ± 27,88

20mM 91,12 ± 24,72

70mM 201,7 ± 42,11 * 70mM 199,9 ± 25,44 *

200mM 209,7 ± 42,21 * 200mM 324,7 ± 45,42 *

NE 1mM 22,12 ± 13,78

DE 1mM 25,88 ± 12,57

2mM 30,08 ± 14,09

2mM 47,77 ± 23,02

7mM 32,73 ± 16,33

7mM 118,4 ± 66,21

20mM 41,58 ± 21,67

20mM 125,4± 42,39

70mM 69,00 ± 32,04

70mM 230,9 ± 50,47

200mM 102,6 ± 38,26

200mM 312,5± 62,36 *

NH 1mM -19,91± 31,26

DH 1mM 20,70 ± 25,00

2mM -27,87± 32,90

2mM 3,184 ± 54,68

7mM 71,66± 40,73

7mM 36,62 ± 79,16

20mM 75,64± 57,83

20mM 62,10 ± 115,5

70mM 81,61± 89,92

70mM 87,58 ± 136,8

200mM 103,5± 106,6

200mM 84,40 ± 178,3 Fonte: Elaborado pela autora

Animais nutridos (N) N = 6; Animais desnutridos (D) N = 9; Animais nutridos infectados com EPEC 2348/69

(NE) N = 14; Animais desnutridos infectados com EPEC 2348/69 (DE) N = 10; Animais nutridos inoculados

com Escherichia coli HS (NH) N = 7; Animais desnutridos inoculados com Escherichia coli HS (DH) N = 8.

Valores (média ± e. p. m.). A análise estatística foi realizada por ANOVA e pós-teste Bonferroni e pelo teste T

não paramétrico – teste Mann Whitney. (*) – P < 0,05 significativo pelo teste ANOVA; (**) – P < 0,05

significativo pelo teste T não paramétrico – teste Mann Whitney.

Nas figuras 10, 11 e 12, estão representados os valores experimentais, o número

de experimentos realizados e a curva dose-resposta da glicose adicionada cumulativamente à

solução de Krebs-Manitol do lado mucoso dos grupos nutridos e desnutridos sem infecção,

infectados com EPEC e inoculados com E. coli HS, respectivamente.

Os valores de Ec50 mostram qual dose de glicose é necessária para atingir a

metade do efeito máximo. A comparação entre os grupos pelo teste t Student não pareado

unicaudal mostra que os animais nutridos infectados com EPEC e os desnutridos sem

infecção necessitam de uma maior dose de glicose para obterem uma resposta máxima.

Enquanto nos desnutridos infectados com E. coli HS, é preciso de uma menor dose para isto.

Além disto, os valores da constante hiperbólica S que são próximos a 10 (grupos

nutrido, nutrido infectado com EPEC e nutrido inoculado com E. coli HS) indicam um

comportamento clássico das curvas de dose-resposta, ou seja, coeficiente de Hill igual a 1

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(ARIENS et al., 1977; SOARES, 1996). Enquanto que os demais grupos não apresentam uma

curva dose-resposta clássica, pois seu coeficiente de Hill é igual a 1,262 (desnutridos), 1,248

(desnutridos infectados com EPEC) e 1,1756 (desnutridos infectados com E. coli HS).

Em relação à resposta máxima, a comparação entre os grupos pelo teste t Student

não pareado e unicaudal mostra que só há diferença significativa (P < 0,05) entre os nutridos e

desnutridos infectados com EPEC.

Figura 10 - Curva dose-resposta cumulativa da glicose

Curva dose-resposta da glicoseAnimais nutridos

012340

100

200

300

400RespResp teórica

pD2 = 1,96 Ec50 = 10,87 mM

Rmáx = 209,7 A/cm²S = 7 n = 6

Resp teórica = Rmáx/(1+ S(pD-pD2)

)

pD (-logDose)

C

CC

(

A/c

m²)

Curva dose-resposta da glicose

Animais desnutridos

1234-100

0

100

200

300

400

500RespResp teórica

pD2 = 1,30 Ec50 = 50,44mM

Rmáx = 324,7 A/cm²S = 18 n = 9

Resp teór = Rmáx/(1+ S(pD-pD2))

pD (-logDose)

C

CC

(

A/c

m²)

Fonte: Elaborado pela autora

A: Grupo nutrido sem infecção. B: Grupo desnutrido sem infecção. Valores (média ± e.

p. m.). S = 10coef. Hill. Número de experimentos (N).

A

B

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53

Figura 11 - Curva dose-resposta cumulativa da glicose

Curva dose-resposta da glicose

Animais nutridos infectados com EPEC

1234

-100

0

100

200

300

Resp teóricaResp

pD2 = 1,636 Ec50 = 35,44 mM

Rmáx = 102,6 A/cm²S = 8 n = 9

Resp teórica = Rmáx/(1+SpD-pD2)

pD (-logDose)

C

CC

(

A/c

m²)

Curva dose-resposta da glicose

Animais desnutridos infectados com EPEC

1234

-200

0

200

400

600

Resp teóricaResp

pD2= 1,643 Ec50 = 38,38 mM

Rmáx = 312,5 A/cm²S = 18 n = 8

Resp teórica = Rmáx/1+S(pD-pD2)

pD (-logDose)

C

CC

(

A/c

m²)

Fonte: Elaborado pela autora

A: Grupo nutrido infectado com Escherichia coli enteropatogênica (EPEC). B: Grupo

desnutrido infectado com Escherichia coli enteropatogênica (EPEC). Valores (média ±

e. p. m.). S = 10coef. Hill. Número de experimentos (N).

A

B

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54

Figura 12 - Curva dose-resposta cumulativa da glicose

Curva dose-resposta da glicose

Animais nutridos infectados com E. coli HS

1234

-100

0

100

200

300Resp

Resp teórica

pD2 = 2,22 Ec50 = 6,00 mM

Rmáx = 103,5 A/cm²S = 9 n = 4

Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD-pD2))

pD (-logDose)

C

CC

(

A/c

m²)

Curva dose-resposta da glicose

Animais desnutridos infectados com E. coli HS

1234

-100

0

100

200

300Resp

Resp teórica

pD2 = 2,06 Ec50 = 8,7 mM

Rmáx = 84,40 A/cm²S = 17 n = 5

Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD-pD2))

pD (-logDose)

C

CC

(

A/c

m²)

Fonte: Elaborado pela autora

A: Grupo nutrido infectado com Escherichia coli HS. B: Grupo desnutrido infectado

com Escherichia coli HS. Valores (média ± e. p. m.). S = 10coef. Hill. Número de

experimentos (N).

