Untersuchungen zu den zytokinartigen Eigenschaften des ... · das endokrine Hormon Prolaktin fokussiert. Die Untersuchung der möglicherweise zytokin- Die Untersuchung der möglicherweise

Aus dem Institut für Immunologie und Transfusionsmedizinder Universität zu Lübeck

Direktor: Prof. Dr. med. H. Kirchner

Untersuchungenzu den zytokinartigen Eigenschaften

des Hormons Prolaktin

Inauguraldissertationzur Erlangung der Doktorwürde

der Universität zu Lübeck- aus der medizinischen Fakultät -

vorgelegt vonKatharina Cziupka

aus StadeLübeck, Mai 2007

1. Berichterstatter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . PD Dr. rer. nat. J. Luhm

2. Berichterstatter(in) . . . . . . . . . . . . . . . . . Prof. Dr. med. J. Steinhoff

Tag der mündlichen Prüfung . . . . . . . . . . . 14.5.2007

Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 14.5.2007

gez. Prof. Dr. med. Werner Solbach- Dekan der Medizinischen Fakultät -

¨THROUGHOUT THE UNIVERSE THERE REIGNS THE UNION OF OPPOSITES...¨

A. N. Whitehead, Adventures of Ideas, New York 196720th, S. 190

Abkürzungen

APC antigen presenting cell Antigen-präsentierende Zellebp base pairs BasenpaarecAMP cyclic adenosin monophosphate zyklisches AdenosinmonophosphatCD cluster of differentiation DifferenzierungsmustercDNA complementary DNA komplementäre DNAcptcAMP chlorophenylthio-cAMP Chlorophenylthio-cAMPCRE cAMP responsive element auf cAMP reagierende EinheitCREB CRE binding protein CRE bindendes ProteinDAR digital autoradiograph digitaler AutoradiographDEPC Diethyl pyrocarbonate DiethylpyrocarbonatDNA Deoxyribonucleic acid DesoxyribonukleinsäureEBNA Epstein-Barr Virus Nuclear Epstein-Barr Virus nukleäres

Antigen-1 Antigen-1ELISA enzyme-linked immuno sorbent

assayEnzym-Immunoassay

EMSA electrophoretic mobility shift assay Gel-Shift-AssayGAPDH Glycer aldehyde 3 phosphate

dehydrogenaseGlyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase

GAS Interferon γ activation site Interferon γ AktivierungsstelleGEArray Gene Expression Array GenexpressionsarrayGrb2 Growth factor receptor-bound

protein 2Wachstumsfaktorrezeptor-gebundenes Protein-2

IFN-γ Interferon γ Interferon γ

Ig immune globulin ImmunglobulinIL Interleukin InterleukinIRF-1 Interferon-Regulatory-Factor 1 Interferon-Regulations-Faktor-1Jak Janus kinase JanuskinaseLPS Lipopolysaccharide LipopolysaccharidMAPK Mitogen activated protein kinase Mitogen-aktivierte ProteinkinaseMHC major histocompatibility complex HaupthistokompatibilitätskomlexmRNA messenger RNA Boten-RNANA norepinephrine NoradrenalinNF-κB Nuclear factor κB nukleärer Faktor κB

III

PBMC peripheral blood mnonuclear cells mononukleäre Zellen des peripherenBlutes

PBS Phosphate buffered solution Phosphat-gepufferte LösungPCR Polymerase chain reaction Polymerase-Ketten-ReaktionPHA Phythaemagglutinine PhythämagglutininPit-1 Pituitary-specific transcription

factor-1Hypophysen-spezifischerTranskriptionsfaktor-1

PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate Phorbol-12-myristyl-13-acetat(h)PRL (humane) prolactin (humanes) ProlaktinPRLR Prolactin receptor ProlaktinrezeptorRNA Ribonucleic acid RibonukleinsäureRT-PCR reverse transcription-Polymerase

Chain ReactionReverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion

SD standard deviation StandardabweichungSH3 Src homology 3 domain Src-Homologie-3-DomäneSHP-1 Src homology 2-containing protein

tyrosine phosphatase-1Src-Homologie-2-enthaltendeTyrosinphosphatase-1

SIRS Systemic inflammatory responsesyndrome

Systemisches inflammatorischesResponse-Syndrom

SLE systemic lupus erythematosus systemischer Lupus erythematodesSOCS-1 Suppressor of cytokine signalling-1 Suppressor der Zytokin-vermittelten

Signaltransduktion-1Sp-1 Specificity protein-1 Spezifizitätsprotein-1STAT Signal transducer and activator of

transcriptionSignalübertrager und Transkriptions-aktivator

TH1 / TH2 T helper type 1 / 2 T-Helfer-Zellen Typ 1 / 2TIVA total intravenous anaesthesia totale intravenöse AnästhesieTLR4 Toll-like-receptor 4 Toll-like Rezeptor 4TNF Tumor-necrosis-faktor Tumor-Nekrose-FaktorTRH Thyreotropin-releasing-hormone Thyreotropin-Releasing-HormonVIP vasoactive intestinal polypeptide vasoaktives intestinales Polypeptid

IV

INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG 51.1 Allgemeines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51.2 Struktur und molekularbiologische Eigenschaften von Prolaktin . . . . . . 81.3 Bereits bekannte Orte der Prolaktinsynthese beim Menschen . . . . . . . . 10

1.3.1 Prolaktinsynthese in der menschlichen Plazenta, Dezidua und Endo-metrium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.3.2 Prolaktinsynthese in der menschlichen Glandula mammaria . . . . 111.3.3 Prolaktinsynthese im Immunsystem . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

1.4 Prolaktinrezeptoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111.4.1 Struktur des Prolaktinrezeptors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111.4.2 Exprimierung des PRL-Rezeptors in unterschiedlichen Geweben . . 121.4.3 PRLR-Isoformen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141.4.4 Aktivierung des Prolaktinrezeptors . . . . . . . . . . . . . . . . . 151.4.5 Mit dem Prolaktinrezeptor assoziierte Signaltransduktion . . . . . . 15

1.5 Immunmodulatorische Wirkung von Prolaktin . . . . . . . . . . . . . . . . 191.5.1 Spezifische und unspezifische Immunantwort . . . . . . . . . . . . 191.5.2 Immunologische Bedeutung der Zytokine TNF-α, IFN-γ, IL-12 und

IL-10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211.5.3 Wirkung von Prolaktin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211.5.4 PRL als Mitogen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221.5.5 PRL als antiapoptotischer Faktor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

1.6 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

2 MATERIAL UND METHODEN 252.1 Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2.1.1 Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 252.1.2 Laborbedarf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 272.1.3 Zellkultur-Reagenzien, -Medien und -Zusätze . . . . . . . . . . . . 292.1.4 Reagenzien für molekularbiologische Methoden . . . . . . . . . . 292.1.5 Immunologische Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 302.1.6 Testkits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 302.1.7 Chemikalien und sonstige Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . 31

2.2 Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 322.2.1 Zellpräparationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

1


2.2.2 Zellkulturverfahren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 332.2.3 Präparation von Kernextrakten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342.2.4 Überstände . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 352.2.5 RNA-Extraktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 352.2.6 EMSA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 362.2.7 Dotbloting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 392.2.8 ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) . . . . . . . . . . . 402.2.9 Elecsys . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 412.2.10 Nachweis der messenger RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 422.2.11 Auswertung der Ergebnisse / Statistik . . . . . . . . . . . . . . . . 45

3 ERGEBNISSE 473.1 Wirkung von Prolaktin auf Immunzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

3.1.1 Einfluss von Prolaktin auf die Zytokinproduktion (IL-12, TNF-α,IL-10) im Vollblutansatz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

3.1.2 Einfluss von PRL auf die IFN-γ-Freisetzung durch Vollblutzellen . 513.1.3 Einfluss von PRL auf die Kerntranslokation von (NF-κB und IRF-1) 523.1.4 Einfluss von PRL auf die Aktivierung von STAT5b in PBMC . . . . 56

3.2 Prolaktinsynthese durch PBMC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 573.2.1 Versuch des Nachweises einer möglichen PRL-Synthese auf Ebene

der Transkriptionsfaktoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 583.2.2 Versuch des Nachweises einer möglichen PRL-Synthese auf Ebene

der mRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 603.2.3 Versuch des Nachweises auf Ebene des Proteins . . . . . . . . . . . 69

4 DISKUSSION 714.1 Einfluss von hypophysärem Prolaktin auf das Immunsystem . . . . . . . . 71

4.1.1 Aktivierung von IRF-1 durch PRL . . . . . . . . . . . . . . . . . . 734.1.2 Aktivierung von NF-κB durch PRL . . . . . . . . . . . . . . . . . 754.1.3 Einordnung der eigenen Ergebnisse zur Beeinflussung von IRF-1

und NF-κB durch PRL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 754.1.4 Beeinflussung der Zytokinsynthese durch PRL . . . . . . . . . . . 784.1.5 Zustände von Hyperprolaktinämie und mögliche klinische Bedeu-

tungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 794.1.6 Zusammenfassende Darstellung des Einflusses von PRL auf das Im-

munsystem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

2


4.2 Prolaktinsynthese durch PBMC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 834.2.1 Aktivität der Transkriptionsfaktoren in Kernextrakten aus PBMC be-

züglich der Bindung an den Prolaktin-Promotor . . . . . . . . . . . 854.2.2 Untersuchung von PBMC auf PRL-mRNA mittels GEArray und RT-

PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 864.2.3 Untersuchung der Überstände von PBMC-Kulturen auf PRL mittels

ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 874.2.4 Zusammenfassende Darstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 884.2.5 Diskussion von autokrinen und parakrinen Wirkungen von mögli-

cherweise in PBMC synthetisiertem PRL . . . . . . . . . . . . . . 884.3 Wirkung von hypophysärem PRL auf die Synthese von PRLR in PBMC . . 894.4 Prolaktin - ein Zytokin ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

5 ZUSAMMENFASSUNG 92

APPENDIX 94

A Protokolle 94A.1 Isolierung von PBMC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

A.1.1 Lösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94A.1.2 Protokoll . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

A.2 Protokoll zur Herstellung von Kernextrakten . . . . . . . . . . . . . . . . . 95A.2.1 Erforderliche Reagenzien: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95A.2.2 Protokoll: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

A.3 Bestimmung des RNA-Gehaltes einer Probe . . . . . . . . . . . . . . . . . 96A.4 Bandshift-Experimente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

A.4.1 5´-32P-Oligonukleotidlabeling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96A.4.2 Bindereaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97A.4.3 Bandshift-Gel und nachfolgende (digitale) Autoradiographie . . . . 99

A.5 Genexpressions-Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101A.5.1 Protokoll zur Herstellung der benötigten Lösungen . . . . . . . . . 101A.5.2 GEArray ASSAY Protokoll . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101A.5.3 Hybridisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103

B Eigene Publikationen und Kongressbeiträge 104

C Danksagung 105

3


D Lebenslauf 106

ABBILDUNGSVERZEICHNIS 108

LITERATUR 110

4

1 EINLEITUNG

1 EINLEITUNG

1.1 Allgemeines

Einen enormen Fortschritt in der Evolution stellte die Entwicklung von vielzelligen Lebewe-sen dar, deren Einzelkomponenten arbeitsteilig organisiert sind. Eine unabdingbare Voraus-setzung für diesen Schritt der Entwicklung war das Entstehen eines diffizilen Systems derSignalübermittlung von Zelle zu Zelle aber auch von Organ zu Organ.Dieses System der interzellulären Signalübermittlung wird zum einen durch das Gefüge derHormone und Zytokine sowie zum anderen bei höheren Lebewesen durch das Nervensystemrepräsentiert.Das Wort “Hormon” kommt von griechisch “horman”, was “erregen” bedeutet. Der Begriffwurde in dem Vortrag “The Chemical Correlations of the Functions of the Body”, den derenglische Physiologe Ernest Henry Starling 1905 hielt, eingeführt. Doch schon Claude Ber-nard prägte die Vorstellung von Hormonen als Signal des Körperinneren, indem er 1855 dieinnere Sekretion via Blut von der äußeren Sekretion über Schweiß und Tränen abgrenzte[43].

Hormone und Zytokine sind nach der heute vorherrschenden Lehrmeinung zumeist extrazel-luläre Signalmoleküle, die mit einem Rezeptor auf einer Zielzelle, der meist ein integralesMembranprotein darstellt, in Wechselwirkung treten. Darauf folgt die Bildung eines intra-zellulären Signalmoleküls, das über eventuelle Zwischenschritte zu dem Effekt des Hormonsan der Zielzelle führt. Signalauslöschung geschieht meist durch intrazelluläre Inaktivierungdes Signalmoleküls [46].

Klassischerweise unterscheidet man glanduläre Hormone, Gewebshormone und Zytokine.Dabei werden die glandulären Hormone von endokrinen Drüsen wie Hypophyse, Langer-hans’sche Inseln des Pankreas, Schilddrüse, Nebenschilddrüse, Nebenniere, Keimdrüse undPlazenta gebildet, an das Blut abgegeben und gelangen so zu ihren Zielzellen. Auf diesemWeg vermitteln sie zwischen räumlich u.U. weit getrennten Organen. Hier regulieren sie ver-schiedenste Stoffwechselwege.

Gewebshormone werden von spezialisierten Zellen synthetisiert, die in verschiedensten Ge-weben verstreut sind. Ihre Wirkung geschieht über den Blutweg, parakrin oder autokrin.Wichtige Vertreter sind Amine, Kinine, Eikosanoide und die gastrointestinalen Hormone[46].

5

1.1 Allgemeines 1 EINLEITUNG

Zytokine sind Polypeptide, die als Reaktion auf Mikroorganismen und andere Antigene pro-duziert werden und Immun- und Entzündungsreaktionen vermitteln. Trotz ihrer strukturellenVerschiedenheit sind ihnen folgende Eigenschaften gemeinsam (nach [1]):

1. Die Zytokin-Sekretion ist ein kurzer, selbstlimitierender Prozess. Die Zytokine sindnormalerweise nicht als präformierte Moleküle gespeichert und ihre Synthese ist ge-wöhnlich durch Transkription nach vorausgehender Zellaktivierung geregelt. Anschlie-ßend werden Zytokine schnell sezerniert und schlagartig freigesetzt.

2. Die Wirkungen der Zytokine sind pleiotrop, d.h., ein Zytokin wirkt auf verschiedeneZelltypen, und redundant, d.h., einen bestimmten Effekt können mehrere Zytokinelosgelöst voneinander bewirken.

3. Zytokine beeinflussen oft die Synthese und die Eigenschaften anderer Zytokine.

4. Zytokine entfalten ihre Wirkung meist lokal eng begrenzt an einer immunologischenSynapse, aber bei massiver Freisetzung ist auch ein Übertritt in die Blutbahn mit Wir-kung über längere Distanz im Sinne einer systemischen Wirkung wie im Rahmen einerSepsis möglich.

5. Die Wirkung wird durch Bindung an spezifische Membranrezeptoren auf Zielzellenvermittelt, wobei die Dissoziationskonstanten zwischen 10−10 bis 10−12 M liegen.Durch diese starke Bindung reichen oft nur geringe Mengen eines Zytokins aus, umeinen biologischen Effekt zu erzielen.

6. Äußere Signale regulieren die Expression von Zytokinrezeptoren und damit die Emp-findlichkeit der Zielzelle für das Zytokin. Dies ist unabdingbar für die Spezifität desImmunsystems, da Zytokine nicht antigenspezifisch sind.

