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Aus dem Veterinar-Physiologisch-Chemischen Institut der Karl-Marx-Universitat zu Leipzig Direktor: Prof. Dr. Dr. E. Kolb Untersuchungen uber das Vorkommen von Cholinesterase im Blut und Serum von Haustieren (Rind, Schaf, Ziege, Pferd, Schwein, Hund) und ihre Beeinflussung durch Kontaktinsektizide (Metasystox und Diazinon) Von E. KOLB (Eingegangen am 26. Juni 1957) Das Acetylcholin spielt als neurohumoraler Wirkstoff im tierischen Orga- nismus eine bedeutsame Rolle: es dient der Erregungsubertragung zwischen den parasympathischen (,,cholinergischen") Nerven und den spezifischen Elementen der Erfolgsorgane sowie dcr Erregungsubertragung in allen praganglionaren Fasern des vegetativen Nervensystems, es wirkt ferner als Obertragersubstanz in den Synapsen des Zentralnervensystems und in den motorischen Endplatten (NACHMANSOHN 1955). Die Synthese des Acetylcholins erfolgt durch das Ferment Cholinacetylase (NACHMANSOHN und MACHADO 1943). Seine Wir- kung ist im Gewebe nur von aufierordentlich kurzer Dauer, da es durch die in allen Organen vorkommende Cholinesterase gespalten wird. Im Blut hat man zwei Cholinesterasen zu unterscheiden: die sogenannte ,,echte" oder ,,spezifische" Cholinesterase ist in den Erythrocyten nachweisbar und hauptsachlich in der Membran lokalisiert; im Serum findet sich eine ,un- spezifische" Cholinesterase, die auch als Pseudocholinesterase bezeichnet wird. Beide Fermente unterscheiden sich durch unterschiedliche Aktivitat gegenuber verschiedenen Substraten sowie durch ihre unterschiedliche Empfindlichkeit gegenuber Hemmstoffen (AUGUSTINSSON 1948). Die Untersuchun der im Blut vorkommenden Cholinesterase-Aktivitat ist sowohl von erhebfichem klinisch-chemischen als auch von pharmakologi- schem und toxikologischem Interesse, denn bei bestimmten Erkrankungen bzw. nach Applikation von Arzneimitteln sind Aktivitats-Erhohungen und -Minde- rungen nachweisbar. In jungster Zeit findet die Bestimmung der Cholinesterase auch fur die Diagnostik von Vergiftungen durch Phosphorinsektizide Anwen- dung (AUGUSTINSSON 1954), was im Hinblick auf die stark ansteigende Ver- wendung solcher Stoffe bedeutungsvoll ist. Wahrend fur den Menschen eine grofie Zah! von Bestimmungen der Cholinesterase-Aktivitlt unter normalen 65,

Untersuchungen über das Vorkommen von Cholinesterase im Blut und Serum von Haustieren (Rind, Schaf, Ziege, Pferd, Schwein, Hund) und ihre Beeinflussung durch Kontaktinsektizide (Metasystox

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Aus dem Veterinar-Physiologisch-Chemischen Institut der Karl-Marx-Universitat zu Leipzig

Direktor: Prof. Dr. Dr. E. Kolb

Untersuchungen uber das Vorkommen von Cholinesterase im Blut und Serum von Haustieren (Rind, Schaf, Ziege,

Pferd, Schwein, Hund) und ihre Beeinflussung durch Kontaktinsektizide (Metasystox und Diazinon)

Von

E. KOLB (Eingegangen am 26. Juni 1957)

Das Acetylcholin spielt als neurohumoraler Wirkstoff im tierischen Orga- nismus eine bedeutsame Rolle: es dient der Erregungsubertragung zwischen den parasympathischen (,,cholinergischen") Nerven und den spezifischen Elementen der Erfolgsorgane sowie dcr Erregungsubertragung in allen praganglionaren Fasern des vegetativen Nervensystems, es wirkt ferner als Obertragersubstanz in den Synapsen des Zentralnervensystems und in den motorischen Endplatten (NACHMANSOHN 1955). Die Synthese des Acetylcholins erfolgt durch das Ferment Cholinacetylase (NACHMANSOHN und MACHADO 1943). Seine Wir- kung ist im Gewebe nur von aufierordentlich kurzer Dauer, da es durch die in allen Organen vorkommende Cholinesterase gespalten wird.

Im Blut hat man zwei Cholinesterasen zu unterscheiden: die sogenannte ,,echte" oder ,,spezifische" Cholinesterase ist in den Erythrocyten nachweisbar und hauptsachlich in der Membran lokalisiert; im Serum findet sich eine ,un- spezifische" Cholinesterase, die auch als Pseudocholinesterase bezeichnet wird. Beide Fermente unterscheiden sich durch unterschiedliche Aktivitat gegenuber verschiedenen Substraten sowie durch ihre unterschiedliche Empfindlichkeit gegenuber Hemmstoffen (AUGUSTINSSON 1948).

Die Untersuchun der im Blut vorkommenden Cholinesterase-Aktivitat ist sowohl von erhebfichem klinisch-chemischen als auch von pharmakologi- schem und toxikologischem Interesse, denn bei bestimmten Erkrankungen bzw. nach Applikation von Arzneimitteln sind Aktivitats-Erhohungen und -Minde- rungen nachweisbar. In jungster Zeit findet die Bestimmung der Cholinesterase auch fur die Diagnostik von Vergiftungen durch Phosphorinsektizide Anwen- dung (AUGUSTINSSON 1954), was im Hinblick auf die stark ansteigende Ver- wendung solcher Stoffe bedeutungsvoll ist. Wahrend fur den Menschen eine grofie Zah! von Bestimmungen der Cholinesterase-Aktivitlt unter normalen

65,

968 KOLB

und pathologischen Bedingungen vorliegt, sind diesbezugliche Untersuchungen bei Haustieren nur in wenigen Fallen durchgefuhrt worden. In Fortsetzung von Rrbeiten uber die Aktivitat von Serumfermenten (KOLB) wurden Unter- suchungen uber das Vorkommen voii Cholinesterase im Blut von Haustieren ~ n d ihre Beeinflussung durch zwei Kontaktinsektizide (Metasystox und Diazinon) durchgefuhrt, uber die im folgenden berichtet wird. Die Unter- suchung der Serumfermente findet neuerdings in der Humanmedizin fur die Diagnose von Erkrankungen starke Beachtung: wahrend normales Serum viele Enzyme in sehr geringen Konzentrationen enthalt, kann man bei bestimmten Erkrankungen einen ungewohnlich hohen Gehalt an manchen Enzymen fest- stellen, deren T y p und Konzentration fur die Krankheit charakteristisch sind.

