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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA E MEDICINA LEGAL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA MÉDICA
INGRID CORDEIRO SAMPAIO
AVALIAÇÃO DO TRANSPORTE TRANSMEMBRÂNICO DE GLICOSE,
GLUTAMINA E ALANIL-GLUTAMINA EM ÍLEO DE CAMUNDONGOS
NUTRIDOS E DESNUTRIDOS INFECTADOS POR ESCHERICHIA COLI
ENTEROPATOGÊNICA
FORTALEZA
2013
INGRID CORDEIRO SAMPAIO
AVALIAÇÃO DO TRANSPORTE TRANSMEMBRÂNICO DE GLICOSE, GLUTAMINA
E ALANIL-GLUTAMINA EM ÍLEO DE CAMUNDONGOS NUTRIDOS E
DESNUTRIDOS INFECTADOS POR ESCHERICHIA COLI ENTEROPATOGÊNICA
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa Pós-Graduação em Microbiologia
Médica da Faculdade de Medicina da
Universidade Federal do Ceará, como requisito
parcial para obtenção do Título de Mestre em
Microbiologia Médica. Área de concentração:
Genética de fatores de virulência em
patógenos gastrointestinais.
Orientador: Prof. Dr. Aldo Ângelo Moreira
Lima
Co-orientador: Prof. Dr. Alberto Melo Soares
FORTALEZA
2013
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Federal do Ceará
Biblioteca de Ciências da Saúde
S181a Sampaio, Ingrid Cordeiro.
Avaliação do transporte transmembrânico de glicose, glutamina e alanil-glutamina em íleo de
camundongos nutridos e desnutridos infectados por Escherichia coli enteropatogênica / Ingrid
Cordeiro Sampaio. – 2013.
92 f. : il., enc. ; 30 cm.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,
Departamento de Patologia e Medicina Legal, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia
Médica, Mestrado em Microbiologia Médica, Fortaleza, 2014.
Área de Concentração: Genética de Fatores de Virulência em Patógenos Gastrointestinais.
Orientação: Prof. Dr. Aldo Ângelo Moreira Lima.
Coorientação: Prof. Dr. Alberto Melo Soares.
1. Desnutrição. 2. Escherichia coli Enteropatogênica. 3. Absorção Intestinal. I. Título.
CDD 612.30832
A Deus, que por sua luz, glória e amor
infinito, desperta no coração do homem o
desejo de aprender sempre mais e me
concedeu a perseverança para desenvolver este
projeto.
Aos meus pais, Paulo Roberto e Antonia, que
vivem a alegria dos meus sonhos
concretizados, compartilhando comigo todos
os momentos, com imensurável amor.
À minha avó, Raimunda Neuza (in
memoriam), que sempre acompanhou todos os
passos de nossa família carinhosamente
mesmo com dificuldade, com emoção e amor.
Às minhas primas, Jaqueline e Érika que me
apoiaram desde o início deste meu objetivo.
Aos meus tios, José Neto, Maria Helena e
Veríssima pela força transmitida com suas
palavras e orações.
AGRADECIMENTO
Aos Profs. Dr. Aldo Ângelo Moreira Lima e Dr. Alberto Melo Soares, pelo
incentivo, transmissão de conhecimentos e valiosa orientação durante a pesquisa e execução
deste projeto, com grande admiração e respeito.
Ao Prof. Dr. Alexandre Havt Bindá, pelo auxílio nos experimentos de Biologia
Molecular.
Ao Prof. Ms. Said Gonçalves da Cruz Fonseca, pela amizade que nasceu a
partir do desenvolvimento do projeto pedagógico desenvolvido junto ao CAPES-REUNI e
seu precioso apoio. Além de ter possibilitado a produção da ração para os animais utilizados
neste projeto no Laboratório de Farmacotécnica.
À cara colega e colaboradora Dra. Marjorie Moreira Guedes pela sua
cooperação nas atividades no laboratório e conhecimentos em microbiologia compartilhados.
À Dra. Ila Fernanda Lima, pelo auxílio nos experimentos microbiológicos.
À Sra. Teresinha Freire França por seu fundamental auxílio técnico, ao Sr.
Jose Amadeus Souza pelo apoio, amizade e por não deixar faltar material para que este
trabalho fosse realizado, e ao Sr. Jociê Andrade da Silva que garantiu o suprimento de
animais.
À Sra. Kátia Lima Nogueira e ao Sr. Charles Melo pela administração e
responsabilidade na garantia da compra dos materiais e pelas inúmeras vezes que me
ajudaram na cópia e impressão de documentos dos experimentos.
Aos estudantes de iniciação científica Cássia Roque e Pedro Henrique Quintela
pelo apoio e cooperação nos experimentos e momentos de alegria.
Aos colegas Ms. Paloma Araújo, Ms. Vinícios Alves pela amizade e partilha de
conhecimentos.
Às mestrandas Rosa Elayne Freitas e Ana Carolina Santos pelos ensinamentos
em extração, pela amizade e pelos momentos de descontração.
“Não se deve julgar a pessoa alguma, porque
julgar pertence só a Deus. E quando se notar
alguma coisa que nos leve a reprovar o
próximo, não o imitemos; porém, vendo a
parte boa que a pessoa tem, não incriminemos
e a remetamos a Deus dizendo:
‘Deus é quem sabe’.”
Santo Antonio de Sant’Anna Galvão
RESUMO
A Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) e a desnutrição são uma das maiores causadoras
de morbidade e mortalidade infantil em países subdesenvolvidos. Este estudo propõe avaliar o
transporte de Na+-glicose, Na+-glutamina e H+-alanil-glutamina através da medida da corrente
de curto circuito (CCC) e da resistência transepitelial (Rt) no íleo de camundongos nutridos e
desnutridos infectados com EPEC. Camundongos albinos de 28 a 35 dias de idade foram
submetidos a uma dieta padrão ou a uma dieta multideficiente em proteínas, lipídeos e
minerais, a DBR. Parte desses animais foi submetida à infecção aguda por 3 horas de contato
direto com a bactéria em alça ligada. Para comparações, o mesmo foi feito utilizando a
bactéria comensal Escherichia coli HS. Foram anestesiados com ketamina e xilazina por via
intramuscular. O íleo foi removido, dissecado da membrana serosa, aberto com bisturi,
segmentado e montado em câmaras de Üssing. O mRNA total foi extraído e, a partir deste, foi
feito o cDNA a fim de observar, por PCR em tempo real, se a desnutrição causou alteração na
transcrição dos genes SGLT-1, SN-2, CAT-1, PEPT-1, CFTR, ZO-1, Claudina-1 e Claudina-2
e Ocludina. Em paralelo, análise por microscopia confocal das proteínas SGLT-1, SN-1, SN-2
e PEPT-1 foi realizada. Os resultados mostraram que a EPEC reduziu a área dos vilos apenas
durante a desnutrição (1,339 ± 0,1 mm²). Mesmo assim, não alterou a CCC basal (67,41 ± 2,0
µA/cm²), enquanto que a EPEC, a E. coli HS e a desnutrição, quando isoladas, reduziram a
CCC basal (65,96 ± 5,1 µA/cm², 72,51 ± 7,7 µA/cm² e 74,23 ± 5,7 µA/cm²). Porém, a
desnutrição não alterou os sistemas de transporte de glicose (ΔCCC = 324,7 ± 45,42 µA/cm²),
glutamina (ΔCCC = 236,7 ± 43,32 µA/cm²) e alanil-glutamina (ΔCCC = 282,6 ± 39,10
µA/cm²) devido ao aumento na expressão da transcrição gênica de SGLT-1 e PEPT-1 e ao
aumento da síntese de SGLT-1, SN-1, SN-2 e PEPT-1. Já a EPEC alterou o transporte de
glicose (ΔCCC = 102,6 ± 38,3 µA/cm²), e a E. Coli HS diminuiu o transporte de glicose
(ΔCCC = 103,5 ± 106,6 µA/cm²) e de glutamina (ΔCCC = 123,4 ± 106,5 µA/cm²), enquanto
que, nos animais desnutridos, a EPEC reduziu o transporte de glutamina (ΔCCC = 62,10 ±
42,7 µA/cm²), e E. Coli HS reduziu os níveis de absorção de glicose (ΔCCC = 84,40 ± 178,3
µA/cm²). Portanto, é possível que esses substratos favoreçam a recuperação da membrana e
aliviem o ciclo vicioso de desnutrição, infecção e diarreia através do aumento da absorção
(CCC) e recuperação da normalidade da permeabilidade intestinal (Rt). Porém, deve-se
avaliar o estado nutricional do hospedeiro e se há presença de patógenos associados, a fim de
eleger o melhor substrato para cada caso.
Palavras-chave: Desnutrição. Escherichia coli enteropatogênica. Absorção intestinal.
ABSTRACT
Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and malnutrition are a major cause of morbidity
and mortality in developing countries. The purpose of this study was to evaluate the transport
of Na+-glucose, Na+-glutamine and H+-alanyl-glutamine by measurement of short circuit
current (Isc) and transepithelial resistance (TR) in the ileum of nourished and malnourished
mice infected with EPEC. Albino mice of approximately 35 days of age were subjected to a
standard diet or a diet deficient in proteins, lipids and minerals, the Regional Basic Diet
(RBD). Of these animals was submitted to acute infection for 3 hours of direct contact with
bacteria in isolated intestinal loop. For comparison, the same was done using the commensal
bacterium Escherichia coli HS. They were anesthetized with ketamine and xylazine
intramuscularly. The ileum was removed, dissected the serous membrane, open with a scalpel,
segmented and mounted in Üssing chambers. The total mRNA was extracted and, from this,
cDNA was done to analyze if malnutrition caused alterations in gene transcription of
transporters as SGLT-1, SN-2, CAT-1, PEPT-1 and CFTR and related proteins to cell
junctions such as ZO-1, Claudin-1 and Claudin-2 and occludin. At the same time,
immunofluorescence analysis of proteins SGLT-1, SN-1, SN-2 and PEPT-1 were performed.
The results showed that EPEC reduced the area of the villi only during malnutrition (1,339 ±
0,1 mm²). But, the basal CCC did not alter (67,41 ± 2,0 μA/ cm²), while EPEC, E. coli HS and
malnutrition, when isolated, reduced the basal CCC (65,96 ± 5,1 μA/ cm ², 72,51 ± 7,7 μA/
cm ² and 74,23 ± 5,7 μA/ cm²). However, malnutrition did not change the transport systems of
glucose (ΔCCC = 324,7 ± 45,42 µA/cm²), glutamine (ΔCCC = 236.7 ± 43.32 μA/ cm²) and
alanyl-glutamine (ΔCCC = 282,6 ± 39,10 μA/ cm²), because occured an increase in gene
expression of SGLT-1 and PEPT-1 and increased synthesis of SGLT-1, SN-1, SN-2 and
PEPT-1. Already EPEC altered glucose transport (ΔCCC = 102,6 ± 38,3 μA/ cm²), and E. coli
HS decreased transport of glucose (ΔCCC = 103,5 ± 106,6 μA/ cm²) and glutamine (ΔCCC =
123,4 ± 106,5 μA/ cm²), whereas in undernourished animals EPEC reduced transport of
glutamine (ΔCCC = 62,10 ± 42,7 μA/ cm²), and E. coli HS reduced levels of glucose
absorption (ΔCCC = 84,40 ± 178,3 μA/ cm²). Therefore, these substrates may facilitate the
recovery of the membrane and alleviate the vicious cycle of malnutrition, infection and
diarrhea by increasing absorption (CCC) and the maintenance of normal intestinal
permeability (Rt), but before using them for the treatment it is essential to evaluate the
nutritional status of the host and the presence of pathogens in their intestinal epithelium.
Keyword: Malnutrition. Enteropathogenic Escherichia coli. Intestinal absorption.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Modelo clássico das vias de transporte de glicose...................................................17
Figura 2 - Dependência indireta dos cátions Na+ no mecanismo absortivo de peptídeo H+-
dependente.............................................................................................................................19
Figura 3 - Esquema das interações proteicas nas junções celulares.........................................29
Figura 4 - Crescimento de camundongos (Mus musculus) Swiss, machos, 28 a 35 dias de
idade submetidos à ração comercial e à dieta básica regional durante 7 dias...........................46
Figura 5 - Microfotografia de íleo infectado com 108 ufc/mL de EPEC 2348/69 corado com
Giemsa....................................................................................................................................47
Figura 6 - Microfotografia de íleo infectado com 108 ufc/mL de E. coli HS corado com
Giemsa......................................................................................................................................47
Figura 7 - Área dos vilos intestinais na presença de desnutrição e/ou infecção.......................48
Figura 8 - Variação da profundidade das criptas na presença de infecção e/ou desnutrição....49
Figura 9 - Comparação da CCC basal entre os grupos nutridos e desnutridos inoculados ou
não com E. coli enteropatogênica ou HS................................................................................50
Figura 10 – Curva dose-resposta cumulativa da glicose. A: Grupo nutrido sem infecção. B:
grupo desnutrido sem infecção...............................................................................................52
Figura 11 - Curva dose-resposta cumulativa da glicose. A: Grupo nutrido infectado com
Escherichia coli enteropatogênica (EPEC). B: Grupo desnutrido infectado com Escherichia
coli enteropatogênica (EPEC)...................................................................................................53
Figura 12 - Curva dose-resposta cumulativa da glicose. A: Grupo nutrido infectado com
Escherichia coli HS. B: Grupo desnutrido infectado com Escherichia coli HS.......................54
Figura 13 - Curva dose-resposta cumultiva da glutamina. A: Grupo nutrido sem infecção. B:
Grupo desnutrido sem infecção................................................................................................ 56
Figura 14 - Curva dose-resposta cumultiva da glutamina. A: Grupo nutrido infectado com
Escherichia coli enteropatogênica (EPEC). B: Grupo desnutrido infectado com Escherichia
coli enteropatogênica (EPEC)...................................................................................................57
Figura 15 - Curva dose-resposta cumultiva da glutamina. A: Grupo nutrido infectado com
Escherichia coli HS. B: Grupo desnutrido infectado com Escherichia coli HS.......................58
Figura 16 - Curva dose-resposta cumultiva da alanil-glutamina. A: Grupo nutrido sem
infecção. B: Grupo desnutrido sem infecção............................................................................60
Figura 17 - Curva dose-resposta cumultiva da alanil-glutamina. A: Grupo nutrido infectado
com Escherichia coli enteropatogênica (EPEC). B: Grupo desnutrido infectado com
Escherichia coli enteropatogênica (EPEC).............................................................................61
Figura 18 - Curva dose-resposta cumultiva da alanil-glutamina. A: Grupo nutrido infectado
com Escherichia coli HS. B: Grupo desnutrido infectado com Escherichia coli HS............62
Figura 19 - Variação da resistência transepitelial basal............................................................63
Figura 20 - Expressão relativa da transcrição do gene SGLT-1 nas células intestinais após
7 dias de alimentação com dieta básica regional....................................................................64
Figura 21 A - Expressão relativa da transcrição do gene SN-2 nas células intestinais
desnutridas................................................................................................................................64
Figura 21 B - Expressão relativa da transcrição do gene CAT-1 nos enterócitos desnutridos.64
Figura 22 - Expressão relativa da transcrição do gene PEPT-1 nas células intestinais
desnutridas................................................................................................................................65
Figura 23 – Expressão relativa da transcrição do gene CFTR nas células intestinais
desnutridas................................................................................................................................65
Figura 24 – Expressão relativa da transcrição do gene ZO-1 nas células intestinais
desnutridas................................................................................................................................66
Figura 25 - Expressão relativa da transcrição do gene claudina-1 nas células intestinais
desnutridas................................................................................................................................66
Figura 26 - Expressão relativa da transcrição do gene claudina-2 nas células intestinais
desnutridas................................................................................................................................67
Figura 27 - Expressão relativa da transcrição do gene ocludina nas células intestinais
desnutridas................................................................................................................................67
Figura 28 - Imunofluorescência da proteína SGLT-1 observada através de microscopia
confocal.....................................................................................................................................68
Figura 29 - Diferença da intensidade de fluorescência da proteína SGLT-1 em íleo nutrido e
desnutrido..................................................................................................................................68
Figura 30 - Imunofluorescência da proteína SN-1 observada através de microscopia
confocal....................................................................................................................................69
Figura 31 - Diferença da intensidade de fluorescência da proteína SN-1 em íleo nutrido e
desnutrido..............................................................................................................................69
Figura 32 - Imunofluorescência da proteína SN-2 observada através de microscopia
Confocal....................................................................................................................................70
Figura 33 - Diferença da intensidade de fluorescência da proteína SN-2 em íleo nutrido e
desnutrido...............................................................................................................................70
Figura 34 - Imunofluorescência da proteína PEPT-1 observada através de microscopia
confocal....................................................................................................................................71
Figura 35 - Diferença da intensidade de fluorescência da proteína PEPT-1 em íleo nutrido e
desnutrido..................................................................................................................................71
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Composição da dieta básica regional (DBR)...........................................................25
Tabela 2 - Método de avaliação, estado nutricional dos animais, substrato testado e número de
animais normais e infectados analisados.................................................................................34
Tabela 3 - Informação nutricional das dietas............................................................................35
Tabela 4 - Nº de unidades formadoras de colônias e sua densidade ótica correspondente.......36
Tabela 5 - Oligonucleotídeos iniciadores, suas respectivas sequências e condições de PCR...43
Tabela 6 - Variação da CCC após adição cumulativa de glicose..............................................51
Tabela 7 - Variação da CCC após adição cumulativa de glutamina.........................................55
Tabela 8 - Variação da CCC após adição cumulativa de alanil-glutamina...............................59
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AA Aminoácido
A/ E Lesão attaching and effacing
Ala-Gln Alanil-glutamina
ANOVA Análise de variância
ATP Adenosina trifosfato
BFP Bundle forming pili
CAT-1 Transportador de Aminoácido Catiônico 1
CCC Corrente de Curto Circuito
cDNA Ácido desoxirubonucléico complementar
CFTR Regulador Transmembrânico de Fibrose Cística
CLD Trocador de Cloreto-Bicarbonato
D Animal desnutrido
DAEC Escherichia coli difusamente aderente
DAPI 4'6'-diamidino-2-fenilindol
DBR Dieta Básica Regional
DE Animal desnutrido infectado com Escherichia coli enteropatogênica
DH Animal desnutrido infectado com Escherichia coli HS
D.O. Densidade Ótica
DDP Diferença de potencial elétrico
E Animal infectado com EPEC 2348/69
EAEC Escherichia coli enteroagregativa
Ec50 Concentração para metade do efeito máximo
EHEC Escherichia coli enterohemorrágica
EIEC Escherichia coli enteroinvasora
EPEC Escherichia coli enteropatogênica
Esp EPEC protein secreted
ETEC Escherichia coli enterotoxigênica
FAD Dinucleotídeo de flavina e adenina
Gli Glicose
Gln Glutamina
GLUT2 Transportador de Glicose 2 (Glucose Transporter 2)
GTP Trifosfato de guanosina
H Animal inoculado com E. coli HS.