7. Die zelluläre Antwort auf die meisten Zytokine beruht auf einer Änderung der Genex-pression von Zielgenen.

Folgerichtig besteht eine scharfe Trennung zwischen endokrin wirkenden Hormonen undZytokinen. Vielfach wurden jedoch in letzter Zeit endokrinen Hormonen zytokinartige Ei-genschaften zugesprochen, sodass sich die Frage stellt, ob die Trennlinie wirklich existiertoder ob es Hormone gibt, die gleichzeitig alle Eigenschaften von Zytokinen erfüllen können.In der Literatur ist von einigen solchen Hormonen berichtet, wobei sich das Interesse v.a. aufdas endokrine Hormon Prolaktin fokussiert. Die Untersuchung der möglicherweise zytokin-artigen Eigenschaften dieses Hormons ist Thema dieser Arbeit.

6

1.1 Allgemeines 1 EINLEITUNG

Prolaktin (PRL) ist ein Polypeptid, von dem zahlreiche verschiedene Funktionen im Lau-fe der Phylogenese bekannt sind. Diese beziehen sich vor allem auf die Reproduktion, sodass man die Wirkungen des Prolaktins zusammenfassend als Schaffung der Voraussetzungfür die Brutpflege betrachten kann [70]. Im Rahmen der Ausübung dieser Funktion ist dasZielorgan bei den meisten Säugern und ganz besonders auch beim Menschen die Brustdrüse(Glandula mammaria), wo das Hormon - ein optimales hormonales Milieu vorausgesetzt -Galaktogenese und Galaktopoese bewirkt. Diesen schon lange bekannten Funktionen ver-dankt Prolaktin seinen Namen.PRL übt viele weitere Effekte auf die unterschiedlichsten Gewebe und Organe aus. Bei Wir-beltieren sind über 300 verschiedene Funktionen von PRL beschrieben. Es ist in verschiede-nen Organen wichtige Voraussetzung für die Differenzierung der organspezifischen Zellen,so z.B. in der Glandula mammaria, dem Ovar, der Prostata, den Tränen- und Speicheldrü-sen, dem Pankreas und der Leber [33]. PRL ist zudem ein Regulator für das Ausmaß derProliferation verschiedener Zelltypen u.a. der Mammaepithelien [66], Betazellen des Pan-kreas [13], Astrozyten [22], Zellen im Hypophysenvorderlappen [42], Adipozyten [59] undT-Lymphozyten [78].

Humanes Prolaktin (hPRL) wird von den laktotropen Zellen des Hypophysenvorderlappensproduziert. Inhibitorisches Prinzip stellt Dopamin dar, das ständig von hypothalamischendopaminergen Zellen ausgeschüttet wird. Daraus ergibt sich, dass Neuroleptika, die das do-paminerge System hemmen, erhöhte Prolaktinspiegel im Serum bewirken.

Stimulierend auf die PRL-Ausschüttung können Thyreotropin-Releasing-Hormon (TRH),vasoaktives intestinales Polypeptid (VIP), Angiotensin und β-Endorphin wirken [70].

Zudem führt Reizung der Mechanorezeptoren der Mamille über Ausschüttung von PRL-Releasing-Hormonen zu einer vermehrten hypophysären PRL-Sekretion. Dieser Prozess istv.a. in der Stillzeit von immenser Bedeutung. Ein weiterer Trigger für die Freisetzung vonPRL aus der Hypophyse ist Stress. Auch Narkotika - hier v.a. Opioide - können Zuständevon Hyperprolaktinämie bedingen.

Auch die Synthese und Sekretion von hPRL ist nicht wie lange Zeit angenommen auf dieAdenohypophyse beschränkt, sondern viele Gewebe und Organe des menschlichen Organis-mus wie Plazenta, Glandula mammaria und eventuell auch das Immunsystem [26] scheinendiese Fähigkeit zu besitzen. So wurde schon der Name Omnipotin für dieses außerordentlichinteressante Hormon vorgeschlagen [4].

7

1.2 Struktur und molekularbiologische Eigenschaften von Prolaktin 1 EINLEITUNG

Normalwerte für Prolaktin im Plasma liegen für Männer bei 0-11 ng/ml und für Frauen bei2-16 ng/ml. Die Ausschüttung unterliegt einem zirkadianen Mechanismus mit hohen Spie-geln in der Nacht-Schlafphase. Die Halbwertszeit beträgt ca. 20 min [23]. Bei Patienten mitPRL-sezernierenden Hypophysentumoren werden nicht selten PRL-Serumkonzentrationenvon 1000 ng/ml erreicht.

1.2 Struktur und molekularbiologische Eigenschaften von Prolaktin

Basierend auf genetischen, strukturellen und funktionellen Eigenschaften gehört Prolaktinzur Gruppe der Prolaktin / Wachstumshormon / Plazentares Laktogen-Familie, deren kodie-rende Gene alle auf ein etwa 400 Millionen Jahre altes Gen zurückgehen, aus dem sie durchGenverdopplung entstanden sind [60].

PRL wird im menschlichen Genom von einem Gen auf Chromosom sechs kodiert, das aus10 Kilobasen besteht und sich in fünf Exons und vier Introns gliedert [76]. Berwaer et al.konnten zeigen, dass die Transkription von PRL durch zwei verschiedene Promotoren un-abhängig voneinander bewirkt werden kann [6], wobei der Ort des Ablesens den Promotorbestimmt.

Das Ablesen der PRL-Desoxyribonukleinsäure (DNA) in der Hypophyse ist streng an dieAnwesenheit des Pituitary-specific transcription factors 1 (Pit-1) gebunden. Pit-1 ist einTranskriptionsfaktor, der spezifisch für die Hypophyse ist. Er reguliert hier die Expressionvon Wachstumshormonen, TSH und PRL. Die regulatorische DNA-Sequenz für die hypo-physäre PRL-Synthese liegt auf dem Exon 1b des PRL-Gens.

Die mRNA von PRL aus extrahypophysären Syntheseorten wie der Plazenta ist 150 Nukleo-tide länger als die in hypophysären Zellen entstehende. Dennoch ist das resultierende Peptidplazentaren Ursprungs nicht von dem hyophysären Ursprungs zu unterscheiden, was durchposttranslatorische Modifikation bedingt sein könnte [29]. Dem entspricht eine weitere nichttranslatierte Region in 5’-Richtung. Di Matta et al. [24] fordern daher die Existenz eines wei-teren Prolaktin-Promotors auf einem Exon in 5’-Richtung, das meist als Exon 1a bezeichnetwird. Berwaer et al. lokalisierten das Exon 1a bei 5840 bp in 5’-Richtung von dem Beginndes Exons 1b entfernt und fanden bei 375/-212 bp Bindungsstellen für lymphozytäre Pro-teine [6]. Ferner stellten sie fest, dass die Aktivität dieses Promotors unabhängig von Pit-1

8

1.2 Struktur und molekularbiologische Eigenschaften von Prolaktin 1 EINLEITUNG

ist. Dieses steht im Einklang mit der Feststellung von Gellersen et al. [28], dass extrahypo-physäre Freisetzung von PRL nicht von Stimulantien der Hypophyse wie TRH, epidermalgrowth factor oder Bromocritpin beeinflusst wird, sehr wohl aber von Glukokortikoiden undzyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP). Berwaer et al. fanden in der Promotorregionfür extrahypophysäres Prolaktin cAMP responsive elements (CREs) (TgACg) u.a. in der Nä-he der TATAA-Box (-20 bis 25) [6] (siehe Abbildung 1).

−100

A CAg CAA AAA CAg gAA gTT CAC TCT gTA AgC TTC TCC CAC CCT TCT

CCC CTg AAg CAg gCC ATA AAA gAA TCC TC T gAC g TT TCT ATA AAg TAg

gTT CA−1

T A

Abbildung 1: Ausschnitt aus der Sequenz des Exon 1a Promotors; cAMP responsive element

gelb unterlegt; Abbildung nach [6]

Die hPRL-cDNA ist 914 Nukleotide lang, das Prohormon 227 Aminosäuren mit einemSignalpeptid aus 28 Aminosäuren, so dass das fertige hPRL eine Länge von 199 Amino-säuren erreicht [26]. Das Molekül ist aus einer Aminosäuren-Kette mit drei intramolekula-ren Disulfidbrücken zwischen sechs Cystein-Resten aufgebaut (Cys4 Cys11, Cys58 Cys174,Cys191 Cys199). Die Molekülmasse von hPRL beträgt etwa 23.000 Dalton. 50% der Ami-nosäuren bilden α-Helices, und der Rest bildet Schleifen. Man nimmt an, dass die Strukturvon hPRL im Raum durch vier lange α-Helices in antiparalleler Anordnung gebildet wird[40] (siehe Abbildung 2).

Neben der vorherrschenden 23.000 Dalton schweren Form des hRPL existieren verschiede-ne Varianten, die zum einen durch alternatives Spleißen, vielmehr jedoch durch proteoly-tisches Schneiden generiert werden, wobei eine 14-, 16- und 22 Kilodalton schwere Formentstehen kann. Die genaue Bedeutung dieser Proteolyseprodukte ist bisher wenig bekannt.Weiter können Makroprolaktine durch Dimerisation und Polymerisation oder durch Bindungan Proteine wie Immunglobuline (Igs) entstehen. Die hochmolekularen Varianten des hPRLsind im Allgemeinen biologisch weniger aktiv. Ebenfalls wird durch Phosphorylierung undGlykolysierung die biologische Aktivität des hPRL herabgesetzt. Eine mögliche Erklärungfür die herabgesetzte biologische Aktivität hochmolekularer Prolaktine könnte eine Spei-cherfunktion sein.

9

1.3 Bereits bekannte Orte der Prolaktinsynthese beim Menschen 1 EINLEITUNG

Abbildung 2: Molekulare Struktur von PRL; links die Vorderseite und rechts die Rückseite derProlaktinstruktur niedrigster Energie; Abbildung entnommen aus [40]

1.3 Bereits bekannte Orte der Prolaktinsynthese beim Menschen

Wie bereits erwähnt ist der Hypophysenvorderlappen bekanntester Ort der Prolaktinsynthe-se. Ontogenetisch stammen die laktotropen Zellen zusammen mit den somatotropen undthyrotropen von einer Pit-1-abhängigen Zelllinie hypophysärer Zellen ab.

Im Hypothalamus von Ratten wurde Prolaktinsynthese-Aktivität in den dorsomedialen, ven-tromedialen, supraoptischen und paraventrikulären Kernen nachgewiesen [26]. Wahrschein-lich geht die Synthese im Hypothalamus unabhängig von der hypophysären Synthese von-statten. Stimulierend wirken Steroidhormone aus dem Ovar, Angiotensin II und VIP. Diebiologische Bedeutung dieses Prozesses ist weitgehend unbekannt.

1.3.1 Prolaktinsynthese in der menschlichen Plazenta, Dezidua und Endometrium

Die Plazenta ist schon seit langem als ein Syntheseort prolaktinartiger Proteine (Prolactinlike proteins, PLP) bekannt. Diese sind jedoch strukturell nicht identisch mit hPRL [26].

Endometriumzellen in der Proliferationsphase können durch Progesteron vermittelt hPRLsynthetisieren. Ebenfalls sind hierzu Stromazellen von dezidualisiertem Endometrium wäh-rend der frühen und späten Schwangerschaft befähigt. Diese Zellen reagieren dabei beson-

10

1.4 Prolaktinrezeptoren 1 EINLEITUNG

ders auf eine intrazelluläre Erhöhung des Spiegels an cAMP mit einer vermehrten Prolaktin-ausschüttung, während eine alleinige Stimulation mit Progesteron keinen Effekt zeigt [74].

1.3.2 Prolaktinsynthese in der menschlichen Glandula mammaria

Zellen der weiblichen Brustdrüse in der Laktationsphase können zum einen hypophysäresProlaktin aufnehmen zum anderen aber auch selbst synthetisieren. In der Milch findet sichzum Teil hypophysäres Prolaktin, aber auch hPRL, das in der Glandula mammaria selbstsynthestisiert wurde. Der Darm des Neonaten kann während eines kurzen Zeitintervalls in-takte Proteine absorbieren, sodass etwa 20% des Prolaktins in der Milch die Zirkulation desNeugeborenen erreichen. Dem hPRL in der Milch wird eine wichtige Funktion bei der Rei-fung des neuroendokrinen Systems und des Immunsystems zugeschrieben [26].

1.3.3 Prolaktinsynthese im Immunsystem

Schon 1989 berichtete Russell erstmalig von einem Prolaktin-ähnlichen Produkt aus Lym-phozyten [67]. T-Zell Aktivatoren wie Phythämagglutinin (PHA) und Phorbol-12-myristyl-13-acetat (PMA) sowie eine erhöhte Konzentration an intrazellulärem cAMP scheinen hier-bei den Promotor für Prolaktin in Lymphozyten zu aktivieren [64]. Auch von ProstaglandinE2 als einem Stoff, der über eine Erhöhung des cAMP-Spiegels wirkt, ist berichtet, dass esin mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) eine Synthese von PRL bewirkensoll [30]. Neueste Ergebnisse zeigen, dass TNF-α den extrahypophysären PRL Promotor inleukämischen Zellen aktiviert, allerdings scheint der Mechanismus hierfür nicht eine Akti-vierung von NF-κB sondern von Proteinkinase C zu sein [31].

Welche Bedeutung dem von Immunzellen synthetisierten PRL zukommen könnte, ist bishernicht bekannt. Vor allem die Frage, ob PRL in biologisch relevantem Ausmaß vom Immun-system selbst gebildet werden kann, bedarf weiterer Untersuchungen.

1.4 Prolaktinrezeptoren

1.4.1 Struktur des Prolaktinrezeptors

Der Prolaktinrezeptor ist ein einfaches membrangebundenes Protein, das zur Klasse I derZytokinrezeptor-Superfamilie gehört. Diese Superfamilie umfasst Rezeptoren für verschie-dene Interleukine, Granulocyte-Colony Stimulating Factor (G-CSF), Granulocyte Macrophage-

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Colony Stimulating Factor (GM-CSF), Erythropoietin (EPO) u.a. Zytokinrezeptoren vomTyp I - auch Hämopoietin-Rezeptoren - enthalten eine oder mehrere Domänen mit zwei kon-servierten Paaren von Cystein-Resten und einer proximal zur Membran gelegenen Sequenzvon Tryptophan - Serin - X - Tryptophan - Serin (WSXWS), wobei X eine beliebige Amino-säure darstellt. Solche Rezeptoren binden klassischerweise Zytokine, die aus vier α-Helicesaufgebaut sind (siehe Abbildung 3).

Abbildung 3: Schema eines Zytokinrezeptors vom Typ I

Die konservierten Eigenschaften des Rezeptors bilden Strukturen, die die α-Helices der Zy-tokine binden, während die spezifischen Eigenschaften der einzelnen Zytokine durch Ami-nosäurereste bestimmt werden, die von Rezeptor zu Rezeptor differieren.Der Prolaktinrezeptor besteht aus einer extrazellulären, einer 24 Aminosäuren langen trans-membranären und einer intrazellulären Domäne.Die extrazelluläre Domäne kann entsprechend dem o.g. in eine Subdomäne D1 (NH2-terminal)mit konservierten Disulfidbrücken zwischen Cysteinresten und eine membranproximale Sub-domäne D2 mit WSXWS-Motiv unterteilt werden. Die Funktion der transmembranären Do-mäne bei der Aktivierung des Prolaktinrezeptors ist bisher unbekannt. So gut wie alle Iso-formen des Prolaktinrezeptors besitzen in der intrazellulären Domäne eine Box 1, währenddie Box 2 bei der kurzen Isoform fehlt [26]. Box 1 ist eine membranproximale Region, dieaus acht Aminosäuren besteht und reich an Prolin- und hydrophoben Resten ist. Die Box 2ist weniger konserviert als Box 1 [7].