Schrifttum Die Literatur uber die Cholinesterase ist in einer Reihe von Handbuch-

artikeln und Obersichtsreferaten niedergelegt (AMMON 1940, AUGUSTINSSON 1950, NACHMANSOHN und WILSON 1951). An dieser Stelle sollert nur einige praktisch bedeutsame Gesichtspunkte zur Darstellung gelangen. Als Bildungs- statte fur die Serumcholinesterase kommt hauptsachlich die Leher in Frage ( B ~ N A R D et al.), daneben noch das gesamte retikuloendotheli ale System ( LABORIT und TANGUY). Eine Verminderung der Fermentaktivitit ist beim Menschen daher bei einer Reihe von Lebererkrankungen, im besonderen bei Parenchymschadigungen, nachgewiesen worden (FABER, MAIER, 0 KINAKA und YOSCHIKAWA), ferner bei Asthma bronchiale (ZINNITZ und ENZINGER), bei Ulcus ventriculi (RUMMA und SIBUL), bei Anaemien (SABINE), bei Colitis ulcerosa (MOELLER et al.), bei akutem Gelenkrheumatismus (OKA.) sowie bei anaphylaktischen Reaktionen und allergischen Hauterkrankungen. Die herab- gesetzte Fermentaktivitat bei Karzinomkachexie (HORNYKIE.WYTSCH, SCHMIDT) und bei chronischer Unterernahrung steht mit einer allgemeinen Senkung der Synthese spezifischer EiweiBkorper durch die Leber im Zusammenhang. Weiter- hin war eine Abnahme der Wirksamkeit der Serumcholinesterase beim Menschen nach Verbrennungen (STRODER und STUTTGEN), nach intensiver Rontgen- bestrahlung (LUTHY) und beim traumatischen Schock (LARORIT) zu verzeichnen.

Eine Steigerung der Aktivitat des Serumfermentes findet sich h i Morbus Basedow (STREHLER und MEYER) sowie bei Nephrosen (LIXRRECHT); unter- schiedliche Befunde wurden bei der essentiellen Hypertonie erhoben (Lit. siehe HEINECKER und MAYER).

Hinsichtlich der Bedeutung der Cholinesterase im Blut bestehen noch ver- schiedene Meinungen: in erster Linie stellt das Ferment ein Werkceug dar, in die Blutbahn ubertretendes Acetylcholin unschadlich zu machen ; tlaneben be- steht noch beim Menschen ein gewisser Zusammenhang zwischen vegetativer Tonuslage, im besonderen auch der Herz- und Kreislauffunktion, und der Aktivitat der Cholinesterase, und zwar hauptsachlich der Serumcholinesterase (HEJNECKER und LOSSE, HOFF und LOSSE). Eine niedrige Aktivitat der Serum- cholinesterase entspricht - infolge langsamen Abbaues das Acetylcholins - einer vorwiegenden Parasympathikotonie, eine erhohte Cholinesterase-Aktivi- tat hingegen auf Grund der schnellen Zerstorung des Wirkstoffes einer uber- wiegenden Sympathikotonie.

Untersuchungen an Tieren ergaben (HEYMANS et al.), dai3 bei selektiver Inaktivierung der Serumcholinesterase mit Ausnahme einer flucht gen Brady- kardie und eines vorubergehenden Blutdruckabfalles keine ausgesprochen cholinergischen Veranderungen auftraten. Bei Belastung mit Acetylcholin in sonst reaktionslos vertragenen Dosen traten schwerste cholinergische. Symptome

Vorkommen von Cholinesterase im Blut und Serum von Haustieren 969

in Form von Bradykardie, Salivation, Bronchospasmus und Hyperperistaltik in Erscheinung. Diese Beobachtungen zeigen, dai3 die Serumcholinesterase eine Barriere gegen evtl. in den Kreislauf ubertretendes Acetylcholin darstellt.

Die Bestimmung der CholinesteraseaktivitBt im Blut beim Menschen hat such Pine gewisse pharmakologische Bedeutung. SO findet das Succinylbicholin wegen seiner muskelerschlaffenden Wirkung als steuerbares Muskelrelaxans h i der Frakturenbehandlung, der Wiedereinrichtung von Luxationen, Lei der intratrachealen Intubation und bei der Elektroschockbehandlung zur Ver- hutung von Spontanfrakturen Verwendung (THESLEFF, BRUCKE et al.). Trotz der Fluchtigkeit der Wirkung treten in manchen Fallen toxische Storungen auf, die auf einen niedrigen Serum-Cholinesterasewert zuruckgefuhrt werden. Es ist daher notwendig, vor Anwendung des Praparates eine Fermentbestimmung im Serum durchzufuhren; hierfiir geben AMMON und ZAPP eine einfache klinisch-chemische Methode an. Uber die Anwendung von Succinylbicholin- chlorid (Pantolax) bei Haustieren berichtet WESTHUES. Das Rind erwies s i h gegeniiber diesem Muskelrelaxans als wesentlich empfindlicher als das Pferd, und dieser Befund durfte mit dem Vorkommen von relativ wenig Cholin- esterase im Blut des Rindes im Zusammenhang stehen.