A tabela 7 mostra o efeito da solução de glutamina em diversas concentrações

sobre a corrente de curto circuito. Nos nutridos, a adição de 70 mM de glutamina causou

aumento significativo na CCC (ΔCCC =170,4± 38,24 µA/cm²). Nos desnutridos, as soluções

de 70 mM e 200 mM também aumentaram significativamente a CCC (ΔCCC = 192,5 ± 39,89

µA/cm² e 236,7 ± 43,32 µA/cm²). Nos nutridos infectados com EPEC, apenas adição da

solução de 200 mM desse substrato aumentou significativamente a CCC (ΔCCC = 167,9±

33,86 µA/cm²). Pela ANOVA e pelo teste t Student Mann Whitney, nos desnutridos

infectados com E. coli HS, a glutamina teve efeito significativo quando se adicionou às hemi-

câmaras a solução de 70 mM (ΔCCC = 85,59 ± 21,65 µA/cm²) e 200 mM de glicose (ΔCCC

= 95,54 ± 21,80 µA/cm²).

A

B

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55

Tabela 7 - Variação da CCC após adição cumulativa de glutamina

Grupo [Gln] ΔCCC µA/cm² p < 0,05 Grupo [Gln] ΔCCC µA/cm² p < 0,05

N 1mM 22,29± 9,215

D 1mM 15,20 ± 5,52

2mM 28,66 ± 13,70

2mM 24,61 ± 6,21

7mM 54,14± 20,05

7mM 56,46 ± 11,88

20Mm 151,3± 56,97

20mM 99,88 ± 21,18

70mM 170,4± 38,24 *

70mM 192,5 ± 39,89 *

200mM 156,0± 19,60

200mM 236,7 ± 43,32 *

NE 1mM -18,82 ± 28,63

DE 1mM -4,778 ± 8,977

2mM 19,54 ± 10,21

2mM 8,756 ± 8,757

7mM 41,25 ± 16,45

7mM -7,963± 19,50

20mM 36,19 ± 54,66

20mM 21,50 ± 22,89

70mM 114,4 ± 28,06

70mM 74,04 ± 23,47

200mM 167,9± 33,86 *

200mM 62,10 ± 42,74

NH 1mM 3,978 ± 13.20

DH 1mM 1,990 ± 3,811

2mM 9,948 ± 25.46

2mM 5,973 ± 5,973

7mM 35,83 ± 51.24

7mM 33,84 ± 16,05

20mM 89,57 ± 59.70

20mM 45,78 ± 16,05

70mM 119,40 ± 94.09

70mM 85,59 ± 21,65 */**

200mM 149,30 ± 104.80

200mM 95,54 ± 21,80 */** Fonte: Elaborado pela autora

Animais nutridos (N) N = 6; Animais desnutridos (D) N = 11; Animais nutridos infectados com EPEC 2348/69

(NE) N = 15; Animais desnutridos infectados com EPEC 2348/69 (DE) N = 12; Animais nutridos inoculados

com Escherichia coli HS (NH) N = 6; Animais desnutridos inoculados com Escherichia coli HS (DH) N = 5.

Valores (média ± e. p. m.) A análise estatística foi realizada por ANOVA e pós-teste Bonferroni e pelo teste T

não paramétrico – teste Mann Whitney. (*) – P < 0,05 significativo pelo teste ANOVA; (**) – P < 0,05

significativo pelo teste T não paramétrico – teste Mann Whitney.

Nas figuras 13, 14 e 15 estão representados os valores experimentais, o número de

experimentos realizados e a curva dose-resposta da glutamina adicionada cumulativamente à

solução de Krebs-Manitol do lado mucoso dos grupos nutridos e desnutridos sem infecção,

infectados com EPEC e inoculados com E. coli HS, respectivamente.

Os valores de Ec50 mostram qual dose de glutamina é necessária para atingir a

metade do efeito máximo. A comparação entre os grupos pelo teste t Student não pareado

unicaudal mostra que não há diferença significativa entre o Ec50 dos grupos analisados.

Mesmo assim, o grupo que requer uma menor dose para atingir a metade do efeito máximo é

o grupo nutrido inoculado com E. coli HS (Ec50 = 13 mM), seguido pelo desnutrido infectado

com E. coli HS (Ec50 = 17,75 mM), nutrido (Ec50 = 19 mM), desnutrido (Ec50 = 24,9 mM),

nutrido infectado com EPEC (Ec50 = 33,82 mM), desnutrido infectado com EPEC (Ec50 =

43,56 mM).

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56

Ademais, todos os grupos estudados apresentam valores da constante hiperbólica

S próximos a 10 (coeficiente de Hill igual a 1), exceto os grupos desnutrido sem infecção

(coeficiente de Hill = 1,426) e o infectado com E. coli HS (coeficiente de Hill = 1,675), o que

indica que as inclinações das curvas seguem um comportamento clássico das curvas de dose-

resposta.

Em relação à resposta máxima, a comparação entre os grupos pelo teste t Student

não pareado e unicaudal mostra que só há diferença significativa (P < 0,05) entre os

desnutridos sem infecção e os desnutridos infectados com EPEC e E. coli HS.

Figura 13 - Curva dose-resposta cumulativa da glutamina

Curva dose-resposta da glutamina

Animais nutridos

012340

100

200

300RespResp teórica

pD2 = 1,854 Ec50 = 19 mM

Rmáx = 156,0 A/cm²S = 8 n = 5

Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD- pD2))

pD (-logDose)

C

CC

(

A/c

m²)

Curva dose-resposta da glutamina

Animais desnutridos

012340

100

200

300

pD2 = 1,60 Ec50 = 24,9 mM

Rmáx = 236,7 A/cm²

S = 27 n = 11

Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD-pD2))

Resp

Resp teórica

pD (-logDose)

C

CC

(

A/c

m²)

Fonte: Elaborado pela autora

A: Grupo nutrido sem infecção. B: Grupo desnutrido sem infecção. Valores (média ± e.

p. m.). S = 10coef. Hill. Número de experimentos (N).

A

B

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57

Figura 14 - Curva dose-resposta cumulativa da glutamina

Curva dose-resposta da glutamina

Animais nutridos infectados com EPEC

1234

-200

-100

0

100

200

300

Resp teóricaResp

pD2 = 1,669 Ec50 = 33,82 mM

Rmáx = 167,9 A/cm²

S = 8 n = 11

Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD-pD2))

pD (-logDose)

C

CC

(

A/c

m²)

Curva dose-resposta da glutamina

Animais desnutridos infectados com EPEC

1234

-100

0

100

200

300

Resp teóricaResp

pD2 = 1,603 Ec50 = 43,56 mM

Rmáx = 62,10 A/cm²S = 9 n = 10

Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD-pD2))

pD (-logDose)

C

CC

(

A/c

m²)

Fonte: Elaborado pela autora

A: Grupo nutrido infectado com Escherichia coli enteropatogênica (EPEC). B: Grupo

desnutrido infectado com Escherichia coli enteropatogênica (EPEC). Valores (média ±

e. p. m.). S = 10coef. Hill. Número de experimentos (N).