1.4.2 Exprimierung des PRL-Rezeptors in unterschiedlichen Geweben

Prolaktinrezeptoren (PRLRs) finden sich auf fast allen Zellen des menschlichen Körpers, soauch auf vielen peripheren Zellen des Immunsystems sowie in Thymus, Milz, Lymphknoten

12


und Knochenmark [45]. Tabelle 1 bietet eine Zusammenstellung der Zellen und Gewebe, indenen PRLRs exprimiert werden.

Zelle bzw. Gewebe Zelle bzw. Gewebe Zelle bzw. Gewebe

Zentrales Nervensystem Niere HerzGehirn Rinde Herzmuskel

Rinde Lymphatisches Gewebe VorhofHippocampus Milz SkelettmuskelPlexus choroideus Thymus Braunes FettgewebeStriatum Helferzellen LeberDuctus cochlearis Epitheliale Zellen HepatozytenCorpus callosum Lymphozyten Kupffer-ZellenHypothalamus T Glandula submandibularisAstrozyten B Glandula submaxillarisGliazellen Makrophagen Pankreas

Retina Ganglien Langerhans’sche InselnOlfaktorisches System Intestinale Zellen Gastrointestinaler Trakt

Ganglien Sexualorgane ÖsophagusHypophyse Weiblich Magen

Vorderlappen Ovar DarmIntermediärlappen Ovum Duodenum

Nebennierenrinde Granulosazellen JejunumHaut Thekazellen Ileum

Epidermis Corpus luteum ColonHaarfollikel Tuba uterina SexualorganeSchweißdrüsen Glandula mammaria männlich

Knorpel und Knochen Epitheliale Zellen TestisChondrozyten Milch GerminalzellenKnorpelsubstanz Tumoren SpermatozoenOsteoblasten Uterus Leydig-Zellen

Lunge Endometrium Sertoli-ZellenPlazenta EpididymisAmnion Vesicula seminalis

Prostata

Tabelle 1: Zusammenstellung der Organe und Gewebe, in de-nen PRLRs exprimiert werden; Tabelle entnommen aus [7]

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Unter den peripheren Zellen des Immunsystems exprimieren T- und B-Lymphozyten PRL-Rezeptoren. Durch PRL oder IL-2 induzierte Aktivierung dieser Zellen nimmt die Dichtean PRLR an der Oberfläche zu [18]. Sun et al. konnten 2004 zeigen, dass vermutlich auchNK-Zellen Rezeptoren für PRL an ihrer Membran besitzen. PRL kann NK-Zellen in Kosti-mulation mit IL-2 oder IL-15 aktivieren [72].

1.4.3 PRLR-Isoformen

Das Gen, das für den Prolaktinrezeptor kodiert, liegt auf Chromosom 5 und enthält 10 Exons.Die Synthese der Rezeptoren geschieht je nach Gewebe über drei verschiedene Promotoren.Die unterschiedlichen Isoformen der Prolaktinrezeptoren differieren in ihrer zytoplasmati-schen Domäne, während die extrazelluläre Domäne identisch ist. Abhängig von der Anzahlder Aminosäuren, aus denen die zytoplasmatische Domäne besteht, unterscheidet man einelange, eine intermediäre und eine kurze Isoform des PRLR. Zudem ist eine lösliche Isoformdes PRLR bekannt (PRL binding protein, PRLbp), die nicht in der Zellmembran verankertist [7] (siehe Abbildung 4).

Abbildung 4: Isoformen des PRLR; alle Isoformen besitzen eine identische extrazelluläre Domäne,

die den Liganden bindet. Subdomäne D1 enthält zwei Cystein-Paare (C-C), Subdomäne D2 das WS-

Motiv (als grüne Box dargestellt). Box 1 (organe dargestellt) findet sich in der zytoplasmatischen

Domäne aller Isoformen. Abbildung entnommen aus [7]

14


1.4.4 Aktivierung des Prolaktinrezeptors

Jedes Prolaktin-Molekül besitzt zwei Bindungsstellen (Binding Sites). Zunächst bindet Bin-dungsstelle 1 (Helices 2 und 4) an das Rezeptor-Molekül. Diese Interaktion ist Bedingung fürdie Bindung von Bindungsstelle 2 (Helices 1 und 3) an ein weiteres Rezeptor-Molekül unterHomodimerisierung des Rezeptors. Es resultiert ein trimerer Komplex aus zwei Rezeptor-Molekülen und einem Prolaktin-Molekül [26], siehe Abbildung 5.

Abbildung 5: Räumliche Struktur und Bindungsstellen von PRL und des PRLR;

(A) Bindungsstellen des PRL-Moleküls für den PRL-Rezeptor

(B) 3-D Struktur des Rezeptors; die Bindungsstelle für das PRL-Molekül ist mit Binding Site gekenn-

zeichnet; Abbildung entnommen aus [7]

Die intrazelluläre Domäne des Prolaktinrezeptors ist mit einer Tyrosinkinase namens Janus-kinase 2 (Jak2) assoziiert, die vermutlich über ein Adapterprotein mit der src kinase homo-logy domain 3 (SH3) der Box 1 verbunden ist. Durch den engen räumlichen Kontakt bei derDimerisierung kommt es zur Transphosphorylierung der Januskinasen. Diese phosphorylie-ren anschließend Tyrosinreste des Prolaktinrezeptors (siehe Abbildung 6).

1.4.5 Mit dem Prolaktinrezeptor assoziierte Signaltransduktion

1.4.5.1 Signaltransduktion über Signal transducers and activators of transcription(STATs): Zunächst interagieren die phosphorylierten Tyrosinreste des aktivierten Zyto-kinrezeptors mit der src homology 2 (SH2)-Domäne von zytoplasmatischen Proteinen na-mens Signal transducers and activators of transcription (STATs) wie in 1.4.4 beschrieben.

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Abbildung 6: Mechanismus der Prolaktinrezeptor-Aktivierung;Aktivierung des PRLR durch Homodimerisierung zweier Rezeptoren nach Bindung eines PRL-Moleküls; Abbildung entnommen aus [26]

Diese werden anschließend durch Rezeptor-assoziierte Januskinasen phosphoryliert, was zuHomo- und Heterodimerisierung der STATs unter Beteiligung der SH2-Domänen führt. DieDimere können in den Kern translozieren, wo sie Transkriptionsfaktoren, wie Nucelar fac-tor κB (NF-κB) und Interferon-Regulatory-Factor 1 (IRF-1) aktivieren. Bindungsstellen anPromotoren finden sich für IRF-1 u.a. an dem Interleukin (IL)-12 p40 Gen-Promotor und fürNF-κB am Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-α-Promotor.Dieser oben beschriebene Reaktionsweg wird meist von Zytokinen eingeschlagen, die vonT-Zellen nach Antigenkontakt freigesetzt werden und ist der wichtigste im Zusammenhangmit Signaltransduktion über den Prolaktinrezeptor (siehe Abbildung 8).Im Rahmen der Signaltransduktion über den Prolaktinrezeptor sind STAT1, STAT3 und v.a.STAT5 von Interesse [35]. Eine Übersicht über die STATs bietet Tabelle 22.

Von STAT5 sind zwei Isoformen, STAT5a und STAT5b, bekannt. Die Sequenzen dieser bei-den Moleküle zeigen eine Übereinstimmung von etwa 95%. Der entscheidende Unterschiedliegt in den 8 C-terminalen Aminosäuren, zudem ist STAT5b am C-terminalen Ende 12 Ami-nosäuren kürzer als STAT5a [47].Ein wichtiger negativer Regulator der Aktivierung von STAT5 ist die Src homology 2-

containing protein tyrosine phosphatase-1 (SHP-1). Dieses Protein wird v.a. in hämatopoe-tischen Zellen, aber auch PBMC exprimiert. SHP-1 bindet dabei an den PRL-Rezeptor /Jak2-Komplex, was zur Phosphorylierung C-terminaler Tyrosinreste führt. Dadurch werden

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STAT beteiligte Zytokine Phänotyp der jeweiligen knockout-MausSTAT1 Interferon α/β, Defekt der angeborenen Immunität;

Interferon γ keine Antwort auf IFNsSTAT2 Interferon α/β Defekt der VirusabwehrSTAT3 IL-6, IL-10 nicht lebensfähigSTAT4 IL-12 Defekt in der TH1-Entwicklung und der IFN-γ-

ProduktionSTAT5a Prolaktin LaktationsdefektSTAT5b Wachstumshormon ZwergwuchsSTAT5a IL-2, IL-7, IL-9 Laktationsdefekt, Zwergwuchs,und 5b zusätzlich o.g. Defekt der T-Zell-Proliferation

unter Einfluss von IL-2STAT6 IL-4 Defekt in TH2-Entwicklung

Defekt der IL-4 abhängigen Ig-Isotypen

Tabelle 2: Übersicht über STATs, frei nach [1]

growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) und das mit Grb2 assoziierte Protein Sup-pressor of cytokine signalling-1 (SOCS-1) aktiviert. SOCS-1 bindet sodann an Jak2, was zuderen Inaktivierung und damit zu einer verminderten Aktivierung von STAT5 führt (siehe

Abbildung 36, Kapitel 4.1.3) [55].Luo et al. konnten zeigen, dass STAT5b die Induktion des IRF-1 Promotors durch NF-κBhemmt [48].NF-κB liegt in ruhenden Zellen inaktiv im Zytoplasma vor, wo es als Dimer an ein oder meh-rere Proteine namens inhibitors of κB (IκBs) gebunden ist. Bei Aktivierung wird NF-κB ausdiesem Komplex freigesetzt und kann durch die Kernporen in den Kern translozieren. Dernukleäre Export ist energieabhängig.NF-κB wurde ursprünglich als Transkriptionsfaktor verstanden, welcher an der Synthese derleichten Kette von Immunglobulinen beteiligt ist und B-Zell-spezifische Genexpression re-guliert (daher der Name). Mittlerweile weiß man, dass diesem Transkriptionsfaktor als einemubiquitär vorhandenen eine zentrale Bedeutung für das Immunsystem zukommt. Unter ande-rem kommt NF-κB eine entscheidende Rolle bei proinflammatorischen Prozessen wie Sepsisund SIRS zu. Hier spielt es bei der Antwort verschiedenster Zellen auf Zytokine wie Tumor-Nekrose-Faktor und IL-1 eine Rolle. Des Weiteren ist NF-κB an der T-Zellaktivierung betei-ligt, indem es die Transkription von IL-2 und IFN-γ initiiert.

IRF-1 gehört zur neunköpfigen Familie der IRF-Proteine. Es ist an der Regulation der Syn-these einer Vielzahl immunmodulatorischer Proteine beteiligt. Zudem spielt IRF-1 eine Rol-

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le im Zusammenhang mit der Progression des Zellzyklus, Apoptose und Tumorsuppression.IRF-1 knock out-Mäuse zeigen multiple Defekte der TH1-Zellen, der CD8-T-Zellen und derNK-Zellen. Beim Menschen sind Defekte dieses Gens mit einer hohen Inzidenz an myelo-dysplastischen Syndromen und Leukämien korreliert [79].Abbildung 7 stellt die vielzähligen Funktionen von IRF-1 zusammenfassend dar.

Abbildung 7: IRF-1 ist ein multifunktionaler TranskriptionsfaktorDie dargestellte Zelle könnte einer T-, B- oder NK-Zelle, einem Makrophagen, einer Antigen-präsentierenden dendritischen Zelle oder einer γδT-Zelle entsprechen; nach [79]

1.4.5.2 Signaltransduktion über alternative Wege: Zusätzlich können Adapterprote-ine wie Shc / Grb2 / SOS über phosphorylierte Tyrosinreste an den PRL-Rezeptor binden,was zur Aktivierung der Ras/Raf/MAPK Kaskade führt. Weiter spielen Mitglieder der Srckinase-Familie eine Rolle, insbesondere eine Aktivierung der PI 39-Kinase über Fyn.Diesen beiden Signaltransduktionswegen über den PRLR wird eine Bedeutung im Rahmender Proliferation und des Überlebens von Lymphozyten zugeschrieben, während der Weg

18

1.5 Immunmodulatorische Wirkung von Prolaktin 1 EINLEITUNG

über Jak/Stat im Zusammenhang mit der Zelldifferenzierung der Lymphozyten und der Be-einflussung anderer Zellen durch Freisetzung von Zytokinen steht [19].Box 1 der intrazellularen Rezeptordomäne ist des Weiteren an einer Aktivierung eines Tyro-sinkinase-abhängigen Kalium-Ionen-Kanals durch Jak2 beteiligt, während das C-terminaleEnde dieser Domäne an der Freisetzung von Inositol-1,3,4,5,-tetrakisphosphat (Ins(1,3,4,5)P4)und Inositolhexakisphosphat (InsP6) beteiligt ist, welche wiederum spannungsabhängigeKalzium-Kanäle öffnen (siehe Abbildung 8).

1.5 Immunmodulatorische Wirkung von Prolaktin

1.5.1 Spezifische und unspezifische Immunantwort

Die unspezifische - oder auch angeborene - Immunität stellt eine schnelle Antwort auf Mi-kroorganismen dar, die unabhängig von dem Erreger immer gleich abläuft. Die Mechanis-men werden durch Strukturen in Gang gesetzt, die mehreren Gruppen von Mikroorganismengemeinsam sind. Die Komponenten der unspezifischen Immunantwort sind

• physikalische und chemische Barrieren wie Epithelien und antimikrobielle Substan-zen, die von epithelialen Oberflächen gebildet werden,

• Phagozyten wie Neutrophile und Makrophagen und Natürliche Killerzellen (NK-Zellen),

• Bluteiweiße wie Komplement und andere Entzündungsmediatoren,

• Zytokine, die die Aktivität der Zellen der unspezifischen Immunantwort beeinflussenund koordinieren.

Die höher entwickelte erworbene und spezifische Immunität setzt vorherigen Kontakt zwi-schen Immunsystem und Antigen voraus und wird mit jeder weiteren Exposition effizienterund stärker. Die Komponenten sind Lymphozyten und ihre Produkte. Man unterscheidet in-nerhalb der erworbenen Immunität zwischen humoraler und zellulärer Immunantwort. Me-diator der humoralen Antwort sind Antikörper, welche von B-Zellen produziert werden. Die-se erkennen lösliche Antigene über Rezeptoren an ihrer Zelloberfläche und entwickeln sichzu Antikörper-sezernierenden Zellen. Zudem erkennen T-Helferzellen (CD4-Zellen) Antige-ne auf der Oberfläche Antigen-präsentierender Zellen des Wirtes und setzen Zytokine frei,welche die Aktivierung von B-, T-Lymphozyten und Makrophagen sowie Entzündungsme-chanismen bewirken. Unter den T-Helfer-Zellen werden zwei Subpopulationen, die TH1-und TH2-Zellen, unterschieden. Hauptsächliches Prinzip der TH1-Antwort ist die Freiset-zung von IFN-γ und damit die Entwicklung einer proinflammatorischen Immunantwort.

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Abbildung 8: Signaltransduktion über den PRL-Rezeptor;Abbildung entnommen aus [26]

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TH2-Zellen sezernieren vorrangig IL-4 und IL-5 sowie IL-10, IL-13 und IL-18.Die zelluläre Immunität wird durch T-Killer-Zellen (CD8-Zellen) und NK-Zellen vermittelt.Sie ist primär gegen intrazelluläre Erreger gerichtet wie z.B. Viren, welche in Phagozytenund anderen Wirtszellen intrazellulär überleben, wo sie für Antikörper nicht erreichbar sind.