Eine Reihe von organischen Phosphorverbindungen stellt wirksame Mittel zur Schadlingsbekampfung dar; sie sind als Kontakt-, FraiS- und Atem- gifte wirksam und hemmen die Cholinesterase (GRoB). Bekannte Verbin- dungen dieser Art sind u. a.:

Hexaathyltetraphosphat (,,HETI'"), ,,Bladan" Diathylphosphorsaure-p-nitrophenolester, ,,Mintacol" Diathylthiophosphorsaureester des 2-Athylmerkaptan, ,,Systox" p-Nitrophenoldiathylthiophosphorsaureester, ,,Parathion", E 605 Thiophosphorsaure-( 2-isopropyl-4-methyl-pyrimidyl-6)-diathylester

Vergiftungen mit solchen Schadlingsbekampfungsmitteln sind sowohl beim Menschen als auch bei Tieren wiederholt bekanntgeworden. Die Ver- giftungssymptome sind: Sehstorungen infolge Miosis, Bronchospasmus, Leib- schmerz rnit spastischer Darmkontraktur, Herzschadigung und Krampfe; der Tod erfolgt in schweren Fallen im Koma unter zunehmender Kreislauf- schwache, Lungenodem und Zyanose. Als Gegenmittel bewahren sich hohe Atropindosen, Adrenalinderivate (Sympatol u. a.), bei Krampfen ist die Ver- abreichung von Barbituraten angezeigt. Fur die friihzeitige Erkennung einer Schgdigun von Personen, die mit der Schadlingsbekampfung beschaftigt sind, bzw. fur Jie Diagnose von Vergiftungsfallen ist die Bestimmung der Cholin- esterase-Aktivitat empfehlenswert: bei einem Absinken der Cholinesterase- Werte um 15-25% gegenuber der Norm ist eine weitere Beruhrung mit Kontaktinsektiziden zu vermeiden (GARLICK, INGRAM). Der Nachweis einer Vergiftung rnit E-Mitteln unter Verwendung chemischer Methoden war bislang mit erheblichen Schwierigkeiten verbunden.

= Diazinon.

Methodik Bei der Bestimmung der Cholinesteraseaktivitat werden Vollblut oder

Serum bzw. Plasma mit dem Substrat bei einem bestimmten pH-Wert und einer bestimmten Temperatur fur eine bes t imte Zeit inkubiert, und es wird das AusmaiS der enzymatischen Hydrolyse ermittelt (STUMPF). Fur die vor- liegenden Untersuchungen diente eine von AMMON eingefuhrte gasanalytische Methode, bei der das durch die Essigsaure aus dem Bikarbonatpuffer frei- gesetzte Kohlendioxyd manometrisch im Warburg-Apparat gemessen wird;

970 KOLB

das Verfahren ist besonders fur Serienanalysen sehr geeignet. Gleichzeitig mit der enzymatischen Hydrolyse wurde die Spontanhydrolyse des Substrates und auch die aus dem Blut allein entwickelte COe-Menge ermittelt, da Proteine COr retinieren konnen (MENDEL und HAWKIN). Zwecks Verhin derung der Gerinnung des Vollblutes erfolgte ein Zusatz von Oxalat, ohne dafl dadurch die Cholinesterase-Aktivitat beeinflufit wurde. Als Verdunnungs- und Losungs- mittel diente Ringer-Losung in der ublichen Zusammensetzung, 1.ediglich der Zusatz von Calciumchlorid unterblieb.

Um eine einfache Ausdrucksform fur die Aktivitat der Cholinesterase zu erhalten, definieren AMMON und ZAPP eine Cholinesterase-Einheit als die- jenige Fermentmenge, die in 60 Min. bei 37" und einem pH-Wert von 7.4 1/1000 Millimol Acetylcholin zu spalten imstande ist. Diese Acetylcholin- rnenge entspricht auch der Freis'etzung von Mol CO,, d. h. 22,4 mm3.

Untersuchungen an Blut und Serum von Wiederkauern Untersuchungen iiber die Normalwerte der Cholinesterase im Blut und

Serum von Wiederkauern sind - vergleichsweise zur humanniedizinischen Literatur - bisher nur in wenigen Fallen durchgefuhrt worden. So berichten AMMON und Voss uber die Aktivitat des Fermentes im Blut von 5 Rindern: unter Verwendung von 0.025 ml Blut-Hamolysat pro Ansatz wurden 12, 20.5, 23, 38 bzw. 47 pl CO, pro Stunde aus dem Bikarbonat-Puffer in Freiheit ge- setzt. Mittels einer elektrometrischen Methode wurde fur die Erythrocyten- Cholinesterase beim Rind ein Mittelwert von A pH = 0.46 - C.47 und eine Schwankungsbreite von A pH = 0.17 - 0.96 ermittelt; bei Schafen ergab sich ein Mittelwert von A p H = 0.16 - 0.17. Im Plasma von Schafen und Rindern war keine Cholinesterase nachweisbar (RADELEFF und WOODARD). Im Gegen- satz zum Pferd ist bei Rindern die Cholinesterase nahezu ausschliefllich in den Erythrocyten lokalisiert; bei Gebarparese und Puerperalfieber traten keine Veranderungen auf (VAN ASPEREN).

Fur die Bestimmung der Normalwerte der Cholinesterase bei Wieder- kauern - der Erythrocyten- und der Serum-Cholinesterase - stand Mischblut von Schlachttieren zur Verfugung; es wurde unmittelbar bei der Schlachtung entnommen und kam sofort zur Messung.

E i n f l u i 3 d e r F e r m e n t k o n z e n t r a t i o n a u f d i e A k t i v i t a t d e r C h o l i n e s t e r a s e i m B l u t v o m K i n d

im Ansatz: freigesetzte C0,-Menge i(in pl) nach 30 Min. 60 Min.

0.1 ml 0.2 ml 0.3 ml

70 127 119 208 176 324

In einer Reihe von Vorversuchen hatten wir zunachst den zeitlichen Ablauf der Acetylcholinspaltung durch das Blut in Abhangigkeit von der Fermentkonzentration einer Untersuchung unterzogen, wobei gezeigt werden konnte, dai3 mit zunehmender Dauer der Reaktion und mit steigender Ferment- konzentration bei Konstantbleiben der Konzentration an Acetylcholinchlorid (0.015 g pro Ansatz) eine Abnahme der Aktivitat erfolgte.