A

B

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58

Figura 15 - Curva dose-resposta cumulativa da glutamina

Curva dose-resposta da glutamina

Animais nutridos infectados com E. coli HS

1234-100

0

100

200

300

400Resp

pD2 = 1,987 Ec50 = 13 mM

Rmáx = 123,4 A/cm²S = 7 n = 4

Resp teórica = Rmáx/(1+S (pD-pD2)

Resp teórica

pD (-logDose)

C

CC

(

A/c

m²)

Curva dose-resposta da glutamina

Animais desnutridos infectados com E. coli HS

1234

-50

0

50

100

150

Resp teóricaResp

pD2 = 1,895 Ec50 = 17,75 mM

Rmáx = 95,54 A/cm²

S = 47 n = 4

Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD- pD2))

pD (-logDose)

C

CC

(

A/c

m²)

Fonte: Elaborado pela autora

A: Grupo nutrido infectado com Escherichia coli HS. B: Grupo desnutrido infectado

com Escherichia coli HS. Valores (média ± e. p. m.). S = 10coef. Hill. Número de

experimentos (N).

A tabela 8 mostra o efeito da solução de alanil-glutamina em diversas

concentrações sobre a corrente de curto circuito.

Nos animais nutridos e desnutridos sem infecção, houve aumento significativo da

CCC após a adição das soluções de 70 mM (ΔCCC = 186,3 ± 34,39 µA/cm² e 204,4 ± 30,12

µA/cm², respectivamente) e 200 mM de alanil-glutamina (ΔCCC = 234,1 ± 61,29µA/cm² e

282,6 ± 39,10 µA/cm², respectivamente).

Nos animais nutridos infectados com EPEC, esse dipeptídeo teve efeito

significativo após adição das soluções de 20 mM, 70 mM e 200 mM, causando um aumento

de 123,1 ± 18,02µA/cm², 161,1 ± 23,22 µA/cm² e 207,6 ± 27,82 µA/cm² na CCC.

Nos animais desnutridos infectados com EPEC, a alanil-glutamina causou um

significativo aumento de 116,4 ± 21,33 µA/cm² e de 184,1 ± 37,54 µA/cm², após a adição de

70 mM e 200 mM de alanil-glutamina, respectivamente. De forma similar, os nutridos

inoculados E. coli HS responderam significativamente após a adição de 70 mM e 200 mM de

alanil-glutamina, sofrendo um aumento na CCC de 100,8 ± 27,71 µA/cm² e 111,5 ± 24,32

µA/cm².

A

B

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59

Já os desnutridos infectados com E. coli HS responderam significativamente à

alanil-glutamina somente após adição da solução de 200 mM desse substrato, sofrendo um

aumento significativo de 95,54 ± 21,06 µA/cm² na CCC.

Tabela 8 - Variação da CCC após adição cumulativa de alanil-glutamina

Grupo [Ala-Gln] ΔCCC µA/cm² p < 0,05 Grupo [Ala-Gln] ΔCCC µA/cm² p < 0,05

N 1mM 14.33 ± 4,641

D 1mM 10.62 ± 3,358

2mM 27,07 ± 5,958

2mM 23,89 ± 6,818

7mM 52,54 ± 8,574

7mM 49,10 ± 10,36

20mM 117,8 ± 13,42

20mM 100,9 ± 18,92

70mM 186,3 ± 34,39 *

70mM 204,4 ± 30,12 *

200mM 234,1 ± 61,29 *

200mM 282,6 ± 39,10 *

NE 1mM 23,27 ± 5,735

DE 1mM 21,90 ± 11,23

2mM 45,32 ± 8,475

2mM 37,82 ± 14,65

7mM 75,95 ± 11,42

7mM 56,73 ± 13,07

20mM 123,10 ± 18,02 *

20mM 78,63 ± 10,79

70mM 169,00 ± 19,17 *

70mM 116,4 ± 21,33 *

200mM 207,60 ± 27,82 *

200mM 184,1 ± 37,54 *

NH 1mM 10.61 ± 2,653

DH 1mM 10,62 ± 7,019

2mM 23.88 ± 4,593

2mM 10,62 ± 5,308

7mM 47.77 ± 7,960

7mM 23,88 ± 4,596

20mM 69.00 ± 11,57

20mM 42,46 ± 7,020

70mM 100.8 ± 27,71 *

70mM 58,39 ± 7,019

200mM 111.5 ± 24,32 *

200mM 95,54 ± 21,06 *

Fonte: Elaborado pela autora

Animais nutridos (N) N = 5; Animais desnutridos (D) N = 6; Animais nutridos infectados com EPEC 2348/69

(NE) N = 14; Animais desnutridos infectados com EPEC 2348/69 (DE) N = 11; Animais nutridos inoculados

com Escherichia coli HS (NH) N = 16; Animais desnutridos inoculados com Escherichia coli HS (DH) N = 6.

Valores (média ± e. p. m.) A análise estatística foi realizada por ANOVA e pós-teste Bonferroni e pelo teste T

não paramétrico – teste Mann Whitney. (*) – P < 0,05 significativo pelo teste ANOVA; (**) – P < 0,05

significativo pelo teste T não paramétrico – teste Mann Whitney.

Nas figuras 16, 17 e 18 estão representados os valores experimentais, o número de

experimentos realizados e a curva dose-resposta da alanil-glutamina adicionada

cumulativamente à solução de Krebs-Manitol do lado mucoso dos grupos nutridos e

desnutridos sem infecção, infectados com EPEC e inoculados com E. coli HS,

respectivamente.

Os valores de Ec50 mostram qual dose de alanil-glutamina é necessária para

atingir a metade da resposta máxima. A comparação entre os grupos pelo teste t Student não

pareado unicaudal mostra que não há diferença significativa entre o Ec50 dos grupos

analisados, exceto entre os grupos nutridos e desnutridos infectados com EPEC. Ainda assim,

o grupo que necessita de uma menor dose para atingir a metade da resposta máxima é o grupo

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60

nutrido inoculado com E. coli HS (Ec50 = 10,67 mM), seguido pelo nutrido infectado com

EPEC (Ec50 = 15,08 mM), nutrido sem infecção (Ec50 = 21 mM), desnutrido (Ec50 = 36,33

mM), desnutrido infectado com EPEC (Ec50 = 37,63 mM), desnutrido infectado com E. coli

HS (Ec50 = 39,67mM).

Outrossim, apenas os grupos desnutridos infectados com EPEC e com E. coli HS

apresentam coeficiente de Hill distante de 1 (0,7775 e 0,6500, respectivamente) e,

conseguintemente, possuem valores da constante hiperbólica S diferentes de 10, portanto

essas curvas dose-resposta não seguem um comportamento clássico.