1.5.2 Immunologische Bedeutung der Zytokine TNF-α, IFN-γ, IL-12 und IL-10

Für die Untersuchungen der immunmodulatorischen Wirkungen von PRL wurden die Zyto-kine TNF-α, IFN-γ und IL-12 als Repräsentanten proinflammatorisch wirkender Stoffe undIL-10 als typisch antiinflammatorisches Zytokin bestimmt.Interleukin 12 (IL-12) ist immanent wichtig für die zelluläre Immunantwort. Es wird v.a. vonB-Zellen und in geringerem Ausmaß von T-Zellen und Granulozyten gebildet. Ein wichtigerInduktor für die Bildung von IL-12 sind Bakterien bzw. LPS als Bestandteil der Zellwandgramnegativer Bakterien. IL-12 bewirkt eine Differenzierung naiver T-Zellen zu TH1-Zellensowie die Synthese von IFN-γ und TNF-α durch diese. Es aktiviert NK-Zellen. Damit ist esein klassisches proinflammatorisches Zytokin.Interferon-γ (IFN-γ) wird hauptsächlich von zytotoxischen T-Zellen, TH1-Zellen und NK-Zellen sezerniert. Es ist ein wichtiger Inhibitor viraler Replikation, induziert MHC-Expres-sion und aktiviert Makrophagen. IFN-γ wirkt bezüglich seiner antiproliferativen Eigenschaf-ten synergistisch mit TNF-α.Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) ist benannt nach seiner zytolytischen und zytostatischenWirkung auf Tumorzellen. Zudem steigert es die phagozytotische und zytotoxische Eigen-schaften Neutrophiler Granulozyten und wirkt chemotaktisch auf diese Zellen. Es aktiviertdas vaskuläre Endothel und erhöht dessen Permeabilität, was zu einem Übertritt von IgG,Komplement und Zellen in das umgebende Gewebe führt. Systemisch induziert es Fieber,mobilisiert Metabolite und führt zum Schock.Interleukin-10 (IL-10), welches von T-Zellen und Makrophagen freigesetzt wird, ist ein typi-sches Zytokin, dem eine entscheidende Bedeutung im Rahmen der TH2-Antwort zukommt.Es inhibiert die Sekretion von TNF-α und verhindert damit eine überschießende Antwort aufLPS. In Anwesenheit von IL-4 wirkt es zudem proliferatorisch auf Mastzellen.

1.5.3 Wirkung von Prolaktin

Bereits 1972 vermuteten Chen et al. eine Funktion von Prolaktin auf das Immunsystem.Sie zeigten, dass exogen hinzugeführtes PRL die herabgesetzte Thymusfunktion bei PRL-defizienten Mäusen wieder verbessern kann [16]. Nagy et al. stellten fest, dass Hypophysek-tomie oder Supprimierung der PRL-Sekretion durch Bromocriptin zu einer Beeinträchtigung

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der humoralen und zellulären Immunantwort führen. Diese kann durch Prolaktingabe aufge-hoben werden [58, 57].In Zellkulturen wirkt PRL immunmodulatorisch auf T- [5] und B- [3] Zellen, Makrophagen[5], NK-Zellen [51] und dendritische Zellen. Die immunmodulatorische Wirkung von PRLhängt hierbei vom Zelltyp, dem Differenzierungsstadium der Zellen und dem die Zelle um-gebenden Milieu des Umfeldes ab.Vielfach wurde für PBMC [15] und NK-Zellen [52, 53] gezeigt, dass diese Zellen unter Sti-mulation mit PRL vermehrt Interferon γ (IFN-γ) sezernieren. Zudem zeigen PRL-stimulierteNK-Zellen eine erhöhte zytolytische Aktivität gegenüber der erythroleukämischen ZelllinieK562 [54].

Die Ausschüttung von PRL durch die Adenohypophyse wird zum einen durch den Hypotha-lamus gesteuert, zum anderen können IL-1, IL-2 und IL-6 die PRL-Produktion stimulieren,während IFN-γ und Endothelin-3 inhibitorisch wirken [17].

1.5.4 PRL als Mitogen

Die durch ein Antigen induzierte klonale Expansion von T-Lymphozyten ist eine wesentlicheKomponente einer effektiven Immunantwort. Im Rahmen von in vitro-Experimenten konntegezeigt werden, dass PRL wesentlich für das Ausmaß der Antwort von T- und B-Zellen aufAntigene oder Mitogene ist [20]. Ebenfalls agiert PRL als Komitogen für NK-Zellen undMakrophagen [19].

1.5.5 PRL als antiapoptotischer Faktor

Während Stressperioden wird von der Hypophyse sowohl vermehrt PRL als auch vermehrtCorticotropin Releasing Factor sezerniert. Ein wichtiger Mechanismus der immunsuppres-siven Wirkung von Glukokortikoiden ist die Induktion von Apoptose in Populationen vonT-Zell-Progenitorzellen. An murinen Thymozyten konnte gezeigt werden, dass die Dexa-methason-induzierte Apoptose durch PRL antagonisiert werden kann. So scheinen PRL undGlukokortikoide ihre Wirkungen gegenseitig zu antagonisieren. Immunologische Homöosta-se kann somit als ein Gleichgewicht der gegenläufigen Effekte von PRL und Glukokortikoi-den aufgefasst werden (siehe Abbildung 9). Diesem Antagonismus könnte eine entscheiden-de Bedeutung für das Immunsystem bei der Pathogenese verschiedener Autoimmunkrank-heiten zukommen.

22


Abbildung 9: Antagonismus von PRL und Glukokortikoiden;

Dex = Dexamethason

Während Glukokortikoide die Apoptose von Lymphozyten induzieren, stimuliert PRL die Lympho-

zytenproliferation; Abbildung entnommen und verändert aus [19]

23

1.6 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit 1 EINLEITUNG

1.6 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit

Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung der möglicherweise zytokinartigen Eigenschaften desHormons PRL.

Das heißt, dass zum einen Aspekte einer potentiellen PRL-Synthese durch Immunzellen be-leuchtet werden, zum anderen die Wirkung von PRL auf PBMC untersucht werden soll.Aspekte der Synthese von PRL durch PBMC sollen in Stimulationsversuchen mit Chloro-phenylthio-(cpt)cAMP, PMA, PHA, PRL, LPS und entsprechenden Kostimulationen geprüftwerden. Um eine umfassende Darstellung der Thematik liefern zu können, wird die Syntheseauf möglichst vielen unterschiedlichen Ebenen der Proteinsynthese in menschlichen Zellenuntersucht. Die Nachweismethoden erfassen dabei die Ebene der Aktivierung von Transkrip-tionsfaktoren (via EMSA), der Bildung der messenger Ribonukleinsäure (mRNA) (via GeneExpression (GE)Array) und der Synthese des fertigen Proteins (via enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)).Die Wirkung von PRL auf PBMC soll einerseits bezüglich des Einflusses auf die Ausschüt-tung anderer Zytokine wie IFN-γ, IL-10, IL-12 und TNF-α via ELISA untersucht werden.Andererseits wird die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren mittels EMSA geprüft undFragen der Aktivierung von STATs via Dotblot beleuchtet.Ein weiterer zu untersuchender Aspekt ist das Expressionsverhalten von PRLR auf PBMCunter unterschiedlichen immunologischen Situationen.Ziel ist, eine Aussage darüber treffen zu können, ob PRL als Zytokin bezeichnet werdenkann und - falls nicht - in welcher Hinsicht diesem Hormon zytokinartige Eigenschaftenzukommen.

24

2 MATERIAL UND METHODEN

2 MATERIAL UND METHODEN

2.1 Material

2.1.1 Geräte

Analysenwaage 2002MPI (Sartorius, Göttingen)

CO2-Inkubator water-jacketed 3029 (Forma Scientific, Labotec, Göttingen)

Dampf-Groß-Sterilisator Hydromat E 14 (Webeco, Bad Schwartau)

Digitaler Auto-Radiograph (EG & G Berthold, Bad Wildbad)

Dotblotter SRC 96 D Minifold I (Schleicher & Schuell, Dassel)

Elecsys 2010 (Roche, Mannheim)

ELISA-Reader (Anthos Labtec Instruments, Salzburg/Österreich)

ELISA-Reader ThermoMax microplate reader (Molecular Devices, MWG Biotech,München)

ELISA-Waschgerät (Biotest, Dreieich)

Filmentwickler Crontex TSA (DuPont, Bad Homburg)

Folieneinschweißgerät Polystar 100 GE (Ritsche + Herfurth, Hamburg)

Gefriertruhe Bio-Freezer (Forma-Scientific, Labotec, Göttingen)

Gelelektrophoresekammer Gelelectrophoresis Apparatus GNA-100 (Pharmacia LKB,Freiburg)

Gelelektrophoresekammer (Micro Bio Tec Brand, Gießen)

Gelelektrophoresekammer (Novex Novel Experimental Technology, San Diego,Californien, USA)

Geltrockner Aldo-Xer (Schütt, Göttingen)

Geltrockner SGD 2000 (Thermo Servant)

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2.1 Material 2 MATERIAL UND METHODEN

Heißluftsterilisator 2712 (Kottermann, Uetze-Hänigsen)

Hybridisationsofen (Bachhofer Laboratoriumsgeräte, Reutlingen)

Laborwaage 12116MP (Sartorius, Göttingen)

Laborwaage LC 6200S (Sartorius, Göttingen)

Netzgerät 3000/150 (Pharmacia LKB, Freiburg)

pH-Meter pHM83 Autocal (Radiometer, Kopenhangen/DK)

Pipette Combi-Pipette Typ 3180 (Eppendorf, Hamburg)

Pipetten Multikanal, 5-50 µl / 50-300 µl (Titertek, ICN, Meckenheim)

Pipetten Vario-Mikroliterpipetten 0,5-10 µl, 10-100 µl, 100-1000 µl (Eppendorf, Hamburg)

Schüttler H S 250 basic (IKA Labortechnik, Staufen)

Sterile Werkbank (Nuaire, Plymouth, MN/USA)

Strahlendetektor LB 122 β,γ-Detector (Berthold, Wildbad)

Strahlendetektor LB 1200 (Berthold, Wildbad)

Thermocycler

Thermomixer 5436 (Eppendorf, Hamburg)

Vakuumkonzentrator Speed Vac Concentrator (Bachofer, Reutlingen)

Vakuum-Pumpe Vacu Gene Pump (Pharmacia LKB, Freiburg)

Vollblut-Zellzähler T-660 (Coulter Electronics, Krefeld)

Zentrifuge Kühlzentrifuge: Centrikon T324 (Kontron, Hamburg)

Zentrifuge Minifuge: Centrifuge 5415C (Eppendorf, Hamburg)

Zentrifuge Omnifuge 2.0.RS (Heraeus Christ, Osterode)

Zentrifuge Tischzentrifuge Sigma 2MK (Sigma Laborzentrifugen, Osterode)

Zentrifuge Zytozentrifuge Cytospin-2 (Shandon, Frankfurt)

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2.1.2 Laborbedarf

Einmalspritzen, steril 2, 5 und 10 ml (Becton Dickinson, Heidelberg)

Einschweißfolie Hybridization Bags (Life Technologies, Berlin)

Filterpapier (Schleicher & Scuell, Dassel)

Filmkassetten Hypercassettes Autoradiographie Cassettes (Amersham, Braunschweig)

Frischhaltefolie (herkömmliche Haushaltsfrischhaltefolie)

Gel-Bloting Papier GB 002 (Schleicher & Scuell, Dassel)

Gewebekulturflaschen, beschichtet, 50, 260 und 800 ml (Nunc, Roskilde/DK)

Gewebekulturplatten, 6- und 24-Loch-Platten (Falcon, Heidelberg)

Gewebekulturschalen 100x20 mm (Falcon, Heidelberg)

Hybridisationszylinder (Anfertigung der Wissenschaftlichen Werkstätten der UniversitätLübeck)

Kanülen 0,5x25 Nr. 18 (Becton Dickinson, Heidelberg)

Kunststoffröhrchen, steril, mit Schraubverschluss, 15 und 50 ml (Sarstedt, Nürmbrecht)

Kunststoffröhrchen, steril, mit Verschlusskappe, 5 ml (Greiner, Nürtingen)

Latex-Einmalhandschuhe (Ansell, München)

Mikroliterspritze (Hamilton, Bonaduz/Schweiz)

Mikrotiterplatten, 96-Loch-Flach- und Rundboden (Falcon, Heidelberg)

Mikrotiterplatten, 96-Loch-Flach- und Rundboden MAXISORP (Nunc, Roskilde/DK)

Mikrotiterplatten 96-Loch, Flachboden, fluoreszenzarm (Millipore, Eschborn)

Petrischalen für Gewebekulturen, 145 x 20 mm (Greiner, Nürtingen)

Pipettenspitzen, 1-10 µl, kristall (Greiner, Nürtingen)

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Pipettenspitzen, 10-100 µl, gelb (Greiner, Nürtingen)

Pipettenspitzen, 100-1000 µl, blau (Greiner, Nürtingen)

Pipettenspitzen, Combitips steril, 2,5 µl / 5 µl / 12,5 µl (Eppendorf, Hamburg)

Pipettenspitzen, Comforttips, 10 µl / 200 µl (Eppendorf, Hamburg)

Pipettenspitzen, PPN Precision Tip, 10-250 µl (Linbro, Amsterdam/Niederlande)

Pipettenspitzen, Sterilfilter-Tips 0,5-10 µl (Biozym Diagnostik, Oldendorf)

Pipettenspitzen, Sterilfilter-Tips 10-100 µl (Biozym Diagnostik, Oldendorf)

ProbeQuantG-50 Micro Columns (Pharmacia LKB, Freiburg)

Reaktionsgefäße 1,5 ml (Sarstedt, Nürmbrecht)

Reaktionsgefäße 2 ml (Eppendorf, Hamburg)

Reaktionsgefäße mit Schraubdeckel 1,5 ml (Sarstedt, Nürmbrecht)

Röntgenfilm Biomax MX Scientific Imaging Film (Kodak, Rochester/USA)

Röntgenfilm TMDG 1, P-MAT (Kodak, Rochester, USA)

RNA-Konzentrierungs-Filter Microcon YM-30 (Millipore, Bedford/USA)

Sarstedt Monovetten (Nürnbrecht)

Stangenpipetten, steril 5, 10 und 25 ml (Greiner, Nürtingen)

Zellschaber 18 cm (Falcon, Heidelberg)

Zellschaber 25 cm (Costar, Cambridge, Massachussets, USA)

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2.1.3 Zellkultur-Reagenzien, -Medien und -Zusätze

Aqua ad injectabile, 10 ml-Ampullen (Braun, Heidelberg)

Fetales Kälberserum, FCS, Myoklone plus-Qualität (Life Technologies, Berlin)

Ficoll-Trennlösung 1,077 g/ml (Seromed Biochrom, Berlin)

Bovines Insulin > 27 USP units/mg (Sigma, Deisenhofen)

Kulturmedium RPMI 1640 (Seromed Biochrom, Berlin)

L-Glutamin 200 mM (Seromed Biochrom, Berlin)

Penicillin 10000 E/ml / Streptomycin 10000 µg/ml (Seromed Biochrom, Berlin)

Phosphat Buffered Saline, PBS, ohne Ca2+ und Mg2+ (Life Technologies, Berlin)

2.1.4 Reagenzien für molekularbiologische Methoden

2.1.4.1 Enzyme

Oligonukleotidlabeling-Kit Ready To Go T4-Polynucleotid-Kinase für dieBandshift-Experimente (Pharmacia LKB, Freiburg)

Multiples Myeloma Reverse Transkriptase 50 u/µl (Promega)

ReactionReady Sweet PCR master mix (SuperArray)

Ribonuklease Inhibitor Rnasin 40 u/µl (Promega)