HE Hematoxilina-eosina
i Corrente elétrica
IgA Imunoglobulina A
Km Constante de Michaelis-Menten
LEE Locus of Enterocyte Effacement
Map Proteína efetora da E. coli enteropatogênica Mitochondrion-associated
protein
mEq/ L Miliequivalência do soluto por litro de solvente
mM Milimolar
mOsm Miliosmole
N Animal nutrido
NAD Dinucleotídeo de nicotinamida e adenina
NE Animal nutrido infectado com Escherichia coli enteropatogênica
NH Animal nutrido infectado com Escherichia coli HS
OMS Organização Mundial da Saúde
PBS Tampão salina fosfato (phosphate-buffered saline)
PEAF Fator de aderência plasmidial de E. coli
PEPT-1 Transportador de peptídeo (Peptide Transporter 1)
PPIA Peptidylprolyl isomerase A
qPCR Reação da polimerase em cadeia quantitativa
Rmáx Resposta máxima
RNA Ácido Ribonucleico (Ribonucleic Acid)
Rt Resistência transepitelial
SGLT Transportador de glicose sódio-dependente
LC2A2 Família 2 de transportadores GLUT
SLC5A Família de transportadores SGLT
SN Transportador de aminoácidos neutros (system N-specific amino acid)
SRO Solução de reidratação oral
STEC Escherichia coli produtora da toxina de Shiga
Tir Receptor translocado de intimina
ufc Unidades formadoras de colônias
ZO Zônula ocludina
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...........................................................................................................16
1.1 Fisiologia da digestão e absorção de carboidratos e proteínas................................16
1.1.1 Glicose...........................................................................................................................16
1.1.2 Aminoácidos e peptídeos..............................................................................................18
1.1.2.1 Glutamina......................................................................................................................19
1.1.2.2 Alanil-glutamina............................................................................................................21
1.2 Desnutrição..................................................................................................................22
1.2.1 Prevalência da desnutrição infantil no Brasil...........................................................23
1.2.2 Desnutrição experimental por dieta básica regional................................................23
1.3 Infecção por Escherichia coli enteropatogênica – EPEC.........................................25
1.4 Integridade da barreira intestinal.............................................................................28
1.5 Reidratação..................................................................................................................31
1.6 Justificativa..................................................................................................................32
2 OBJETIVOS................................................................................................................33
2.1 Objetivo geral..............................................................................................................33
2.2 Objetivos específicos...................................................................................................33
3 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................34
3.1 Origem e manutenção dos animais............................................................................34
3.2 Produção da ração de acordo com a Dieta Básica Regional...................................35
3.3 Indução da desnutrição experimental.......................................................................35
3.4 Inóculo bacteriano.......................................................................................................36
3.5 Modelo de infecção aguda por Escherichia coli enteropatogênica e a bactéria
controle Escherichia coli HS.......................................................................................36
3.6 Detecção da adesão bacteriana...................................................................................37
3.7 Avaliação histológica...................................................................................................38
3.8 Variação do transporte iônico....................................................................................39
3.8.1 O sistema das câmaras de Üssing...............................................................................39
3.8.2 Soluções perfusoras.....................................................................................................40
3.8.3 As soluções – teste com substratos.............................................................................40
3.8.4 Protocolo experimental...............................................................................................40
3.8.5 Medidas elétricas.........................................................................................................41
3.9 Avaliação da transcrição dos genes de transportadores intestinais e das junções
celulares......................................................................................................................41
3.9.1 Extração do RNA total...............................................................................................41
3.9.2 Síntese de cDNA..........................................................................................................42
3.9.3 Análise da transcrição dos transportadores e das junções celulares......................42
3.10 Reação de Imunofluorescência...................................................................................44
3.11 Análise Estatística.......................................................................................................45
4 RESULTADOS............................................................................................................46
4.1 Crescimento dos animais de acordo com a ração consumida.................................46
4.2 Detecção da adesão bacteriana...................................................................................46
4.3 Avaliação histomorfométrica.....................................................................................47
4.4 Variação do transporte iônico em íleo de camundongos.........................................49
4.5 Variação da resistência transepitelial........................................................................62
4.6 Variação da transcrição dos genes de transportadores e junções celulares durante
a desnutrição............................................................................................................................63
4.7 Microscopia confocal...................................................................................................67
5 DISCUSSÃO................................................................................................................72
5.1 Controle geral dos experimentos...............................................................................72
5.1.1 Crescimento dos animais com DBR..........................................................................72
5.1.2 Inóculo bacteriano.......................................................................................................72
5.1.3 Câmaras de Üssing......................................................................................................73
5.2 Consequências da desnutrição e infecção..................................................................74
5.2.1 Desnutrição..................................................................................................................74
5.2.2 Infecção com EPEC.....................................................................................................75
5.2.3 Desnutrição e EPEC....................................................................................................76
5.2.4 Colonização da E. coli HS...........................................................................................77
5.2.5 Desnutrição e E. coli HS.............................................................................................78
5.2.6 Resistência transepitelial............................................................................................79
6 CONCLUSÃO.............................................................................................................80
REFERÊNCIAS .......................................................................................................82
ANEXO A.....................................................................................................................92
16
1 INTRODUÇÃO
O sistema digestivo recebe diariamente grande quantidade de água através dos
alimentos, líquidos ingeridos e das secreções salivar, gástrica, biliar, pancreática e entérica
que, a cada 24 horas de intensa absorção pelo jejuno, íleo e cólon direito, cerca de 2 a 3%
desse volume são eliminados junto às fezes. No entanto, um distúrbio absortivo ou secreção
excessiva pode acarretar o aumento desse volume, devido a uma agressão à mucosa destes
segmentos gastroentéricos por agentes físicos, químicos ou biológicos (MISZPUTEN et al.,
2007).
O conteúdo alimentar que chega ao duodeno apresenta diferença de osmolaridade
em relação ao plasma e, é essa diferença que causa o transporte osmótico a partir do lúmen
intestinal para o plasma a fim de equilibrar as concentrações nos dois meios, entretanto esse
fluxo de água também acarreta o fluxo dos solutos dissolvidos no conteúdo luminal ou no
extra vascular. Esses solutos podem ser os íons sódio (Na+), potássio (K+), bicarbonato
(HCO3-), hidrogênio (H+) e macronutrientes como carboidratos, aminoácidos, peptídeos,
lipídeos entre outros (SILVA, 2002).
1.1 Fisiologia da digestão e absorção de carboidratos e proteínas
1.1.1 Glicose
As funções principais do intestino delgado é tanto a absorção de nutrientes quanto
a prévia digestão deles em moléculas suficientemente pequenas que possam ser absorvidas
(KOEPPEN; STANTON, 2009).
Assim, a digestão dos carboidratos no intestino delgado é dividida em duas etapas.
A primeira ocorre no lúmen e a segunda, na borda em escova dos enterócitos, para só então
ser possível a absorção, pois os enterócitos conseguem absorver apenas monossacarídeos e
não carboidratos grandes (KOEPPEN; STANTON, 2009).
Após digestão dos carboidratos a monossacarídeos como glicose, frutose e
galactose, o transporte destes pela membrana apical e posteriormente pela basolateral dos
enterócitos é realizado por transportadores específicos.
O transportador de glicose sódio-dependente (SGLT-1) é responsável pela
absorção de glicose na membrana apical dos enterócitos, funcionando por transporte ativo
secundário, visto que a energia utilizada não provém diretamente do ATP, mas do gradiente
17
de concentração de Na+, mantido pela bomba de Na+/K+ATPase presente na membrana
basolateral (WRIGHT; MARTÍN; TURK, 2003; WOOD; TRAYHURN, 2003).
Além do SGLT-1, no intestino delgado, há outros transportadores de glicose
dependentes do sódio (SGLT1-SGLT6, genes da família SLC5A) que foram identificados não
somente no intestino, mas em diversos órgãos (WRIGHT; MARTÍN; TURK, 2003; WOOD;
TRAYHURN, 2003).
Quando a concentração de glicose aumenta no meio intracelular, esse
monossacarídeo deixa a célula por difusão facilitada (a favor do gradiente de concentração)
pela membrana basolateral em direção à circulação sanguínea pelo transportador de glicose
GLUT2. Esse transportador independe de íons Na+, alta capacidade de transportar glicose,
porém tem baixa afinidade (Km para a glicose > 50 mM, ou seja, é preciso que haja
concentrações superiores a 50 mM de glicose no meio intracelular para que a velocidade de
transporte seja a metade da velocidade máxima) (WOOD; TRAYHURN, 2003; COSTANZO,
2007).
Paralelamente ao transporte intestinal de glicose via SGLT-1, o cloreto (Cl-) e o
bicarbonato (HCO3-) acompanham por uma via distinta o transporte de sódio, mantendo a
neutralidade elétrica (WRIGHT ; LOO, 2000; WRIGHT; MARTÍN; TURK, 2003) através do
trocador cloreto-bicarbonato (CLD) (RAFF; LEVITZKY, 2012), e a água (H2O) também vai
seguindo o gradiente osmótico passivamente gerado pelo transporte transcelular de eletrólitos
e nutrientes (GADEWAR; FASANO, 2005; KING et al., 2003), como mostra a Figura 1:
Figura 1 - Modelo clássico das vias de transporte de glicose
Fonte: Adaptado de Costanzo (2007).
SGLT 1 – proteína 1 transportadora de glicose Na+-dependente; ATP –
Trifosfato de adenosina; GLUT 2 – proteína 2 transportadora de glicose Na+-
independente; CLD – trocador cloreto-bicarbonato.
CCLLDD
Cl-
HCO3-
18
Desta maneira, o cotransporte de glicose, sódio e água pelo SGLT-1 e o transporte
associado de cloreto e bicarbonato tornaram-se as bases do desenvolvimento da terapia de
reidratação oral (WRIGHT; LOO, 2000; WRIGHT; MARTÍN; TURK, 2003), pois esses
transportes não são afetados por agentes infecciosos conhecidos ou suas toxinas
(GADEWAR; FASANO, 2005; KING et al., 2003).
1.1.2 Aminoácidos e peptídeos
Com o pH neutro, a enteropeptidase presente no intestino delgado converte o
tripsinogênio em tripsina, promovendo a ativação das outras propeptidases do suco
pancreático e levando à hidrólise luminal de proteínas e polipeptídeos, produzindo
aminoácidos (AA) livres e pequenos peptídeos com 2 a 6 AA. Estes são hidrolisados pelas
peptidases da borda em escova a AA, di e tripeptídeos e são absorvidos pelos enterócitos
(FRENHANI; BURINI, 1999).
Essa absorção ocorre por mecanismos carreadores específicos para grupos de
aminoácidos que dividem características químicas semelhantes, ou seja, AA neutros, básicos e
ácidos. Mas, os AA são absorvidos através da membrana apical, principalmente por transporte
ativo secundário Na+ - dependente (FREITAS et al., 1995; YANG; DANTZIG; PIDGEON,
1999).
Já o transporte de peptídeos através da membrana borda em escova é
independente do sistema de transporte de AA e é dependente de prótons H+, pois é estimulado
pelo gradiente de pH através da membrana borda em escova. Como o gradiente de Na+
promove o antiporte de Na+/ H+ na borda em escova, ele acaba gerando também o gradiente
de H+, essencial para energizar o transporte de peptídeos (FREITAS et al., 1995), como
ilustrado na Figura 2 a seguir:
19
Figura 2 - Dependência indireta dos cátions Na+ no mecanismo
absortivo de peptídeo H+-dependente
Fonte: Frenhani e Burini (2009).
1.1.1.1 Glutamina
A glutamina é um aminoácido bipolar, neutro, hidrofílico, facilmente hidrolisado
por ácidos e bases (ROGERO; TIRAPEGUI, 2003) cujo papel no metabolismo proteico e no
transporte de nitrogênio entre diversos órgãos tem sido muito pesquisado (SOUBA, 1991).
É considerado um AA não essencial. No entanto, torna-se essencial em situações
de estresse, pois a sua síntese não supre a demanda exigida pelo organismo (SANTOS;
CAPERUTO; COSTA ROSA, 2007).
Sua ação trófica sobre a mucosa do intestino delgado já é bastante conhecida
(KHAN, 1999; SOUBA et al., 1990), sendo encontrada em altas concentrações em células de
mamíferos, podendo captar a amônia e doar átomos de nitrogênio para a síntese de
nucleotídeos, mucossacarídeos e aminoácidos (SMITH, 1990). No sangue, corresponde a um
terço do nitrogênio circulante sob a forma de aminoácidos e, sua concentração varia de 600 a
800 mM, dando suporte à síntese de ureia no fígado e de amônia nos rins (SOUBA, 1987).
A mucosa do intestino delgado é importante na absorção desse aminoácido
(HANSON; PARSON, 1977). Essa absorção aumenta o influxo de água e o efluxo de íons K+,
aumentando a hidratação e o volume celular (ROGERO; TIRAPEGUI, 2003) e,
consequentemente a absorção de sódio (YANG; DANTZIG; PIDGEON, 1999).
20
O transporte de glutamina através da membrana a partir da borda em escova se faz
por meio de uma via Na+ dependente e em menor grau por uma via Na+ independente. O
transporte através da membrana basolateral é dependente de Na+ e do pH (BULUS;
ABUMRAD; GHISHAN, 1989).
Ainda que parte do transporte intestinal da glutamina seja semelhante ao da
glicose, a glutamina é mais importante do que esta como fonte energética para enterócitos,
colonócitos (WINDMUELLER, 1982) e células do sistema imune (VAN DER HULST et al.,
1993), pois nos tecidos animais existem muitas enzimas que catalisam a hidrólise de
glutamina em glutamato, possibilitando a participação desse AA no ciclo de Krebs e
consequentemente a formação de ATP ou GTP após a reoxidação de NAD e FAD na
mitocôndria (RAW; KRASILCHIK; MENNUCCI, 2001).
Além disto, estudos demonstraram que a glutamina altera a expressão gênica de
proteínas participantes da sinalização celular, regulação dos fatores de crescimento e resposta
inflamatória e imunológica (CORLESS et al., 2006). Ela também promove a proliferação de
enterócitos, linfócitos e fibroblastos (LI et al., 2008) e preserva o sistema imune com a
promoção de uma maior eficácia da função da barreira intestinal (CETINBAS; YELKEN;
GULBAS, 2010), mantendo a integridade da mucosa, prevenindo alterações na
permeabilidade intestinal e aumentando a absorção de Na+ pelo jejuno (VAN DER HULST et
al., 1993).
Segundo Fukatsu e Kudsk (2011), a suplementação com glutamina aumenta o
número de linfócitos nas placas de Peyer e na lâmina própria, normaliza a concentração
tecidual de citocinas de resposta imune do tipo Th2 e melhora os níveis de IgA na mucosa
intestinal.
O uso de glutamina em pacientes com estresse pós-operatório e tratamento com
imunossupressores preserva a integridade da mucosa intestinal e previne a translocação de
bactérias e toxinas (RIBEIRO et al., 2004). Outrossim, a administração de glutamina por via
parenteral também resulta no aumento do peso corporal, melhora dos níveis nitrogenados e
aumenta as células do epitélio gastrointestinal em estados catabólicos (SMITH, 1990).
Em ratos com isquemia intestinal há melhora da sobrevida com a suplementação
parenteral com glutamina (FUKATSU; KUDSK, 2011).
Em uma avaliação da permeabilidade intestinal através de lactulose/manitol em
camundongos com lesão intestinal induzida por 5-fluorouracil e suplementados com
glutamina e alanil-glutamina, demonstrou-se que apenas a glutamina foi capaz de restaurar a
permeabilidade intestinal, enquanto que a suplementação com alanil-glutamina reduziu a
21
recuperação de lactulose e de manitol individualmente ainda que a razão lactulose/manitol
tenha sido igual à do grupo com lesão (MONTEIRO, 2006).
Em 2011, Silva, Costa e Burgos relataram um caso de paciente HIV positivo com
desnutrição severa e diarreia (8 a 10 evacuações/ dia) tratada com 35 g de fibra solúvel
(goma-guar parcialmente hidrolisada), fracionados em sete porções de 5 g e 30 g de L-
glutamina, durante 10 dias. A partir do segundo dia de suplementação, o número de
evacuações diárias foi reduzido para três, sem alteração de consistência. No 4º dia, a paciente
apresentou uma evacuação líquida em 24 horas e, a partir do 5º dia, ocorreu a normalização da
função intestinal, com fezes pastosas uma vez ao dia e melhora do estado clínico geral. Essa
suplementação foi mantida durante 10 dias e, a partir do 20º dia, após a intervenção, a
paciente permanecia com função intestinal normal. Depois, a fórmula elementar foi
substituída por dieta polimérica (nutrientes intactos) associada à alimentação por via oral,
conforme aceitação diária da paciente.
Van der Hulst et al. (1993) afirmaram sobre a importância da suplementação com
glutamina para a manutenção da integridade do trato gastrintestinal, aumento da capacidade
absortiva intestinal e síntese proteica em condições de estresse prolongado, como na infecção
pelo HIV.
No entanto, características químicas desse aminoácido desfavorecem o seu uso
rotineiro, tais como instabilidade térmica, baixo coeficiente de solubilidade (3g/ 100 mL a
20ºC), velocidade de hidrólise dependente de temperatura, pH e concentração iônica
(MEISTER, 1956). Além disto, a glutamina decompõe-se em amônia e ácido piroglutâmico
(LIMA, 2006). Por isto, tem-se buscado desenvolver dipeptídeos com resíduos de glutamina
ligados às terminações C- ou N- como L-alanil-glutamina e glicil-L-glutamina (FÜRST;
POGAN; STEHLE, 1997).
1.1.1.2 Alanil-glutamina
É um dipeptídeo muito utilizado em experimentos devido à sua maior absorção
pelo intestino, alta hidrossolubilidade e termoestabilidade, além de ser possível o seu
armazenamento por até 2 anos (FÜRST; POGAN; STEHLE, 1997). Ademais, estudos
revelaram que a competição entre AA livres é evitada ou reduzida quando eles estão sob a
forma de dipeptídeos (GARDNER, 1975; TEMPLE et al., 1998).
22
Fei et al. (1994) relataram que o transportador intestinal PEPT-1, presente
exclusivamente na membrana apical dos enterócitos, possui ampla especificidade e transporta
ativamente di e tripeptídeos. Essa proteína está presente exclusivamente na membrana apical
dos enterócitos (THAMOTARAN et al., 1999; ADIBI, 2003).
A PEPT-1 é a principal via de absorção dos peptídeos oriundos das proteínas
digeridas, pois na membrana apical quase não há atividade das hidrolases (apenas 5 a 12% do
total). Por isto, em 1992, Minami, Morse e Adibi verificaram que L-alanil-glutamina era
especificamente transportada através dos enterócitos sem sofrer hidrólise. Assim, essa
proteína permite que dipeptídeos atinjam o citosol, no qual as peptidases apresentam 80 a
95% da atividade celular (FRENHANI; BURINI, 1999; YANG; DANTZIG; PIDGEON,
1999; ADIBI, 2003). Após essa digestão, os AA são aproveitados pela célula ou liberados
para a circulação portal, através de transportadores na membrana basolateral (DÉCHELOTTE
et al., 1991; D’SOUZA; TUCK, 2004).