Em relação à resposta máxima, a comparação entre os grupos pelo teste t Student

não pareado e unicaudal mostra que só há diferença significativa (P < 0,05) entre os

desnutridos sem infecção e os desnutridos infectados com EPEC e E. coli HS.

Figura 16 - Curva dose-resposta cumulativa da alanil-glutamina

Curva dose-resposta da alanil-glutamina

Animais nutridos

012340

100

200

300

400RespResp teórica

pD2 = 1,754 Ec50 = 21 mM

Rmáx = 234,1 A/cm²S = 13 n = 5

Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD-pD2))

pD (-logDose)

C

CC

(

A/c

m²)

Curva dose-resposta da alanil-glutamina

Animais desnutridos

012340

100

200

300

400

Resp teóricaResp

pD2 = 1,483 Ec50 = 36,33 mM

Rmáx = 282,6 A/cm²

S = 12 n = 6

Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD-pD2))

pD (-logDose)

C

CC

(

A/c

m²)

Fonte: Elaborado pela autora

A: Grupo nutrido sem infecção. B: Grupo desnutrido sem infecção. Valores (média ± e.

p. m.). S = 10coef. Hill. Número de experimentos (N).

A

B

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61

Figura 17 - Curva dose-resposta cumultiva da alanil-glutamina

Curva dose-resposta da alanil-glutamina

Animais nutridos infectados com EPEC

012340

100

200

300

400

Resp teóricaResp

pD2 = 1,925 Ec50 = 15,08 mM

Rmáx = 207,6 A/cm²S = 9 n = 13

Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD-pD2))

pD (-logDose)

C

CC

(

A/c

m²)

Curva dose-resposta da alanil-glutamina

Animais desnutridos infectados com EPEC

1234-100

0

100

200

300

400

Resp teóricaResp

pD2 = 1,483 Ec50 = 37,63 mM

Rmáx = 184,1 A/cm²S = 6 n = 8

Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD-pD2))

pD (-logDose)

C

CC

(

A/c

m²)

Fonte: Elaborado pela autora

A: Grupo nutrido infectado com Escherichia coli enteropatogênica (EPEC). B: Grupo

desnutrido infectado com Escherichia coli enteropatogênica (EPEC). Valores (média ±

e. p. m.). S = 10coef. Hill. Número de experimentos (N).

A

B

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62

Figura 18 - Curva dose-resposta cumultiva da alanil-glutamina

Curva dose-resposta da alanil-glutamina

Animais nutridos infectados com E. coli HS

012340

50

100

150

200

Resp teóricaResp

pD2 = 1,987 Ec50 = 10,67 mM

Rmáx = 111,5 A/cm²S = 8 n = 3

Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD-pD2))

pD (-logDose)

C

CC

(

A/c

m²)

Curva dose-resposta da alanil-glutamina

Animais desnutridos infectados com E. coli HS

1234

-50

0

50

100

150

Resp teóricaResp

pD2 = 1,5 Ec50 = 39,67 mM

Rmáx = 95,54 A/cm²

S = 4 n = 3

Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD-pD2))

pD (-logDose)

C

CC

(

A/c

m²)

Fonte: Elaborado pela autora

A: Grupo nutrido infectado com Escherichia coli HS. B: Grupo desnutrido infectado

com Escherichia coli HS. Valores (média ± e. p. m.). S = 10coef. Hill. Número de

experimentos (N).

4.5 Variação da resistência transepitelial

A figura 19 mostra que a desnutrição e ou infecção aguda não causaram alteração

significativa sobre a resistência transepitelial em nenhum dos grupos. Assim, o fluxo

paracelular de cloreto, bicarbonato e de água não foram alterados.

B

A

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63

Figura 19 - Variação da resistência transepitelial basal

Resistência transepitelial basal

N NE

NH D D

EDH

0

5

10

15

20

RE

(

.cm

2)

Fonte: Elaborado pela autora

Nutridos sem bactérias (N); nutridos infectados com EPEC (NE);

nutridos inoculados com E. coli HS (NH); desnutridos sem bactérias

(D); desnutridos com EPEC (DE); desnutridos com E. coli HS (DH).

Valores (média ± e. p. m.) A análise estatística foi realizada por

ANOVA e pós-teste Bonferroni. (*) – P < 0,05.

4.6 Variação da transcrição dos genes de transportadores e junções celulares durante a

desnutrição

Em relação à transcrição dos genes de transportadores e junções celulares, foi

encontrado um aumento significativo da transcrição do gene de transportadores de sódio-

glicose (SGLT-1) e de peptídeos (PEPT-1) nas células intestinais dos animais desnutridos

pela dieta básica regional (Figura 20 e 22, respectivamente).

De maneira diferente, a figura 21 A mostra que a transcrição do gene SN-2,

envolvido no co-transporte de Na+ e aminoácidos neutros como glutamina, sofreu redução

significativa, enquanto que a transcrição do gene CAT-1, para o transportador de aminoácidos

catiônicos, não sofreu alteração durante a desnutrição (Figura 21 B).

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64

Figura 20 - Expressão relativa da transcrição do gene

SGLT-1 nas células intestinais após 7 dias de alimentação

com dieta básica regional

N D0

1

2

3 *

Exp

ressão

rela

tiva

de

SG

LT

-1

Fonte: Elaborado pela autora

Grupo nutrido (N); Grupo desnutrido (D). A análise estatística foi

realizada pelo teste não pareado de t-Student unicaudal.

Figura 21 - Expressão relativa da transcrição do gene SN-

2 e CAT-1 nas células intestinais

N D0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

*

Exp

ressão

rela

tiva

de S

N-2

N D0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Exp

ressão

rela

tiva

de C

AT

-1

Fonte: Elaborado pela autora. A – Expressão relativa da transcrição do gene

SN-2 nas células intestinais desnutridas. B – Expressão relativa da transcrição

do gene CAT-1 nos enterócitos desnutridos. Grupo nutrido (N); Grupo

desnutrido (D). A análise estatística foi realizada pelo teste não pareado de t-

Student unicaudal.

A

B

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65

Figura 22 - Expressão relativa da transcrição do gene PEPT-1 nas células

intestinais desnutridas

N D0

1

2

3

4 *

Exp

ressão

rela

tiva

de P

EP

T-1

Fonte: Elaborado pela autora

Grupo nutrido (N); Grupo desnutrido (D). A análise estatística foi

realizada pelo teste não pareado de t-Student unicaudal.

Em relação ao gene CFTR, a desnutrição também não altera significativamente a

sua transcrição, como mostra a figura 23 a seguir:

Figura 23 - Expressão relativa da transcrição do gene

CFTR nas células intestinais desnutridas

N D0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

exp

ressao

rela

tiva

de C

FT

R

Fonte: Elaborado pela autora

Grupo nutrido (N); Grupo desnutrido (D). A análise estatística foi

realizada pelo teste não pareado de t-Student unicaudal.