2.1.4.2 Nukleotide und Nukleinsäuren

α-32P-dCTP, 3000 Ci/mmol (Amersham, Braunschweig)

γ-32P-ATP, 3000 Ci/mmol (Amersham, Braunschweig)

dATP Li-Salz 100 mM (Roche, Mannheim)

dGTP Li-Salz 100 mM (Roche, Mannheim)

dTTP Li-Salz 100 mM (Roche, Mannheim)

dCTP Li-Salz 10 mM (Perkin Elmer)

DTT, 0,1 M (Promega, Heidelberg)

Heringsperma-DNA, sonifiziert (Pharmacia LKB, Freiburg)

diverse Oligonukleotide für die Bandshift-Versuche (siehe Tabelle 4; TIB Molbiol, Berlin;Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg)

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2.1.4.3 Zelllinie, Prolaktin und Mitogene Re, Rc und Ra LPS aus E. coli, StämmeF515, J5 und K12 (extrahiert nach der Phenol-Chloroform-Ether-Methode in der Abt. f. Bio-physik des Forschungszentrums Borstel, Referenz: [27])

Phythämagglutinin (PHA) (Sigma Chemie, Deisenhofen)

Phorbol-12-myristyl-13-acetat (PMA) (Sigma Chemie, Deisenhofen)

Humanes rekombinantes Prolaktin (R&D Systems GmbH, Wiesbaden-Nordenstadt)

Duktale Mammakarzinomzellen (Zelllinie T-47D, ATCC American Type CultureCollection, Rockville, Maryland, USA)

2.1.5 Immunologische Reagenzien

2.1.5.1 Antikörper für Dotblot

anti-STAT5a-IgG, sc-1081 (monoklonales Kaninchen IgG, Santa Cruz Biotechnology,Heidelberg)

anti-STAT5b-IgG, sc-1656 (monoklonales Maus IgG, Santa Cruz Biotechnology,Heidelberg)

anti-STAT1-IgG, sc-346 (monoklonales Kaninchen IgG, Santa Cruz Biotechnology,Heidelberg)

anti-Maus-IgG, sc-2008 (polyklonales Ziegen IgG, AP-konjugiert, Santa CruzBiotechnology, Heidelberg)

anti-Kaninchen-IgG, sc-2007 (polyklonales Ziegen IgG, AP-konjugiert, Santa CruzBiotechnology, Heidelberg)

2.1.6 Testkits

Die Testkitbestandteile sind nicht im Einzelnen aufgeführt.

BandShift Kit (Pharmacia LKB, Freiburg)

Elecsys humanes PRL (Roche, Mannheim)

ELISA human TNF-α (R&D Systems GmbH)

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ELISA human IFN-γ (Bender MedSystems, Wien/Österreich)

ELISA human IL-10 (Bender MedSystems, Wien/Österreich)

ELISA human IL-12 (Bender MedSystems, Wien/Österreich)

First strand cDNA Synthesis Kit (SuperArray)

Gene Expression Array Customer Array (Firma)

RNA-Isolierungskit RNeasy Mini Kit (Quiagen, Hilden)

RNA-Isolierungskit Purescript (Gentra, Minneapolis/USA)

Protein-Bestimmungs-Kit Bio-Rad Protein Assay Dye Detergent Concentrate (Bio-Rad,München)

RT PCR Primer Sets für PRLR, IFN-γ, PRL, IRF-1 (SuperArray)

2.1.7 Chemikalien und sonstige Reagenzien

Alle außer den nachfolgend aufgeführten Chemikalien wurden in Analysenqualität von derFirma Merck (Darmstadt) bezogen:

Aqua ad injectabilia, 10 ml-Ampullen (Braun, Heidelberg)

Acrylamid-Bisacrylamid (30 %) (Sigma, Deisenhofen)

Chlorophenylthio-cAMP (Biomol, Plymouth)

Dodecylsulfat Na-Salz (Serva, Heidelberg)

Dulbecco‘s Phosphate Buffered Saline DPBS (Bio Whittaker, Verviers/Belgien)

Entwickler D 19 (Kodak, Rochester/USA)

Färbelösung für Western blot Bio Rad Reagenz

Ficoll 400 (Serva, Heidelberg)

Fixierer Unifix (Kodak, Rochester/USA)

Formaldehyddimethylacetal (Merck-Schuchardt, Hohenbrunn)

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2.2 Methoden 2 MATERIAL UND METHODEN

Gel-Ladepuffer 10x Loading Dye (250 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,2 % Bromphenol-blau,0,2 % Xylenxylol, 40 % Glycerin; Pharmacia LKB, Freiburg)

2 β-Mercapto-Ethanol (Sigma, Deisenhofen)

NP-40 (Nonided P40 Protein Grade Detergent; Calbiochem, San Diego, Kalifornien, USA)

Pefablock SC Proteinaseinhibitor (Boehringer, Mannheim)

Phenol, flüssig (Fluka, Neu-Ulm)

Photoemulsion NTB-2 (Kodak, Rochester/USA)

Poly dI-dC*Poly dI*dC (Pharmacia LKB, Freiburg)

Rinderserumalbumin (BSA), Fraktion V (Boehringer, Mannheim)

Substrat für Alkalische Phosphatase BCIP / NBT Alkaline Phosphatase Substrate Kit IV(Bio-Rad, München)

Tetramethylethylendiamin (TEMED, Bio-Rad, München)

2.2 Methoden

2.2.1 Zellpräparationen

2.2.1.1 Präparation von PBMC: Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (peripheralblood mononuclear cells, PBMC) wurden gewonnen aus Buffy Coats, einer angereichertenLeukozytenfraktion, die bei der Präparation von Erythrozytenkonzentraten und Blutplasmafür Transfusionszwecke zurückbleibt. Die Isolierung erfolgte durch isopyknische Zentrifu-gation nach einer im Institut etablierten und in der Appendix (A.1) beschriebenen Methode.Dabei wurde eine Zellausbeute im Bereich von 1,0 - 1,5 x 109 Zellen/l erreicht. Die Zellkon-zentration in dem Produkt wurde bestimmt mit Hilfe des Vollblut-Zellzählers T-660 (CoulterElectronics, Krefeld).

32


2.2.2 Zellkulturverfahren

2.2.2.1 Kulturen von PBMC: Das benötigte Endvolumen der Kultur von 4 ml wurde ausZellsuspensionen mit einer Konzentration von 5 x 105 Zellen/ml auf sterile, pyrogenfreie 6-Loch-Platten ausgesät. Als Kulturmedium verwendeten wir RPMI 1640 Medium der FirmaBio Whittaker mit Zusätzen (siehe Appendix, Kapitel A1.1).Es wurden jeweils möglichst geringe Volumina (insgesamt max. 10 %) der Stimulantienzugegeben. In Kontrollexperimenten wurde statt dessen das entsprechende Volumen des je-weiligen Mediums, das zur Verdünnung der Stimulantien bzw. Zusätze verwendet wurde,zugesetzt.Zum zeitlichen Ablauf der Kostimulation und den einzelnen Endkonzentrationen sei auf Ka-

pitel 3 verwiesen.

Die anschließende Inkubation erfolgte bei 37 ◦C, 5 % CO2 und gesättigter Luftfeuchtigkeitohne Medienwechsel bis zu 72 Stunden.

2.2.2.2 Vollblutansätze: Zur Erfassung der Effekte von PRL auf die Zytokinsynthese viaELISA nutzten wir Vollblutansätze nach einem im Institut etablierten und in [41] publiziertenVerfahren.Blutproben wurden zehn gesunden Blutspendern in Sarstedt-Monovetten (15 IU Li-Heparin/mlBlut) abgenommen. 100 µl wurden zu 800 µl RPMI-Medium mit Zusätzen (siehe A1.1) pi-pettiert, das entweder 0 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml oder 300 ng/ml rekombinantes PRLenthielt. Nach einer Stunde Vorinkubation wurden Aliquoten von 100 µl Kulturlösung oderLPS-Aliquoten (Endkonzentration: 100 ng/ml) hinzugegeben. Nach zwölf Stunden Inkuba-tion wurden die Überstände für Messung von IL-10, IL-12 und TNF-α via ELISA abgenom-men.

2.2.2.3 Präparation der Stimulantien: LPS und PMA wurden in RPMI-Medium untersterilen Bedingungen ohne weitere Zusätze aliquotiert. PRL, cptcAMP, Noradrenalin undPHA wurden in sterilem Wasser aliquotiert. Dabei kamen die folgenden Endkonzentrationenzum Einsatz:

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Stimulans EndkonzentrationcptcAMP 50 µmol / 106 Zellen

LPS 100 ng/ml

Noradrenalin 100 ng/ml

PHA 5 µg / 106 Zellen

PMA 10 ng / 106 Zellen

PRL 300 ng/ml

Tabelle 3: Endkonzentration der Stimulantien in Zellkulturen von PBMC

2.2.2.4 Präparation von Mamma-Karzinom-Zellkulturen: Als Positivkontrolle einerPRLR-synthetisierenden Zelllinie dienten uns Zellen eines duktalen Mamma-Karzinoms (Zell-linie T-47D, ATCC).Die Stammkulturen wurden in Zellkulturflaschen in Konzentrationen von 2 x 105 Zellen/mlkultiviert. Die Zellen wurden zweimal wöchentlich nach mikroskopischer Kontrolle sedi-mentiert, gezählt, auf die entsprechenden Zellkonzentrationen eingestellt und in frisches Me-dium umgesetzt. Die Kulturmedien wurden mit folgenden Zusätzen versehen:

Kulturmedium ZusatzRPMI 1640 10% FCS

2 mM L-Glutamin1% Penicillin / Streptomycin1,5 g/l Natriumbicarbonat4,5 g/l Glucose10 mM HEPES1,0 mM Natriumpyruvat0,2 Units/ml Rinderinsulin

Tabelle 4: Zusätze des Kulturmediums für die Kultivierung der Mamma-Karzinom-Zelllinie

2.2.3 Präparation von Kernextrakten

Prinzip der Herstellung von Kernextrakten ist die Lyse des Zellkerns mit Freisetzung desKerninhalts inklusiv der Transkriptionsfaktoren und Trennung desselben vom übrigen Zell-material.

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Zunächst werden die Zellen nach Stimulierung geerntet und gewaschen. Sodann werden imersten Schritt die Zellmembranen lysiert und mit dem Zytosol entfernt. Die übrig bleiben-den Zellkerne werden anschließend lysiert und das Karyoplasma freigesetzt. DNA sowie dieTrümmer der Kernmembranen werden entfernt, wobei die Kernextrakte mit den darin ent-haltenen Kernproteinen und Transkriptionsfaktoren im Überstand übrig bleiben. Aus etwa4 x 106 Zellen wurden 50 µl Kernextrakt mit einer Protein-Konzentration von 4-6 µg/µlerreicht und in Aliquots von 10 µl bei -80 ◦C tiefgefroren. Die Protein-Konzentration derKernextrakte wurde mit Hilfe des Bio-Rad-Protein-Bestimmungs-Kits und des Hitachi-U-3000-Photometers gemäß der Testanleitung des Herstellers durchgeführt.Für Einzelheiten zur Herstellung von Kernextrakten sei auf Kapitel A.2 der Appendix ver-

wiesen.

2.2.4 Überstände

Die Überstände der Stimulierungsexperimente enthielten die von den Immunzellen produ-zierten Zytokine und wurden zu deren Messung (via ELISA) steril abgenommen und bei-80◦C ohne zwischenzeitliches Auftauen bis zur Messung tiefgefroren.

2.2.5 RNA-Extraktion

Als Voraussetzung für das Arbeiten mit RNA müssen alle Materialien und Lösungen frei vonRNAsen sein. Das heißt, dass die Materialien autoklaviert und acht Stunden bei 160 ◦C ste-rilisiert sein müssen. Lösungen werden mit 0,02 % Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelt,was zu einer unspezifischen Alkylierung der RNAsen führt. Ferner sind sämtliche Arbeitenmit Einmal-Latex-Handschuhen durchzuführen, um eine nachträgliche Kontamination mitRNAsen zu vermeiden.Die RNA-Isolierung wurde entsprechend der Arbeitsvorschrift des Testherstellers mit Hilfedes RNA-Isolierungs-Kits von Invitrogen und des Kits von Quiagen durchgeführt.Durch spektralphotometrische Messung der optischen Dichte lässt sich sowohl die Mengeals auch die Reinheit der zuvor isolierten RNA quantifizieren. Nukleinsäuren weisen beieiner Wellenlänge von 260 nm ein Maximum ihrer Lichtabsorption auf, während das vonProteinen bei 280 nm liegt. Die absolute Extinktion der Lösung in einer Quarzküvette gegenWasser bei 260 nm ist dabei gemäß dem Lambert-Beerschen Gesetz linear vom RNA-Gehaltabhängig. Über den Quotienten beider Extinktionswerte (260 nm/280 nm) kann der Konta-minationsgrad der Probe mit Proteinen beurteilt werden. Der Quotient sollte zwischen 1,6und 2,0 liegen.Die Proben wurden entweder sofort für die Gen-Expressions-Analyse eingesetzt oder bei -

35


80 ◦C gelagert. Das Protokoll zur Bestimmung der Konzentration an RNA einer Probe ist inKapitel A.3 der Appendix aufgeführt.

2.2.6 EMSA

Ziel eines EMSA (electrophoretic mobility shift assays, im Folgenden auch als Bandshiftsbezeichnet) ist der Nachweis von Wechselwirkungen von Nukleinsäuren mit Proteinen.Die in vivo vorliegenden Verhältnisse werden dadurch simuliert, dass Transkriptionsfaktorenaus dem Kern von stimulierten Zellen isoliert und diese dann mit in vitro synthetisierten, ra-dioaktiv markierten Promotor-Abschnitten der Gene inkubiert werden, an die die Transkrip-tionsfaktoren in vivo binden (sogenannte Transkriptionsfaktor-Binderegionen oder - wie imFolgenden bezeichnet - Binding sites). Diese Bildung eines Komplexes aus Transkriptions-faktor und Oligonukleotid kann aufgrund der dadurch entstehenden höhermolekularen Ver-bindungen mit nativer Acrylamid-Elektrophorese durch Trennung des Komplexes vom übri-gen Reaktionsgemisch autoradiographisch sichtbar gemacht werden.Mit Hilfe der Bandshifts sollten Aussagen über die Aktivierung der TranskriptionsfaktorenNF-κB, IRF-1 und CRE binding protein (CREB) gewonnen werden. Eine normale autoradio-graphische Auswertung ermöglicht allenfalls semiquantitative Aussagen über das Ausmaßder Transkriptionsfaktor-Aktivierung, vergleichbar zur herkömmlichen RT-PCR. Wirklichequantitative Aussagen sind nur mit Hilfe eines Instruments zur Bestimmung von Position, In-tensität und Verteilung ionisierender Strahlung möglich. Dies ist mit einem Phosphoimageroder Digitalem Autoradiographen (DAR) möglich.

2.2.6.1 5´-32P-Oligonukleotidlabeling: Die in Tabelle 5 aufgelisteten Transkriptionsfaktor-Promotor-Binderegionen (Oligonukleotide) der verschiedenen Zytokin-Gene wurden für Bandshift-Experimente verwendet.NF-κB ist ein ubiquitäres, innerhalb von Minuten aktivierbares Protein, das maßgeblich ander Aktivierung der verschiedenen Zytokin-Gene beteiligt ist und zur Entstehung einer pro-inflammatorischen Antwort entscheidend beiträgt (siehe auch Kapitel 2, Seite 17).IRF-1 ist ein Mitglied der Familie der IRF-Transkriptionsfaktoren, das am Entstehen einerantiviralen Immunantwort beteiligt ist. Zudem ist IRF-1 als Tumorsuppressor und Regulatorvon Zellzyklus und Apoptose bekannt [65]. Auch IRF-1 ist innerhalb von Minuten aktivier-bar (siehe auch Kapitel 2, Seite 18).CREB (CRE binding protein) ist ein Transkriptionsfaktor, der über cAMP und ProteinkinaseA aktiviert wird und die Transkription CRE-regulierter Gene bewirkt. Ein CRE-reguliertesGen ist das PRL-Gen.

