Untersuchung des Reaktionsmechanismus von Rinderleberkatalase .diesem Zusammenhang ist vor allem

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Text of Untersuchung des Reaktionsmechanismus von Rinderleberkatalase .diesem Zusammenhang ist vor allem

  • Universität Duisburg-Essen

    Untersuchung des Reaktionsmechanismus

    von Rinderleberkatalase

    Dissertation

    zur

    Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften

    - Dr. rer. nat. -

    im Fachbereich Chemie

    der Universität Duisburg-Essen

    vorgelegt von

    Oliver Auferkamp

    aus Bochum

    2007

  • Referent: Prof. Dr. Dr. H. de Groot

    Korreferent: Prof. Dr. Dr. h.c. R. Sustmann

    Tag der mündlichen Prüfung: 25.01.2008

  • 1

    Danksagung

    Die vorliegende Arbeit entstand im Zeitraum von 13.03.2003 bis 31.03.2006 am Institut für

    Physiologische Chemie des Universitätsklinikums Essen. Für den Vorschlag zu dieser

    Dissertation, bei der Durchführung der Versuche und für die wertvollen Ratschläge, die mir

    bei der Erstellung dieser wissenschaftlichen Arbeit geholfen haben, gilt mein besonderer

    Dank dem Leiter dieses Institutes

    Herrn Prof. Dr. Dr. Herbert de Groot

    Des Weiteren gilt mein besonderer Dank dem Leiter des Institutes für Organische Chemie der

    Universität Duisburg-Essen für das gewährte Interesse an dem Thema, die

    Diskussionsbereitschaft und die Übernahme des Korreferates für diese Arbeit

    Herrn Prof. Dr. Dr. h. c. Reiner Sustmann

    Ebenfalls vom Institut für Organische Chemie der Universität Duisburg-Essen danke ich

    Herrn Dr. H.-G. Korth für die sehr große Diskussionsbereitschaft.

    Vom Universitätsklinikum Essen danke ich weiterhin Herrn Priv. Doz. Dr. M. Kirsch für die

    vielen Ratschläge und Ideen zur Optimierung der Versuche.

    Mein Dank gilt auch besonders Frau A. Wensing für die große Hilfestellung bei der

    Einarbeitung an den verschiedenen Apparaturen und für das tolle Arbeitsklima im Labor.

    Herrn Dr. T. Bramey danke ich für die gewährte Hilfe, das nette Klima in unserem kleinen

    Schreibraum und für den freundschaftlichen Kontakt, was natürlich auch für seine Freundin,

    Frau K. Pamp, gilt.

    Für das angenehme Arbeitsklima und die vielen Hilfen bzw. Ratschläge danke ich außerdem

    Frau Dr. U. Kerkweg, Frau Dr. S.G.E. Meyer, Frau B. Lammers, Frau J. Fieker, Frau M.

    Brachvogel, Frau W. Diesner, Frau E. Hillen, Frau A. Kytzia, Frau S. Liebeskind, Frau K.

    Sonnenschein, Frau J. Arnold-Thomas, Herrn Dr. F. Petrat, Herrn F. Homann, Herrn S.

    Klempt, Herrn K. Müller, allen ehemaligen Mitarbeitern und allen Gast-Mitarbeitern.

    Besonderer Dank gilt meiner Familie, meiner Freundin Regina sowie allen meinen Freunden

    und Bekannten, die nicht nur während der Zeit dieser Promotion für mich da waren.

    Diese Arbeit wurde teilweise durch die DFG im Rahmen des SFB-452 gefördert.

  • Inhaltsverzeichnis

    2

    Inhaltsverzeichnis

    1. Einleitung………………………………………………………………………... 5

    1.1

    1.2.

    1.3.

    1.4.

    1.5.

    Katalase………………………………………………………………………...

    Funktion der Katalase…………………………………………………………..

    Struktur des Enzyms……………………………………………………………

    Bedeutung der Katalase für die Zelle sowie technische Anwendung………….

    Bestimmungsmöglichkeiten der Katalaseaktivität……………………………..

    5

    8

    10

    17

    18

    2. Fragestellung……………………………………………………………………. 20

    3. Ergebnisse………………………………………………………………………. 21

    3.1. Abhängigkeit der katalatischen Sauerstoffproduktion von der eingestellten

    H2O2 steady-state-Konzentrationen…………………………………………. 21

    3.2. Bildung von Compound-I, -II, -III bei verschiedenen v(H2O2)/[Katalase]-

    Verhältnissen………………………………………………………………… 24

    3.3. Untersuchung der Absorption (405 nm) bei niedrigen bzw. hohen

    v(H2O2)/[Katalase]-Verhältnissen…………………………………………… 26

    3.4. Untersuchung der katalytischen Aktivität nach Inkubation von Rinderleberkatalase

    mit unterschiedlichen v(H2O2)/[Katalase]-Verhältnissen..............… 28

    3.5. Oxidation des synthetischen Peroxidasesubstrates Rhodamin-123 in Gegenwart

    unterschiedlicher v(H2O2)/[Katalase]-Verhältnisse bei An- bzw. Abwesenheit von

    Additiven............................................................................. 32