Fur die folgenden Versuche kamen einheitlich jeweils 1.5 ml Acetylcholin- chloridlosung (0.1 g in 10 ml Ringer-Losung) und 0.05 ml Blut bzw. 0.5 ml Serum zum Ansatz. Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in Tabelle 1 aufgef uhrt :

Vorkommen yon Cholinesterase im Blut und Serum von Haustieren

T a b e l l e 1

C h o l i n e s t e r a s e - A k t i v i t a t i m B l u t u n d S e r u m v o n R i n d e r n

97 1

durch 0.05 ml Blut durch 0.5 ml Serum in 60 Min. frei- in 60 Min. frei-

gemachtes CO, gemachtes COa PI PI

Rind Nr.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Schwankungsbreite : Mittelwert:

64 65 41 60 96 45 90 81 65 97 64

121 72 79 64 84 71 89

102 68

41-121 76

22 21 20 21 24 37 36 46 33 74 18 40 30 32 40 46 32 30 56 32

18-74 35

Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, dai3 die Cholinesterase-Aktivitat im Blut von Rindern an die Erythrocyten gebunden ist, denn die Aktivitat der unspezifi- schen Serum-Cholinesterase ist aui3erordentlich gering. Die Werte fur das Vollblut liegen ungefahr im gleichen Bereich, wie si'e bereits von AMMON und Voss im Blut-Hamolysat von 5 Rindern gefunden wurden. Es ergab si& ein Mittelwert von 76 pl pro 0.05 ml Blut und eine beachtlich groi3e Schwankungs- breite von 41-121 rtl C02. Nach AMMON berechnet sich daraus der Mittelwert zu 3.4 Cholinesterase-Einheiten und die Schwankungsbreite zu 2-5.5 Ch.-E.; die Aktivitat der Cholinesterase liegt also beim Rind erheblich niedriger als beim Menschen, wo sich die Werte zwischen 5 und 11 Ch.-E. mit einem Maximum um 9 Ch.-E. bewegen. Die Wirksamkeit des Fermentes, welches an der Oberflache der Erythrocyten lokalisiert ist, durfte jedoch fur die Inaktivie- rung evtl. in die Blutbahn eintretenden Acetylcholins vollends genugen - eine Cholinesterase-Einheit entspricht der Spaltung von 0.001 Millimol Acetyl- cholin -, denn einmal sind die unter physiologischen Bedingungen entstehen- den Mengen an Acetylcholin auflerordentlich klein, zum anderen bezieht sich die Aktivitatsbestimmung nur auf eine geringe Blutmenge von 0.05 ml.

Im Gegensatz zu den negativen Befunden bezuglich des Vorkommens einer unspezifischen Cholinesterase im Serum von Rindern konnten wir regelmai3ig eine wenn auch sehr geringfugige Cholinesterase-Aktivitat ermitteln. Dieses Ergebnis wird auf den Ansatz relativ grofler Serummengen (0.5 ml) zuruck- gefuhrt, denn bei Anwendung von Serumverdunnungen (1 : 10) verliefen die Versuche negativ. Der Mittelwert der durch 0.5 ml Serum freigemamten COz-Menge betrug 35 pl, dies entspricht einer Aktivitat von 0.15 Cholin- es terase-Einheiten.

972 KOLR

Eine groi3e Zahl von Untersuchungen hat ergeben, dai3 zwischen den morphologischen und chemischen Eigenschaften des Blutes von erwachsenen Tieren und Jungtieren erhebliche Differenzen bestehen, die meist mit den physiologischen Bedurfnissen des Organismus wahrend der Wachst umsperiode im Zusammenhang stehen. Groi3ere Unterschiede innerhalb der verschiedenen Lebensalter finden sich im besonderen auch in der Konzentration vieler Fermente im Blut und in den Organen. Im Hinblick auf den hoheren Erythro- cytengehalt von wachsenden Tieren wurden Untersuchungen tler Cholin- esterase-Aktivitat im Blut und Serum von Kalbern durchgefuhrt; ihre Ergeb- nisse sind in Tabelle 2 zur Darstellung gebracht.

T a b c l l e 2 C h o l i n e s t e r a s e - A k t i v i t a t i m B l u t u i i d S e r u m v o n l i a l b e r n

d u r h 0.05ml Blut d u r h 0.5 ml Serum in 60 Min. frei- in 60 Min. frei-

gemachtes CO, gemachtes CO, Kalb Nr.

lul !dl

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Schwankungsbreite: Mittelwert :

110 83

111 90 91

102 100

87 92 99

143 179 155 125 91

138 131 177 124 115

83-179 117 (5. 2 E.)

32 40 41 41 48 38 33 32 55 22 32 45 31 48 22 53 43 3 3 42 3 6

22--53 38 (0. 17 E.)

Fur die Cholinesterase-Aktivitat im Blut von 20 Kalbern (Tabelle 2) ergab sich ein Mittelwert von 117 pl CO. und eine Schwankungsbreite von 83-179 pl Con. Die hohere Wirksamkeit der Cholinesterase ist nicht durch einen groi3eren Gehalt des Serums an diesem Ferment bedingt -- die Werte der Serum-Cholinesterase liegen im gleichen Bereich wi e bei erwachsenen Tieren - sondern durch den hoheren Gehalt des Blutes an Erythrocyten.

Erganzungsweise erschien noch die Aktivitat der Cholinesterase im Blut von Schafen und Ziegen von Interesse; die Ergebnisse der Messung der Fer- mentaktivitat bei diesen Tieren sind aus Tabelle 3 ersichtl ich.

Die Aktivitat der Cholinesterase im Blut und Serum von Schafen und Ziegen lag unter dem fur das Rind ermittelten Wert: bei Schafen wurde im Blut (0.05 ml im Ansatz) ein Mittelwert von 34 j t1 COa (1.5 Ch.-E.) und im Serum (0.5 ml) ein solcher von 25 pl COz (0.1 Ch.-E.) ermittdt; die ent- sprechenden Werte bei Ziegen beliefen sich fur das Blut (0.05 ml) auf 18 p I

Vorkommen yon Cholinesterase im Blut und Serum von Haustieren 973

T a b e l l e 3 C h o l i n e s t e r a s e - A k t i v i t a t i m B l u t u n d S e r u m

v o n S c h a f e n u n d Z i e g e n

durh 0.05 ml Blut durch 0.5 ml Serum in 60 Min. frei- in 60 Min. frei-

gemachtes COz gemachtes C02 PI A

Schaf Nr.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10

25 20 44 30 45 20 46 33 36 44

Schwankungsbreite : 20-46 Mittelwert: 34

Ziege Nr.

