Università Università di di CataniaCatania

Dipartimento di Scienze BiomedicheDipartimento di Scienze Biomediche- Sezione Embriologia Medica -- Sezione Embriologia Medica -

Corso di Istologia ed Embriologia – Corso di Istologia ed Embriologia – polo B -polo B -

Testi Consigliati:

• Istologia di V. Monesi Ed. Piccin

• Larsen - Embriologia Umana - Ed. Gnocchi

o

• Barbieri - Carinci – Embriologia – Casa Editrice Ambrosiana

Dr. Imbesi Dr. Imbesi RosaRosa 1

Materia ViventeMateria Vivente= Tutto ciò che ha la capacità di riprodursi o di replicarsi

• UNITA’ DI MISURA DI LUNGHEZZA:UNITA’ DI MISURA DI LUNGHEZZA:

- micrometro m) = 10-3 mm

- nanometro (nm) = 10 -3 m - Angstrom (Å) = 10 -1 nm

• UNITA’ DI PESO:UNITA’ DI PESO: - milligrammo (mg) = 10-3 g - microgrammo (g) = 10-6 g - nanogrammo (ng) = 10-9 g - picogrammo (pg) = 10-12 g

•DaltonDalton = unità di massa molecolare Corrisponde al peso dell’atomo di idrogeno considerato come

unità

2

LIVELLI DI ORGANIZZAZIONE DELLA SOSTANZA VIVENTE

Virus, viroidi e prioni

Procarioti

Eucarioti

pluricellulari

Batteri

Alghe

unicellulari

Protozoi

Protofiti

atomo

aminoacidi

Proteina globulare

ribosomavirus

batterio

Cellula animale

Cellula vegetale

3

CELLULACELLULA

La più piccola unità vivente

Cellule

Cellule + matrice extracellulare

TESSUTO

ISTOLOGIAISTOLOGIA

Porzione di materia vivente con aspetto omogeneo presente con caratteristiche simili in varie sedi del corpo

Cellula Cellula

TESSUTO

Studio dei tessuti 4

POTERE DI RISOLUZIONEPOTERE DI RISOLUZIONE

Occhio umano

200 nm (0.2m)100 m

(0.1 mm)

PR:0.4 nm

distanza minima alla quale due punti possono essere distinti come entità separate

10 nm

5

MICROSCOPIA OTTICAMICROSCOPIA OTTICA

Consistenza

INCLUSIONEINCLUSIONE

Conservazione della struttura

FISSAZIONEFISSAZIONE

6

MICROSCOPIA OTTICA

1- 2 ore per gradazione

1- 2 ore per recipiente

Si fanno 2 – 3 cambi di xilolo per eliminare tutto l’alcool

Da pochi minuti ad 1-2 giorni

Diafanizzazione

Formella

Qui viene versata la paraffina fusa La paraffina viene versata all’interno di formelle di plastica o rame di seguito, abbastanza velocemente, vengono allineati, i pezzi da includere

7

MICROSCOPIA OTTICA

Inclusione

Taglio

Il taglio delle sezioni è effettuato utilizzando il microtomo

6-24 ore in totale

Si fanno 2-3 cambi per eliminare tutto il solvente

8

MICROSCOPIA OTTICA

Montaggio

Colorazione e montaggio

2’ per ogni recipiente

20-30” per alcool

Qui i vetrini possono rimanere per un certo

tempo

Ematossilina 5’

5’ -10’

Eosina 1’

1-2’ per X

Montaggio

9

INCLUSIONE PER INCLUSIONE PER CONGELAMENTOCONGELAMENTO

TAGLIOTAGLIO

VantagVantaggigi

SvantagSvantaggigi

Danneggiamento della morfologia dei tessuti

•Maggiore rapidità

•Migliore conservazione delle caratteristiche chimiche

10

MICROSCOPIA OTTICA

FASI, OCCORRENTE, SCOPI E TEMPI NECESSARI PER L'ALLESTIMENTO DI UN PREPARATO ISTOLOGICO

PRELIEVO

di organi o tessuti da studiare

forbici, pinzette, bisturi, lamette, piano di sughero o in materiale plasticol’operazione va eseguita nel più breve tempo possibile