Os peptídeos resistentes à hidrólise pelas peptidases intracelulares, são
transportados através da membrana basolateral via transportadores de peptídeos por transporte
facilitado, pois o antiporte de Na+/H+ gera e mantém o gradiente de prótons no lúmen
enquanto que a bomba de Na+/K+ (ATPase) mantém reduzida a concentração de Na+ no meio
citoplasmático (YANG; DANTZIG; PIDGEON, 1999).
1.2 Desnutrição
O estado nutricional infantil adequado requer o consumo satisfatório de nutrientes
para que haja um apropriado desenvolvimento físico e mental. Todavia, a desnutrição decorre
do consumo inadequado de nutrientes ou de frequentes infecções (UNITED NATIONS
CHILDREN’S FUND, 2006), associando-se geralmente às precárias condições de vida e de
assistência à gestante e às crianças, sendo que, na faixa etária de até 5 anos, há maior
vulnerabilidade biológica à desnutrição, à morbidade e à mortalidade (IBGE, 2010),
prejudicando o desenvolvimento psicomotor, o aproveitamento escolar e a diminuição da
altura e da capacidade produtiva na idade adulta (BLACK et al., 2008; VICTORA et al.,
2008).
Segundo o Fundo das Nações Unidas para a Infância (UNITED NATIONS
CHILDREN’S FUND), cerca de 165 milhões de crianças em todo o mundo são
subdesenvolvidas pela desnutrição quando bebês e enfrentam um futuro de enfermidades,
déficit educacional, baixa renda e pobreza (KELLAND, 2013).
23
Entre 2000 e 2003, a taxa de mortalidade infantil por desnutrição era de 53%.
Além disto, Wolrd Health Organization (WHO) - Global Database on Child Growth and
Malnutrition mostrou que a desnutrição contribui em 52,2% nos casos de morte infantil por
diarréia, sarampo e malária (CAUFIELD et al., 2004). No entanto, no Brasil, a ocorrência da
mortalidade por desnutrição tem diminuído devido a implementação de políticas de saúde e
distribuição de alimentos e pela melhoria das condições de saúde e de alimentação das
crianças, embora esta não tenha sido homogênea para todas as regiões (IBGE, 2010).
Portanto, a sobrevivência das crianças de países subdesenvolvidos depende da
prevenção e controle da desnutrição e morbidades associadas.
1.2.1 Prevalência da desnutrição infantil no Brasil
Atualmente, o estado nutricional infantil é avaliado antropometricamente através
dos índices peso / altura (P/A), altura / idade (A/I) e peso / idade (P/I) e, os indicadores podem
ser expressos em escore z (IBGE, 2010; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1995).
Assim, quando os valores de P/A são inferiores a -2 escores z, a criança apresenta peso baixo
em relação à altura e quando esse valor varia entre -2 e -1 escore z há risco para baixo peso
para a altura. Entretanto, se esse valor for de +1 a +2 escore z, a criança apresenta sobrepeso.
Em caso de obesidade, tal valor é superior a +2 escores z. Em relação aos índices A/I e P/I, há
retardo no crescimento e baixo peso para a idade, respectivamente, quando a criança apresenta
valores menores que -2 escores z; quando esse valor varia entre -2 e -1 escore z, há risco para
retardo de crescimento e risco nutricional para peso baixo para a idade, respectivamente
(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1995).
A partir disto, a Pesquisa Nacional de Demografia e Saúde da Criança e da
Mulher (2006) informou que 7% das crianças brasileiras apresentavam déficit de crescimento
em relação à altura, sendo 15% delas do Norte, 6% do Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste, e
8% do Sul do Brasil. Enquanto que, apenas 1,5% das crianças menores de 5 anos tinham
deficiência de peso em relação à altura (BRASIL, 2008b).
1.2.2 Desnutrição experimental por dieta básica regional
Como já dito anteriormente, as deficiências alimentares podem acarretar à criança
um grave estado de desnutrição que se reflete em seu desenvolvimento físico, mental e
intelectual, além de provocar desequilíbrios morfológicos e funcionais que, dependendo da
24
intensidade e duração, poderão ser irreversíveis (UNITED NATIONS CHILDREN’S FUND,
1998), pois a desnutrição nos primeiros anos de vida de um ser humano pode ter efeitos
devastadores e irreversíveis, considerando que neste período ocorre um rápido crescimento
(MORGANE et al., 1993) e consequentemente uma grande necessidade calórica e nutricional
(BROWN; POLLIT, 1996).
Por isto, para possibilitar futuros estudos sobre a desnutrição, os fisiologistas
Nelson Ferreira de Castro Chaves e Naíde Regueira Teodósio, ambos do Instituto de Nutrição,
da Universidade Federal de Pernambuco, realizaram um estudo para obter uma dieta,
denominada Dieta Básica Regional (DBR), que reproduzisse, no rato, carências dietéticas
qualitativa e quantitativamente.
Então, esses pesquisadores selecionaram alimentos de maior consumo pela
população do nordeste brasileiro tais como feijão mulatinho – Phaseolus vulgaris (SILVA et
al., 1987); charque (COSTA, 1995; FERREIRA et al., 1993); batata doce - Iponaea batatas
(PINHEIRO et al., 2000); farinha de mandioca – Manihot esculenta (BARRETO-
MEDEIROS et al., 2004) e compararam essa dieta com uma dieta padrão.
A DBR revela-se deficitária no teor e qualidade das proteínas, calorias, gordura,
vitaminas e minerais, como mostra a tabela 1, seus aminoácidos são extremamente limitantes
(TEODÓSIO et al., 1990), o que permitiu consolidar a DBR como um modelo experimental
de desnutrição, pois esta provoca, no rato, um tipo de desnutrição proteico-calórica,
associando o nanismo nutricional com alguns sinais clínicos de marasmo (TEODÓSIO et al.,
1990; COSTA, 1995).
25
Tabela 1 - Composição da Dieta Básica Regional (DBR)
Alimentos Quant. (g) Prot.(%) Carb. (%) Gord. (%) Sais (%) Fib. (%) Cal.
Feijão
mulatinho 16,41 3,86 7,27 0,24 0,68 0,29 46,68
Farinha de
mandioca 47,01 0,75 39,30 0,16 0,54 1,10 161,64
Charque 7,09 2,49 - 0,89 0,49 - 17,97
Batata
doce 20,62 0,34 16,18 0,05 0,42 0,84 66,53
Óleo de
algodão 6,87 - - 6,87 - - 61,83
Minerais 2,00 - - - 2,00 - -
Total 100,00 7,44 62,75 8,21 4,13 2,23 354,65
Fonte: Coutinho (1976).
A DBR vem sendo estudada em animais, sob vários aspectos, tais como:
crescimento (TEODÓSIO et al., 1990); desenvolvimento do sistema nervoso (MORGANE et
al., 1993); longevidade (LAGO et al., 1997); gerações sucessivas (PESSOA et al., 2000)
entre outros.
1.3 Infecção por Escherichia coli enteropatogênica - EPEC
Desde 1920, a Escherichia coli tem sido caracterizada como agente diarreico
especialmente em crianças (NATARO; KAPER, 1998).
Cepas de E. coli colonizam o trato gastrointestinal poucas horas após o
nascimento, e passam a constituir a microbiota intestinal de seus hospedeiros. Pertencente à
família Enterobacteriaceae, geralmente causa doença em seu hospedeiro quando há
imunocomprometimento ou quando as barreiras do sistema digestivo são rompidas
(NATARO; KAPER, 1998).
Atualmente, existem seis tipos patogênicos de Escherichia coli conhecidos:
a) E. coli enteroinvasora (EIEC);
b) E. coli enterotoxigênica (ETEC);
26
c) E. coli enteropatogênica (EPEC) que, dependendo da presença ou ausência do
fator de aderência plasmidial de E. coli (PEAF) (KAPER, 1996), é subdividida
em:
- Típica;
- Atípica;
d) E. coli produtora da toxina de Shiga (STEC);
e) Subgrupo E. coli enterohemorrágica (EHEC);
f) E. coli enteroagregativa (EAEC);
g) E. coli difusamente aderente (DAEC) (NATARO; KAPER, 1998).
Dentre os microrganismos mais patogênicos está a Escherichia coli
enteropatogênica (EPEC), causando um amplo espectro de doenças intestinais e extra
intestinais, incluindo diarreia, infecções do trato urinário, septicemia e meningite neonatal em
muitos países, principalmente nos subdesenvolvidos (MÜLLER et al., 2006).
A EPEC foi reconhecida pela primeira vez em 1940, e foi associada a surtos de
diarreia infantil em hospitais e creches do Reino Unido (BLANCO et al., 2006). Mesmo com
o desaparecimento dos grandes surtos de diarreia infantil por EPEC na maior parte dos países
industrializados, essa bactéria continua a ser um importante agente diarreico nos países em
desenvolvimento (NATARO; KAPER, 1998).
O seu mecanismo de patogenicidade relaciona-se à capacidade de provocar a lesão
adesão e apagamento (attaching and effacing - A/E) na mucosa intestinal do hospedeiro
(KENNY; FINLAY, 1995; NATARO; KAPER, 1998), causando destruição das
microvilosidades e aderência da EPEC à mucosa. Além disto, podem ser observadas
modificações no citoesqueleto celular logo abaixo das bactérias aderidas, como o acúmulo de
actina polimerizada, formando uma estrutura de pedestal (NATARO; KAPER, 1998).
Os fatores que levam à lesão A/E são codificados pelos genes presentes na ilha de
patogenicidade cromossômica denominada Lócus de Apagamento do Enterócito (Locus of
Enterocyte Effacement - LEE) (ELLIOTT et al., 1998). O contato inicial entre a EPEC e a
célula hospedeira é mediado por fímbrias do tipo IV denominadas pili formadores de feixes
(bundle forming pili - BFP) da superfície bacteriana. Essas fimbrias promovem a formação de
microcolônias com aderência localizada em culturas de células epiteliais (GIRÓN; HO;
SCHOOLNIK, 1991). Porém, é a proteína EspA, codificada pelo gene espA, a responsável
pela adesão inicial da EPEC e formação de um tubo de translocação bacteriana. Este, quando
em contato com os enterócitos, transloca proteínas codificadas ou não pela região LEE
(HERNANDES et al., 2009). Dentre as proteínas translocadas estão o receptor de intimina
27
translocado (Tir) que funciona como um receptor da adesina intimina codificada no LEE
(KENNY et al., 2002), responsável pela firme aderência bacteriana às células epiteliais do
intestino. Outras proteínas também são translocadas atuando na desestruturação do
citoesqueleto (EspB), perda da resistência transepitelial (EspF) e desregulação mitocondrial
(Map) (NATARO; KAPER, 1998).
Após estes processos de ataque, essas bactérias ligam-se às células membranosas
das placas de Peyer e rompem o gel mucoso suprajacente da célula do hospedeiro, causando
uma diarreia líquida com muco, febre e desidratação que pode ser severa e prolongada em
crianças (WALDER, 2006). As complicações geralmente decorrem da desidratação e do
desequilíbrio hidroeletrolítico e quando não tratadas adequada e precocemente podem levar a
óbito. Os casos crônicos ou repetidos acarretam desnutrição crônica, com retardo do
desenvolvimento estato-ponderal, ou seja, do peso e altura (BRASIL, 2008a).
Estima-se que na Ásia, África e América Latina, dependendo de fatores
socioeconômicos e nutricionais, a probabilidade de uma criança morrer antes dos 5 anos por
essas causas pode chegar a 50%. As epidemias de diarreia em bebês, crianças e adultos são
geralmente causadas por microrganismos veiculados pela água ou alimentos contaminados
por fezes humanas (VILA et al., 2009). Assim, entende-se que a prevalência de doenças
causadas por enterobactérias depende de vários fatores em especial a idade e o nível
socioeconômico dos pacientes.
Acredita-se que uma das razões importantes do prolongamento diarreico, seja um
atraso na reparação da mucosa intestinal, o que aumenta o risco de um ciclo vicioso de
infecção e desnutrição (ZIEGLER et al., 2003). Esse ciclo repetitivo pode levar a diarreias,
porque a desnutrição altera a mucosa intestinal com a redução do índice mitótico,
predispondo, portanto, a mucosa a infecções secundárias e dificultando a recuperação da
membrana. A manutenção da lesão nas vilosidades dificulta a absorção de moléculas e a
função imunológica (SULLIVAN; MARSH, 1992).
A diarreia é compreendida como uma maior eliminação de água junto às fezes
(MISZPUTEN et al., 2007) e tem causado a morte de 1,5 a 2,5 milhões de crianças menores
de 5 anos a cada ano (UNITED NATIONS CHILDREN’S FUND; WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2009), principalmente por desidratação. Na maioria dos casos, a diarreia é
aguda com duração menor que 14 dias, no entanto pode ser classificada como persistente,
quando supera esse período (MCAULIFFE et al., 1986).
Segundo a Organização Mundial de Saúde - OMS, 80% das diarreias agudas estão
relacionadas ao uso de água imprópria para consumo, ao sistema de esgoto ausente ou
28
inadequado ou ainda práticas de higiene insuficientes, especialmente em países ou áreas onde
são precárias as condições de saúde e saneamento básico.
1.4 Integridade da barreira intestinal
Se a desnutrição associada ou não à infecção intestinal pode acarretar diarreia,
devido à alteração da mucosa absortiva, então a integridade da barreira morfo-funcional
intestinal também está afetada, havendo redução da área absortiva e/ ou aumento da
permeabilidade intestinal. Esta é regulada por um contato intercelular mantido pelas junções
celulares, que são estruturas simétricas formadas entre as células, classificadas por junções de
oclusão, de adesão ou comunicantes (KIERSZENBAUM, 2007; GARTNER; HIATT, 2012).
Na zona apical dos enterócitos, as junções oclusivas controlam a permeabilidade
seletiva (MONTEIRO, 2006; GARTNER; HIATT, 2012) e determinam a polaridade dessas
células, separando a zona apical da basolateral e impedindo a livre difusão de lipídeos e
proteínas entre essas regiões (KIERSZENBAUM, 2007; GARTNER; HIATT, 2012).
Enquanto que as junções de adesão permitem a aderência célula-célula, e as junções
comunicantes ou do tipo gap possibilitam o fluxo de íons e de pequenas moléculas
(GARTNER; HIATT, 2012).
Dependendo da integridade das junções oclusivas, algumas zônulas são mais
permeáveis por possuir menos arranjos proteicos transmembranares ou menos permeáveis,
apresentando um maior número de faixas proteicas. Estas são compostas pelas proteínas
claudinas e ocludinas, como ilustrado na figura 5. Além dessas proteínas, as junções de
oclusão são reforçadas pelas proteínas citoplasmáticas ZO-1, ZO-2 e ZO-3, que asseguram o
correto alinhamento das claudinas e das ocludinas (GARTNER; HIATT, 2012).
29
Figura 3 - Esquema das interações proteicas nas junções celulares
Fonte: Aktories e Barbieri (2005).
Próximo às junções de oclusão, estão as junções de adesão que se mantêm ligadas
às células por intermédio das proteínas transmembranares caderinas. A região dessas
proteínas que ficam no meio extracelular depende de Ca²+ para que haja conexão da caderina
com a célula adjacente. Enquanto que a fração intracelular das caderinas liga-se aos
filamentos de actina que correm paralelos à membrana celular (GARTNER; HIATT, 2012).
Porém, a associação dessas junções aos microfilamentos de actina é mediada pela interação da
caderina com as cateninas (α, β e γ) (KIERSZENBAUM, 2007). Desta forma, a caderina liga
o citoqueleto de células adjacentes.
Devido a essa estrutura das vias paracelulares, as zônulas de oclusão são cerca de
duas vezes mais permeáveis ao Na+, K+ e Cl- (JOHNSON, 1997), portanto a maior parte do
transporte passivo de íons e pequenas moléculas no intestino ocorre entre os enterócitos.
Exemplo disto é que 90% da absorção intestinal de magnésio livre (Mg²+) ocorre por
transporte passivo nas vias paracelulares, dependendo do gradiente de concentração e da
voltagem transepitelial, caso o soluto seja carregado eletricamente (OLIVEIRA, 2011).
Importante salientar que, o transporte paracelular é impulsionado pelo
transmembranar, como ocorre quando há absorção transmembranar de Na+, que leva à
variação da voltagem transepitelial e acarretando a absorção paracelular de Cl-. De forma
semelhante, em alguns epitélios, a saída de Cl- pelos canais transmembrânicos, aumenta a
secreção de Na+ pela via paracelular, equilibrando eletricamente a região. Além desses
transportes, a água também pode mover-se pela via paracelular, pois a absorção de cloreto de
sódio (NaCl) pela membrana apical reduz a pressão osmótica nessa região e a travessia desse
sal pela membrana basolateral aumenta essa pressão. Assim, surge um gradiente transepitelial
30
de pressão osmótica que favorece o aumento da absorção de água. No epitélio do túbulo
proximal do nefrón, esse fluxo paracelular de água possibilita o transporte, pelas junções de
oclusão, de alguns solutos dissolvidos nela, processo chamado de transporte por arraste
(KOEPPEN; STANTON, 2009).
No entanto, a condutância das junções intercelulares pode ser afetada por toxinas
bacterianas (SEARS, 2000) e citocinas (NUSRAT; TURNER; MADARA, 2000), alterando a
permeabilidade intestinal. Este fato torna importante o seu estudo, pois a permeabilidade
intestinal relaciona-se à barreira funcional e à permeação de marcadores (TRAVIS;
MENZIES, 1992), o que permite o cálculo da permeabilidade e do fluxo de solutos em um
determinado intervalo de tempo (mL/mm²/min).
Assim, a permeabilidade depende do tamanho molecular da substância ou íon em
relação aos poros hidrofílicos da membrana, ou seja, ela é diretamente proporcional à
facilidade com que a superfície da mucosa intestinal pode ser atravessada por substâncias, por
difusão, sem a interferência de mediadores de constituintes específicos. Porém, para estudá-la,
é necessário o uso de moléculas com massa superior a 150 daltons (Da) para permeação, em
vez de íons, como sódio ou cloreto, pois uma mucosa intestinal saudável discrimina
acentuadamente a dimensão, configuração, solubilidade e polaridade molecular (TRAVIS;
MENZIES, 1992). Estes parâmetros são analisados em conjunto, por modelos matemáticos de
computação, com a conformação óptica e raio de Van der Waals (HOLLANNDER;
RICKETTS; BOYD, 1988).
Desta maneira, a integridade intestinal pode ser avaliada com alguns açúcares
hidrofílicos, que são pouco transportados pelo sistema de transporte de monossacarídeos da
mucosa intestinal e que não são metabolizados, pois após sua captação, circulam no sangue e
são excretados intactos na urina (LIMA et al., 1997; WYATT et al., 1993; PEARSON et al.
1982; LAKER; MENZIES, 1977). Dentre esses açúcares estão a lactose, a sacarose, o manitol
e a lactulose (CORREIA, 2007). Além destes, ramnose, xilose e arabinose foram utilizadas
por McCance e Madders em 1930 para demonstrar a taxa de absorção de uma variedade de
substâncias (HOBER, R.; HOBER, J., 1937).