    3.6. Effizienz der Dihydrorhodamin-123-Oxidation durch Compound-I in Gegenwart

    verschiedener Additive (Ascorbinsäure bzw. NADPH)………… 35

    3.7. Bestimmung der Compound-I-Abbaurate (kapp) in Gegenwart verschiedener

    Additiven (Ascorbinsäure, NADPH u. Ethanol)…………………………….. 37

    3.8. Additive-abhängige Compound-II Bildung bei konstanten H2O2-Fluxen in

    Anwesenheit von Xanthinoxidase-generierten O2

    .-

    Radikalen…..………….. 39

    3.9. Compound-II-Bildung bei physiologischen H2O2-Fluxen in An- bzw. Abwesenheit

    verschiedener Additive…………...……….....…………………... 41

  • Inhaltsverzeichnis

    3

    3.10. Bestimmung der Ferrikatalase u. Compound-II-Entwicklung bei Inkubation von

    Katalase mit physiologischen H2O2-Fluxen in An- bzw. Abwesenheit von

    Additiven………………………………………………………………... 43

    3.11. Bestimmung des bevorzugten Reaktionszyklus von Katalase bei verschiedenen

    H2O2-Fluxen und physiologischen NADPH-Konzentrationen 46

    3.12. NADPH-Verbrauch bei niedrigen und hohem v(H2O2)/[Katalase]-

    Verhältnissen……………………………………………………………............…… 50

    3.13. Beeinflussung des Katalasezyklus-Anteiles am Gesamtreaktionszyklus durch

    Zugabe unterschiedlicher Additive (Methanol, NADPH) in unterschiedlichen

    Konzentrationen………………………………………….......... 52

    3.14. Stabilität der Katalase gegenüber oxidativen Angriffen. Peroxinitrit als

    Modellinitiator………………………………………………………………....... 53

    4. Diskussion………………………………………………………………………. 56

    4.1. Unterschiedliche Reaktionsmöglichkeiten des Enzyms bei

    unterschiedlichenv(H2O2)/[Katalase]-Verhältnissen ........ 56

    4.2. Verhalten von Katalase unter physiologischen Bedingungen bzw. in vivo.. 56

    4.3. Reaktion von Katalase bei niedrigen H2O2-Fluxen und Stabilität

    gegenüber oxidativen Angriffen .... 60

    5. Zusammenfassung……………………………………………………………… 62

    6. Material und Methoden………………..………………………………………. 64

    6.1. Charakterisierung der eingesetzten Katalase, Peroxidase, Glucoseoxidase

    und Xanthinoxidase………………………………………………………… 64

    6.2. Herstellung des verwendeten Puffers und Entfernung von Metallionen…... 65

    6.3. Lösen von Rinderleberkatalase für anschließende Aufbereitung………….. 66

    6.4. Aufreinigung von Rinderleberkatalase mittels Gelfiltrationssäule………… 66

    6.5. Aufreinigung von Katalaselösung mittels 100 kDa „Microcons“…………. 68

    6.6. Dialyse von Rinderleberkatalase…………………………………………… 69

  • Inhaltsverzeichnis

    4

    6.7. Bestimmung der Sauerstoffkonzentration in Lösungen mit Hilfe einer

    Clark-Sauerstoffelektrode…………………………………………………..

    70

    6.8. Bestimmung der H2O2-Konzentration mittels Amplex-Red……………….. 72

    6.9. Fluorimetrische Bestimmung der Tryptophanfluoreszenz…………………. 74

    6.10. Bestimmung der Katalase-Aktivität mittels UV/VIS-Spektroskopie…….... 74

    7. Literaturverzeichnis…………...………………………………………………... 77

    8. Anhang…………………………….……………………………………………. 84

    8.1. Abkürzungsverzeichnis…………………………………………….............. 84

    8.2. Konstanten………………………………………………………….............. 85

    8.3. Extinktionskoeffizienten der eingesetzten Substanzen…………………….. 86

    8.4. Chemikalien, Verbrauchsmaterialien, Geräte................................................ 86

    8.5. Literaturliste beteiligter Veröffentlichungen ………………………………. 87

    9. Curriculum vitae……….………………………………………………………. 88

  • Einleitung

    5

    1. Einleitung

    1.1. Katalase

    Neben schädlichen exogenen Einflüssen (wie etwa chemische (aus dem umgebenden Milieu);

    bzw. physikalische (z.B. kosmische Strahlung)) sind es vor allem zellinterne, beim Abbau

    bzw. beim Umbau entstehende Substanzen, wie Wasserstoffperoxid sowie verschiedene

    Radikale (z.B. ROS-Radikale), womit Zellen konfrontiert werden. Um diese Noxen zu

    neutralisieren bzw. zu eliminieren, bedienen sich Zellen verschiedener Stra