15 10 26 17 44 10 56 30 29 16

10-56 25

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10

10 10 15 20 15

40 23 22 24

-

Schwankungsbreite: 0-40 Mittelwert: 18

20 10 15 18 10

20 10 20 15

0 -20 14

-

CO2 (0.8 Ch.-E.) bzw. fur das Serum (0.5 ml) auf 14 pl C02 (0.06 Ch.-E.). Bei derartig niedrigen Cholinesterase-Aktivitaten ist die Verwendung hoherer Fermentkonzentrationen fur die Messung zwecks Steigerung der Genauigkeit empfehlenswert. Bei vorliegenden Untersuchungen haben wir zunachst hiervon Abstand genommen, da es uns auf einen Vergleich der Fermentwirksamkeit bei den einzelnen Tierarten ankam. Fur den Nachweis ein,er evtl. Veranderung der Cholinesterase-Aktivitat bei Vergiftungen und Erkrankungen ist jedoch das Arbeiten mit groi3eren Blutmengen (0.1-0.5 ml je nach Tierart) vorteil- haft. Erschwerend fur eine Beurtei1un)g der Hemmung der Cholinesterase durch Kontaktinsektizide wirkt sich dabei die sehr erhebliche Schwankungs- breite der Normalwerte bei Tieren aus, wie sie auch u. a. von AMMON und ZAPP beim Menschen festgestellt wurde.

Was die Stabilitat der Cholinesterase anbetrifft, so ist das Ferment sehr widerstandsfahig: nach 4wochiger Aufbewahrung bei 4' bzw. nach 24- bis 48stundigem Stehenlassen von Blut und Serum der Wiederkauer bei Zimmer- temperatur lag die Aktivitat des Fermentes im gleichen Bereich wie im frisch entnommenen Material.

Wie bereits erwahnt, zeichnen sich eine Reihe von Estern der Phosphor- saure durch eine spezifische Hemmung der Cholinesterase aus und finden als

974 KOLB

Schadlingsbekampfungsmittel Anwendung. Ober eine Heinmung dieses Fer- mentes im Blut von Haustieren durch die genannten Stoffe ist wenig bekannt; es wurden daher bei einer Reihe von Tieren diesbezuglich Versuche durch- gefiihrt und der Einflui3 von Metasystox (Dimethyl-athylmerlrapto-athyl- thiophosphat und isomere Verbindungen) sowie von Diazinon (Th iophosphor- saure- [ 2-isopropyl-4-methyl-pyrimidyl-6] -diaethylester) auf die Cholin- esterase im Blut und Serum gepruft. Von beiden Verbindungen (Metasystox und Diazinon) kamen jeweils gesattigte Losungen zur Untersuchung. Die Loslichkeit dieser Stoffe in Wasser ist sehr gering, sie betragt bei Diazinon nur 0.004%.

Ansatze: der Hauptraum enthielt 1.5 ml Substrat-Ringerlosung (15 mg Acetylcholin), der Seitenarm die Fermentlosung (Blut bzw. Serum) und 0.1 ml Hemmstoff. Einige Ergebnisse dieser Untersuchungen sind nachfolgend dar- gestellt (Tab. 4 und 5).

T a b e l l e 4 D i e H e m m u n g d e r C h o l i n e s t e r a s e i m S e r u m u n d B l u t

v o n R i n d u n d K a l b d u r c h K o n t a k t i n s e k t i z i d e

durch 0.1 ml Blut durch 0.5 ml Serum in 60 Min. frei- in 60 Min. frei-

gemachtes COB gemachtes COz PI tcl

Rind: ohne Zusatz + Mctasystox + Diazinon

Kalb: ohnc Zusatz + Metasystox + Diazinon

210

34 -

167 11 -

T a b e l l e 5 D i e H e m m u n g d e r C h o l i n e s t e r a s e i rn S e r u m u n d B I u t

v o n S c h a f u n d Z i e g e d u r c h K o n t a k t i n s e k t i z i d e

durch 0.1 rnl Blut durch 0.5 ml Serum in 60 Min. frei- in 60 Min. frei-

gemachtes CO, gemachtes C02

--____ PI

Schaf : ohne Zusatz + Metasystox -+ Diazinon

Ziegc: ohne Zusatz $- Metasystox -t Diazinon

80

28 -

18 -

Aus Tabelle 4 und 5 ist ersichtlich, dai3 beide Phosphorsiiureester eine auiierordentlich starke Hemmwirkung auf die Cholinesterase cles Blutes und Serums von Rind, Kalb, Schaf und von der Ziege ausiiben. Die Hemmwirkung

Vorkommen von Cholinesterase im B h t und Serum von Haustieren 975

wird durch eine reversible Fermentblockade hervorgerufen, wobei das aktive, Acetylcholin hydrolysierende, Zentrum belegt wird: Der Rezeptor reagiert dabei mit dem Phosphorsaureester und wird phosphoryliert.

Beim Menschen war nach Anwendung von E-Mitteln ein Abfall der Serumcholinesterase um uber 50 % nachweisbar, wobei cholinergische Symp- tome in Erscheinung traten (Ingram). Bei gefahrdeten Arbeitern sollte bei einem Abfall der Fermentaktivitat um 15-25 % ein weiterer Kontakt ver- mieden werden (GARLICK). In Anbetracht der bei Wiederkauern vergleichs- weise zum Menschen wesentlich geringeren Cholinesterase-Aktivitat im Blut wird man schon bei kleineren Hemmeffekten mit einer Schadigung zu rechnen haben, und verschiedene Beobachtungen weisen darauf hin, dai3 KaIber und Schafe besonders empfindlich sind.