Os açúcares mais comumente utilizados para tal fim são manitol (182 Da) e
lactulose (342 Da). O manitol penetra pela via transcelular e a lactulose, pela via paracelular,
testando desta maneira essas regiões, porque a perda da integridade da região intercelular
aumenta a absorção de lactulose e, a lesão das áreas absortivas diminui a absorção de manitol
(FLEMING et al., 1990). Consequentemente, a razão entre a concentração de lactulose e
manitol é uma medida quantitativa da integridade e função absortiva intestinal.
31
1.5 Reidratação
Em 1940, soluções eletrolíticas começaram a ser usadas para tratamento, e a partir
dos anos 60, a glicose foi adicionada a essas soluções, pois pesquisadores verificaram a
existência de um mecanismo de transporte Na+-glicose (SCHULTZ; ZALUSKY, 1964), ou
seja, a presença de glicose no lúmen intestinal aumenta a absorção de sódio e
consequentemente de água.
Em 1975, a Organização Mundial da Saúde (OMS) e o Fundo das Nações Unidas
para a Infância (UNITED NATIONS CHILDREN’S FUND) recomendaram o uso da solução
de reidratação oral (SRO) padrão contendo 90 mEq de Na+, 20 mEq de K+, 80 mEq de Cl-, 10
mM de base e 111 mM de glicose, com osmolaridade total de 311 mOsm, pois foi
demonstrado que essa solução é segura e eficaz para reidratação e manutenção para crianças e
adultos com todos os tipos de diarreia (MOLLA et al., 1981).
No entanto, uma metanálise posterior envolvendo estudos controlados apoiou a
adoção de uma SRO com menor osmolaridade, pois tem sido associada a menor ocorrência de
vômitos e defecações, além da redução da necessidade de infusões intravenosas não
programadas quando comparada com a SRO padrão entre bebês e crianças com diarreia sem
cólera (HAHN; KIM; GARNER, 2001). Já na infecção por cólera, não houve diferença
clínica com esta solução quando comparada à solução padrão, entretanto houve aumento na
incidência de hiponatremia assintomática (ALAM; MAJUMDER; FUCHS, 1999).
Em 2002, uma nova formulação foi recomendada pela OMS, contendo 75 Na+
mEq/ L, 75 mM de glicose e osmolaridade total de 245 mOsm / L.
Considerando esse histórico, a SRO passou a ser a terapêutica indicada para
diarreia, pois simplificou o tratamento e tem contribuído significativamente para a diminuição
da mortalidade por desidratação (BRASIL, 2008a).
Segundo Barbosa e Sztajnbok (1999),
Independente da etiologia da desidratação, os princípios gerais de tratamento são os
mesmos, devendo-se avaliar o volume de água perdido (gravidade) e o nível de
sódio (tipo de desidratação), não se esquecendo de que outros distúrbios eletrolíticos
e metabólicos poderão estar presentes, merecendo atenção especial o equilíbrio
acidobásico (H+) e os níveis de potássio (K+).
Estudos sobre a fisiopatologia de diarreias severas mostram que ocorre uma
intensa secreção luminal de íons Cl- e HCO3- e redução na absorção de Na+ e Cl- nos vilos
intestinais (FIELD; RAO; CHANG, 1989). Portanto, é necessária a reposição desses
32
eletrólitos perdidos através do emprego da SRO, e o processo de restituição apresenta as
seguintes etapas:
A primeira etapa da terapia de reidratação envolve restabelecimento rápido dos
níveis de água e eletrólitos. Em crianças desnutridas ou enfermas, deve-se utilizar soro
glicosado com soro fisiológico (HARRISON, 1989). A segunda etapa é de manutenção em 24
horas, envolvendo a reposição de água, eletrólitos e nutrientes necessários à normalização da
atividade metabólica (HOLLIDAY; SEGAR, 1957).Por fim, a terceira etapa é a reposição das
perdas anormais continuadas.
1.6 Justificativa
A desnutrição e a infecção por EPEC alteram a região absortiva da mucosa
intestinal, levando, às vezes, a diarreias devido à ocorrência de possíveis alterações no
transporte de nutrientes como carboidratos, aminoácidos e peptídeos e, consequentemente,
uma alteração nos mecanismos fisiológicos de transporte de eletrólitos e água, causando
desidratação, desequilíbrio eletrolítico e até a morte.
Por isto, é importante estudar o mecanismo de absorção de substratos Na+-
dependente e H+-dependente, observando as variações ocorridas durante a desnutrição e/ou
infecção, a fim de encontrar nutrientes que possam ser utilizados junto às soluções de
reidratação oral no intuito de aumentar a absorção de eletrólitos e de água e,
consequentemente, reduzir a incidência de desidratação, acidose e hipoperfusão de órgãos
vitais, visto que, por ser de baixo custo, a SRO é a terapia mais adequada no contexto de
países subdesenvolvidos, nos quais as doenças diarreicas são mais frequentes. Ademais, a
terapia de reidratação oral é não invasiva, o que possibilita uma maior adesão ao tratamento e
a dispensa de pessoal médico especializado em tempo indeterminado.
33
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Pretende-se estudar o efeito da glicose, glutamina e alanil-glutamina no processo
elétrico (corrente de curto circuito – CCC) da membrana intestinal do íleo normal e
histopatológico.
2.2 Objetivos específicos
1. Comparar as consequências histomorfológicas do íleo normal com o submetido
à desnutrição experimental e à infecção aguda por EPEC na região absortiva intestinal.
2. Analisar o transporte iônico através do epitélio intestinal em condições normais
de jejum e na presença de nutrientes frente à infecção pela E. coli enteropatogênica, com o
modelo de câmaras de Üssing e com a relação da corrente elétrica, diferença de potencial e
resistência transepitelial.
3. Avaliar as alterações no transporte de substratos como glicose, glutamina e
alanil-glutamina e íons intestinais e o efeito in vitro desses substratos no transporte iônico no
íleo nutrido e desnutrido, em condições normais e infectado.
4. Estudar se a desnutrição acarretam alterações na expressão gênica dos
transportadores intestinais e de algumas proteínas das junções celulares.
5. Analisar se a desnutrição altera a síntese proteica dos transportadores.
34
3 MATERIAL E MÉTODOS
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Doenças Infecciosas e no
Laboratório Pré-clínico do Instituto de Biomedicina da Universidade Federal do Ceará, com o
auxílio financeiro do próprio instituto (Número do Processo: 573928/2008-8) e aprovado pela
Comissão de Ética em Pesquisa Animal - CEPA da mesma universidade (nº 62/2011).
3.1 Origem e manutenção dos animais
Foram utilizados camundongos (Mus musculus) albinos, da linhagem Swiss, do
sexo masculino, provenientes do Biotério do Instituto de Biomedicina da Universidade
Federal do Ceará. Os animais foram distribuídos em grupos de acordo com a dieta, tratamento
e a presença de infecção. A tabela 2 esquematiza a distribuição dos experimentos e a
quantidade de animais utilizados.
Tabela 2 - Método de avaliação, estado nutricional dos animais, substrato testado e número de
animais normais e infectados analisados
Método de Avaliação Substrato teste Normal/Infectado
Coloração Giemsa 3NE/3NH
3DE/3DH
Histomorfometria 3N/ 3E/ 3H
3N/ 3E/ 3H
Câmaras de Üssing Glicose 4N/ 4NE/ 4NH
Glutamina 4N/ 4NE/ 4NH
Alanil-glutamina 4N/ 4NE/ 4NH
Glicose 4D/ 4DE/ 4DH
Glutamina 4D/ 4DE/ 4DH
Alanil-glutamina 4D/ 4DE/ 4DH
PCR para transportadores
intestinais e junções celulares
10N
10D
Imunofluorescência 5N / 5D
5N / 5D
Fonte: Elaborado pela autora
Animal nutrido (N); Animal nutrido infectado com EPEC 2348/69 (NE); Animal nutrido
inoculado com E. coli HS (NH); Animal desnutrido infectado com EPEC 2348/69 (DE);
Animal desnutrido inoculado com E. coli HS (DH).
35
3.2 Produção da ração de acordo com a Dieta Básica Regional
A Dieta Básica Regional (DBR) foi feita no laboratório de Farmacotécnica da
Universidade Federal do Ceará, utilizando-se como ingredientes batata-doce (Iponea batatas),
feijão mulatinho (Phaseolus vulgaris), farinha de mandioca (Manihot esculenta), carne de
charque e gordura da própria carne (TEODÓSIO et al., 1990).
Os ingredientes (exceto a farinha de mandioca) foram cozidos e em seguida
desidratados em estufa de esterilização e secagem com circulação de ar (60-70ºC), durante,
aproximadamente, 48 horas. Em seguida, foram moídos em moinho de facas e
homogeneizados em batedeira planetária, acrescentando-se a gordura do charque e carmelose
em gel na proporção total de 2%.
A massa foi então processada em uma extrusora para obtenção de pequenos
pedaços (pellets). Os pellets assim obtidos permaneceram em estufa com circulação de ar
(50ºC-60ºC) durante aproximadamente 24 horas até a sua secagem e solidificação.
A DBR e a ração comercial apresentam em percentagem, respectivamente, os
seguintes nutrientes:
Tabela 3 - Informação nutricional das dietas
Constituintes (%) DBR Ração comercial
Proteínas 7,87 22
Carboidratos 69,67 50,44
Lipídeos 0,8 5,0
Fibras 7,21 10,0
Minerais 1,26 10,0
Valor energético (Kcal) 317,36 338,76
Fonte: Elaborado pela autora
DBR – Dieta Básica Regional.
3.3 Indução da desnutrição experimental
Os animais foram alimentados com as rações descritas na tabela 3 por 7 dias.
Metade deles consumiu a dieta comercial e, a outra metade se alimentou com a ração
deficiente (DBR). O desenvolvimento foi acompanhado pela medida da variação do peso
corporal versus idade.
36
3.4 Inóculo bacteriano
As cepas utilizadas neste estudo nos foram fornecidas gentilmente pelo Dr. James
Nataro, da Universidade de Virgínia, E.U.A.
Para encontrar o inóculo adequado para causar infecção aguda nos animais deste
estudo, semeou-se, em Agar MacConkey, amostras de Escherichia coli enteropatogênica cepa
2348/69, essa placa semeada foi incubada a 37ºC por 24 horas.
Após esse período, coletou-se diversas unidades formadoras de colônias (ufc),
transferindo-as para um tubo eppendorff de 1,5 ml contendo 1000 µL de solução salina estéril
tamponada com fosfato (PBS), a fim de obter suspensões bacterianas com densidade ótica (D.
O.) de aproximadamente 0,100 nm, 0,200 nm e 0,280 nm. Destas, semeou-se 50 µL em Agar
MacConkey pelo método de espalhamento em triplicata e incubou-se a 37ºC por 24 horas.
Feito isto, contou-se o número de ufc crescidas e, utilizando-se a seguinte equação
(HÖFLING; GONÇALVES, 2008; TORTORA; FUNKE; CASE, 2012):
Número de ufc x fator de diluição / volume semeado no meio
Obteve-se a contagem de microrganismos viáveis e a densidade ótica correspondente como na
tabela a seguir:
Tabela 4 - Nº de unidades formadoras de colônias e sua densidade ótica
correspondente
D. O. medida Nº de ufc/1 mL
0,0853 nm 6,853E7 ± 2,086E7
0,1335 nm 7,467E8 ± 4,631E7
0,2367 nm 57,67E9 ± 9,262E9 Fonte: Elaborado pela autora
Densidade ótica (D.O.); unidades formadoras de colônias (ufc).
3.5 Modelo de infecção aguda por Escherichia coli enteropatogênica e a bactéria
controle Escherichia coli HS
O modelo de infecção foi semelhante ao descrito por Silva (2002) e Soares
(1996), porém como era outro tipo de animal e de agente infeccioso era necessário saber qual
suspensão induziria uma infecção aguda e qual o período mínimo de contato da bactéria com
a célula hospedeira era necessário para isto.
37
Assim, após obter uma suspensão bacteriana de 109ufc/ml, ou seja, com densidade
ótica de aproximadamente 0,23 nm, transferiu-se 100 µL desta para um segundo tubo
eppendorf contendo 900 µL de PBS estéril, repetindo-se esse procedimento até obter
suspensões com fator de diluição igual a 108, 107, 106 e 105.
Foram utilizados camundongos Swiss nutridos e desnutridos, machos, com peso
de 20 a 25 g e de 5 semanas de idade aproximadamente. Os animais foram mantidos em
ambiente fechado, devidamente refrigerado, à temperatura de 22 ºC, sob luz artificial,
recebendo água e ração ad libitum.
Para cada fator de diluição, foram utilizados 3 animais nutridos e 3 animais
desnutridos. Foram anestesiados, por via intramuscular, com cloridrato de cetamina 10% (35
mg/Kg) e cloridrato de xilazina 2% (4 mg/Kg), ambos da Syntec do Brasil Ltda., Cotia, SP,
BRA, após serem mantidos em jejum por 18 horas aproximadamente. A indução foi
conseguida em aproximadamente cinco minutos e a anestesia durou cerca de duas horas;
sendo necessário prolongar o tempo anestésico, injetando um quarto da dose inicial. Após a
anestesia, o animal foi fixado em decúbito dorsal por meio de fita adesiva em mesa cirúrgica
de 30x50cm.
A partir disto, foi feita laparotomia mediana longitudinal, desde o apêndice
xifoide do animal à porção inferior do músculo reto abdominal, identificando a região do íleo
após encontrar o ceco. Perfurou-se a região mesentérica livre de vasos sanguíneos para fazer
as ligaduras com fios de poliéster e, desta forma, isolar dois segmentos ilíacos de 3
centímetros cada.
Após isolamento das alças, injetou-se 200 µL de suspensão bacteriana com
seringa de insulina de 1mL diretamente na região isolada. Logo depois, o intestino delgado
deslocado foi reposicionado na cavidade abdominal e fez-se uma sutura com Fio de Sutura
Agulhado Nylon 3.0 Procare. O tempo foi de 2 e 3 horas de incubação bactéria-hospedeiro.
3.6 Detecção da adesão bacteriana
Depois do período de 2 ou 3 horas, a sutura foi desfeita e os dois segmentos
isolados do íleo foram removidos, limpos com PBS estéril a 4ºC. Cada alça foi armazenada
em cassete previamente identificado, posta em formol 10% por até 24 horas para fixação e,
para desidratar os tecidos, as lâminas foram transferidas para solução de álcool etílico 70% até
o momento de parafinizar, em seguida receberam banhos com sequências alcoólicas em
38
concentrações crescentes (álcool 70%, 80%, 90% e absoluto). Os tecidos foram diafanizados
com banhos de xilol e parafinizados (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
Para detectar a adesão bacteriana, cortou-se com micrótomo manual e, com
albumina, esses microssegmentos de tecido parafinizados foram aderidos a lâminas de
microscopia (CAPUTO; GITIRANA; MANSO, 2010).
Para desparafinizar a fim de corar os tecidos, procedeu-se como descrito no
manual do Giemsa Kit da EasyPath.
As lâminas coradas foram observadas em microscópio Nykon Eclipse E200, com
aumento de 1000 vezes através de lente objetiva de 100x e ocular de 10x. As mesmas foram
fotografadas com câmera NykonCoolpix 4500.
3.7 Avaliação histológica
Após detecção de adesão bacteriana apenas com a suspensão bacteriana de
108ufc/mL e após 3 horas de incubação bactéria-hospedeiro, para análise histomorfométrica,
semeou-se em Agar MacConkey colônias de Escherichia coli enteropatogênica cepa 2348/69
e de Escherichia coli HS. Essas placas semeadas foram incubadas a 37 ± 2ºC por 24 horas.
Após esse período, coletou-se diversas ufc, transferindo-as para um tubo
eppendorff de 1,5 mL contendo 1000 µL de PBS, a fim de obter uma suspensão bacteriana
com densidade ótica de aproximadamente 0,23 nm. Repetindo-se o item 3.5. apenas com essa
suspensão. Em paralelo, foi coletado tecido ilíaco de 3 animais nutridos e desnutridos que não
receberam injeção de suspensão bacteriana, sendo usados como grupo controle.
Depois de 3 horas, a sutura foi desfeita e as duas alças ilíacas foram removidas,
lavadas com PBS estéril a 4ºC para descartar as fezes e as bactérias não aderidas. Cada alça
foi armazenada em cassete previamente identificado, posta em formol 10% por até 24 horas
para fixação até o momento de parafinizar, em seguida foram banhadas com álcool 70%,
80%, 90% e absoluto. Os tecidos foram diafanizados com banhos de xilol e parafinizados
(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2005).
Os tecidos parafinizados foram cortados com micrótomo e, com albumina, esses
microssegmentos de tecido parafinizados foram aderidos a lâminas de microscopia
(CAPUTO; GITIRANA; MANSO, 2010).
Para corar com hematoxilina-eosina (HE), prosseguiu-se a desparafinização com
xilol, depois banhos alcoólicos decrescentes (álcool absoluto, 90%, 80% e 70%). Logo após,
as lâminas foram postas em água destilada, imersas em hematoxilina, lavadas com água
39
corrente e mergulhadas em eosina. Depois disto, os segmentos teciduais foram desidratados
com banhos de álcool 70%, 80%, 90% e absoluto, e finalizou-se tal processo com banhos de
xilol (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
Ao fim do processo, colocou-se as lâminas já coradas, com a secção virada para
cima sobre a superfície de trabalho, sem deixar a lâmina secar; com uma pipeta de Pasteur
aplicou-se uma gota de meio de montagem sobre a lâmina; umedeceu-se a lamínula com xilol,
e cobriu-se a lâmina.
As lâminas coradas foram observadas em microscópio Nykon Eclipse E200 e com
aumento de 40 vezes através de lente objetiva de 4x e ocular de 10x. Elas foram fotografadas
com câmera NykonCoolpix 4500 e, a área dos vilos e a profundidade das criptas foram
medidas pelo programa Image J versão 1.6.0.
3.8 Variação do transporte iônico
3.8.1 O sistema das câmaras de Üssing
Foram utilizados animais com e sem infecção. Semelhante aos trabalhos feitos por
Soares (1996) e Silva (2002), após o abdômen ser aberto na linha mediana, 6 cm do íleo distal
foi seccionado, limpo com PBS a 4ºC e varetado em bastão de vidro. A seguir, foi feita uma
incisão superficial à margem da inserção mesentérica.
O tecido foi rapidamente dissecado da membrana serosa, aberto com bisturi e
cortado em segmentos de linha mesentéricos de 0,5 a 1 cm. Todos esses procedimentos foram
realizados sobre uma placa de Petri em contato com gelo.
Cada segmento foi colocado entre duas hemicâmaras de acrílico, fixadas no
suporte das câmaras. Simultaneamente, as câmaras foram preenchidas com 5 mL de solução
de Krebs glicosado (lado seroso do tecido) e igual volume de solução de Krebs-Manitol (lado
mucoso), previamente aerada. Em seguida, as câmaras foram conectadas e, a circulação do
perfusato foi liberada.