Em relação às proteínas ZO-1, claudina-1 e ocludina, das junções celulares, não

houve diferença significativa da transcrição de seus genes quando os animais eram

submetidos à desnutrição experimental, como mostra as figuras 24, 25 e 27.

Na figura 26, foi observado um aumento significativo da transcrição do gene da

claudina-2 nos enterócitos desnutridos.

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66

Figura 24 - Expressão relativa da transcrição do gene ZO-

1 nas células intestinais desnutridas

N D0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Exp

ressão

rela

tiva d

e Z

O-1

Fonte: Elaborado pela autora

Grupo nutrido (N); Grupo desnutrido (D). A análise estatística foi

realizada pelo teste não pareado de t-Student unicaudal.

Figura 25 - Expressão relativa da transcrição do gene

claudina-1 nas células intestinais desnutridas

N D0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Exp

ressão

rela

tiva d

e

Cla

ud

ina-1

Fonte: Elaborado pela autora

Grupo nutrido (N); Grupo desnutrido (D). A análise estatística foi

realizada pelo teste não pareado de t-Student unicaudal.

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67

Figura 26 - Expressão relativa da transcrição do gene

claudina-2 nas células intestinais desnutridas

N D0

1

2

3

4*

Exp

ressão

rela

tiva d

e

Cla

ud

ina-2

Fonte: Elaborado pela autora Grupo nutrido (N); Grupo desnutrido (D). A análise estatística foi

realizada pelo teste não pareado de t-Student unicaudal.

Figura 27 - Expressão relativa da transcrição do gene

ocludina nas células intestinais desnutridas

N D0

1

2

3

Exp

ressão

rela

tiva

de O

clu

din

a

Fonte: Elaborado pela autora

Grupo nutrido (N); Grupo desnutrido (D). A análise estatística foi

realizada pelo teste não pareado de t-Student unicaudal.

4.7 Microscopia confocal

Paralelo aos resultados da transcrição gênica relacionados aos transportadores

intestinais e às proteínas das junções celulares, também foi realizado uma avaliação através da

intensidade da fluorescência das proteínas estudadas, utilizando a microscopia confocal, para

verificar se a alteração ou não na transcrição dos genes refletiria na síntese proteica.

Em relação às imagens de fluorescência da proteína SGLT-1, nas figuras 28 e 29,

diferenças na intensidade foram observadas no grupo desnutrido pela dieta básica regional em

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68

relação ao grupo nutrido (controle). Assim, no íleo submetido à desnutrição foi observado um

significativo aumento na intensidade da fluorescência.

Figura 28 - Imunofluorescência da proteína SGLT-1 observada através de

microscopia confocal

Fonte: Elaborado pela autora

A - Íleo de camundongo nutrido - controle; B - Íleo de camundongo desnutrido. Aumento de

40X. Coloração verde – proteína SGLT-1, coloração azul – núcleo.

Figura 29 - Diferença da intensidade de fluorescência da

proteína SGLT-1 em íleo de camundongo nutrido e

desnutrido

SGLT-1

N D0

20

40

60

80

100

*

Inte

nsid

ad

e d

e f

luo

rescen

cia

(U

A)

Fonte: Elaborado pela autora

Grupo nutrido (N); Grupo desnutrido (D). A análise estatística foi

realizada pelo teste não pareado de t-Student unicaudal.

Da mesma maneira, nas figuras 30 e 31, pôde-se ver que a desnutrição aumentou

significativamente a intensidade da fluorescência da proteína SN-1.

A B

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69

Figura 30 - Imunofluorescência da proteína SN-1 observada através de

microscopia confocal

Fonte: Elaborado pela autora

A - Íleo de camundongo nutrido; B - Íleo de camundongo desnutrido. Aumento de 40X.

Coloração verde – proteína SN-1, coloração azul – núcleo.

Figura 31 - Diferença da intensidade de fluorescência da

proteína SN-1 em íleo de camundongo nutrido e

desnutrido

SN-1

N D0

10

20

30

40

50 *

Inte

nsid

ad

e d

e f

luo

rescen

cia

(U

A)

Fonte: Elaborado pela autora.

Grupo nutrido (N); Grupo desnutrido (D). A análise estatística foi

realizada pelo teste não pareado de t-Student unicaudal.

A B

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70

Semelhantemente, as figuras 32 e 33 mostram que a desnutrição aumentou

significativamente a intensidade da fluorescência da proteína SN-2.

Figura 32 - Imunofluorescência da proteína SN-2 observada através de

microscopia confocal

Fonte: Elaborado pela autora

A – Íleo de camundongo nutrido; B - Íleo de camundongo desnutrido. Aumento de 40X.

Coloração verde – proteína SN-2, coloração azul – núcleo.

Figura 33 - Diferença da intensidade de fluorescência da

proteína SN-2 em íleo nutrido e desnutrido

SN-2

N D0

20

40

60

80

*

Inte

nsid

ad

e d

e f

luo

rescen

cia

(U

A)

Fonte: Elaborado pela autora

Grupo nutrido (N); Grupo desnutrido (D). A análise estatística foi

realizada pelo teste não pareado de t-Student unicaudal.

A figura 34 e 35 mostra que a proteína PEPT-1 apresentou maior intensidade no

grupo desnutrido, quando comparado ao grupo nutrido.

A B

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71

Figura 34 - Imunofluorescência da proteína PEPT-1 observada através de

microscopia confocal

Fonte: Elaborado pela autora

A – Íleo de camundongo nutrido; B – Íleo de camundongo desnutrido. Aumento de 40X.

Coloração verde – proteína SN-1, coloração azul – núcleo.

Figura 35 - Diferença da intensidade de fluorescência da

proteína PEPT-1 em íleo de camundongo nutrido e

desnutrido

PEPT-1

N D0

20

40

60

*

Inte

nsid

ad

e d

e f

luo

rescen

cia

(U

A)

Fonte: Elaborado pela autora

Grupo nutrido (N); Grupo desnutrido (D). A análise estatística foi

realizada pelo teste não pareado de t-Student unicaudal.

A B

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72

5 DISCUSSÃO

5.1 Controle geral dos experimentos

5.1.1 Crescimento dos animais com DBR

Com a finalidade de avaliar experimentalmente os efeitos da desnutrição com ou

sem infecção com EPEC em camundongos de 28 a 35 dias de idade, administrou-se, durante 7

dias, a Dieta Básica Regional, que é uma dieta multideficiente em proteínas, lipídios,

vitaminas e minerais, porém apresenta um alto teor de carboidratos, o que compensa a

redução energética devido a menores teores de lipídios e proteínas, caracterizando uma

restrição nutricional qualitativa e não energética similar ao que ocorre no Nordeste brasileiro

(TEODÓSIO et al., 1990).