FISSAZIONE

Impedire la degenerazione dei tessuti per mantenere il più possibile inalterato il quadro strutturale dei tessutiFormalina neutra al 10%Il tempo di soggiorno dei pezzi nel fissativo varia da poche ore a 1-2 giorni

INCLUSIONE

Rendere il pezzo di consistenza tale da poter essere affettato allo spessore voluto (5-7 m)

Serie di alcooli – Solvente del mezzo includente – Mezzo includente – Stufa a 56-60°CDa alcune ore a 1-2 giorni

TAGLIO Affettare il pezzo in modo da poter essere osservato al microscopioMicrotomo

MONTAGGIO

Disporre le sezioni su vetrini

Vetrini portaoggetto - Piastratermostata

COLORAZIONE

Permettere l’osservazione della sezione al microscopio

Coloranti

MONTAGGIOProteggere le sezioni e migliorare l’osservazione al micorscopio

Vetrini coprioggetto - Montante

11

Ematossilina/Ematossilina/EosinaEosina• Ematossilina

• Eosina

Colorante basico che ha affinità per le molecole cariche negativamente (DNA, RNA ed alcune proteine)

Colorante acido che ha affinità per le molecole cariche positivamente (proteine del citosol)

Porzioni cellulari basofile

Porzioni cellulari acidofile

Alcuni esempi Alcuni esempi di colorazionidi colorazioni

• PAS (Acido Periodico Schiff)Dimostrazione della presenza di carboidrati.

Tali strutture sono colorate in magenta

• TricromicaUtilizzata per evidenziare le fibre connettivali

e per distinguerle da quelle muscolari

• Sudan black o osmioPer lipidi/mielina

I lipidi non incorporano coloranti acquosi

• Impregnazione argentica o con oroPer processi cellulari e fibre delicate comprese quelle nervose

Per l’esame di strisci di sangue

e di midollo osseo

• May-Grünwald-Giemsa

Esiste una grande varietà di colorantiQuesta tabella ne evidenzia alcuni dei più comuni

12

Come si osserva il Come si osserva il campione?campione?

• Attraverso un buon microscopio ottico

• Fotografandolo

Interpretare il campione !!!!Interpretare il campione !!!!

Sezione trasversale

Sezione obliqua

Sezione longitudinale

13

Allestimento di uno Allestimento di uno strisciostriscio

COLORAZIONE

14

MICROSCOPIMICROSCOPI

Microscopio otticoMicroscopio ottico

A contrasto di faseA contrasto di fase A interferenzaA interferenza

A fluorescenzaA fluorescenza ConfocaleConfocale

Permette di osservare cellule e tessuti a

fresco

Fornisce dati

quantitativi

E’ in grado di rivelare e localizzare molecole

fluorescenti

E’ in grado di mettere a fuoco piani diversi di un

preparato

15

MICROSCOPIA MICROSCOPIA ELETTRONICAELETTRONICA

Membrana cellulare

RERGranuli di secrezione

Mitocondri

Nucleo

Apparato di GolgiTEMTEM SEMSEM

Entrambi basati sull’uso di un fascio di elettroni

TEM: TEM: • Immagine derivata dall’attraversamento delle strutture biologiche da parte degli elettroni

• permette lo studio della morfologia subcellulare

SEM: • basato sul principio di una immagine riflessa derivante dal rimbalzare degli elettroni sulla superficie del campione

• permette la visione tridimensionale della superficie di cellule e tessuti

16

Microscopio ottico Microscopio ottico ee

microscopio microscopio elettronico a elettronico a

confrontoconfronto

Sorgente luminosa: lampada

Lente del condensatore

Sezione istologica

Obiettivo

oculare

Catodo: filamento

Anodo

Condensatore

Preparato

Obiettivo

Proiettore

Schermo fluorescente

Quando usare il microscopio Quando usare il microscopio elettronico?elettronico?