Para a circulação e aeração dos 5mL das soluções perfusoras Krebs-Glicose e
Krebs-Manitol, foi utilizada uma mistura carbogênica de 95% de oxigênio e 5% de dióxido de
carbono. A temperatura do perfusato foi mantida em 37,8ºC pela circulação de água entre as
paredes da camisa dos tubos conectados a uma bomba de circulação termoestável.
40
As medidas elétricas da corrente de curto circuito (CCC), diferença de potencial
elétrico (DP) e resistência transepitelial (Rt) foram feitas a cada 5 minutos durante todo o
período experimental (90 minutos).
3.8.2 Soluções perfusoras
A solução de Krebs utilizada nos experimentos foi composta por 115 mM de
NaCl, 25 mM de NaHCO3-, 2,4 mM de K2HPO4, 1,2 mM de CaCl2, 1,2 mM de MgCl2, 0,4
mM de KH2PO4 a pH 7.4 (CLARKE, 2009). Desta, 100 mL foram separados em dois
erlenmeyers e em um deles foi adicionado 0,180 g de glicose (10 mM) e no outro, 0,182 g de
manitol (10 mM).
As pontes Krebs-ágar foram feitas preenchendo cânulas de polietileno com a
solução Krebs-ágar composta por 2,4 g de ágar dissolvidos em 50 mL de solução de Krebs
fervida em banho-maria (LIMA et al., 1992).
3.8.3 As soluções – teste com substratos
Os substratos utilizados neste estudo foram:
a) Glicose - Sigma, St.Louis,Mo.,USA.
b) L-glutamina - Sigma, St.Louis,Mo.,USA.
c) L-alanil-glutamina (Rexim SA, Courbevoie, França).
As soluções desses substratos foram feitas nas concentrações de 0,7 mM, 2 mM, 7
mM, 20 mM, 70 mM e 200 mM como descrito em Soares (1996) de modo que cada uma
delas apresentasse 300 mOsm (miliosmois).
3.8.4 Protocolo experimental
As medidas elétricas feitas durante os primeiros 20 minutos foram usadas para
triagem das condições teciduais. Além disto, se, logo após a montagem, um segmento
intestinal apresentasse uma medida de CCC distante da média dos outros segmentos, ele era
substituído por outro (SOARES, 1996).
A cada 10 minutos, 100 µL das soluções perfusoras foram substituídos por 100
µL das soluções teste mencionadas no subitem anterior.
41
Na fase final do experimento, 200 µL da solução perfusora de Krebs-glicose do
lado seroso foram substituídos por 200 µL de solução de teofilina 1mM (Sigma, St. Louis,
Mo.,USA). O teste com teofilina objetivou testar a estabilidade elétrica da membrana, e caso
o clampeador de voltagem apresentasse uma sobrecarga de corrente em uma das câmaras, os
dados obtidos dessa câmara eram eliminados (SOARES, 1996).
3.8.5 Medidas elétricas
Após as câmaras serem conectadas aos tubos de circulação, com todo o sistema de
manutenção de temperatura e aeração ligado, e as câmaras preenchidas com as soluções
perfusoras, os pré-amplificadores foram ligados e o amperímetro zerado a fim de ser medido e
registrado o potencial elétrico (DP1) espontaneamente gerado pelo sistema.
Para medir a resistência elétrica do sistema, foi aplicada uma corrente de 50 µA,
possibilitando o registro de um novo valor apresentado pelo voltímetro (DP2), com as duas
diferenças, calculou-se a resistência do sistema, usando a Lei de Ohm:
R = ΔDP / i
A seguir, o valor da resistência calculada foi imposto e assim a resistência do
sistema foi zerada, permitindo a medida apenas da R da membrana (Rt).
3.9 Avaliação da transcrição dos genes de transportadores intestinais e das junções
celulares
3.9.1 Extração do RNA total
Na análise da transcrição gênica, foram utilizados 10 animais nutridos e 10
desnutridos sem infecção, dos quais foram removidos 3 cm do íleo distal, lavados com PBS a
4ºC e abertos com tesoura. A mucosa foi raspada com o auxílio de lâminas de microscopia em
um ângulo de 45º, o raspado mucosal foi armazenado em tubo eppendorf a -80ºC até o
momento da extração de mRNA. A extração do RNA foi realizada de acordo com o protocolo
do QiagenRNeasyLipidTissue Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany).
Para lisar as células, adicionou-se 1000 µL de trizol e uma pequena quantidade de
grânulos de vidro aos tubos contendo raspado tecidual. Homogeneizou-se em batedor de
42
grânulos. Deixou-se o tubo com o homogenato por 5 minutos à temperatura ambiente. Logo
após, centrifugou-se por 5 minutos a 14000 rotações por minuto (rpm) a 4ºC. Transferiu-se o
sobrenadante para outro tubo eppendorf de 2mL. A esse sobrenadante, foram adicionados
200µL de BCP (1-bromo-3-cloropropano, FLUKA 16720), a fim de separar a solução em fase
aquosa e orgânica após agitação por 15 s e centrifugação por 15 min a 12000G. A fase aquosa
que contém o RNA foi transferida para outro tubo e, a ele, foi acrescentado igual volume de
etanol 70%. Essa mistura foi adicionada à coluna mini spin, esta retém o RNA. Centrifugou-
se por 15 segundos a 12000 G a 4ºC e descartou-se o volume do tubo coletor. À coluna, foi
adicionado o tampão RW1. Centrifugou-se novamente e o volume do frasco coletor foi
descartado. Adicionou-se 500µL do tampão RPE e centrifugou-se duas vezes por 15 segundos
e 2 minutos, respectivamente. O frasco coletor foi trocado, repetiu-se a centrifugação por 1
minuto.
Para eluir o RNA contido na coluna, posicionou-se esta em um tubo eppendorf de
1,5 mL, previamente identificado e adicionou-se 30 µL de água RNase-free, centrifugando em
seguida. Sua concentração foi medida através de NanoDrop 2000. E o RNA extraído foi
estocado a -80ºC.
3.9.2 Síntese de cDNA
O mRNA foi transcrito reversamente em cDNA, utilizando iScript™
cDNASynthesis Kit (Bio-RadLaboratories, USA) de acordo com o instruções do fabricante. O
protocolo da reação incluiu 1 µL da enzima trasncriptase reversa, 4 µL do tampão 5x
iScriptReaction Mix (solução constituída de oligonucleotídeos e iniciadores aleatórios), 200
ng/µL de RNA extraído das amostras e completou-se o volume total até 20µL com água livre
de nuclease. Incubou-se a mistura por 5 minutos a 25ºC, 30 minutos a 42ºC e 5 minutos a 8ºC.
Armazenou-se o cDNA em freezer a -20º C até sua posterior utilização no PCR quantitativo
em tempo real (qPCR).
3.9.3 Análise da transcrição dos transportadores e das junções celulares
Como mostra a Tabela 5, foi avaliada a transcrição dos genes ZO-1, Claudina-1,
Claudina-2, Ocludina, SGLT-1, SN-2, CAT-1, PEPT-1, CFTR utilizando o iQ5 Real-Time
PCR Detection System (Bio-RadLaboratories, Estados Unidos ). O gene de referência
utilizado foi o PPIA (peptidylprolyl isomerase A).
43
Tabela 5 - Oligonucleotídeos iniciadores, suas respectivas sequências e condições de PCR
Genes Sequencias dos iniciadores
(5´ - 3´)
Produto
(pb) Nº NCBI
TºC
anelamento
ZO-1 S – GACCATCGCCTACGGTTTGA
AS – AGGTCTCGGGGATGCTGATT 116
NM_0011
63574.1 60ºC
Claudina-1 S – TCTACGAGGGACTGTGGATG
AS – TCAGATTCAGCAAGGAGTCG 84
NM_0166
74.4 58ºC
Claudina -2 S – CCCACCACCACCAGCTTAAT
AS – GAAATGGCTTCCAGGTCAGC 170
NM_0166
75.4 60ºC
Ocludina S – AAGAGCAGCCAAAGGCTTCC
AS – CGTCGGGTTCACTCCCATTA 199
NM_0087
56.2 60ºC
SGLT-1 S – CGGAAGAAGCGATCTGAGAA
AS – AATCAGCACGAGGATGAACA 63
NM_0198
10.4 58ºC
SN-2 S – ATATCCTCGTCATCTGTGTGC
AS – CAGTAGGTACAATACGGAGGTAGA 120
NM_1724
79.2 60ºC
CAT-1 S – CTTTGGATTCTCTGGTGTCCTGTC
AS – GTTCTTGACTTCTTCCCCTGTGG 97
NM_0075
13.4 58ºC
PEPT-1 S – AGGGGAGAACGGAATCAGGT
AS – CTTTTCGCCAGAAGGGAAGA 130
NM_0530
79.2 60ºC
CFTR S – GGATGCTGAGGAAGCAACTC
AS – CCAGCCTGGAACTCTCTTTG 172
NM_0210
50.2 58ºC
PPIA S – AATGCTGGACCAAACACAAA
AS – TTCCACAATGTTCATGCCTT 117
NM_0089
07.1 58ºC
Fonte: Elaborado pela autora
S – iniciador sense; AS – iniciador antisense
Para a reação foram utilizados 10 µL de Syber Green PCR Master Mix
(AppliedBiosystems, Inglaterra), 2 µL de cada iniciador (0,2 µM) e 1 µL de cDNA das
amostras completando com água livre de nuclease até um volume final de 20µL. Todos os
iniciadores utilizados e as condições da qPCR estão na Tabela 5.
Para assegurar a especificidade das amplificações, foi realizada após cada reação
uma curva de fusão, na qual a temperatura da reação foi aumentada a cada 15 s em 0,5 °C,
começando a partir da temperatura de anelamento dos iniciadores e terminando a 95 °C.
Durante todo o processo de construção da curva, as alterações na fluorescência foram
medidas, e os dados foram obtidos com o software do sistema óptico iQ5 (versão 2,0; Bio-
Rad) e foram baseados nos valores do ciclo de limiar, em que a fluorescência observada é de
10 vezes maior do que a fluorescência basal para cada ensaio de qPCR. A expressão da
transcrição dos genes foi obtida através do software REST 2009 (QIAGEN) baseado na
aplicação do método matemático de Pfaffl (PFAFFL; HORGAN; DEMPFLE, 2002) que
utiliza um teste de significância aleatória, com intervalo de confiança de 95% e P < 0,05.
44
3.10 Reação de Imunofluorescência
As alças de íleo nutrido e desnutrido não infectado foram removidas, limpas com
PBS estéril a 4ºC, a alça foi fixada por paraformaldeído 4% por até 24 horas e, para desidratar
os tecidos, eles foram mantidos em álcool etílico 70% até o momento de parafinizar, depois
foram banhados em álcool 70%, 80%, 90% e absoluto. O clareamento foi conseguido com
banhos de xilol. Em seguida, os tecidos foram parafinizados (CAPUTO; GITIRANA;
MANSO, 2010).
Após síntese dos blocos de parafina, os microssegmentos teciduais foram obtidos
com micrótomo manual e aderidos às lâminas de microscopia.
A realização da técnica de imunofluorescência foi orientada pelo manual do
Immunofluorescence kit for VIP (human, porcine, rat) Peninsula Laboratories, código PENI -
IFK7161.
Prosseguindo-se inicialmente com a desparafinização através de 3 lavagens com
xileno, 5 minutos cada. Feito isto, lavou-se duas vezes, 5 minutos cada, com etanol 100% e
95%. Posteriormente, lavou-se 1 vez, por 5 minutos em etanol 80%, 70% e 50%. Por fim,
lavou-se duas vezes, 5 minutos cada, em água. Após essas lavagens, as lâminas foram
mergulhadas em recipiente contendo tampão de recuperação (citrato de sódio) e postas em
forno microondas na potência máxima, até começar a ferver. Depois, reduziu-se a potência
por 9 minutos. Retirou-se do forno e deixou-se arrefecer à temperatura ambiente durante 20
minutos. As lâminas foram lavadas três vezes com água, 5 minutos cada.
Escorreu-se as lâminas, sem deixar ressecar. Desenhou-se uma barreira
hidrofóbica ao redor de cada tecido e colocou-se as lâminas na água e depois em PBS por 5
minutos. Depois, colocou-se as lâminas em um recipiente contendo tampão de
permeabilização (0,2% Triton X-100 em PBS) por 45 minutos à temperatura ambiente.
Lavou-se com PBS por 5 minutos. O excesso de PBS foi removido com papel toalha. Logo
após, elas foram postas na horizontal em câmara umidificada. Sobre as secções teciduais,
adicionou-se tampão de bloqueio (soro de animal normal 4% mais BSA/PBS 1%), utilizando
uma pipeta. Fechou-se a câmara úmida e incubou-se durante 1 hora à temperatura ambiente.
As lâminas foram lavadas três vezes, 5 minutos cada, com PBS.
Com papel toalha, o excesso de PBS foi retirado e, as lâminas foram repostas
horizontalmente em câmara umidificada. Adicionou-se o anticorpo primário a cada secção
tecidual. Fechou-se a câmara umidificada e incubou-se durante a noite a 4°C. Os anticorpos
primários utilizados foram SGLT-1 (Santa Cruz #SC98974, diluído em 1:200), SN-1 (Santa
45
Cruz #SC33445, na concentração de 1:200), SN-2 (Santa Cruz #SC50682, concentração
utilizada: 1:200), PEPT-1 (Santa Cruz #SC20653, concentração usada: 1:200), ambos diluídos
em tampão de bloqueio.
Os anticorpos secundários utilizados foram Alexa fluor 488 anti-rabbit e anti-
goat e Alexa Fluor 594 ambos da (Invitrogen) diluídos em tampão de bloqueio em 1:250. Para
adicionar o anticorpo secundário, lavou-se as lâminas 3 vezes, 5 minutos cada, com PBS e
enxugou-se o excesso com papel toalha e novamente incubou-se as lâminas horizontalmente
em câmara úmida. Os anticorpo foi posto sobre as secções, protegido da luz, durante 1 hora a
temperatura ambiente. Após esse período, lavou-se três vezes, 5 minutos cada, com PBS.
Posteriormente, as lâminas foram retiradas do recipiente contendo PBS, e o
excesso deste foi removido. Adicionou-se, sobre os tecidos, DAPI (4'6'-diamidino-2-
fenilindol) da Invitrogen (#D1306) diluído a 1:300 em Fluormount-G (Fisher, #0100-01), a
fim de corar o núcleo celular. Excluiu-se as bolhas, deixou-se secar em ambiente escuro por 1
hora. As bordas foram seladas com caneta hidrofóbica. Aguardou-se 15 minutos para secar no
escuro, depois armazenou-se a 4ºC no escuro.
As lâminas foram observadas em fotomicroscópio de campo escuro com epi-
iluminação (Zeissaxioscan) com filtro de 490 nm de comprimento de onda, acoplado à câmara
de fotografia convencional.
3.11 Análise Estatística
Todos os resultados foram analisados por análise de variância pelo teste ANOVA
e pós-teste Bonferroni, pelo teste de hipótese não pareado de t-Student unicaudal ou pelo teste
t-Student não paramétrico (Mann Whitney) através do programa GraphPad Prism 5.0. O nível
de significância do teste foi α = 0,05, ou seja, P < 0,05 e o intervalo de confiança foi de 95%.
46
4 RESULTADOS
4.1 Crescimento dos animais de acordo com a ração consumida
As curvas de peso versus idade dos animais (Figura 4) obtidas com a dieta
comercial padrão e a dieta básica regional permitiram o estabelecimento de uma referência de
desenvolvimento dos animais utilizados nos experimentos. Assim, os resultados mostram que
os animais alimentados com a dieta básica regional tiveram um menor ganho de peso,
havendo diferença significativa de desenvolvimento entre os grupos (P < 0,05).
Figura 4 – Variação do crescimento de camundongos
Variação do peso vs. idade de animais
28 3510
15
20
25
30
Dieta padrão
Dieta básica regional*
Idade (dias)
Peso
(g
)
Fonte: Elaborado pela autora
Crescimento de camundongos (Mus musculus) Swiss, machos, 28 a 35
dias de idade submetidos à ração comercial (n = 10) e à dieta básica
regional (n = 10) durante 7 dias. A análise estatística foi realizada pelo
teste não pareado de t-Student unicaudal. (*) – P < 0,05.
4.2 Detecção da adesão bacteriana
Por microfotografia em maior aumento do material de biópsia do intestino
delgado (íleo) de camundongos nutridos e desnutridos, pôde-se observar a presença de nichos
bacterianos aderidos à superfície epitelial quando o tempo de infecção foi de 3h, após injeção
direta de 200µL de suspensão bacteriana contendo 108ufc/ mL (EPEC 2348/69) no íleo
(figura 5 A e B; figura 5 C e D). Nas figuras 8 A e B, não se visualiza adesão direta da E. coli
HS ao epitélio intestinal, mas o seu acúmulo na região central do lúmen.
47
Figura 5 - Microfotografia de íleo de camundongo Swiss infectado com 108ufc/mL de
EPEC 2348/69 corado com Giemsa
Fonte: Elaborado pela autora
A e B: Grupo nutrido. C e D: Grupo desnutrido. Objetiva de 40x (A, B e D) e de 10x (C). Círculo vermelho
indica os grumos bacterianos aderidos às células epiteliais (aderência localizada). Fonte: Laboratório de
Doenças Infecciosas – UFC.
Figura 6 - Microfotografia de íleo de camundongo Swiss infectado com 108ufc/mL de E.
coli HS corado com Giemsa
Fonte: Elaborado pela autora
A: Grupo nutrido. B: Grupo desnutrido. Objetiva de 10x. Círculo vermelho indica a presença de grumos
bacterianos no lúmen intestinal. Fonte: Laboratório de Doenças Infecciosas – UFC.
4.3 Avaliação histomorfométrica
A figura 7 mostra que a área dos vilos intestinais não sofreu alteração significativa
com a presença das bactérias ou com a desnutrição (P > 0,05) quando comparados com o
B
A
A
C D
Vilosidades
Vilosidade
Vilosidade
Vilosidades Vilosidade
B
Vilosidades
Lúmen
Vilosidades
Lúmen
A
Vilosidades
48
grupo nutrido, ademais, a E. coli HS também não altera a área absortiva durante a desnutrição.
Já a EPEC, no tecido desnutrido, reduziu significativamente a área vilositária.
A E. coli HS tem efeito similar sobre os vilos nutridos e desnutridos, enquanto
que a EPEC altera muito mais a área vilositária quando o íleo está desnutrido.
Figura 7 - Área dos vilos intestinais na presença de
desnutrição e ou infecção
ÁREA DOS VILOS
N NE NH D DE DH0
5.010-3
1.010-2
1.510-2
2.010-2
2.510-2
*
*
mm
²
Fonte: Elaborado pela autora
Nutridos sem bactérias (N); nutridos infectados com EPEC (NE);
nutridos inoculados com E. coli HS (NH); desnutridos sem bactérias
(D); desnutridos com EPEC (DE); desnutridos com E. coli HS (DH).