Este estudo mostrou que 7 dias de consumo da DBR foi suficiente para induzir

alterações na curva de crescimento peso/idade, assim essa dieta ocasionou uma redução

significante no desenvolvimento ponderal dos camundongos avaliados, visto que antes de

dividir os animais por ração consumida, todos apresentavam peso semelhante, e o

desenvolvimento ponderal foi progressivamente menor nos camundongos alimentados com a

DBR, sugerindo que esta não fornece nutrientes suficientes para um adequado

desenvolvimento. Resultados semelhantes foram obtidos em diversos trabalhos, utilizando

ratos Wistar (RIBEIRO; CHAVES, 2008; PRAZERES et al., 2004) e camundongos suíços

(COUTO et al., 2008).

No entanto, o consumo da DBR por 7 dias não foi capaz de alterar a área

vilositária, como esperado, levando-nos a pensar que o grau de desnutrição atingido neste

estudo foi leve, sendo apenas um estado de má nutrição.

5.1.2 Inóculo bacteriano

Ainda que a EPEC seja um agente diarreico em humanos, não é fácil induzir a sua

fixação experimental no intestino delgado de animais, porém o prévio tratamento com

antimicrobianos pode levar a bons resultados, pois suprime a microbiota intestinal endógena

(MUSHIN; DUBOS, 1965). Entretanto, isto altera o equilíbrio competitivo entre as bactérias

endógenas e as patogênicas e não demonstra um modelo real de uma infecção, mascarando,

desta maneira, os resultados. Por isto, neste estudo os animais não foram previamente tratados

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73

com antibacterianos, provando que a aderência da EPEC não se vincula a esse tipo de pré-

tratamento e sim a uma série de fatores patogênicos.

Em relação ao fato de que apenas a dose de 108ufc/mL de EPEC foi capaz de

induzir uma infecção aguda, Mushin e Dubos (1965) relataram que inóculos bacterianos

contendo 2,3 x 108 células devem ser utilizados para a infecção experimental em

camundongos, e que, independente da concentração bacteriana usada, a E. coli O26: K60

estabeleceu-se nos animais com até 13 dias de idade. Entretanto, a taxa de colonização em

animais com 18 dias de idade é proporcional à dose utilizada. Além disto, nos animais com 24

dias de idade, a quantidade de E. coli foi reduzida após 48 horas de infecção. Assim,

verificou-se que a idade do hospedeiro influencia a capacidade de colonização da E. coli O26:

K60nointestino.

Um experimento semelhante ao nosso foi feito por Punyashthiti e Finkelstein em

1971, no qual foram injetados 0,2ml, contendo cerca de 2 x 109 a 3x 109 organismos viáveis

em alça intestinal ligada de camundongos Swiss, a fim de testar a sua enteropatogenicidade

através da taxa de secreção de fluido no lúmen intestinal após contato direto com EPEC de

diversos sorotipos. Desta maneira, foi mostrado que o modelo de alça intestinal de

camundongo é válido, pois 34% das cepas isoladas de crianças com diarreia causou secreção

de no mínimo 50 mg de fluido por cm, o que sugere o grande potencial de utilidade desse

modelo, ainda que não seja o ideal.

5.1.3 Câmaras de Üssing

A montagem do íleo entre as hemi-câmaras foi feita de forma padronizada (lado

mucoso à esquerda e lado seroso à direita), além disto, o uso da solução de Krebs para

perfusão em ambos os lados da membrana intestinal permitiu anular os transportes passivos

iônicos que ocorrem na via paracelular; já os transportes passivos transcelulares, gerados pelo

potencial elétrico espontâneo através do epitélio, foram eliminados com a aplicação de uma

corrente elétrica externa de 50 µA na membrana intestinal, o que possibilitou a análise

somente dos transportes ativos iônicos transcelulares por meio da medida da CCC que é

equivalente à soma das correntes iônicas de Na+, K+, Cl-, HCO3- e K+ (CLARCK, 2009).

Porém, nem todos os experimentos realizados apresentaram resultados viáveis,

por isto critérios foram estabelecidos para a escolha dos valores de CCC considerados

verdadeiros. Dentre eles foi o valor da CCC basal. Nos grupos não infectados, o intervalo

aceito foi de -200 µA/cm² a 200 µA/cm², pois segundo Clarke (2009) a CCC através do

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74

intestino delgado de murino é levemente negativa. Porém, no caso dos grupos infectados,

como não se sabia o limite de aceitação dos valores da CCC basal, a seleção envolveu a

observação dos segmentos que apresentavam valores aproximados, e aqueles resultados

discrepantes foram descartados.

Outro critério de seleção dos resultados utilizado foi a aplicação de uma solução

de teofilina no lado seroso da membrana, pois esta normalmente aumenta a secreção de Cl-

pelos canais CFTR na região apical das criptas e, consequentemente, a CCC, devido a uma

elevação intracelular de cAMP (CERMAK; FOLLMER; WOLFFRAM, 1998). Esse efluxo de

Cl- é possibilitado pela força impulsionadora gerada pela diferença entre o potencial elétrico

de equilíbrio do Cl- e o potencial da membrana, no entanto é logo compensado pelo influxo de

Cl- na região basolateral através do cotransportador NaKCCl, havendo, portanto uma grande

concentração desse ânion no meio luminal das criptas, o que perturba a eletroneutralidade

nessa região que, logo é corrigida pela difusão de Na+ e pela passagem água pela via

paracelular (SILVA, 2002).

É importante salientar que a membrana, quando viva e bem fixada entre as hemi-

câmaras, responde à teofilina com um rápido e grande aumento na CCC, mas esta não

ultrapassa seu valor máximo (FIELD, 1971; CHAPPE, 1998), mesmo que se adicione uma

maior dose, não havendo, portanto, sobrecarga da CCC, permitindo detectar quais segmentos

teciduais postos entre as hemi-câmaras permaneceram vivos e bem fixados entre as

hemicâmaras durante todo o experimento.

Assim, todos os resultados analisados neste estudo responderam

significativamente à teofilina e não apresentaram sobrecarga, devendo-se enfatizar que, nos

casos de falta de resposta relevante aos substratos aplicados ao lado mucoso do tecido, houve

alguma alteração no transporte desses substratos e não a morte da membrana.

5.2 Consequências da desnutrição e infecção

5.2.1 Desnutrição

Embora se saiba que os nutrientes luminais sejam essenciais à integridade da

mucosa intestinal, o papel da desnutrição na má absorção intestinal ainda é controverso, pois a

atrofia vilositária tem sido descrita em crianças com diferentes graus de desnutrição e

observou-se que os casos mais leves de desnutrição não parecem ter grande impacto sobre a

estrutura e a função da mucosa intestinal e, provavelmente, não explicam as alterações

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75

encontradas na arquitetura mucosa comumente vista (FARTHING, 2002). Ademais, Romer et

al. (1983) ao estudarem a mucosa do intestino delgado de 24 crianças com diarreia com

diferentes de desnutrição não observaram correlação entre as alterações morfológicas e o grau

de desnutrição.