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Oligonukle-otid

Basensequenz (5’-XXX-3’) Zytokingen, auf dessenPromotor die Binderegionlokalisiert ist

CREB S CTg AAg CAg gCC ATA AAA gAA TCC CRETCT gAC gTT TCT ATA AAg TAg in der

CREB AS CTA CTT TAT AgA AAC gTC AgA ggA Prolaktin-TCC TTT TAT ggC CTg CTT CAg Promotorregion

IRF-1 S AgT TTC TAg TTT AAg TTT CCA IL-12 p40-IRF-1 AS Tgg AAA cTT AAA cTA gAA ACT Gen-Promotor

NF-κBC S gAT CCT CAg Agg ggA CTT TCC gAT G NF-κB-Consensus-Sequenz/

NF-κBCAS

CAT Cgg AAA gTC CCC TCT gAg gAT C TNF-α-Promotor

Oct-1 S TCC ATG CAA ATG GAT Oct-1-KontrolleOct-1 AS ATC CAT TTG CAT GGA (unrelated DNA, Pharma-

cia)

EBNA-1 S TAG CAT ATG CTA EBNA-1-KontrolleEBNA-1AS

TAG CAT ATG CTA (Positivkontrolle, Pharma-cia)

Tabelle 5: In den Bandshift-Experimenten verwendete Oligonukleotide.Erläuterungen: S: Sense; AS: Antisense; Referenzen: für NF-κB/TNF-α [75]; für IRF-1 [50]; für

CREB [64].Hinweis: Die meisten o. g. Oligonukleotide wurden in Analysenqualität von TIB Molbiol

(Berlin) bezogen. War der Lieferant Pharmacia (Freiburg), ist dies gesondert vermerkt. Von sämtli-

chen Oligonukleotiden wurde eine 50 nM-Stammlösung in aqua dest. hergestellt. EBNA = Epstein-

Barr Virus Nuclear Antigen

Das 5´-Endlabeling mit radioaktivem Phosphor (32P, Amersham) dient der Detektierbarkeitder Oligonukleotide im Bandshift-Experiment und wurde mit Hilfe des Polynukleotidkinase-kits der Firma Pharmacia nach deren Anleitung hergestellt (für detailliertere Angaben siehe

A4.1).

2.2.6.2 Bindereaktion und elektrophoretische Trennung: Zum Bandshift werden et-wa 10 µg Kernproteine zusammen mit 10 Mikrocurie radioaktiv markierter DNA eingesetzt.

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Je nach Alter der radioaktiven Reagenzien entspricht dies etwa 2 µl. Während der Binde-reaktion kommt es zur Bindung der Transkriptionsfaktoren aus dem Kernextrakt an den32P-markierten DNA-Abschnitt aus der Promotorregion des nachzuweisenden Gens. Die-ses Reaktionsgemisch wird für ein bis zwei Stunden elektrophoretisch mit 200 V und 15 - 30mA getrennt mit Hilfe eines Polyacrylamid-Gels, wobei die für das menschliche Auge un-sichtbare Radioaktivität während des Laufvorganges zur Darstellung der Lauffront durch dieFarbstoffe Bromphenol-blau und Xylenxylol ersetzt werden. Dabei laufen die ungebunde-nen Kernproteine und ungebundenen Oligonukleotide schneller im elektrischen Feld als dieKomplexe aus Transkriptionsfaktor und gebundenem Oligonukleotid. Letztere lassen sich alsradioaktiv detektierbare Bande sichtbar machen, während die ungebundenen Oligonukleoti-de als freie Radioaktivität am unteren Rand des Gels auftauchen (siehe Abbildung 10).Details zum Vorgehen sind im Anhang aufgeführt.

2.2.6.3 Trocknung, Detektion der Radioaktivität: Nach der elektrophoretischen Tren-nung wurden die Gele auf Filterpapier aufgebracht und im Geltrockner bei 95 ◦C getrocknet.Die Auswertung erfolgte analog durch das Aufbringen eines Filmes in einer Filmkassette für48-72 Stunden bei -80 ◦C sowie autoradiographisch durch den Digitalen Autoradiographen.Zur Gewährleistung der Machbarkeit dieses Versuchsaufbaues wurde als Positiv-Kontrolleein entsprechendes Experiment mit EBNA-1-DNA (EBNA-1 = Epstein-Barr Virus NuclearAntigen-1) und EBNA-1-Extrakt (kloniert) durchgeführt.

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Abbildung 10: Prinzip des EMSA; die freie DNA lagert sich unten ab, die Komplexe aus DNA-

Transkriptionsfaktor-Antikörper als Supershift am weitesten oben; die Komplexe aus Transkriptions-

faktor und DNA befinden sich dazwischen;

Abbildung aus dem Internet entnommen

2.2.7 Dotbloting

Ziel des Dotblotings ist der Nachweis gesuchter Proteine mit Hilfe spezifischer Antikörper.Das Vorgehen entspricht im Allgemeinen dem beim Western Blot, doch werden beim Dot-blot die zu untersuchenden Proteingemische nicht elektrophoretisch aufgetrennt, wodurchdie zeitaufwendige Gelelektrophorese und der Umgang mit den giftigen Acrylamidgelenentfällt.Die zu untersuchenden Kernextrakte werden beim Dotbloting durch Vakuum direkt auf einekleine runde Fläche (Dot) einer Membran aufgebracht. Anschließend wird mit einer Anti-körperlösung gegen das gesuchte Protein, im zweiten Schritt mit einem gegen den erstenAntikörper gerichteten enzymverbundenen Antikörper (Alkalische Phosphatase-konjugiert)

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inkubiert. Dabei findet eine Bindung des ersten Antikörpers (Primary) an das gesuchte Pro-tein und des zweiten Antikörpers (Secondary) an den ersten statt. Dem zweiten Antikörperkann dann durch Zugabe einer Lösung Substrat für die Alkalische Phosphatase (BCIP / NBTAlkaline Phoshphatase Substrate Kit IV) angeboten werden, was zu einem farbigen Produktverarbeitet wird. Die violetten Markierungen weisen somit die Anwesenheit des gesuchtenProteins im Kern nach.Wir verwendeten Gel-Bloting Papier der Firma Schleicher & Scuell, Dassel und kommerziellerhältliche Antikörper (Santa Cruz).Zur Feststellung der idealen Antikörperkonzentrationen stellten wir Verdünnungsreihen derersten und zweiten Antikörper her und ermittelten so ein ideale Antikörper-Konzentrationenvon 0,1 µg/ml in einer Lösung aus 10 % BSA für den ersten Antikörper und 1 µl/ml 10 %BSA-Lösung für den zweiten Antikörper. Die Inkubationen mit den Antikörpern fanden fürden ersten Antikörper über Nacht und für den zweiten etwa 2 Stunden bei Raumtemperaturstatt.Wir verwendeten erste Antikörper vom Kaninchen und von der Maus, die Zweitantikörperwaren dementsprechend gegen Antikörper dieser Tiere gerichtet. Positive Kontrollen mit re-kombinant hergestelltem, käuflichem Protein (STAT5b) führten zu dem erwarteten Nachweisdurch den entsprechenden Antikörper. Zur negativen Kontrolle setzten wir proteinfreie Lö-sungen auf der Membran ein; weiterhin inkubierten wir versuchsweise ohne ersten oder ohnezweiten Antikörper und setzten rekombinante Proteine mit nicht darauf spezifische Antikör-per ein (STAT5b mit Antikörper gegen STAT1). Alle dieser negativen Kontrollen führten zukeiner Markierung und bewiesen somit die Spezifität der Versuche.

2.2.8 ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay)

Zur Messung der Zytokinkonzentration im Kulturüberstand diente die ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay)-Technik. Das zu untersuchende Zytokin/Mediatorprotein (all-gemein Antigen) bindet dabei im Rahmen einer Antigen-Antikörperreaktion an einen mo-noklonalen Primärantikörper (erster Antikörper), mit dem eine Mikrotiterplatte zuvor be-schichtet wurde. Darauf erfolgt die Zugabe eines biotinilierten Sekundärantikörpers (zweiterAntikörper), der gegen ein weiteres Epitop des zu untersuchenden Zytokins gerichtet ist.Das Enzym (meistens eine avidingekoppelte Peroxidase) katalysiert eine Farbstoffreaktionmit einem Substrat (z. B. TMB).Die Geschwindigkeit der stattfindenden Reaktion ist innerhalb des Messbereichs proportio-nal zur Enzymkonzentration und ermöglicht so durch photometrische Quantifizierung desFarbstoffumsatzes die Bestimmung der zuvor gebundenen Antigenmenge (siehe auch Abbil-

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dung 11).

Abbildung 11: Prinzip des Sandwich-ELISA;Abbildung entnommen aus http://www.biologie.de/Nuetzliches/FCI-CD/ausschnitte/KVs2.pdf

Durch dieses sehr sensitive Verfahren können geringste Zytokinkonzentrationen gemessenwerden (Nachweisgrenze je nach ELISA bei ca. 5 pg/ml), wobei in die Auswertung nurWerte einbezogen wurden, die eine mindestens ebenso große Absorption zeigten wie derkleinste Standard (beispielsweise zwischen 3 und 32 pg/ml bei Zytokinen).Die Durchführung erfolgte entsprechend der dem Testkit beigefügten Arbeitsvorschrift.

2.2.9 Elecsys

Zur Messung der PRL-Konzentration in Kulturüberständen bedienten wir uns des PRL-Testkits der Serie der Elecsys der Firma Roche. Auch bei dieser Methode bilden sich Sandwich-Komplexe. Der erste Antikörper ist biotinyliert und der zweite mit einem Ruthenium-Komplexmarkiert. Diese Mikropartikel werden in der Messzelle magnetisch auf der Oberfläche einerElektrode fixiert. Das Anlegen elektrischer Spannung induziert sodann Chemolumineszenz,die mittels Photomultiplier gemessen wird. Die Ergebnisse werden anhand einer Kalibrati-onskurve ermittelt. Diese wird durch 2-Punkt-Kalibration und eine vom Hersteller mitgelie-ferte Masterkurve generiert. Der Nachweisbereich liegt zwischen 0,470-470 ng/ml, und istdamit sehr gut geeignet, endokrinologisch relevante PRL-Konzentrationen im Zellüberstandzu erfassen. Allerdings haben für die Messung von Zytokinen eingesetzte ELISAs untereNachweisgrenzen im Pikogrammbereich und sind damit deutlich sensitiver. Ein ELISA mitsolchen Nachweisgrenzen ist für PRL kommerziell nicht erhältlich.Die Durchführung erfolgte entsprechend der Arbeitsvorschrift des Testherstellers.

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2.2.10 Nachweis der messenger RNA

Eine weitverbreitete Möglichkeit, zu untersuchen, ob ein bestimmtes Gen in einer Zellpopu-lation aktuell transkribiert wird, ist der Nachweis der messenger RNA des gesuchten Gen-produktes. Dazu wird die gesamte mRNA aus den zu untersuchenden Zellen isoliert (siehe

Kapitel 2.2.5, Seite 35) und mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase in komplementäreDNA (cDNA) umgeschrieben. Die cDNA wurde in unseren Experimenten entweder direktmittels Genexpressions-Analysen untersucht oder zunächst durch die Polymerase-Ketten-Reaktion vervielfältigt und anschließend durch Gelelektrophorese identifiziert.

2.2.10.1 Nachweis mittels Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR, polymerase chain re-action) Die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ist eine sehr gängige Methode, um kurzeDNA-Abschnitte zu vervielfältigen. Mit jedem Zyklus der PCR erfolgt eine Verdopplungder entsprechenden DNA-Sequenz. Der zu amplifizierende Abschnitt der DNA wird durchdie Auswahl der Primer festgelegt. Dies sind synthetisch hergestellte Oligonukleotide, derenSequenz dem Anfang und dem Ende des zu vervielfältigenden DNA-Abschnittes entspricht.Ein Zyklus besteht aus drei Teilschritten.

1. Melting: Im ersten Schritt wird der DNA-Doppelstrang sowohl der Ausgangs-DNA alsauch der Primer denaturiert und damit in seine Einzelstränge zerlegt. Dies geschiehtdurch Erwärmung des Reaktionsgemisches auf etwa 95◦C, wobei es zur Lösung derWasserstoffbrückenbindungen kommt, die für die Bildung des Doppelstranges verant-wortlich sind.

2. Annealing: Die Temperatur des Reaktionsgemisches wird soweit gesenkt, dass sich diePrimer an die Einzelstränge der DNA anlagern. Die hierfür erforderliche Temperaturhängt von den Primern ab und liegt meist 5◦C unter ihrem Schmelzpunkt bei Wertenum 50-60◦C.

3. Elongation: Durch Erwärmung des Gemisches auf das Temperaturoptimum der DNA-Polymerase (72◦C) beginnt die Polymerase, komplementäre Nukleotide an die einzel-strängigen DNA-Stücke anzulagern. Den Anfang des entstehenden Stranges stellt dererste und den Endpunkt der zweite Primer dar.

Die periodische Erwärmung und Abkühlung findet in einem Thermocycler statt. Nach meist20-40 Zyklen werden die Reaktionsgemische dem Thermocycler entnommen und auf einAgarosegel aufgetragen. Durch das Anlegen von Spannung kommt es zur Wanderung der Be-standteile ihrer Masse entsprechend im elektrischen Feld. Die vervielfältigten DNA-Stücke

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bilden damit eine Bande, deren Lokalisation auf dem Gel von ihrer Masse und damit derAnzahl der Basenpaare abhängt. Parallel wird eine sog. Leiter aufgetragen, ein Gemisch ausDNA-Stücken definierter Größe, die ebenfalls durch das elekrische Feld ihrer Masse ent-sprechend aufgetrennt werden, und anhand derer die Anzahl von Basenpaaren einer Bandenbildenden Struktur abgelesen werden kann.Wir synthetisierten cDNA aus der mRNA der Zellen unserer Versuchsreihen mit Hilfe desFirst Strand cDNA Synthesis Kit der Firma SuperArray (Versuchsanleitungen siehe Appen-

dix). Für die PCR setzten wir Primer eines RT PCR Primer Sets der Firma SuperArray so-wie mit dem Programm OligoExplorer kreierte Oligonukleotide ein (siehe Ergebnisteil). Alsmaster mix für die PCR verwendeten wir ReactionReady Sweet PCR master mix der FirmaSuperArray.