N = 3 animais/ grupo. A análise estatística foi realizada por ANOVA e
pós-teste Bonferroni. (*) – P < 0,05.
A figura 8 mostra que a desnutrição e a infecção com E. coli HS reduz
significativamente a profundidade das criptas (P < 0,05). No entanto, a infecção com EPEC
nos animais nutridos não alterou de forma significativa as criptas (P > 0,05). Além disto, a E.
coli HS e a EPEC também não reduziram ainda mais a profundidade das criptas intestinais (P
> 0,05) já reduzida pela desnutrição.
A E. coli HS reduz a profundidade das criptas dos desnutridos tanto quanto reduz
nos nutridos. No entanto, a EPEC reduz a profundidade das criptas somente quando o
intestino está desnutrido.
49
Figura 8 - Variação da profundidade das criptas na
presença de infecção e ou desnutrição
CRIPTAS
0
50
100
150
200
N NE NH DED DH
*
*
*
m
Fonte: Elaborado pela autora
Nutridos sem bactérias (N); nutridos infectados com EPEC (NE);
nutridos inoculados com E. coli HS (NH); desnutridos sem bactérias
(D); desnutridos com EPEC (DE); desnutridos com E. coli HS (DH).
N = 3 animais/ grupo. A análise estatística foi realizada por ANOVA e
pós-teste Bonferroni. (*) – P < 0,05.
4.4 Variação do transporte iônico em íleo de camundongos
A figura 9 mostra que a desnutrição, a infecção aguda com EPEC e inoculação de
E. coli HS reduz significativamente (P < 0,05) a CCC basal no íleo.
Quando se comparou o grupo desnutrido não infectado com o grupo desnutrido
inoculado com E. coli HS, percebeu-se que essa bactéria aumenta a CCC basal
significativamente (P < 0,05). Diferentemente, a EPEC não consegue reduzir ainda mais essa
corrente já diminuída pela desnutrição (P > 0,05).
A inoculação da E. coli HS teve efeitos diferentes quando o tecido era nutrido ou
desnutrido. Enquanto que a EPEC reduz a CCC de forma semelhante nos dois estados de
nutrição.
50
Figura 9 - Comparação da CCC basal entre os grupos
nutridos e desnutridos inoculados ou não com E. coli
enteropatogênica ou HS
CCC BASAL
N NE NH D DE DH0
50
100
150*
**
*
*
A
/cm
²
Fonte: Elaborado pela autora
Nutridos sem bactérias (N); nutridos infectados com EPEC (NE);
nutridos inoculados com E. coli HS (NH); desnutridos sem bactérias
(D); desnutridos com EPEC (DE); desnutridos com E. coli HS (DH).
A análise estatística foi realizada por ANOVA e teste de Bonferroni.
(*) – P < 0,05.
A tabela 6 mostra o efeito da solução de glicose em diversas concentrações sobre
a corrente de curto circuito. De acordo com a análise de variância (ANOVA), nos animais
nutridos, a glicose teve efeito significativo quando se adicionou às hemi-câmaras a solução de
70 mM (ΔCCC = 201,7 ± 42,11 µA/cm²) e 200 mM de glicose (ΔCCC = 209,7 ±
42,21µA/cm²), ocorrendo de forma semelhante entre os animais desnutridos, pois a adição da
solução de 70 mM e 200 mM de glicose no meio luminal caracterizou um aumento
significativo na CCC (ΔCCC = 199,9 ± 25,44 µA/cm² e ΔCCC = 324,7 ± 45,42 µA/cm²,
respectivamente). Todavia, entre os grupos infectados, apenas os desnutridos infectados com
EPEC responderam significativamente à 200 mM de glicose, havendo um aumento de 312,5±
62,36 µA/cm² na CCC.
51
Tabela 6 - Variação da CCC após adição cumulativa de glicose
Grupo [Gli] ΔCCC µA/cm² p < 0,05 Grupo [Gli] ΔCCC µA/cm² p < 0,05
N 1mM 17,25 ± 6,946
D 1mM 8,848 ± 7,321
2mM 50,43 ± 10,21
2mM 14,15 ± 6,192
7mM 78,29 ± 12,74
7mM 39,81 ± 14,90
20mM 127,4 ± 27,88
20mM 91,12 ± 24,72
70mM 201,7 ± 42,11 * 70mM 199,9 ± 25,44 *
200mM 209,7 ± 42,21 * 200mM 324,7 ± 45,42 *
NE 1mM 22,12 ± 13,78
DE 1mM 25,88 ± 12,57
2mM 30,08 ± 14,09
2mM 47,77 ± 23,02
7mM 32,73 ± 16,33
7mM 118,4 ± 66,21
20mM 41,58 ± 21,67
20mM 125,4± 42,39
70mM 69,00 ± 32,04
70mM 230,9 ± 50,47
200mM 102,6 ± 38,26
200mM 312,5± 62,36 *
NH 1mM -19,91± 31,26
DH 1mM 20,70 ± 25,00
2mM -27,87± 32,90
2mM 3,184 ± 54,68
7mM 71,66± 40,73
7mM 36,62 ± 79,16
20mM 75,64± 57,83
20mM 62,10 ± 115,5
70mM 81,61± 89,92
70mM 87,58 ± 136,8
200mM 103,5± 106,6
200mM 84,40 ± 178,3 Fonte: Elaborado pela autora
Animais nutridos (N) N = 6; Animais desnutridos (D) N = 9; Animais nutridos infectados com EPEC 2348/69
(NE) N = 14; Animais desnutridos infectados com EPEC 2348/69 (DE) N = 10; Animais nutridos inoculados
com Escherichia coli HS (NH) N = 7; Animais desnutridos inoculados com Escherichia coli HS (DH) N = 8.
Valores (média ± e. p. m.). A análise estatística foi realizada por ANOVA e pós-teste Bonferroni e pelo teste T
não paramétrico – teste Mann Whitney. (*) – P < 0,05 significativo pelo teste ANOVA; (**) – P < 0,05
significativo pelo teste T não paramétrico – teste Mann Whitney.
Nas figuras 10, 11 e 12, estão representados os valores experimentais, o número
de experimentos realizados e a curva dose-resposta da glicose adicionada cumulativamente à
solução de Krebs-Manitol do lado mucoso dos grupos nutridos e desnutridos sem infecção,
infectados com EPEC e inoculados com E. coli HS, respectivamente.
Os valores de Ec50 mostram qual dose de glicose é necessária para atingir a
metade do efeito máximo. A comparação entre os grupos pelo teste t Student não pareado
unicaudal mostra que os animais nutridos infectados com EPEC e os desnutridos sem
infecção necessitam de uma maior dose de glicose para obterem uma resposta máxima.
Enquanto nos desnutridos infectados com E. coli HS, é preciso de uma menor dose para isto.
Além disto, os valores da constante hiperbólica S que são próximos a 10 (grupos
nutrido, nutrido infectado com EPEC e nutrido inoculado com E. coli HS) indicam um
comportamento clássico das curvas de dose-resposta, ou seja, coeficiente de Hill igual a 1
52
(ARIENS et al., 1977; SOARES, 1996). Enquanto que os demais grupos não apresentam uma
curva dose-resposta clássica, pois seu coeficiente de Hill é igual a 1,262 (desnutridos), 1,248
(desnutridos infectados com EPEC) e 1,1756 (desnutridos infectados com E. coli HS).
Em relação à resposta máxima, a comparação entre os grupos pelo teste t Student
não pareado e unicaudal mostra que só há diferença significativa (P < 0,05) entre os nutridos e
desnutridos infectados com EPEC.
Figura 10 - Curva dose-resposta cumulativa da glicose
Curva dose-resposta da glicoseAnimais nutridos
012340
100
200
300
400RespResp teórica
pD2 = 1,96 Ec50 = 10,87 mM
Rmáx = 209,7 A/cm²S = 7 n = 6
Resp teórica = Rmáx/(1+ S(pD-pD2)
)
pD (-logDose)
C
CC
(
A/c
m²)
Curva dose-resposta da glicose
Animais desnutridos
1234-100
0
100
200
300
400
500RespResp teórica
pD2 = 1,30 Ec50 = 50,44mM
Rmáx = 324,7 A/cm²S = 18 n = 9
Resp teór = Rmáx/(1+ S(pD-pD2))
pD (-logDose)
C
CC
(
A/c
m²)
Fonte: Elaborado pela autora
A: Grupo nutrido sem infecção. B: Grupo desnutrido sem infecção. Valores (média ± e.
p. m.). S = 10coef. Hill. Número de experimentos (N).
A
B
53
Figura 11 - Curva dose-resposta cumulativa da glicose
Curva dose-resposta da glicose
Animais nutridos infectados com EPEC
1234
-100
0
100
200
300
Resp teóricaResp
pD2 = 1,636 Ec50 = 35,44 mM
Rmáx = 102,6 A/cm²S = 8 n = 9
Resp teórica = Rmáx/(1+SpD-pD2)
pD (-logDose)
C
CC
(
A/c
m²)
Curva dose-resposta da glicose
Animais desnutridos infectados com EPEC
1234
-200
0
200
400
600
Resp teóricaResp
pD2= 1,643 Ec50 = 38,38 mM
Rmáx = 312,5 A/cm²S = 18 n = 8
Resp teórica = Rmáx/1+S(pD-pD2)
pD (-logDose)
C
CC
(
A/c
m²)
Fonte: Elaborado pela autora
A: Grupo nutrido infectado com Escherichia coli enteropatogênica (EPEC). B: Grupo
desnutrido infectado com Escherichia coli enteropatogênica (EPEC). Valores (média ±
e. p. m.). S = 10coef. Hill. Número de experimentos (N).
A
B
54
Figura 12 - Curva dose-resposta cumulativa da glicose
Curva dose-resposta da glicose
Animais nutridos infectados com E. coli HS
1234
-100
0
100
200
300Resp
Resp teórica
pD2 = 2,22 Ec50 = 6,00 mM
Rmáx = 103,5 A/cm²S = 9 n = 4
Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD-pD2))
pD (-logDose)
C
CC
(
A/c
m²)
Curva dose-resposta da glicose
Animais desnutridos infectados com E. coli HS
1234
-100
0
100
200
300Resp
Resp teórica
pD2 = 2,06 Ec50 = 8,7 mM
Rmáx = 84,40 A/cm²S = 17 n = 5
Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD-pD2))
pD (-logDose)
C
CC
(
A/c
m²)
Fonte: Elaborado pela autora
A: Grupo nutrido infectado com Escherichia coli HS. B: Grupo desnutrido infectado
com Escherichia coli HS. Valores (média ± e. p. m.). S = 10coef. Hill. Número de
experimentos (N).
A tabela 7 mostra o efeito da solução de glutamina em diversas concentrações
sobre a corrente de curto circuito. Nos nutridos, a adição de 70 mM de glutamina causou
aumento significativo na CCC (ΔCCC =170,4± 38,24 µA/cm²). Nos desnutridos, as soluções
de 70 mM e 200 mM também aumentaram significativamente a CCC (ΔCCC = 192,5 ± 39,89
µA/cm² e 236,7 ± 43,32 µA/cm²). Nos nutridos infectados com EPEC, apenas adição da
solução de 200 mM desse substrato aumentou significativamente a CCC (ΔCCC = 167,9±
33,86 µA/cm²). Pela ANOVA e pelo teste t Student Mann Whitney, nos desnutridos
infectados com E. coli HS, a glutamina teve efeito significativo quando se adicionou às hemi-
câmaras a solução de 70 mM (ΔCCC = 85,59 ± 21,65 µA/cm²) e 200 mM de glicose (ΔCCC
= 95,54 ± 21,80 µA/cm²).
A
B
55
Tabela 7 - Variação da CCC após adição cumulativa de glutamina
Grupo [Gln] ΔCCC µA/cm² p < 0,05 Grupo [Gln] ΔCCC µA/cm² p < 0,05
N 1mM 22,29± 9,215
D 1mM 15,20 ± 5,52
2mM 28,66 ± 13,70
2mM 24,61 ± 6,21
7mM 54,14± 20,05
7mM 56,46 ± 11,88
20Mm 151,3± 56,97
20mM 99,88 ± 21,18
70mM 170,4± 38,24 *
70mM 192,5 ± 39,89 *
200mM 156,0± 19,60
200mM 236,7 ± 43,32 *
NE 1mM -18,82 ± 28,63
DE 1mM -4,778 ± 8,977
2mM 19,54 ± 10,21
2mM 8,756 ± 8,757
7mM 41,25 ± 16,45
7mM -7,963± 19,50
20mM 36,19 ± 54,66
20mM 21,50 ± 22,89
70mM 114,4 ± 28,06
70mM 74,04 ± 23,47
200mM 167,9± 33,86 *
200mM 62,10 ± 42,74
NH 1mM 3,978 ± 13.20
DH 1mM 1,990 ± 3,811
2mM 9,948 ± 25.46
2mM 5,973 ± 5,973
7mM 35,83 ± 51.24
7mM 33,84 ± 16,05
20mM 89,57 ± 59.70
20mM 45,78 ± 16,05
70mM 119,40 ± 94.09
70mM 85,59 ± 21,65 */**
200mM 149,30 ± 104.80
200mM 95,54 ± 21,80 */** Fonte: Elaborado pela autora
Animais nutridos (N) N = 6; Animais desnutridos (D) N = 11; Animais nutridos infectados com EPEC 2348/69
(NE) N = 15; Animais desnutridos infectados com EPEC 2348/69 (DE) N = 12; Animais nutridos inoculados
com Escherichia coli HS (NH) N = 6; Animais desnutridos inoculados com Escherichia coli HS (DH) N = 5.
Valores (média ± e. p. m.) A análise estatística foi realizada por ANOVA e pós-teste Bonferroni e pelo teste T
não paramétrico – teste Mann Whitney. (*) – P < 0,05 significativo pelo teste ANOVA; (**) – P < 0,05
significativo pelo teste T não paramétrico – teste Mann Whitney.
Nas figuras 13, 14 e 15 estão representados os valores experimentais, o número de
experimentos realizados e a curva dose-resposta da glutamina adicionada cumulativamente à
solução de Krebs-Manitol do lado mucoso dos grupos nutridos e desnutridos sem infecção,
infectados com EPEC e inoculados com E. coli HS, respectivamente.
Os valores de Ec50 mostram qual dose de glutamina é necessária para atingir a
metade do efeito máximo. A comparação entre os grupos pelo teste t Student não pareado
unicaudal mostra que não há diferença significativa entre o Ec50 dos grupos analisados.
Mesmo assim, o grupo que requer uma menor dose para atingir a metade do efeito máximo é
o grupo nutrido inoculado com E. coli HS (Ec50 = 13 mM), seguido pelo desnutrido infectado
com E. coli HS (Ec50 = 17,75 mM), nutrido (Ec50 = 19 mM), desnutrido (Ec50 = 24,9 mM),
nutrido infectado com EPEC (Ec50 = 33,82 mM), desnutrido infectado com EPEC (Ec50 =
43,56 mM).
56
Ademais, todos os grupos estudados apresentam valores da constante hiperbólica
S próximos a 10 (coeficiente de Hill igual a 1), exceto os grupos desnutrido sem infecção
(coeficiente de Hill = 1,426) e o infectado com E. coli HS (coeficiente de Hill = 1,675), o que
indica que as inclinações das curvas seguem um comportamento clássico das curvas de dose-
resposta.
Em relação à resposta máxima, a comparação entre os grupos pelo teste t Student
não pareado e unicaudal mostra que só há diferença significativa (P < 0,05) entre os
desnutridos sem infecção e os desnutridos infectados com EPEC e E. coli HS.
Figura 13 - Curva dose-resposta cumulativa da glutamina
Curva dose-resposta da glutamina
Animais nutridos
012340
100
200
300RespResp teórica
pD2 = 1,854 Ec50 = 19 mM
Rmáx = 156,0 A/cm²S = 8 n = 5
Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD- pD2))
pD (-logDose)
C
CC
(
A/c
m²)
Curva dose-resposta da glutamina
Animais desnutridos
012340
100
200
300
pD2 = 1,60 Ec50 = 24,9 mM
Rmáx = 236,7 A/cm²
S = 27 n = 11
Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD-pD2))
Resp
Resp teórica
pD (-logDose)
C
CC
(
A/c
m²)
Fonte: Elaborado pela autora
A: Grupo nutrido sem infecção. B: Grupo desnutrido sem infecção. Valores (média ± e.
p. m.). S = 10coef. Hill. Número de experimentos (N).
A
B
57
Figura 14 - Curva dose-resposta cumulativa da glutamina
Curva dose-resposta da glutamina
Animais nutridos infectados com EPEC
1234
-200
-100
0
100
200
300
Resp teóricaResp
pD2 = 1,669 Ec50 = 33,82 mM
Rmáx = 167,9 A/cm²
S = 8 n = 11
Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD-pD2))
pD (-logDose)
C
CC
(
A/c
m²)
Curva dose-resposta da glutamina
Animais desnutridos infectados com EPEC
1234
-100
0
100
200
300
Resp teóricaResp
pD2 = 1,603 Ec50 = 43,56 mM
Rmáx = 62,10 A/cm²S = 9 n = 10
Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD-pD2))
pD (-logDose)
C
CC
(
A/c
m²)
Fonte: Elaborado pela autora
A: Grupo nutrido infectado com Escherichia coli enteropatogênica (EPEC). B: Grupo
desnutrido infectado com Escherichia coli enteropatogênica (EPEC). Valores (média ±
e. p. m.). S = 10coef. Hill. Número de experimentos (N).
A
B
58
Figura 15 - Curva dose-resposta cumulativa da glutamina
Curva dose-resposta da glutamina
Animais nutridos infectados com E. coli HS
1234-100
0
100
200
300
400Resp
pD2 = 1,987 Ec50 = 13 mM
Rmáx = 123,4 A/cm²S = 7 n = 4
Resp teórica = Rmáx/(1+S (pD-pD2)
Resp teórica
pD (-logDose)
C
CC
(
A/c
m²)
Curva dose-resposta da glutamina
Animais desnutridos infectados com E. coli HS
1234
-50
0
50
100
150
Resp teóricaResp
pD2 = 1,895 Ec50 = 17,75 mM
Rmáx = 95,54 A/cm²
S = 47 n = 4
Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD- pD2))
pD (-logDose)
C
CC
(
A/c
m²)
Fonte: Elaborado pela autora
A: Grupo nutrido infectado com Escherichia coli HS. B: Grupo desnutrido infectado
com Escherichia coli HS. Valores (média ± e. p. m.). S = 10coef. Hill. Número de
experimentos (N).
A tabela 8 mostra o efeito da solução de alanil-glutamina em diversas
concentrações sobre a corrente de curto circuito.
Nos animais nutridos e desnutridos sem infecção, houve aumento significativo da
CCC após a adição das soluções de 70 mM (ΔCCC = 186,3 ± 34,39 µA/cm² e 204,4 ± 30,12
µA/cm², respectivamente) e 200 mM de alanil-glutamina (ΔCCC = 234,1 ± 61,29µA/cm² e
282,6 ± 39,10 µA/cm², respectivamente).