Untersuchungen iiber das Vorkommen von Cholinesterase im Blut und Serum vom Schwein

Untersuchungen uber die Verteilung der Pseudocholinesterase bei Ferkeln und Schweinen (HINES und MCCANCE) ergaben fur Serum, Parotis, Sub- maxillaris und Leber bei erwachsenen Tieren etwa 2-4fach hohere Werte als bei Neugeborenen. Die durchschnittliche Aktivitat des Fermentes bei Ferkeln (unter 3 Tage alt) und bei erwachsenen Schweinen ist nachfolgend aufgefuhrt; eine Enzym-Einheit setzt in der Minute 1 pl CO2 bei der manometrischen Be- stimmung in Freiheit.

Serum Par o t i s Submaxillaris Leber E.-Einheiten E.-Einheiten E.-Einheiten E.-Einheiten

ml R R R

Ferkel : 5.4f0.7 178f 73 ll5f90 20f8 Schwein: 14.8*3.8 632&177 291k61 47k9

Eine annahernd gleich hohe Aktivitat war im Kolostrum und in der Milch von Sauen nachweisbar. Vergleichsweise zu den Werten fur die Speicheldriisen ist die Wirksamkeit des Fermentes in der Leber relativ niedrig, und dieser Be- fund spricht gegen die Bedeutung dieser Druse als Hauptbildungsstatte beim Schwein. Bei der Umrechnung in Enzym-Einheiten nach AMMON und ZAPP ergibt sich fur Ferkel ein Durchschnittswert von 0.7 Einheiten, fur Schweine ein solcher von 2 Einheiten.

Durch Vorversuche wurde zunachst der zeitliche Ablauf der Reaktion in Abhangigkeit von der Fermentkonzentration einer Untersuchung unterzogen, wobei entsprechende Ansatze zur Ermittlung der Leerwerte dienten; die Unter- suchungsergebnisse sind nachfolgend dargestellt:

E i n f l u i 3 d e r F e r m e n t k o n z e n t r a t i o n a u f d i e A k t i v i t a t d e r C h o l i n e s t e r a s e i m B l u t v o n S c h w e i n e n

ml Blut Zeit in Minuten im Ansatz 15 30 45 60

freigesetzte CO z-Menge in ,d

0.05 13 24 34 46 0.10 25 50 70 91 0.15 36 69 104 130 0.20 46 86 123 149

976 KOLB

Es ist ersichtlich, dai3 mit fortschreitender Reaktioii eine geringfugige Ab- nahme der Fermentaktivitat erfolgt, die mit zunehmender Konzentration des Blutes ansteigt. Als wesentlich erwies sich jeweils der Ansatz von Kontrollen, da durch die glykolytischen Fermente der Erythrocyten Milchsaure gebildet wird, die CO, aus dem Puffer freisetzt.

An Hand von 20 Blutproben, die unmittelbar bei der Schlachtung der Tiere entnommen wurden, wurden die Normalwerte der Cholinesterase im Blut und Serum festgelegt; die Ergebnisse sind in Tabelle 6 aufgefiihrt. Es ist ersichtlich, dai3 die Cholinesterase im Schweineblut vornehmlich m den Ery-

T a b e l l e 6 C h o l i n e s t e r a s e - A k t i v i t a t i m B l u t u n d S e r u m v o m S c h w e i n

durch 0.05 ml Blur durch 0.05 ml Serum Schwein Nr. in 60 Min. frei- in 60 Min. frei-

gernachtes COP gemachtes CO, A ,ul

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Schwankungsbreite : Mittelwert:

53 57 43 53 96 81 61 79 69 42

110 124 40 56 63 71 80 45 70

126 40-126

71

36 3 9 2! 9 25 48 37 33 46 40 25 46 63 22 25 3 8 3 6 46 :29 .39 '7 5

22-75 .39

throcyten lokalisiert ist; fur das Vollblut ergab sich dabei ein Mittelwert von 71 pl durch 0.05 ml Blut in 60 Min. freigesetzten Kohlendioxyds, dies ent- spricht 3.1 Einheiten; die Werte fur das Serum betrugen 39 pl CO, (1.7 Einh.).

In einer Reihe von Ansatzen wurde die Hemmbarkeit der Cholinesterase im Blut und Serum von Schweinen durch Metasystox und Diazinon gepruft. Die Versuchsanordnung war die gleiche, wie sie bei den Untersuchungen an Blut von Wiederkauern beschrieben wurde. Die Ergebnisse einer solchen Unter- suchung sind nachfolgend dargestellt (Tabelle 7):

In allen Fallen wurde durch die beiden Kontaktinsektizide eine vollige Hemmung der Serum-Cholinesterase erzielt; das Ferment der Erythrocyten zeigte eine erhebliche Einbui3e seiner Aktivitat. Das unterschiedliche Verhalten gegenuber bestimmten Hemmstoffen kann zur Trennung der 'Wirkung der spezifischen Cholinesterase der Erythrocyten und der Pseudo-Cholinesterase des Serums verwendet werden (AUGUSTINSSON 1948).

Vorkommen von Cholinesterase im Blut und Serum von Haustieren

T a b e l l e 7

v o m S c h w e i n d u r c h K o n t a k t i n s e k t i z i d e

977

D i e H e m m u n g d e r C h o l i n e s t e r a s e i m S e r u m u n d B l u t

durch 0.1 ml Blut durch 0.2 ml Serum in 60 Min. frei- in 60 Min. frei-

gemadxes CO, gemachtes CO, P1 PI

ohne Zusan + Metasystox + Diazinon

109 32 16

133 - -

Untersuchungen iiber das Vorkommen von Cholinesterase im Blut und Serum vom Pferd

Die Esteraseaktivitat im Pferdeserum zeigt vergleichsweise zu der der anderen Haustiere einen beachtlich hohen Wert, gemessen an Hand der Spal- tung von Tributyrin (KoLB). AMMON und Voss beobachteten im Rahmen von Untersuchungen der Cholinesterase naA Einwirkung von 0.01 ml Serum bei 6 Pferden eine COe-Entwicklung von 31-47 pl ; die Werte fur 0.01 ml Blut beliefen sich auf 20-36 pl CO,; sie liagen somit wesentlich hoher als bei den anderen Haustieren, nahezu im gleichen Bereich wie beim Menschen.