O presente estudo mostrou que a desnutrição induzida pelo consumo da dieta

básica regional (DBR) durante 7 dias foi capaz de reduzir a CCC basal, ainda que a área dos

vilos intestinais não tenha sido significativamente alterada e que a profundidade das criptas

tenha diminuído em resposta à injúria intestinal, pois a mucosa intestinal responde aos agentes

exógenos por meio de modificações morfológicas no comprimento e no número das

vilosidades e na profundidade das criptas intestinais (GOMIDE-JUNIOR et al., 2004).

Essa redução na CCC basal é consequência da redução dos transportes iônicos

ativos transcelulares, o que indica que não há absorção catiônica e/ou secreção aniônica.

Então, é possível que, nesses casos, haja o acúmulo de Na+ no lúmen intestinal oriundo da

bomba de Na+/K+ presente na região basolateral, já que esse cátion atravessa a via paracelular

para chegar à região luminal e, como não há nutrientes nessa região, o cotransporte de Na+-

substrato fica limitado.

É importante ressaltar que, ainda que a desnutrição reduza os fluxos iônicos

basais, a diferença significativa entre a CCC basal e a CCC (ΔCCC) após a adição de glicose,

glutamina e alanil-glutamina demonstra que o transporte desses substratos permanece intacto,

fato confirmado pelas respostas máximas obtidas serem similares ao grupo nutrido, mesmo

que, no caso da glicose, seja necessária uma maior dose para atingir a metade do efeito

máximo, o que não ocorreu com os demais substratos. Essa manutenção dos transportes pode

ser explicada pelo aumento da síntese das proteínas transportadoras SGLT-1, SN-1, SN-2 e

PEPT-1 e aumento da expressão dos genes SGLT-1 e PEPT-1. Quanto à redução da expressão

do gene SN-2, parece que não houve influência sobre a síntese de sua proteína

correspondente, permitindo, portanto, a manutenção da normalidade do transporte de

glutamina.

5.2.2 Infecção com EPEC

Este estudo mostrou que a infecção aguda induzida com EPEC foi capaz de

reduzir a CCC basal, ainda que a área dos vilos intestinais não tenha sido significativamente

alterada e que a profundidade das criptas tenha diminuído com a presença dessa bactéria, o

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76

que contraria trabalhos como o de Kallas, Patrício e Fagundes-Neto (1995) que observaram

uma diminuição da relação vilosidade-cripta em pacientes com EPEC presente nas fezes.

Semelhante ao grupo anterior, essa redução na CCC basal é devida à redução dos

transportes iônicos ativos transcelulares, o que indica que a EPEC reduz a absorção catiônica

e/ou secreção aniônica em condições de jejum, acarretando acúmulo de cátions e secreção de

água no lúmen intestinal, tornando a região basolateral menos positiva eletricamente e

contribuindo para a diminuição da CCC basal.

No que concerne à EPEC nos animais nutridos, ocorre alteração no transporte de

glicose, necessitando de uma maior dose desse carboidrato para atingir a metade do efeito

máximo, que é estatisticamente semelhante à resposta máxima obtida com a adição de glicose

ao lado mucoso do íleo de animais nutridos (controle), ainda que essa diferença seja em torno

de 100 µA/cm².

No entanto, a EPEC não danifica o transporte de glutamina e alanil-glutamina

nem o nível de resposta máxima obtida com esses substratos, não havendo, portanto a

necessidade de uma maior dose desses substratos para atingir a metade do efeito máximo

quando comparado ao grupo controle nutrido.

5.2.3 Desnutrição e EPEC

Nos animais desnutridos, a EPEC reduz a área das vilosidades não reduzida pela

desnutrição, porém isto não reduziu ainda mais a CCC já reduzida pela desnutrição, assim os

fluxos iônicos basais permanecem iguais aos dos animais desnutridos sem infecção.

Além disto, os transportes de glicose e alanil-glutamina continuaram normais,

obtendo, portanto, uma resposta máxima a esses substratos semelhante aos grupos controle

nutridos e desnutridos sem infecção. Entretanto, o transporte de glutamina é alterado,

acarretando numa significativa redução na resposta máxima a esse aminoácido, mesmo que,

para atingir a metade desta não seja necessária uma maior dose de glutamina.

Quando se comparou os grupos nutridos e desnutridos infectados com EPEC,

observou-se que essa bactéria altera a estrutura da mucosa de acordo com o grau de nutrição

do hospedeiro, assim os desnutridos apresentam uma menor área vilositária e profundidade

das criptas do que os nutridos.

Mesmo assim o grau de nutrição não tem influência sobre as variações dos fluxos

iônicos basais nem sobre a dose mínima necessária para atingir a metade do efeito máximo da

glicose e da glutamina, porém a resposta máxima à glicose é significativamente maior nos

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77

animais desnutridos, o que não ocorre com a glutamina. Já em relação aos valores de Ec50

para alanil-glutamina nesses grupos, percebe-se que os nutridos com EPEC respondem

melhor à alanil-glutamina do que os desnutridos.

5.2.4 Colonização da E. coli HS

Quando a E. coli HS foi escolhida para este estudo, pensava-se em considerá-la

como um controle negativo de infecção, visto que havia os controles negativos sem bactérias

e, era necessário observar se as alterações ocorriam em decorrência da simples presença de

uma bactéria externa não patogênica. No entanto, no decorrer dos experimentos foi observado

que tal bactéria comensal humana, diferente do esperado, era capaz de induzir danos ao tecido

epitelial do íleo de camundongos.

Por isto, deve ser salientado que o termo adesão não significa apenas a ligação

física do microrganismo às células hospedeiras, pois há diversas maneiras de associação das

bactérias à mucosa, e todas têm efeitos semelhantes, isto é, reduzem a taxa de remoção das

bactérias do sistema (FRETER, 1980), o que explica a presença da E. coli HS em suspensão

livre no lúmen intestinal observada neste estudo. Além disto, é possível que essa bactéria

tenha se agregado a outras bactérias capazes de se aderir à mucosa intestinal, a fim de

permanecer no lúmen mesmo na presença do peristaltismo intestinal (BIOCAMP, 2013).

Tal forma de colonização também foi observada em um estudo com E. coli

MG1655, outra cepa comensal humana, no intestino grosso de ratos tratados com

estreptomicina, pois essa bactéria também não estava associada ao epitélio, mas estava

dispersa ou como células ou na camada de muco, a qual sobrepõe o epitélio e se renova a cada

2 horas (RANG et al., 1999). O mesmo ocorreu com a cepa comensal de ratos E. coli BJ4

(POULSEN et al., 1994).