2.2.10.2 Nachweis mittels Genexpressions-Analysen (GEArray) Mit Genexpressions-Analysen wird der Status der Genexpression einer Zellpopulation dargestellt. Dies geschiehtunter Zuhilfenahme der mRNA der Zellen, die den aktuell in der Zelle transkribierten Genenentspricht.Diese mRNA wird aus den zu untersuchenden Zellen isoliert (siehe Kapitel 2.2.5) und mitHilfe des Enzyms Reverse Transkriptase in DNA umgeschrieben und radioaktiv markiert.Man erhält somit komplementäre DNA (cDNA).Auf einer Nitrozellulosemembran sind vom Hersteller cDNA-Fragmente aufgetragen wor-den, die den einzelnen Genen entsprechen, die bei der Genexpressions-Analyse untersuchtwerden sollen.In einem Annäherungsschritt wird die cDNA den auf der Membranen aufgebrachten Gen-proben präsentiert.Tritt eine Hybridisierung zwischen der aus der mRNA synthetisierten cDNA und den aufder Membran aufgebrachten DNA-Genen ein, so wird dies sichtbar durch eine radioaktiveStrahlung im definierten Bereich des aufgebrachten Genes auf der Membran.Autoradiographisch stellt sich dies als Punkt dar, wobei aus dem Hybridisierungsmusterauf der Membran sowie aus der Hybridisierungsintensität auf die Genexpression zurück-geschlossen werden kann.Durch dieses Verfahren werden eine quantitative sowie auch eine qualitative Aussage ge-macht zu den Genen, die in der untersuchten Zellpopulation exprimiert werden. Die qualita-tive Aussage lässt sich durch das Vorhandensein eines radioaktiv strahlenden Bereiches aufder Membran tätigen. Dies zeigt eine Hybridisation der radioaktiv markierten cDNA an.Die quantitative Aussage entsteht durch den Vergleich der Expression verschiedener Geneder Zellen bei unterschiedlichen Situationen. So untersuchten wir die Genexpression bei

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Abbildung 12: Prinzip des GEArrayAbbildung modifiziert nach der Anleitung des Herstellers

PBMC im Ruhezustand und nach Zugabe verschiedener Stimulantien. Ein im Vergleich zuden Experimenten mit Zellen im Ruhezustand stärker radioaktiv strahlender Bereich auf derMembran deutet auf eine stärkere Expression des in diesem Bereich aufgebrachten Genes imstimulierten Zustand hin.Zum Versuchsaufbau sei auf die Versuchsanleitung der GEA-Kits der Firma Superarray ver-wiesen, deren Test-Kits wir zur Genexpressions-Analyse verwendeten (siehe Kapitel A.5 der

Appendix). Eine kurze Zusammenfassung des Versuches wird nachfolgend wiedergegeben.Nach der RNA-Extraktion wurde die RNA mit Hilfe des aus Multiple-Myeloma-Zellen ge-wonnenen Enzyms Reverse Transkriptase in cDNA translatiert und mit 32P radioaktiv mar-kiert. Versuche mit 33P, das ebenfalls für Genexpressions-Analysen empfohlen wird, führtenzu wesentlich schwächeren Signalen und einer erschwerten Auswertung, so dass wir die Ex-perimente mit einer Markierung mit 32P durchführten. Gleichzeitig zur cDNA-Herstellungwird die Membran mit den darauf aufgebrachten Genen mit DNA aus Lachssperma bei 65◦C in einem Waschpuffer inkubiert, um unspezifische Bindungen mit der DNA zu vermin-dern. Anschließend wird die cDNA mit dem gleichen Waschpuffer und unter Zusatz vonLachssperma-DNA für mehrere Stunden bei 65 ◦C inkubiert. Nach mehreren Waschschrit-ten mit Lösungen aus SDS und SSC (nähere Angaben in der Appendix) in verschiedenen

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Konzentrationen ist die Membran fertig zur Auswertung. Dazu wird sie in feuchtem Zustandin Hybridisationsfolie eingeschweißt und entweder bei -20 ◦C zur Belichtung einem Filmausgesetzt und mittels DAR autoradigraphisch ausgewertet.Die Membran kann durch Kochen mit einer konzentrierten SDS-Lösung zum erneuten Ge-brauch wieder verwendet werden, indem die Hybridisierungen der auf der Membran aufge-brachten Gene mit der cDNA gelöst und die cDNA abgespült wird (Stripping). Ein Erfolgdes Strippings wird durch die Exposition der gestrippten Membran mit einem Röntgenfilmdargestellt, der bei erfolgreichem Stripping keine Markierungen durch radioaktive Strahlenmehr aufweist.Nach der Entwicklung der GEArrays als Instrument zur Untersuchung der Genexpressionim Jahre 1995 wurde deutlich, dass die Ergebnisse verschiedener Versuchsreihen mit un-terschiedlichen Zellpopulationen nur bedingt miteinander vergleichbar sind und auch inner-halb einer Versuchsreihe die Ergebnisse deutlich divergieren können. Daher wurden Kri-terien gesucht, deren Einhaltung die Ergebnisse verschiedener Versuchsreihen miteinandervergleichbar machen und die Genexpressions-Experimente als verlässliche Untersuchung inder Forschung etablieren. Dies führte zu den MIAME-Kriterien (Minimal Information aboutMicroarray Experiments), die im Jahre 2001 in Miami formuliert und publiziert wurden [12].Darin wird neben den technischen Anforderungen an die kommerziellen Anbieter von Testsfür Genexpressions-Analysen auch eine fünfmalige Reproduktion der Ergebnisse von denAnwendern verlangt, bis deren Daten als verlässlich gelten und veröffentlicht werden dür-fen.

2.2.11 Auswertung der Ergebnisse / Statistik

Die dargestellten Ergebnisse basieren auf der Auswertung einer Reihe von Einzelexperi-menten. Um den Ergebnisteil besser überschaubar und anschaulicher zu gestalten, sind dieErgebnisse als Mittelwerte ± Standardabweichung (standard deviation, SD) bzw. ± Stan-dardfehler (standard error, SE) aus mehreren Einzelresultaten dargestellt.Mit Hilfe des “Kolmogorow-Smirnov Goodness of Fit” - Testes wurden die Stichprobenhinsichtlich ihrer Normalverteilung untersucht. Die Unterschiede für den verteilungsunab-hängigen Vergleich zweier verbundener Stichproben in der Mediatorproduktion bzw. in dermRNA- und Gen-Aktivierung wurden im Falle einer Normalverteilung mittels des “Stu-dent´s T”-Tests auf Signifikanz überprüft (** : p < 0,01; * : p < 0,05; Trend Tendenz: p <0,10).Im Falle einer Nicht-Normalverteilung der Datensätze wurde der Vorzeichen-Rang-Test vonWilcoxon (Wilcoxon Matched-Pairs Signed-Ranks Test) verwendet.

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Die Korrelationen zwischen biologischen und biophysikalischen Daten wurden unter An-wendung des Pearson-Tests (normalverteilte Daten) bzw. des Spearman-Tests (nicht normal-verteilte Daten) analysiert.Sämtliche oben aufgeführten statistischen Testverfahren wurden mit dem Programm SPSSfor windows durchgeführt.

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3 ERGEBNISSE

3 ERGEBNISSE

Es wurde die Wirkung von PRL auf Immunzellen an Vollblutzellen und PBMC sowie einemögliche Synthese von PRL durch Immunzellen an PBMC untersucht.

3.1 Wirkung von Prolaktin auf Immunzellen

Im Rahmen der Untersuchung zur Wirkung von PRL auf Immunzellen wurden zunächstExperimente mit Vollblutzellen durchgeführt, um der Effekt auf die Gesamtheit der Blut-zellen zu erfassen. Da in Vorversuchen Bandshift-Experimente an Vollblutkulturen methodi-sche Schwierigkeiten aufwarfen, wurden die Untersuchungen an Transkriptionsfaktoren mitPBMC-Kulturen durchgeführt.Es wurde zunächst die Wirkung von PRL auf Vollblutzellen und anschließend den Effekt vonPRL auf LPS-stimulierte Zellen untersucht. Im Vollblutansatz wurden Einflüsse von PRL aufdie Synthese von IL-12, TNF-α, IL-10 und IFN-γ untersucht, Wirkungen auf eine möglicheAktivierung der Transkriptionsfaktoren NF-κB und IRF-1 wurden an PBMC gemessen.

3.1.1 Einfluss von Prolaktin auf die Zytokinproduktion (IL-12, TNF-α,IL-10) im Vollblutansatz

Zunächst wurde der Einfluss von Prolaktin auf die spontane Freisetzung der Zytokine IL-12,TNF-α und IL-10 im Vollblutansatz via ELISA untersucht.

Es wurde mit Endkonzentrationen von 100 ng/ml, 200 ng/ml und 300 ng/ml an rekom-binantem humanen PRL über einen Zeitraum von 12 Stunden inkubiert und die Zytokin-Konzentrationen in den Überständen der einzelnen Ansätze mit der Konzentration im Über-stand der Medium-Kontrolle verglichen.Bei Messungen an Vollblut zehn unterschiedlicher Blutspender ergaben sich keine statistischsignifikanten Unterschiede unter PRL-Inkubation im Vergleich zur Kontrolle, so dass sichfolgern lässt, dass PRL allein nicht in der Lage ist, die Ausschüttung dieser Zytokine inmerklichem Ausmaße zu beeinflussen.Desweiteren wurde ein etwaiger kostimulatorischer Effekt von PRL auf die LPS-induzierteZytokinfreisetzung im Vollblutansatz betrachtet. Dieser Versuchsaufbau erfasst somit dieWirkung von PRL auf eine inflammatorische Immunantwort. Die Ansätze wurden eine Stun-de mit 0 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml und 300 ng/ml PRL vorinkubiert, anschließend wurdeLPS (Endkonzentration: 100 ng/ml) hinzugegeben und für weitere 11 Stunden inkubiert.

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3.1 Wirkung von Prolaktin auf Immunzellen 3 ERGEBNISSE

Abbildung 13 zeigt die im ELISA gemessene Konzentration von IL-12 gegen die Endkon-zentration von PRL im Ansatz aufgetragen, mit der vorinkubiert wurde.

Abbildung 13: Einfluss von PRL auf die IL-12-Konzentration im Überstand von Vollblutkul-turen nach LPS-StimulationDargestellt ist die IL-12-Sekretion LPS-stimulierter Vollblutzellen in Abhängigkeit von der PRL-

Konzentration, mit welcher vorinkubiert wurde.

Es wurde mit PRL-Konzentrationen von 0, 100, 200 und 300 ng/ml für 1 h vorinkubiert und anschlie-

ßend LPS (100 ng/ml) hinzugegeben. Die Überstände wurden nach 12 Stunden abgenommen.

Abgebildet sind Box Plots mit Mittelwert (dicke Linie) und Median (dünne Linie).

n = 10, statistische Signifikanzen gegen 0 ng/ml PRL sind mit (*) gekennzeichnet: p < 0,01.

Die Konzentration von IL-12 wurde 11 Stunden nach Zugabe von LPS gemessen. Bei einerFallzahl von n = 10 ergibt sich dabei ein signifikanter Anstieg der IL-12-Konzentration imÜberstand bei Vorinkubation mit PRL von 2006 ± 247 pg/ml (2006 pg/ml ±12%) nach al-leiniger Stimulation mit LPS auf 2617 ± 352 pg/ml (2617 pg/ml ±13%) bei Vorinkubationmit 300 ng/ml PRL. Es deutete sich eine Konzentrationsabhängigkeit des Effektes von derPRL-Konzentration, mit der vorinkubiert wurde, an, diese war jedoch nicht statistisch signi-

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fikant.

Abbildung 14: Einfluss von PRL auf die TNF-α-Konzentration im Überstand von Vollblutkul-turen nach LPS-StimulationDargestellt ist die TNF-α-Sekretion LPS-stimulierter Vollblutzellen in Abhängigkeit von der PRL-Konzentration, mit welcher vorinkubiert wurde.Es wurde mit PRL-Konzentrationen von 0, 100, 200 und 300 ng/ml für 1 h vorinkubiert und LPS (100ng/ml) hinzugegeben. Die Überstände wurden nach 12 h abgenommen.Abgebildet sind Box Plots mit Mittelwert (dicke Linie) und Median (dünne Linie).n = 10, statistische Signifikanzen gegen 0 ng/ml PRL sind mit (*) gekennzeichnet: p < 0,01

Abbildung 14 zeigt die Konzentration von TNF-α im Überstand bei Vorinkubation mit PRLund LPS. Für eine Fallzahl von n = 10 ist die TNF-α-Konzentration im Überstand gegendie Endkonzentration an PRL, mit der vorinkubiert wurde, aufgetragen. Es zeigt sich einsignifikanter Anstieg der Konzentrationen von TNF-α im Überstand bei Vorinkubation mitPRL von 617 ± 72 pg/ml auf 746 ± 92 pg/ml. Eine Abhängigkeit dieses Effektes von derPRL-Konzentration im Ansatz besteht hier in Form eines Trends (p < 0,1).

Zusamenfassend lässt sich feststellen, dass sowohl für TNF-α als auch für IL-12 ein kosti-

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mulatorischer Effekt von PRL bei LPS-Stimulation vorliegt. Dabei konnten alle untersuchtenPRL-Konzentrationen die TNF-α- und die IL-12-Sekretion signifikant erhöhen verglichenmit der Sekretion nach alleiniger Stimulation mit LPS (p < 0,01). Eine Zunahme dieses Ef-fektes mit der PRL-Konzentration lässt sich für TNF-α in Form eines Trends feststellen, istjedoch sowohl für TNF-α als auch für IL-12 statistisch nicht signifikant.Abbildung 15 zeigt die Konzentration von IL-10 im Überstand in Abhängigkeit von der PRL-

Abbildung 15: Einfluss von PRL auf die IL-10-Konzentration im Überstand von Vollblutkul-turen nach LPS-StimulationDargestellt ist die IL-10-Sekretion LPS-stimulierter Vollblutzellen in Abhängigkeit von der PRL-Konzentration, mit welcher vorinkubiert wurde.Es wurde mit PRL-Konzentrationen von 0, 100, 200 und 300 ng/ml für 1 h vorinkubiert und LPS (100ng/ml) hinzugegeben. Die Überstände wurden nach 12 h abgenommen.Abgebildet sind Box Plots mit Mittelwert (dicke Linie) und Median (dünne Linie).n = 10, statistische Signifikanzen gegen 0 ng/ml PRL sind mit (*) gekennzeichnet: p < 0,05

Endkonzentration im Ansatz. Die Konzentrationen von IL-10 ändern sich unter Vorinkubati-on mit PRL in Endkonzentrationen von 0 ng/ml, 100 ng/ml und 200 ng/ml nicht signifikantim Vergleich zu der nur mit LPS stimulierten Kontrolle. Bei einer PRL-Endkonzentration

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von 100 ng/ml scheint ein Trend zur Minderung der IL-10-Synthese zu bestehen, dieser istjedoch nicht statistisch signifikant. Bei Vorinkubation mit einer PRL-Konzentration von 300ng/ml kommt es zu einer statistisch signifikanten Zunahme der IL-10-Konzentration (p <0,05) von 15,79 ± 3,76 pg/ml (15,79 pg/ml ±24%) auf 20,87 ± 3,81 pg/ml (20,87 pg/ml±18%). Dieser Effekt ist jedoch trotz seiner statistischen Signifikanz aufgrund der niedrigenGesamtkonzentrationen an IL-10 nicht überzubewerten (siehe Abbildung 15).

3.1.2 Einfluss von PRL auf die IFN-γ-Freisetzung durch Vollblutzellen

Sowohl unter Stimulation mit LPS als auch unter Stimulation mit PHA wirkt PRL auch aufdie IFN-γ-Sekretion kostimulatorisch, während Stimulation mit PRL allein keine signifikan-te Erhöhung der IFN-γ-Konzentration bewirkt.