Fur vorliegende Untersuchungen standen 20 Blutproben von Pferden - durch Punktion der Vena jugularis gewonnen - zur Verfiigung. Die Ergeb- nisse sind nachfolgend zur Darstellung gebracht (Tabelle 8).

T a b e l l e 8 C h o l i n e s t e r a s e - A k t i v i t i t i m B l u t u n d S e r u m v o m P f e r d

durch 0.05 ml Blut durch 0.05 ml Serum Pferd Nr. in 60 Min. frei- in 6C hlin. frei-

gemachtes CO, gemaQtes CO, Pl Pl

1 89 156 2 159 245 3 112 190 4 179 191 5 232 360 6 122 196 7 244 390 8 151 187 9 139 180 10 170 222 11 167 198 12 163 259 13 259 283 14 179 260 15 59 79 16 238 339 17 187 214 18 176 200 19 159 217 20 166 204

Schwankungsbreite : 59-259 79-360 Mittelwert: 168 229

978 KOLB

Fur die Cholinesterase-Aktivitat im Blut von 20 Pferden ergab sich ein Mittelwert von 168 yl C0,/0.05 ml in 60 Min. (7.5 Einh.), fur die des Serums ein solcher von 229 pl CO, (10.2 Einh.). Die Aktivitat des Fermentes im Blut und Serum vom Pferd liegt somit erheblich hoher als bei den anderen Haus- tieren. Die Frage, welche biochemische Bedeutung solche Aktivitatsunterschiede haben, ist gegenwartig schwer zu beantworten, zumal die Meinungen uber die

T a b e l l e 9

D i e H e m m u n g d e r C h o l i n e s t e r a s e i m S e r u m u n d B l u t v o m P f e r d d u r c h K o n t a k t i n s e k t i z i d e

durch 0.05 ml Blut in 60 Min. frei- in 60 Min. frei-

gemachtes COz gemachtes CO, P1 P1

durch 0.05 ml Serum

ohne Zusatz + Metasystox + Diazinon

111 132 8 32 7 12

Rolle des Fermentes im Blut noch geteilt sind; immerhin wird man mit einer unterschiedlichen Empfindlichkeit gegenuber cholinesterasehemmeiiden Arznei- mitteln bzw. Giftstoffen zu rechnen haben.

Die Beeinflussung der Aktivitat der Cholinesterase durch Kontaktinsekti- zide beim Pferd ist aus nachfolgender Tabelle (Tab. 9) ersichtlidi: beide Pra- parate bewirkten eine erhebliche Hemmung des Fermentes.

Untersuchungen uber das Vorkommen von Cholinesterase im Blut und Serum vom Hund

Angaben uber die Cholinesterase-Aktivitat im Bhit und Serum von 3 Hunden liegen von AMMON und Voss vor: fur das Serum wurden C0,- Werte (pro 0.025 ml in 60 Min.) von 60, 55 und 54 pl, fur das B h t solche von 42, 34 und 40 jrl ermittelt.

T a b e l l e 10

C h o i i n e s t e r a s e - A k t i v i t a t i m B l u t u n d S e r u m vorn H u n d

durch 0.05 mi Biut in 60 Min. frei- in 60 Min. frei-

gemachtes C 0 2 gemnchtes CO,

durch C.05 ml Serum Hund Nr.

P1 P1

1 88 21 1 2 90 232 3 101 255 4 92 212 5 77 180

Mittelwert: 90 218 Schwankungsbreite: 77-101 180-255

Vorkommen von Cholinesterase im Blut und Serum von Haustieren 979

Fur die eigenen Versuche stand das Blut von 5 Hunden zur Verfugung; die Untersuchung der Aktivitat des Fermentes erfolgte wie beschrieben; die Ergeb- nisse sind aus Tabelle 10 ersichtlich.

Fur das Blut von Hunden ergab sich eine durchschnittliche Cholinesterase- Aktivitat von 90 pl CO pro 0.05 ml (4.0 Einh.); die Werte fur das Serum lagen erheblich hoher, sie getrugen durchschnittlich 218 pl CO, (9.7 Einh.); es ist so ersichtlich, dai3 die Erythrocyten beim Hund auflerordentlich wenig Cholinesterase enthalten.

Bei den bisher untersuchten Seren handelt es sich bei der Cholinesterase um ein Gemisch von unspezifischer (Pseudocholinesterase) und spezifischer Cholinesterase (Acetylcholinesterase) (MENDEL et al., HAWKINS und MENDEL). Im Serum von Mensch und Pferd dominiert die Pseudocholinesterase, hingegen enthalt Serum von Kaninchen hauptsachlich Cholinesterase. In diesem Zu- sammenhang erscheint eine Ge enuberstellung der Esteraseaktivitat des Serums

in nachfolgender Tabelle durchgefuhrt ist: von Haustieren gegenuber Tri t utyrin und Acetylcholin von Interesse, wie sie

T a b e l l e 1 1

Lipase- Aktivitat Cholinesterase- Aktivitat (Substrat: Tributyrin) (Substrat: Acetylcholin)

L.-Konstante Ch.-Einh.

Pferd Hund Schwein Kalb Rind Schaf

0.0269 10.2 0.0071 9.7 0.0016 1.7 0.0014 0.17 0.0017 0,15 0.0016 0.1

Die lipolytisch sehr aktiven Seren von Pferd und Hund zeigen auch die hochste Wirksamkeit bezuglich Spaltung von Acetylcholin. Uber den Anteil der verschiedenen Cholinesterasen im Serum von Haustieren sind weitere Untersuchungen wunschenswert.

Von Interesse ist noch die Ubertragung der in der Humanmedizin disku- tierten Vorstellungen uber die Bedeutung der unterschiedlichen Cholinesterase- Aktivitat im Serum auf die Verhaltnisse bei unseren Haustieren: Infolge der niedrigen Fermentaktivitat und der dadurch bedingten langsameren Zersto- rung von Acetylcholin wurde man bei Wiederkauern und Schweinen mit einem Uberwiegen des Parasympathikotonus zu rechnen haben; Pferde und Hunde dagegen konnten infolge ihrer hohen Cholinesterase-Aktivitat den Typ des Sympathikotonikers reprasentieren. Zwischen Sympathikus und Parasym- pathikus bestehen nicht nur antagonistische, sondern auch synergistische Be- ziehungen, wobpi ersterem System mehr die Rolle einer dissimilatorischen, letzterem mehr die einer assimilatorischen Funktion zukommt. Der Sym- pathikus mui3 unter gleichzeitigem Nachlassen des parasympathischen Tonus uberall dort in gesteigertem MaBe in Funktion treten (Sympathikotonus), wo Hochstleistungen gefordert werden, wie es bei Pferd und Hund zweifellos haufig der Fall ist.