Nos animais nutridos infectados com EPEC, esse dipeptídeo teve efeito
significativo após adição das soluções de 20 mM, 70 mM e 200 mM, causando um aumento
de 123,1 ± 18,02µA/cm², 161,1 ± 23,22 µA/cm² e 207,6 ± 27,82 µA/cm² na CCC.
Nos animais desnutridos infectados com EPEC, a alanil-glutamina causou um
significativo aumento de 116,4 ± 21,33 µA/cm² e de 184,1 ± 37,54 µA/cm², após a adição de
70 mM e 200 mM de alanil-glutamina, respectivamente. De forma similar, os nutridos
inoculados E. coli HS responderam significativamente após a adição de 70 mM e 200 mM de
alanil-glutamina, sofrendo um aumento na CCC de 100,8 ± 27,71 µA/cm² e 111,5 ± 24,32
µA/cm².
A
B
59
Já os desnutridos infectados com E. coli HS responderam significativamente à
alanil-glutamina somente após adição da solução de 200 mM desse substrato, sofrendo um
aumento significativo de 95,54 ± 21,06 µA/cm² na CCC.
Tabela 8 - Variação da CCC após adição cumulativa de alanil-glutamina
Grupo [Ala-Gln] ΔCCC µA/cm² p < 0,05 Grupo [Ala-Gln] ΔCCC µA/cm² p < 0,05
N 1mM 14.33 ± 4,641
D 1mM 10.62 ± 3,358
2mM 27,07 ± 5,958
2mM 23,89 ± 6,818
7mM 52,54 ± 8,574
7mM 49,10 ± 10,36
20mM 117,8 ± 13,42
20mM 100,9 ± 18,92
70mM 186,3 ± 34,39 *
70mM 204,4 ± 30,12 *
200mM 234,1 ± 61,29 *
200mM 282,6 ± 39,10 *
NE 1mM 23,27 ± 5,735
DE 1mM 21,90 ± 11,23
2mM 45,32 ± 8,475
2mM 37,82 ± 14,65
7mM 75,95 ± 11,42
7mM 56,73 ± 13,07
20mM 123,10 ± 18,02 *
20mM 78,63 ± 10,79
70mM 169,00 ± 19,17 *
70mM 116,4 ± 21,33 *
200mM 207,60 ± 27,82 *
200mM 184,1 ± 37,54 *
NH 1mM 10.61 ± 2,653
DH 1mM 10,62 ± 7,019
2mM 23.88 ± 4,593
2mM 10,62 ± 5,308
7mM 47.77 ± 7,960
7mM 23,88 ± 4,596
20mM 69.00 ± 11,57
20mM 42,46 ± 7,020
70mM 100.8 ± 27,71 *
70mM 58,39 ± 7,019
200mM 111.5 ± 24,32 *
200mM 95,54 ± 21,06 *
Fonte: Elaborado pela autora
Animais nutridos (N) N = 5; Animais desnutridos (D) N = 6; Animais nutridos infectados com EPEC 2348/69
(NE) N = 14; Animais desnutridos infectados com EPEC 2348/69 (DE) N = 11; Animais nutridos inoculados
com Escherichia coli HS (NH) N = 16; Animais desnutridos inoculados com Escherichia coli HS (DH) N = 6.
Valores (média ± e. p. m.) A análise estatística foi realizada por ANOVA e pós-teste Bonferroni e pelo teste T
não paramétrico – teste Mann Whitney. (*) – P < 0,05 significativo pelo teste ANOVA; (**) – P < 0,05
significativo pelo teste T não paramétrico – teste Mann Whitney.
Nas figuras 16, 17 e 18 estão representados os valores experimentais, o número de
experimentos realizados e a curva dose-resposta da alanil-glutamina adicionada
cumulativamente à solução de Krebs-Manitol do lado mucoso dos grupos nutridos e
desnutridos sem infecção, infectados com EPEC e inoculados com E. coli HS,
respectivamente.
Os valores de Ec50 mostram qual dose de alanil-glutamina é necessária para
atingir a metade da resposta máxima. A comparação entre os grupos pelo teste t Student não
pareado unicaudal mostra que não há diferença significativa entre o Ec50 dos grupos
analisados, exceto entre os grupos nutridos e desnutridos infectados com EPEC. Ainda assim,
o grupo que necessita de uma menor dose para atingir a metade da resposta máxima é o grupo
60
nutrido inoculado com E. coli HS (Ec50 = 10,67 mM), seguido pelo nutrido infectado com
EPEC (Ec50 = 15,08 mM), nutrido sem infecção (Ec50 = 21 mM), desnutrido (Ec50 = 36,33
mM), desnutrido infectado com EPEC (Ec50 = 37,63 mM), desnutrido infectado com E. coli
HS (Ec50 = 39,67mM).
Outrossim, apenas os grupos desnutridos infectados com EPEC e com E. coli HS
apresentam coeficiente de Hill distante de 1 (0,7775 e 0,6500, respectivamente) e,
conseguintemente, possuem valores da constante hiperbólica S diferentes de 10, portanto
essas curvas dose-resposta não seguem um comportamento clássico.
Em relação à resposta máxima, a comparação entre os grupos pelo teste t Student
não pareado e unicaudal mostra que só há diferença significativa (P < 0,05) entre os
desnutridos sem infecção e os desnutridos infectados com EPEC e E. coli HS.
Figura 16 - Curva dose-resposta cumulativa da alanil-glutamina
Curva dose-resposta da alanil-glutamina
Animais nutridos
012340
100
200
300
400RespResp teórica
pD2 = 1,754 Ec50 = 21 mM
Rmáx = 234,1 A/cm²S = 13 n = 5
Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD-pD2))
pD (-logDose)
C
CC
(
A/c
m²)
Curva dose-resposta da alanil-glutamina
Animais desnutridos
012340
100
200
300
400
Resp teóricaResp
pD2 = 1,483 Ec50 = 36,33 mM
Rmáx = 282,6 A/cm²
S = 12 n = 6
Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD-pD2))
pD (-logDose)
C
CC
(
A/c
m²)
Fonte: Elaborado pela autora
A: Grupo nutrido sem infecção. B: Grupo desnutrido sem infecção. Valores (média ± e.
p. m.). S = 10coef. Hill. Número de experimentos (N).
A
B
61
Figura 17 - Curva dose-resposta cumultiva da alanil-glutamina
Curva dose-resposta da alanil-glutamina
Animais nutridos infectados com EPEC
012340
100
200
300
400
Resp teóricaResp
pD2 = 1,925 Ec50 = 15,08 mM
Rmáx = 207,6 A/cm²S = 9 n = 13
Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD-pD2))
pD (-logDose)
C
CC
(
A/c
m²)
Curva dose-resposta da alanil-glutamina
Animais desnutridos infectados com EPEC
1234-100
0
100
200
300
400
Resp teóricaResp
pD2 = 1,483 Ec50 = 37,63 mM
Rmáx = 184,1 A/cm²S = 6 n = 8
Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD-pD2))
pD (-logDose)
C
CC
(
A/c
m²)
Fonte: Elaborado pela autora
A: Grupo nutrido infectado com Escherichia coli enteropatogênica (EPEC). B: Grupo
desnutrido infectado com Escherichia coli enteropatogênica (EPEC). Valores (média ±
e. p. m.). S = 10coef. Hill. Número de experimentos (N).
A
B
62
Figura 18 - Curva dose-resposta cumultiva da alanil-glutamina
Curva dose-resposta da alanil-glutamina
Animais nutridos infectados com E. coli HS
012340
50
100
150
200
Resp teóricaResp
pD2 = 1,987 Ec50 = 10,67 mM
Rmáx = 111,5 A/cm²S = 8 n = 3
Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD-pD2))
pD (-logDose)
C
CC
(
A/c
m²)
Curva dose-resposta da alanil-glutamina
Animais desnutridos infectados com E. coli HS
1234
-50
0
50
100
150
Resp teóricaResp
pD2 = 1,5 Ec50 = 39,67 mM
Rmáx = 95,54 A/cm²
S = 4 n = 3
Resp teórica = Rmáx/(1+S(pD-pD2))
pD (-logDose)
C
CC
(
A/c
m²)
Fonte: Elaborado pela autora
A: Grupo nutrido infectado com Escherichia coli HS. B: Grupo desnutrido infectado
com Escherichia coli HS. Valores (média ± e. p. m.). S = 10coef. Hill. Número de
experimentos (N).
4.5 Variação da resistência transepitelial
A figura 19 mostra que a desnutrição e ou infecção aguda não causaram alteração
significativa sobre a resistência transepitelial em nenhum dos grupos. Assim, o fluxo
paracelular de cloreto, bicarbonato e de água não foram alterados.
B
A
63
Figura 19 - Variação da resistência transepitelial basal
Resistência transepitelial basal
N NE
NH D D
EDH
0
5
10
15
20
RE
(
.cm
2)
Fonte: Elaborado pela autora
Nutridos sem bactérias (N); nutridos infectados com EPEC (NE);
nutridos inoculados com E. coli HS (NH); desnutridos sem bactérias
(D); desnutridos com EPEC (DE); desnutridos com E. coli HS (DH).
Valores (média ± e. p. m.) A análise estatística foi realizada por
ANOVA e pós-teste Bonferroni. (*) – P < 0,05.
4.6 Variação da transcrição dos genes de transportadores e junções celulares durante a
desnutrição
Em relação à transcrição dos genes de transportadores e junções celulares, foi
encontrado um aumento significativo da transcrição do gene de transportadores de sódio-
glicose (SGLT-1) e de peptídeos (PEPT-1) nas células intestinais dos animais desnutridos
pela dieta básica regional (Figura 20 e 22, respectivamente).
De maneira diferente, a figura 21 A mostra que a transcrição do gene SN-2,
envolvido no co-transporte de Na+ e aminoácidos neutros como glutamina, sofreu redução
significativa, enquanto que a transcrição do gene CAT-1, para o transportador de aminoácidos
catiônicos, não sofreu alteração durante a desnutrição (Figura 21 B).
64
Figura 20 - Expressão relativa da transcrição do gene
SGLT-1 nas células intestinais após 7 dias de alimentação
com dieta básica regional
N D0
1
2
3 *
Exp
ressão
rela
tiva
de
SG
LT
-1
Fonte: Elaborado pela autora
Grupo nutrido (N); Grupo desnutrido (D). A análise estatística foi
realizada pelo teste não pareado de t-Student unicaudal.
Figura 21 - Expressão relativa da transcrição do gene SN-
2 e CAT-1 nas células intestinais
N D0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
*
Exp
ressão
rela
tiva
de S
N-2
N D0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Exp
ressão
rela
tiva
de C
AT
-1
Fonte: Elaborado pela autora. A – Expressão relativa da transcrição do gene
SN-2 nas células intestinais desnutridas. B – Expressão relativa da transcrição
do gene CAT-1 nos enterócitos desnutridos. Grupo nutrido (N); Grupo
desnutrido (D). A análise estatística foi realizada pelo teste não pareado de t-
Student unicaudal.
A
B
65
Figura 22 - Expressão relativa da transcrição do gene PEPT-1 nas células
intestinais desnutridas
N D0
1
2
3
4 *
Exp
ressão
rela
tiva
de P
EP
T-1
Fonte: Elaborado pela autora
Grupo nutrido (N); Grupo desnutrido (D). A análise estatística foi
realizada pelo teste não pareado de t-Student unicaudal.
Em relação ao gene CFTR, a desnutrição também não altera significativamente a
sua transcrição, como mostra a figura 23 a seguir:
Figura 23 - Expressão relativa da transcrição do gene
CFTR nas células intestinais desnutridas
N D0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
exp
ressao
rela
tiva
de C
FT
R
Fonte: Elaborado pela autora
Grupo nutrido (N); Grupo desnutrido (D). A análise estatística foi
realizada pelo teste não pareado de t-Student unicaudal.
Em relação às proteínas ZO-1, claudina-1 e ocludina, das junções celulares, não
houve diferença significativa da transcrição de seus genes quando os animais eram
submetidos à desnutrição experimental, como mostra as figuras 24, 25 e 27.
Na figura 26, foi observado um aumento significativo da transcrição do gene da
claudina-2 nos enterócitos desnutridos.
66
Figura 24 - Expressão relativa da transcrição do gene ZO-
1 nas células intestinais desnutridas
N D0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Exp
ressão
rela
tiva d
e Z
O-1
Fonte: Elaborado pela autora
Grupo nutrido (N); Grupo desnutrido (D). A análise estatística foi
realizada pelo teste não pareado de t-Student unicaudal.
Figura 25 - Expressão relativa da transcrição do gene
claudina-1 nas células intestinais desnutridas
N D0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Exp
ressão
rela
tiva d
e
Cla
ud
ina-1
Fonte: Elaborado pela autora
Grupo nutrido (N); Grupo desnutrido (D). A análise estatística foi
realizada pelo teste não pareado de t-Student unicaudal.
67
Figura 26 - Expressão relativa da transcrição do gene
claudina-2 nas células intestinais desnutridas
N D0
1
2
3
4*
Exp
ressão
rela
tiva d
e
Cla
ud
ina-2
Fonte: Elaborado pela autora Grupo nutrido (N); Grupo desnutrido (D). A análise estatística foi
realizada pelo teste não pareado de t-Student unicaudal.
Figura 27 - Expressão relativa da transcrição do gene
ocludina nas células intestinais desnutridas
N D0
1
2
3
Exp
ressão
rela
tiva
de O
clu
din
a
Fonte: Elaborado pela autora
Grupo nutrido (N); Grupo desnutrido (D). A análise estatística foi
realizada pelo teste não pareado de t-Student unicaudal.
4.7 Microscopia confocal
Paralelo aos resultados da transcrição gênica relacionados aos transportadores
intestinais e às proteínas das junções celulares, também foi realizado uma avaliação através da
intensidade da fluorescência das proteínas estudadas, utilizando a microscopia confocal, para
verificar se a alteração ou não na transcrição dos genes refletiria na síntese proteica.
Em relação às imagens de fluorescência da proteína SGLT-1, nas figuras 28 e 29,
diferenças na intensidade foram observadas no grupo desnutrido pela dieta básica regional em
68
relação ao grupo nutrido (controle). Assim, no íleo submetido à desnutrição foi observado um
significativo aumento na intensidade da fluorescência.
Figura 28 - Imunofluorescência da proteína SGLT-1 observada através de
microscopia confocal
Fonte: Elaborado pela autora
A - Íleo de camundongo nutrido - controle; B - Íleo de camundongo desnutrido. Aumento de
40X. Coloração verde – proteína SGLT-1, coloração azul – núcleo.
Figura 29 - Diferença da intensidade de fluorescência da
proteína SGLT-1 em íleo de camundongo nutrido e
desnutrido
SGLT-1
N D0
20
40
60
80
100
*
Inte
nsid
ad
e d
e f
luo
rescen
cia
(U
A)
Fonte: Elaborado pela autora
Grupo nutrido (N); Grupo desnutrido (D). A análise estatística foi
realizada pelo teste não pareado de t-Student unicaudal.
Da mesma maneira, nas figuras 30 e 31, pôde-se ver que a desnutrição aumentou
significativamente a intensidade da fluorescência da proteína SN-1.
A B
69
Figura 30 - Imunofluorescência da proteína SN-1 observada através de
microscopia confocal
Fonte: Elaborado pela autora
A - Íleo de camundongo nutrido; B - Íleo de camundongo desnutrido. Aumento de 40X.
Coloração verde – proteína SN-1, coloração azul – núcleo.
Figura 31 - Diferença da intensidade de fluorescência da
proteína SN-1 em íleo de camundongo nutrido e
desnutrido
SN-1
N D0
10
20
30
40
50 *
Inte
nsid
ad
e d
e f
luo
rescen
cia
(U
A)
Fonte: Elaborado pela autora.
Grupo nutrido (N); Grupo desnutrido (D). A análise estatística foi
realizada pelo teste não pareado de t-Student unicaudal.
A B
70
Semelhantemente, as figuras 32 e 33 mostram que a desnutrição aumentou
significativamente a intensidade da fluorescência da proteína SN-2.
Figura 32 - Imunofluorescência da proteína SN-2 observada através de
microscopia confocal
Fonte: Elaborado pela autora
A – Íleo de camundongo nutrido; B - Íleo de camundongo desnutrido. Aumento de 40X.
Coloração verde – proteína SN-2, coloração azul – núcleo.
Figura 33 - Diferença da intensidade de fluorescência da
proteína SN-2 em íleo nutrido e desnutrido
SN-2
N D0
20
40
60
80
*
Inte
nsid
ad
e d
e f
luo
rescen
cia
(U
A)
Fonte: Elaborado pela autora
Grupo nutrido (N); Grupo desnutrido (D). A análise estatística foi
realizada pelo teste não pareado de t-Student unicaudal.
A figura 34 e 35 mostra que a proteína PEPT-1 apresentou maior intensidade no
grupo desnutrido, quando comparado ao grupo nutrido.
A B
71
Figura 34 - Imunofluorescência da proteína PEPT-1 observada através de
microscopia confocal
Fonte: Elaborado pela autora
A – Íleo de camundongo nutrido; B – Íleo de camundongo desnutrido. Aumento de 40X.
Coloração verde – proteína SN-1, coloração azul – núcleo.
Figura 35 - Diferença da intensidade de fluorescência da
proteína PEPT-1 em íleo de camundongo nutrido e
desnutrido
PEPT-1
N D0
20
40
60
*
Inte
nsid
ad
e d
e f
luo
rescen
cia
(U
A)
Fonte: Elaborado pela autora
Grupo nutrido (N); Grupo desnutrido (D). A análise estatística foi
realizada pelo teste não pareado de t-Student unicaudal.
A B
72
5 DISCUSSÃO
5.1 Controle geral dos experimentos
5.1.1 Crescimento dos animais com DBR
Com a finalidade de avaliar experimentalmente os efeitos da desnutrição com ou
sem infecção com EPEC em camundongos de 28 a 35 dias de idade, administrou-se, durante 7
dias, a Dieta Básica Regional, que é uma dieta multideficiente em proteínas, lipídios,
vitaminas e minerais, porém apresenta um alto teor de carboidratos, o que compensa a
redução energética devido a menores teores de lipídios e proteínas, caracterizando uma
restrição nutricional qualitativa e não energética similar ao que ocorre no Nordeste brasileiro
(TEODÓSIO et al., 1990).
Este estudo mostrou que 7 dias de consumo da DBR foi suficiente para induzir
alterações na curva de crescimento peso/idade, assim essa dieta ocasionou uma redução
significante no desenvolvimento ponderal dos camundongos avaliados, visto que antes de
dividir os animais por ração consumida, todos apresentavam peso semelhante, e o
desenvolvimento ponderal foi progressivamente menor nos camundongos alimentados com a
DBR, sugerindo que esta não fornece nutrientes suficientes para um adequado
desenvolvimento. Resultados semelhantes foram obtidos em diversos trabalhos, utilizando
ratos Wistar (RIBEIRO; CHAVES, 2008; PRAZERES et al., 2004) e camundongos suíços
(COUTO et al., 2008).