É possível que a colonização da E. coli HS tenha decorrido da resistência

incompleta da microbiota à colonização, pois diferentes cepas de E. coli comensais utilizam

nutrientes distintos para crescerem no intestino do hospedeiro como mostrado por Conway e

Cohen (2007), quando observaram que as cepas comensais humanas E. coli MG1655 e E. coli

Nissle 1917 utilizam L-arabinose e L-fucose no intestino de rato, mas que somente a última

utiliza D-manose, permitindo, desta maneira, a coexistência de ambas bactérias no mesmo

meio.

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78

Então, neste trabalho, observou-se que a colonização da E. coli HS não causou

alterações importantes na estrutura da mucosa intestinal, porém isto não impossibilitou a

redução da CCC basal, significando que houve alteração nos fluxos iônicos normais na via

transecular.

No tocante ao transporte de glicose no íleo de animais nutridos, a E. coli HS

induziu modificações, necessitando de uma maior dose desse carboidrato para atingir a

metade do efeito máximo, ainda que a resposta máxima a esse substrato tenha sido semelhante

ao grupo controle.

Nos animais nutridos, o transporte de glutamina também foi alterado pela

colonização da E. , mesmo que a resposta máxima a esse aminoácido não tenha sido

prejudicada, ainda que não tenha sido necessário aplicar uma maior dose no lado mucoso da

membrana para obter a metade do efeito máximo.

Porém, quando se avaliou o transporte de alanil-glutamina, nos nutridos

infectados com E. , observou-se que esse substrato foi o único que permaneceu sendo

transportado normalmente através dos enterócitos, não necessitando de doses maiores para

obter a metade do efeito máximo. Além de tudo, esse dipeptídeo causou uma resposta máxima

similar ao grupo controle, portanto é o mais adequado para casos de infecção com E. .

5.2.5 Desnutrição e E. coli HS

Nos desnutridos, a E. coli HS não modifica a mucosa do íleo e ainda aumenta a

CCC basal até se assemelhar ao grupo controle nutrido, o que sugere que essa bactéria

estimule a secreção aniônica e/ou a absorção catiônica e possivelmente normalize os fluxos

iônicos basais reduzidos pela desnutrição. Porém, isto não impede que o transporte de glicose

seja danificado por essa bactéria, mas a absorção de glutamina e alanil-glutamina permanece

intacta, ainda que a resposta máxima à alanil-glutamina seja reduzida.

Com a comparação entre os animais inoculados com E. coli HS, nota-se que esta

não altera a estrutura da mucosa ileal de acordo com o grau de nutrição do hospedeiro, porém

modifica a CCC basal sob tais condições. Mesmo assim, a dose de glicose, glutamina e alanil-

glutamina necessária para atingir a metade do efeito máximo é similar entre os grupos.

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79

5.2.3 Resistência transepitelial

Em relação à resistência transepitelial, nenhum dos fatores induzidos neste

trabalho foi capaz de alterá-la significativamente. Portanto, a desnutrição e/ou as infecções

induzidas neste estudo não danificaram a integridade das vias paracelulares e, por

consequência, o transporte intercelular de íons e pequenas moléculas, pois a Rt é

inversamente proporcional à permeabilidade intestinal (CLARKE, 2009). Um exemplo disto

foi o aumento da expressão da transcrição do gene claudina-2 no íleo dos animais

desnutridos, já que a interação das claudinas e permite a passagem seletiva de íons, tendo

como principal função regular a permeabilidade paracelular (PARIS et al., 2008).

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6 CONCLUSÃO

Nos animais nutridos, a EPEC não causa alteração na estrutura morfológica da

mucosa do íleo, porém reduz a CCC basal e, consequentemente, os fluxos iônicos normais.

Ademais, essa bactéria danifica o co-transporte de Na+-glicose, entretanto é incapaz de alterar

o transporte de glutamina e alanil-glutamina.

A presença da E. coli HS no lúmen do intestino nutrido não altera a estrutura da

mucosa absortiva, apenas reduz a profundidade das criptas de Lieberkühn. No entanto, causa

decréscimo da CCC basal, modificando os transportes iônicos nessa região. Nesse grupo

experimental, apenas a adição cumulativa total de alanil-glutamina foi capaz de estimular o

processo absortivo. Haja vista, somente os sistemas de transportadores de glicose e glutamina

foram modificados pela colonização da E. coli HS.

A histomorfometria mostrou que a desnutrição não causa danos à mucosa

intestinal. E mesmo que a CCC basal diminua, adições de glicose, glutamina e alanil-

glutamina ao meio luminal estimulam a absorção de íons, ocorrendo uma melhora na

capacidade absortiva do íleo.

A EPEC, em intestino desnutrido, é capaz de reduzir a área vilositária, no entanto

as criptas e a CCC basal permanecem normais. Embora o transporte de glutamina seja

prejudicado pela presença dessa bactéria, a adição de glicose e alanil-glutamina no lado

mucoso do íleo contribui para o aumento da absorção iônica.

O íleo de animal desnutrido e colonizado por E. coli HS não sofre alterações na

estrutura da mucosa em relação ao desnutrido sem infecção. Contudo, essa bactéria causa

aumento na CCC basal, normalizando os fluxos iônicos danificados pela desnutrição. Nesse

grupo de animais, apenas o transporte de glicose sofreu alteração. Enquanto a adição de

glutamina e alanil-glutamina favorece o processo absortivo.

A desnutrição e ou infecção induzidas nos experimentos não danificam a

integridade das vias paracelulares.

A desnutrição aumenta a transcrição gênica dos transportadores SGLT-1 e PEPT-

1 e da claudina-2; e diminui a transcrição do gene SN-2. A síntese das proteínas SGLT-1, SN-

1, SN-2 e PEPT-1 foi aumentada com a desnutrição. Explicando, por esta razão, a

manutenção da normalidade dos sistemas transportadores de glicose, glutamina e alanil-

glutamina em íleo de camundongos desnutridos.

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Destarte, é possível que esses substratos favoreçam a recuperação da membrana e

aliviem o ciclo vicioso de desnutrição, infecção e diarreia através do aumento da absorção

(CCC) e recuperação da normalidade da permeabilidade intestinal (Rt), no entanto, no caso de

se utilizar a glicose ou a glutamina, deve-se avaliar o estado nutricional do hospedeiro e se há

presença de agentes patogênicos associados, a fim de eleger o melhor substrato para cada

caso, porém a alanil-glutamina mostrou-se o mais adequado substrato, pois foi o único que

favoreceu o aumento absortivo em todos os grupos experimentais.

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ANEXO A – DOCUMENTO DE APROVAÇÃO PELA COMISSÃO DE ÉTICA EM

PESQUISA ANIMAL