Zusammenfassung

1. Die Bedeutung der Untersuchung der Cholinesterase im Blut bzw. Serum fur die klinische Chemie, im besonderen fiir die Diagnostik von Schadi- gungen durch bestimmte Kontaktinsektizide, wird aufgezeigt.

980 KOLB

2. Es wurden manometrische Untersuchungen uber die Nornialwerte der Cholinesterase im Blut und Serum von Haustieren durchgefuhrt und folgende Mittelwerte (in Cholinesterase-Einheiten nach IIMMON und ZAPP) gefunden:

Blut Ch.-Einh.

Serum Ch.-Einh.

Rind S&af Ziege Pferd Schwein Hund Kalb

3.4 1.5 0.8

0 15 0 1 0.06

7.5 10 2 3.6 1.7 4.0 5.2

9.7 0.17

Es besteht bei den untersuchten Haustieren, ahnlich wie beim Menschen, eine erhebliche physiologische Schwankungsbreite.

3. Durch Zusatz von Metasystox (Dimethyl-athylmerkapto-athylthio- phosphat) bwz. Diazinon (Thiophosphorsaure-[2-isopropyl-4-rnethyL pyrimidyl-61 -diaethylester) war in vitro eine vollige oder sehr erhebliche Hemmung der Cholinesterase des Blutes und Serums von Haustieren nachweisbar.

Summary

Studies on the presence of cholinesterase in the blood and serum of domestic animals (OX, sheep, goat, horse, pig and dog) and the effects on it of contact insecticides

(Metasystox and Diazinon)

1. The significance for clinical chemistry of studying the cholinesterase in the blood or serum, particularly in the diagnosis of injury due to particular contact insecticides, is indicated.

2. Manometric studies were carried out on the normal levels for cholin- esterase in the blood and serum of domestic animals, and the following were the mean values (expressed in cholinesterase units) according to AMMON and ZAPP.

Blood (units)

Serum (units)

ox Sheep Goat Horse Pig Dog Calf

3.4 1.5 0.8 7.5 3.6 4.0 5.2

0.15 3.1 0.06

10.2 1.7 9.7 0.17

There exist among the animals studied, as is the case in man, wid'e physio- logical variations.

Vorkommen von Cholinesterase im Blut und Serum von Haustieren 98 1

3. By adding Metasystox (dimethyl-ethylmerkapto-ethylthiophosphate) or Diazinon (thiophosphoric acid-[2-isopropyl-4-methyl-pyrimidyl-6]-di- ethylester) i t was possible to demonstrate i n v i t r o a complete or very considerable inhibition of the cholinestera5e in the blood and serum of domestic animals.

RCsumC Recherches sur la prksence de cholinesfCrase dans le sang et le sCrum de plusieurs animaux domestiques (boeuf, mouton, chhtvre, cheval, porc, hien) et l’influence

d’insecticides de contact (Metasystox et Diazinon) 1 . L’auteur signale I’importance des dosages de la cholinestkrase dans le sang,

resp. le skrum, pour la chimie clinique et en particulier pour le diagnostic des dommages occasionnks par certains inslecticides de contact.

2. I1 effectua des recherches manomktriques pour dkterminer les valeurs normales de la cholinestkrase dans le sang et le skrum des animaux domestiques, ce qui permit de dCterminer les valeurs moyennes suivantes (en unitks de cholinestkrase selon AMMON et ZAPP):

Sang SCrum (Unitis de Ch.) (Unites de Ch.)

Bceuf Mouton Ch&vre Cheval Porc Chien Veau

0,15 0,1 0,OG

10,2 1,7 997 0,17

Chez les animaux ktudik il existe, comme chez l’hmme, des variations physiologiques considkrables.

3. Aprks adjonction de Metasystox (thiophoshate de di-methyl-kthyl- mercapto-kthyl) resp. de Diazinon (kther-sel di-kthyl d‘acide thiophos- phorique-2-isopropyl-4-mkthyl-pyrimidyl-6) on put constater in vitro une inhibition complhte ou trhs importante de la cholinestkrase dans le sang et le skrum des animaux domestiques ktudiks.

Resumen Investigaciones sobre la presencia de colinesterasa en ka sangre y suer0 de 10s animales domCsticos (vaca, oveja, cabra, caballo, cerdo y perro) y su influjo por 10s

insecticidas de contacto (metasystox y diazinon)

1. Se describe la importancia del anilisis de la colinesterasa en sangre y suer0 para la quimica clinica, en especial para diagnosticar lesiones producidas por determinados insecticidas de contacto.

2. Se realizaron estudios manomktricos sobre 10s valores normales de colinesterasa en sangre y suer0 de 10s animales domksticos, hallindose 10s valores medios (expresados en unidades colinesterasa segdn AMMON y ZAPP) siguientes:

Zcntralblarr flir Vetermarmedizin, Band IV, Hefi 10 66

982 KOLB

sangre unidades col.

suer13 unidade:; col.

vaca oveja cabra caballo cerdo perro ternero

4,o 5 2

0,15

0,06 0,1

10,2 1-7 9,7 0,17

En 10s animales domksticos analizados existe, de forma anAloga a lo que occurre en el hombre, una considerable amplitud de oscilaci6n fisioMgica.

3. Mediante la adici6n de metasystox (tiofosfato dimetil-etil niercapto etilico) y diazinon (di8etil ester del Acid0 2-is0 propil 4 metil pirimidil-6 tiofosf6rico) se pudo demostrar “in vitro” la inhibici6a de la colinesterasa de la sangre y suer0 de 10s animales domksticos.

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