No entanto, o consumo da DBR por 7 dias não foi capaz de alterar a área
vilositária, como esperado, levando-nos a pensar que o grau de desnutrição atingido neste
estudo foi leve, sendo apenas um estado de má nutrição.
5.1.2 Inóculo bacteriano
Ainda que a EPEC seja um agente diarreico em humanos, não é fácil induzir a sua
fixação experimental no intestino delgado de animais, porém o prévio tratamento com
antimicrobianos pode levar a bons resultados, pois suprime a microbiota intestinal endógena
(MUSHIN; DUBOS, 1965). Entretanto, isto altera o equilíbrio competitivo entre as bactérias
endógenas e as patogênicas e não demonstra um modelo real de uma infecção, mascarando,
desta maneira, os resultados. Por isto, neste estudo os animais não foram previamente tratados
73
com antibacterianos, provando que a aderência da EPEC não se vincula a esse tipo de pré-
tratamento e sim a uma série de fatores patogênicos.
Em relação ao fato de que apenas a dose de 108ufc/mL de EPEC foi capaz de
induzir uma infecção aguda, Mushin e Dubos (1965) relataram que inóculos bacterianos
contendo 2,3 x 108 células devem ser utilizados para a infecção experimental em
camundongos, e que, independente da concentração bacteriana usada, a E. coli O26: K60
estabeleceu-se nos animais com até 13 dias de idade. Entretanto, a taxa de colonização em
animais com 18 dias de idade é proporcional à dose utilizada. Além disto, nos animais com 24
dias de idade, a quantidade de E. coli foi reduzida após 48 horas de infecção. Assim,
verificou-se que a idade do hospedeiro influencia a capacidade de colonização da E. coli O26:
K60nointestino.
Um experimento semelhante ao nosso foi feito por Punyashthiti e Finkelstein em
1971, no qual foram injetados 0,2ml, contendo cerca de 2 x 109 a 3x 109 organismos viáveis
em alça intestinal ligada de camundongos Swiss, a fim de testar a sua enteropatogenicidade
através da taxa de secreção de fluido no lúmen intestinal após contato direto com EPEC de
diversos sorotipos. Desta maneira, foi mostrado que o modelo de alça intestinal de
camundongo é válido, pois 34% das cepas isoladas de crianças com diarreia causou secreção
de no mínimo 50 mg de fluido por cm, o que sugere o grande potencial de utilidade desse
modelo, ainda que não seja o ideal.
5.1.3 Câmaras de Üssing
A montagem do íleo entre as hemi-câmaras foi feita de forma padronizada (lado
mucoso à esquerda e lado seroso à direita), além disto, o uso da solução de Krebs para
perfusão em ambos os lados da membrana intestinal permitiu anular os transportes passivos
iônicos que ocorrem na via paracelular; já os transportes passivos transcelulares, gerados pelo
potencial elétrico espontâneo através do epitélio, foram eliminados com a aplicação de uma
corrente elétrica externa de 50 µA na membrana intestinal, o que possibilitou a análise
somente dos transportes ativos iônicos transcelulares por meio da medida da CCC que é
equivalente à soma das correntes iônicas de Na+, K+, Cl-, HCO3- e K+ (CLARCK, 2009).
Porém, nem todos os experimentos realizados apresentaram resultados viáveis,
por isto critérios foram estabelecidos para a escolha dos valores de CCC considerados
verdadeiros. Dentre eles foi o valor da CCC basal. Nos grupos não infectados, o intervalo
aceito foi de -200 µA/cm² a 200 µA/cm², pois segundo Clarke (2009) a CCC através do
74
intestino delgado de murino é levemente negativa. Porém, no caso dos grupos infectados,
como não se sabia o limite de aceitação dos valores da CCC basal, a seleção envolveu a
observação dos segmentos que apresentavam valores aproximados, e aqueles resultados
discrepantes foram descartados.
Outro critério de seleção dos resultados utilizado foi a aplicação de uma solução
de teofilina no lado seroso da membrana, pois esta normalmente aumenta a secreção de Cl-
pelos canais CFTR na região apical das criptas e, consequentemente, a CCC, devido a uma
elevação intracelular de cAMP (CERMAK; FOLLMER; WOLFFRAM, 1998). Esse efluxo de
Cl- é possibilitado pela força impulsionadora gerada pela diferença entre o potencial elétrico
de equilíbrio do Cl- e o potencial da membrana, no entanto é logo compensado pelo influxo de
Cl- na região basolateral através do cotransportador NaKCCl, havendo, portanto uma grande
concentração desse ânion no meio luminal das criptas, o que perturba a eletroneutralidade
nessa região que, logo é corrigida pela difusão de Na+ e pela passagem água pela via
paracelular (SILVA, 2002).
É importante salientar que a membrana, quando viva e bem fixada entre as hemi-
câmaras, responde à teofilina com um rápido e grande aumento na CCC, mas esta não
ultrapassa seu valor máximo (FIELD, 1971; CHAPPE, 1998), mesmo que se adicione uma
maior dose, não havendo, portanto, sobrecarga da CCC, permitindo detectar quais segmentos
teciduais postos entre as hemi-câmaras permaneceram vivos e bem fixados entre as
hemicâmaras durante todo o experimento.
Assim, todos os resultados analisados neste estudo responderam
significativamente à teofilina e não apresentaram sobrecarga, devendo-se enfatizar que, nos
casos de falta de resposta relevante aos substratos aplicados ao lado mucoso do tecido, houve
alguma alteração no transporte desses substratos e não a morte da membrana.
5.2 Consequências da desnutrição e infecção
5.2.1 Desnutrição
Embora se saiba que os nutrientes luminais sejam essenciais à integridade da
mucosa intestinal, o papel da desnutrição na má absorção intestinal ainda é controverso, pois a
atrofia vilositária tem sido descrita em crianças com diferentes graus de desnutrição e
observou-se que os casos mais leves de desnutrição não parecem ter grande impacto sobre a
estrutura e a função da mucosa intestinal e, provavelmente, não explicam as alterações
75
encontradas na arquitetura mucosa comumente vista (FARTHING, 2002). Ademais, Romer et
al. (1983) ao estudarem a mucosa do intestino delgado de 24 crianças com diarreia com
diferentes de desnutrição não observaram correlação entre as alterações morfológicas e o grau
de desnutrição.
O presente estudo mostrou que a desnutrição induzida pelo consumo da dieta
básica regional (DBR) durante 7 dias foi capaz de reduzir a CCC basal, ainda que a área dos
vilos intestinais não tenha sido significativamente alterada e que a profundidade das criptas
tenha diminuído em resposta à injúria intestinal, pois a mucosa intestinal responde aos agentes
exógenos por meio de modificações morfológicas no comprimento e no número das
vilosidades e na profundidade das criptas intestinais (GOMIDE-JUNIOR et al., 2004).
Essa redução na CCC basal é consequência da redução dos transportes iônicos
ativos transcelulares, o que indica que não há absorção catiônica e/ou secreção aniônica.
Então, é possível que, nesses casos, haja o acúmulo de Na+ no lúmen intestinal oriundo da
bomba de Na+/K+ presente na região basolateral, já que esse cátion atravessa a via paracelular
para chegar à região luminal e, como não há nutrientes nessa região, o cotransporte de Na+-
substrato fica limitado.
É importante ressaltar que, ainda que a desnutrição reduza os fluxos iônicos
basais, a diferença significativa entre a CCC basal e a CCC (ΔCCC) após a adição de glicose,
glutamina e alanil-glutamina demonstra que o transporte desses substratos permanece intacto,
fato confirmado pelas respostas máximas obtidas serem similares ao grupo nutrido, mesmo
que, no caso da glicose, seja necessária uma maior dose para atingir a metade do efeito
máximo, o que não ocorreu com os demais substratos. Essa manutenção dos transportes pode
ser explicada pelo aumento da síntese das proteínas transportadoras SGLT-1, SN-1, SN-2 e
PEPT-1 e aumento da expressão dos genes SGLT-1 e PEPT-1. Quanto à redução da expressão
do gene SN-2, parece que não houve influência sobre a síntese de sua proteína
correspondente, permitindo, portanto, a manutenção da normalidade do transporte de
glutamina.
5.2.2 Infecção com EPEC
Este estudo mostrou que a infecção aguda induzida com EPEC foi capaz de
reduzir a CCC basal, ainda que a área dos vilos intestinais não tenha sido significativamente
alterada e que a profundidade das criptas tenha diminuído com a presença dessa bactéria, o
76
que contraria trabalhos como o de Kallas, Patrício e Fagundes-Neto (1995) que observaram
uma diminuição da relação vilosidade-cripta em pacientes com EPEC presente nas fezes.
Semelhante ao grupo anterior, essa redução na CCC basal é devida à redução dos
transportes iônicos ativos transcelulares, o que indica que a EPEC reduz a absorção catiônica
e/ou secreção aniônica em condições de jejum, acarretando acúmulo de cátions e secreção de
água no lúmen intestinal, tornando a região basolateral menos positiva eletricamente e
contribuindo para a diminuição da CCC basal.
No que concerne à EPEC nos animais nutridos, ocorre alteração no transporte de
glicose, necessitando de uma maior dose desse carboidrato para atingir a metade do efeito
máximo, que é estatisticamente semelhante à resposta máxima obtida com a adição de glicose
ao lado mucoso do íleo de animais nutridos (controle), ainda que essa diferença seja em torno
de 100 µA/cm².
No entanto, a EPEC não danifica o transporte de glutamina e alanil-glutamina
nem o nível de resposta máxima obtida com esses substratos, não havendo, portanto a
necessidade de uma maior dose desses substratos para atingir a metade do efeito máximo
quando comparado ao grupo controle nutrido.
5.2.3 Desnutrição e EPEC
Nos animais desnutridos, a EPEC reduz a área das vilosidades não reduzida pela
desnutrição, porém isto não reduziu ainda mais a CCC já reduzida pela desnutrição, assim os
fluxos iônicos basais permanecem iguais aos dos animais desnutridos sem infecção.
Além disto, os transportes de glicose e alanil-glutamina continuaram normais,
obtendo, portanto, uma resposta máxima a esses substratos semelhante aos grupos controle
nutridos e desnutridos sem infecção. Entretanto, o transporte de glutamina é alterado,
acarretando numa significativa redução na resposta máxima a esse aminoácido, mesmo que,
para atingir a metade desta não seja necessária uma maior dose de glutamina.
Quando se comparou os grupos nutridos e desnutridos infectados com EPEC,
observou-se que essa bactéria altera a estrutura da mucosa de acordo com o grau de nutrição
do hospedeiro, assim os desnutridos apresentam uma menor área vilositária e profundidade
das criptas do que os nutridos.
Mesmo assim o grau de nutrição não tem influência sobre as variações dos fluxos
iônicos basais nem sobre a dose mínima necessária para atingir a metade do efeito máximo da
glicose e da glutamina, porém a resposta máxima à glicose é significativamente maior nos
77
animais desnutridos, o que não ocorre com a glutamina. Já em relação aos valores de Ec50
para alanil-glutamina nesses grupos, percebe-se que os nutridos com EPEC respondem
melhor à alanil-glutamina do que os desnutridos.
5.2.4 Colonização da E. coli HS
Quando a E. coli HS foi escolhida para este estudo, pensava-se em considerá-la
como um controle negativo de infecção, visto que havia os controles negativos sem bactérias
e, era necessário observar se as alterações ocorriam em decorrência da simples presença de
uma bactéria externa não patogênica. No entanto, no decorrer dos experimentos foi observado
que tal bactéria comensal humana, diferente do esperado, era capaz de induzir danos ao tecido
epitelial do íleo de camundongos.
Por isto, deve ser salientado que o termo adesão não significa apenas a ligação
física do microrganismo às células hospedeiras, pois há diversas maneiras de associação das
bactérias à mucosa, e todas têm efeitos semelhantes, isto é, reduzem a taxa de remoção das
bactérias do sistema (FRETER, 1980), o que explica a presença da E. coli HS em suspensão
livre no lúmen intestinal observada neste estudo. Além disto, é possível que essa bactéria
tenha se agregado a outras bactérias capazes de se aderir à mucosa intestinal, a fim de
permanecer no lúmen mesmo na presença do peristaltismo intestinal (BIOCAMP, 2013).
Tal forma de colonização também foi observada em um estudo com E. coli
MG1655, outra cepa comensal humana, no intestino grosso de ratos tratados com
estreptomicina, pois essa bactéria também não estava associada ao epitélio, mas estava
dispersa ou como células ou na camada de muco, a qual sobrepõe o epitélio e se renova a cada
2 horas (RANG et al., 1999). O mesmo ocorreu com a cepa comensal de ratos E. coli BJ4
(POULSEN et al., 1994).
É possível que a colonização da E. coli HS tenha decorrido da resistência
incompleta da microbiota à colonização, pois diferentes cepas de E. coli comensais utilizam
nutrientes distintos para crescerem no intestino do hospedeiro como mostrado por Conway e
Cohen (2007), quando observaram que as cepas comensais humanas E. coli MG1655 e E. coli
Nissle 1917 utilizam L-arabinose e L-fucose no intestino de rato, mas que somente a última
utiliza D-manose, permitindo, desta maneira, a coexistência de ambas bactérias no mesmo
meio.
78
Então, neste trabalho, observou-se que a colonização da E. coli HS não causou
alterações importantes na estrutura da mucosa intestinal, porém isto não impossibilitou a
redução da CCC basal, significando que houve alteração nos fluxos iônicos normais na via
transecular.
No tocante ao transporte de glicose no íleo de animais nutridos, a E. coli HS
induziu modificações, necessitando de uma maior dose desse carboidrato para atingir a
metade do efeito máximo, ainda que a resposta máxima a esse substrato tenha sido semelhante
ao grupo controle.
Nos animais nutridos, o transporte de glutamina também foi alterado pela
colonização da E. , mesmo que a resposta máxima a esse aminoácido não tenha sido
prejudicada, ainda que não tenha sido necessário aplicar uma maior dose no lado mucoso da
membrana para obter a metade do efeito máximo.
Porém, quando se avaliou o transporte de alanil-glutamina, nos nutridos
infectados com E. , observou-se que esse substrato foi o único que permaneceu sendo
transportado normalmente através dos enterócitos, não necessitando de doses maiores para
obter a metade do efeito máximo. Além de tudo, esse dipeptídeo causou uma resposta máxima
similar ao grupo controle, portanto é o mais adequado para casos de infecção com E. .
5.2.5 Desnutrição e E. coli HS
Nos desnutridos, a E. coli HS não modifica a mucosa do íleo e ainda aumenta a
CCC basal até se assemelhar ao grupo controle nutrido, o que sugere que essa bactéria
estimule a secreção aniônica e/ou a absorção catiônica e possivelmente normalize os fluxos
iônicos basais reduzidos pela desnutrição. Porém, isto não impede que o transporte de glicose
seja danificado por essa bactéria, mas a absorção de glutamina e alanil-glutamina permanece
intacta, ainda que a resposta máxima à alanil-glutamina seja reduzida.
Com a comparação entre os animais inoculados com E. coli HS, nota-se que esta
não altera a estrutura da mucosa ileal de acordo com o grau de nutrição do hospedeiro, porém
modifica a CCC basal sob tais condições. Mesmo assim, a dose de glicose, glutamina e alanil-
glutamina necessária para atingir a metade do efeito máximo é similar entre os grupos.
79
5.2.3 Resistência transepitelial
Em relação à resistência transepitelial, nenhum dos fatores induzidos neste
trabalho foi capaz de alterá-la significativamente. Portanto, a desnutrição e/ou as infecções
induzidas neste estudo não danificaram a integridade das vias paracelulares e, por
consequência, o transporte intercelular de íons e pequenas moléculas, pois a Rt é
inversamente proporcional à permeabilidade intestinal (CLARKE, 2009). Um exemplo disto
foi o aumento da expressão da transcrição do gene claudina-2 no íleo dos animais
desnutridos, já que a interação das claudinas e permite a passagem seletiva de íons, tendo
como principal função regular a permeabilidade paracelular (PARIS et al., 2008).
80
6 CONCLUSÃO
Nos animais nutridos, a EPEC não causa alteração na estrutura morfológica da
mucosa do íleo, porém reduz a CCC basal e, consequentemente, os fluxos iônicos normais.
Ademais, essa bactéria danifica o co-transporte de Na+-glicose, entretanto é incapaz de alterar
o transporte de glutamina e alanil-glutamina.
A presença da E. coli HS no lúmen do intestino nutrido não altera a estrutura da
mucosa absortiva, apenas reduz a profundidade das criptas de Lieberkühn. No entanto, causa
decréscimo da CCC basal, modificando os transportes iônicos nessa região. Nesse grupo
experimental, apenas a adição cumulativa total de alanil-glutamina foi capaz de estimular o
processo absortivo. Haja vista, somente os sistemas de transportadores de glicose e glutamina
foram modificados pela colonização da E. coli HS.
A histomorfometria mostrou que a desnutrição não causa danos à mucosa
intestinal. E mesmo que a CCC basal diminua, adições de glicose, glutamina e alanil-
glutamina ao meio luminal estimulam a absorção de íons, ocorrendo uma melhora na
capacidade absortiva do íleo.
A EPEC, em intestino desnutrido, é capaz de reduzir a área vilositária, no entanto
as criptas e a CCC basal permanecem normais. Embora o transporte de glutamina seja
prejudicado pela presença dessa bactéria, a adição de glicose e alanil-glutamina no lado
mucoso do íleo contribui para o aumento da absorção iônica.
O íleo de animal desnutrido e colonizado por E. coli HS não sofre alterações na
estrutura da mucosa em relação ao desnutrido sem infecção. Contudo, essa bactéria causa
aumento na CCC basal, normalizando os fluxos iônicos danificados pela desnutrição. Nesse
grupo de animais, apenas o transporte de glicose sofreu alteração. Enquanto a adição de
glutamina e alanil-glutamina favorece o processo absortivo.
A desnutrição e ou infecção induzidas nos experimentos não danificam a
integridade das vias paracelulares.
A desnutrição aumenta a transcrição gênica dos transportadores SGLT-1 e PEPT-
1 e da claudina-2; e diminui a transcrição do gene SN-2. A síntese das proteínas SGLT-1, SN-
1, SN-2 e PEPT-1 foi aumentada com a desnutrição. Explicando, por esta razão, a
manutenção da normalidade dos sistemas transportadores de glicose, glutamina e alanil-
glutamina em íleo de camundongos desnutridos.
81
Destarte, é possível que esses substratos favoreçam a recuperação da membrana e
aliviem o ciclo vicioso de desnutrição, infecção e diarreia através do aumento da absorção
(CCC) e recuperação da normalidade da permeabilidade intestinal (Rt), no entanto, no caso de
se utilizar a glicose ou a glutamina, deve-se avaliar o estado nutricional do hospedeiro e se há
presença de agentes patogênicos associados, a fim de eleger o melhor substrato para cada
caso, porém a alanil-glutamina mostrou-se o mais adequado substrato, pois foi o único que
favoreceu o aumento absortivo em todos os grupos experimentais.
82
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ANEXO A – DOCUMENTO DE APROVAÇÃO PELA COMISSÃO DE ÉTICA EM
PESQUISA ANIMAL