La maggiore risoluzione del TEM permette La maggiore risoluzione del TEM permette di visualizzare strutture non visibili con il di visualizzare strutture non visibili con il microscopio otticomicroscopio otticoP.R. Occhio: 0.2 mm = 200

mP.R. M. Ottico: 2000 Å = 200 nm

P.R. TEM: 2Å

17

PREPARAZIONE DI CAMPIONI BIOLOGICI PER PREPARAZIONE DI CAMPIONI BIOLOGICI PER TEMTEM

1.. FissazionFissazionee

Glutaraldeide tamponata a pH 7.2-7.8

2. PostfissazionePostfissazione Tetrossido di osmioL’osmio agisce anche da “colorante” sia perché si lega come osmio ridotto alle lipoproteine e ad altri costituenti delle cellule sia perché l’osmio, a causa del suo elevato numero atomico, aumenta la diffrazione degli elettroni da parte dei costituenti cellulari, accentuandone il contrasto

3. DisidratazioneDisidratazione Passaggi in soluzioni crescenti di etanolo

4. InclusioneInclusione Resine epossidiche

5. TaglioTaglio Ultramicrotomo

Lama di diamante o di vetro

Sezioni che galleggiano in acquaSpessore da 40 a 100

nm6. . MontaggioMontaggio

7. ColorazioneColorazione

8. VisualizzazioneVisualizzazione

Fotografia, sviluppo ed analisi delle Fotografia, sviluppo ed analisi delle immaginiimmagini

Retino Vetrino portaoggetto

Blu di toluidina

Microscopio ottico

Coloranti elettronici

TEM 18

Catodo: filamento

Anodo

Condensatore

Preparato

Obiettivo

Proiettore

Schermo fluorescente

TEMTEM SEMSEM

Preparato

Amplificatore elettronico

SCHERMO

Scanner

Fascio di elettroni

Elettroni secondari

19

MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONEMICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE

Vediamo di sapern

e un po’ di

più…

• Minore potere di risoluzione rispetto al TEM

• Fornisce una immagine tridimensionale della superficie del campione

• Il campione non viene tagliato

• Usato per studiare la superficie cellulare

• Consente di valutare il rilievo degli oggetti

20

Come si prepara il campione per l’osservazione al SEM?Come si prepara il campione per l’osservazione al SEM?

• Acquisizione del campioneIl campione deve essere trattato con cura per non danneggiare la

superficie

• Fissazione e Disidratazione

• No inclusione

• Il campione viene poggiato su un supporto

• Ricoperto con un metallo elettronconducente

• Visualizzato

• Fotografato

• Analizzato ai raggi X21

Riassumendo ……Riassumendo ……

MO TEM SEM

1 1 1

1. Sorgente per l’illuminazione

lampadina Filamento elettronico ad alta

tensione

2 2 2

2. Lente condensatore

3 3

3

3. Preparato

3

4

4

4

4. Obiettivo

5

5. Oculare

6

6. Proiettore

7. Sistema di deflessione del fascio

8. Fotomoltiplicatore

Schermo TV

Lente di vetro

Lente elettromagneti

caVetrino

portasezione Retino portasezione

Blocchetto metallizzato

Lente di vetro

Lente di vetro

Lente elettromagneti

ca

***

OCCHIOSCHERMO

FLUORESCENTE

Immagine riflessa

22

L’istologia moderna non si limita all’osservazione descrittiva degli aspetti morfologici e strutturali di base di cellule e tessuti.

Esistono numerose tecniche che consentono di rispondere a quesiti su aspetti funzionali della composizione di un tessuto

Istologia “funzionale”Istologia “funzionale”

• Colture cellulari

• Istocitochimica

• Immunoistochimica

• Citometria a flusso

• Autoradiografia

• IBRIDAZIONE In Situ

- Si prefigge di localizzare particolari molecole impiegando reazioni chimiche specifiche

- Permette di dimostrare la presenza di specifiche sostanze nei tessuti utilizzando anticorpi

- Permette di misurare alcuni parametri morfologici

- Permette di approfondire le conoscenze della fisiologia cellulare

- Permette studio e osservazione delle cellule viventi

• Biologia molecolare- NORTHERN BLOTTING- Permette di definire quali geni sono

espressi da un tipo cellulare o tessuto

- Permette di localizzare RNAm per specifiche proteine

23