Abbildung 16: Effekt von PRL auf die IFN-γ-Sekretion LPS-stimulierter Zellen im Vollblut-ansatzDargestellt ist die IFN-γ-Sekretion LPS-stimulierter Vollblutzellen in Abhängigkeit von der PRL-Konzentration, mit welcher vorinkubiert wurde.Es wurde mit PRL-Konzentrationen von 0, 5, 10 und 100 ng/ml für 1 h vorinkubiert und anschließendmit LPS (100 ng/ml) stimuliert. Die Überstände wurden nach 12 h abgenommen.Statistische Signifikanzen gegen 0 ng/ml PRL sind mit (*) markiert, Signifikanzen gegenüber dernächstniedrigeren PRL-Konzentration sind mit (#) markiert

Abbildung 16 zeigt die Konzentration an IFN-γ im Überstand LPS-stimulierter Vollblutzel-len aufgetragen gegen die Endkonzentration an PRL im Ansatz, mit welcher vorinkubiertwurde. Es konnten in Bezug auf die Sekretion von IFN-γ signifikante Effekte bereits bei

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PRL-Endkonzentrationen von 5 ng/mlgemessen werden. Hier fand sich eine statistisch si-gnifikante Abhängigkeit zwischen IFN-γ-Spiegeln und PRL-Endkonzentrationen (siehe Ab-

bildung 16).

3.1.3 Einfluss von PRL auf die Kerntranslokation von (NF-κB und IRF-1)

Die in Kapitel 3.1.2 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass PRL allein keinen Einfluss aufdie Zytokinsynthese in Vollblutzellen hat, wohl aber in Verbindung mit LPS. Daher wur-de der Einfluss von PRL allein und mit Stimulation durch LPS auf eine Aktivierung vonTranskriptionsfaktoren untersucht. Für diese Untersuchungen wurden drei unterschiedlichstimulierte Ansätze von PBMC verwendet und mit der als “K” deklarierten unstimuliertenKontrolle verglichen. Die im Folgenden als “PRL” und “PRL+LPS” bezeichneten Ansätzewurden zunächst mit PRL in einer Endkonzentration von 300 ng/ml stimuliert, während dieAnsätze “K” und “LPS” ohne Stimulation mit PRL inkubierten. Nach einer Stunde wurdezu den Ansätzen “LPS” und “PRL+LPS” Lipopolysaccharid in einer Endkonzentration von100 ng/ml zugegeben und alle Ansätze inkubierten für eine weitere halbe Stunde im Brut-schrank. Es wurden demzufolge PBMC-Kulturen nach dem in Abbildung 17 dargestelltenSchema angesetzt.

Abbildung 17: Prinzip der Vorinkubation mit PRL und anschließenden Stimulation mit LPSDie Ansätze PRLünd PRL+LPS"werden mit einer PRL-Endkonzentration von 300 ng/ml für

1 h vorinkubiert. Anschließend werden die Ansätze LPSünd LPS+PRLmit LPS (100 ng/ml) für 30

min inkubiert. Nach 1,5 h Gesamtinkubationszeit werden die Kernextrakte extrahiert.

Diese stimulierten Zellkulturen wurden auf Unterschiede bezüglich des Maßes an aktiviertenTranskriptionsfaktoren untersucht. Weil aktivierte Transkriptionsfaktoren in den Kern trans-

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lozieren, wurden mittels EMSA die Aktivität der Transkriptionsfaktoren NF-κB und IRF-1in den Kernextrakten der einzelnen Ansätze bestimmt und verglichen sie mit der Kontrollesowie untereinander. Für NF-κB bestimmten wir die Aktivität der Bindung des Transkripti-onsfaktors an den TNF-α-Promotor, für IRF-1 an den IL-12-Promotor.

Abbildung 18: Repräsentativer NF-κB-EMSA von n=3

Die Ansätze PRLünd PRL+LPS"wurden mit einer PRL-Endkonzentration von 300 ng/ml für

1 h vorinkubiert, anschließend wurden die Ansätze LPSünd LPS+PRLmit LPS (100 ng/ml) für 30

min stimuliert. Die Kernextrakte wurden nach 1,5 h Gesamtinkubationszeit extrahiert. Die Intensität

der Banden ist ein Maß für die Bindungsaktivität von NF-κB an den TNF-α-Promotor

K = unstimulierte Kontrolle, aqua = Wasserkontrolle (absolute Kontrolle)

Abbildung 18 zeigt einen repräsentativen EMSA von drei durchgeführten Versuchen für NF-κB. Die Intensität der spezifischen Banden ist dabei ein Maß für die Bindungsaktivität vonNF-κB an den TNF-α-Promotor, die mit der Konzentration an NF-κB im Kernextrakt korre-liert.Abbildung 19 zeigt einen repräsentativen EMSA für IRF-1 bei einer Fallzahl von n = 3. DieIntensität der spezifischen Banden entspricht hierbei der Bindungsaktivität von IRF-1 an denIL-12-Promotor und kann wiederum als Maß für die Konzentration von IRF-1 im Kern be-trachtet werden.Den Abbildungen 18 und 19 ist zu entnehmen, dass mit PRL inkubierte Zellen (PRL) im Ver-gleich zur unstimulierten Kontrolle (K) eine erhöhte Bindungsaktivität für sowohl NF-κB als

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auch IRF-1 aufweisen. Die Bindungsaktivität unter PRL-Inkubation entspricht in etwa dervon mit LPS stimulierten PBMC.

Abbildung 19: Repräsentativer IRF-1-EMSA von n=3

Die Ansätze PRLünd PRL+LPS"wurden mit einer PRL-Endkonzentration von 300 ng/ml für

1 h vorinkubiert, anschließend wurden die Ansätze LPSünd LPS+PRLmit LPS (100 ng/ml) für 30

min stimuliert. Die Kernextrakte wurden nach 1,5 h Gesamtinkubationszeit extrahiert. Die Intensität

der Banden ist ein Maß für die Bindungsaktivität von IRF-1 an den IL-12-Promotor.

K = unstimulierte Kontrolle

Vorinkubation mit PRL und anschließende Stimulation mit LPS führt zu einer weiteren Zu-nahme der Bindungsaktivität von NF-κB und IRF-1.Die quantitative Erfassung der Signalintensitäten mittels DAR und anschließende statisti-sche Auswertung liefert die in Abbildung 20 und Abbildung 21 dargestellten Ergebnisse.Abbildung 20 zeigt die Bindungsaktivität von NF-κB nach Stimulation im Vergleich zur un-stimulierten Kontrolle als x-fache Verstärkung. Gezeigt sind Mittelwert und Standardfehlerdes Mittelwertes. Diese Darstellung erlaubt die Aussage, dass Stimulation mit LPS eine et-wa 1,5fache Erhöhung der Bindungsaktivität von NF-κB - verglichen mit der unstimuliertenKontrolle - induziert, während Inkubation mit PRL ohne nachfolgende Stimulation eine et-wa 2fache Erhöhung der Bindungsaktivität bewirkt (p < 0,05). Ein der Darstellung nach zuvermutende Trend, dass die Inkubation mit PRL höhere NF-κB-Spiegel induziert als Stimu-

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lation mit dem starken Immunstimulans LPS, lässt sich statistisch signifikant jedoch nichtfeststellen.In Verbindung mit LPS und Vorinkubation mit PRL werden mit etwa 3fach höheren Bin-dungsaktivitäten die höchsten Werte erreicht (p < 0,01). Der Effekt entspricht einem syner-gistischen (siehe Diskussion, Kapitel 4.1.3)

Abbildung 20: Phosphoimager basierte quantitative Auswertung dreier EMSAs von NF-κBDargestellt ist das Maß der Aktivierung von NF-κB in PBMC unter den beschriebenen Stimulations-

bedingungen als x-fache Verstärkung der Signalintensität im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle.

Mittelwert und Standardfehler des Mittelwertes sind gezeigt

* = signifikant versus unstimulierter Kontrolle oder entsprechender Probe: p < 0,05

K = unstimulierte Kontrolle

Abbildung 21 zeigt die Phosphoimager-basierte quantitative Auswertung dreier EMSAs vonIRF-1. Man sieht die Verstärkung der Signalintensität der spezifischen Bande für IRF-1 imVergleich zur unstimulierten Kontrolle. Es ist eine etwa 1,5-fache Verstärkung der Signalin-tensität nach ausschließlicher Inkubation mit PRL als auch nach ausschließlicher Stimulationmit LPS (p < 0,05) zu erkennen. In Verbindung von Vorinkubation mit PRL und Stimulati-on mit LPS wird eine etwa 3,5-fache Verstärkung der Signalintensität erreicht (p < 0,01).Dies lässt einen Effekt vermuten, der den eines reinen additiven übersteigt und somit einemüberadditiven-synergistischem entspricht (siehe Diskussion, Kapitel 4.1.3).

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Abbildung 21: Phosphoimager basierte quantitative Auswertung dreier EMSAs von IRF-1Dargestellt ist das Maß der Aktivierung von IRF-1 unter den dargestellten Stimulationsbedingungenals x-fache Verstärkung der Signalintensität im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle.Mittelwert und Standardfehler des Mittelwertes sind gezeigt* = signifikant versus unstimulierter Kontrolle oder entsprechender Probe: p < 0,05K = unstimulierte Kontrolle

3.1.4 Einfluss von PRL auf die Aktivierung von STAT5b in PBMC

Aufgrund des offensichtlichen Klärungsbedarfs, der sich aus der Tatsache ergibt, dass es beiInkubation mit PRL sowohl zur Aktivierung von NF-κB als auch von IRF-1 kommt, aller-dings bei nachfolgender Stimulation mit LPS eine signifikante Änderungen der Zytokinsyn-these bewirkt, wurde der Einfluss von PRL auf die Aktivierung von Signal transducers andactivators of transcriptions (STATs) untersucht. Im Zusammenhang mit der Signaltransduk-tion über den PRL-Rezeptor ist STAT5b von enormer Bedeutung. Von STAT5b ist bekannt,dass es dieNF-κB-vermittelte Signaltransduktion hemmt (siehe Einleitung).Es wurden daher Kernextrakte aus PBMC, welche nach dem in Abbildung 17 dargestelltenSchema stimuliert worden waren, semiquantitativ mit einem Dotblot (n = 5) auf das Vorhan-densein von STAT5b untersucht.STAT5b: Ein typischer Dotblot für STAT5b ist in Abbildung 22 dargestellt.Abbildung 22 ist zu entnehmen, dass sich die stärksten Indikatorreaktionen in den Kulturan-sätzen fanden, die allein mit PRL inkubiert wurden, was auf einen hohen Gehalt der Kern-extrakte an STAT5b schließen lässt. In den Stimulationsansätzen mit LPS findet sich eine

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3.2 Prolaktinsynthese durch PBMC 3 ERGEBNISSE

Abbildung 22: repräsentativer Dotblot mit Antikörpern gegen STAT5b (n = 5)Die Ansätze PRLünd PRL+LPS"wurden mit einer PRL-Endkonzentration von 300 ng/ml für1 h vorinkubiert. Anschließend wurden die Ansätze LPSünd LPS+PRLmit LPS (100 ng/ml) für 30min stimuliert. Die Kernextrakte wurden nach 1,5 h Gesamtinkubationszeit gewonnen.Die Farbintensität ist der Konzentration an STAT5b im Kernextrakt proportional.PBS = absolute Kontrolle

deutlich geringere Farbintensität entsprechend einer geringeren Konzentration an STAT5bim Kernextrakt im Vergleich zur mit PRL inkubierten Probe kommt. Bei Vorinkubation mitPRL und nachfolgender Stimulation mit LPS kommt es zu einer stärkeren Farbreaktion alsbei alleiniger LPS-Stimulation, aber zu einer geringeren Reaktion als bei alleiniger PRL-Inkubation. Durch das Zusammenwirken von PRL und LPS müssen also geringere Konzen-trationen von STAT5b in den Kern transferiert werden als durch alleinige PRL-Inkubation.

3.2 Prolaktinsynthese durch PBMC

Um einen möglichst sicheren und biologisch umfassenden Nachweis einer eventuellen Syn-these von PRL durch PBMC zu führen, wurden drei unterschiedliche Ebenen der Generie-rung von Proteinen in eukaryontischen Zellen betrachtet. Im Einzelnen wurde gemessen:

1. die Aktivität von aus PBMC gewonnenen Kernextrakten bezüglich der Bindung an eincAMP responsive element in der Promotorregion für extrahypophysäres PRL mittelsEMSA,

2. die mRNA für extrahypophysäres PRL in PBMC mittels GEArray und RT-PCR,

3. die Konzentration an PRL in Kulturüberständen von PBMC.

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3.2.1 Versuch des Nachweises einer möglichen PRL-Synthese auf Ebene der Tran-skriptionsfaktoren

Wie bereits in der Einleitung dargestellt, gelang Berwaer et al. der Nachweis von CREs(TgACg) in der Promotorregion für extrahypophysäres Prolaktin u.a. in der Nähe der TATAA-Box (-20 bis 25) [6].Für den Nachweis der Transkriptionsfaktoren mittels EMSA wurde als Oligonukleotid einAbschnitt aus dem Exon 1a des Prolaktinspromotors, der den in Abbildung 1 gelb markiertenBereich enthält, verwendet.Inkubiert wurden PBMC mit PRL für 30 min, um eine eventuelle positive Rückkopplungeiner etwaigen PRL-Synthese durch extrazelluläres PRL zu erfassen. Zudem wurden Expe-rimente mit PHA-Stimulation durchgeführt. Stimuliert wurde entsprechend denen in Tabelle

6 aufgeführten Bedingungen.

Ansatz PHA PRLKontrolle (K) - -PHA 5 µg/ml -PRL - 300 ng/ml

Tabelle 6: Bedingungen für die Inkubation mit PRL und PHA; Inkubation über 30 min

Abbildung 23 zeigt einen repräsentativen EMSAs (n = 5). Setzt man die Signalintensität derspezifischen Banden optisch in Beziehung zur Gesamtintensität der jeweiligen Spuren, solässt sich feststellen, dass das Verhältnis dieser Größen nach Stimulation mit PHA und PRLin etwa dem der Kontrolle entspricht. Die quantitative Auswertung mittels Phosphoimagerzeigte demzufolge keine statistischen Signifikanzen für die Beeinflussung der Signalinten-sität durch Stimulation mit PHA und PRL. Dementsprechend lässt sich die CRE-Bindungs-aktivität des PRL-Promotors weder durch PHA noch durch PRL im Vergleich zur unstimu-lierten Kontrolle erhöhen.Weiter wurden PBMC mit cptcAMP, PMA, PHA und Noradrenalin (NA) mit den in Tabelle

3 aufgelisteten Endkonzentrationen über 20 min, 1 h, 3 h, 7 h, 10 h, 14 h, 17 h und 21h stiumiert. Hier zeigte sich nach 20 min im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle einevermehrte Bindungsaktivität von CRE nach Stimulation mit cptcAMP allein oder cptcAMP+ PHA und eine noch stärkere Bindungsaktivität bei Stimulation mit cptcAMP + PMA +PHA, jedoch nicht bei cptcAMP + PMA.Es wurde kein Anstieg der Bindungsaktivität für CRE nach Stimulation mit Noradrenalingemessen.

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Abbildung 23: Repräsentativer EMSA nach Stimulation mit PHA und PRL von n = 5Untersucht wurde die Aktivierung von Stimulation des Ansatzes PRL mit einer PRL-Konzentrationvon 300 ng/ml und des Ansatzes PHA mit einer PHA-Konzentration von 5 µg/ml über 30 minDie Intensität der spezifischen Banden bezogen auf die Intensität der gesamten Spur entsprechen fürPHA und PRL etwa der der Kontrolle;K = unstimulierte Kontrolleaqua = Wasserkontrolle (absolute Kontrolle)

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Die Bindungsaktivität nahm mit der Stimulationszeit zu, erreichte bei 10 h ihr Maximum, umdann abzusinken und nach 21 h wieder das Niveau der unstimulierten Kontrolle zu erreichen.Ein repräsentativer EMSA von n = 5 für eine Stimulationszeit von 10 h ist in Abbildung 24

gezeigt.

Abbildung 24: Repräsentativer EMSA nach Stimulation mit cptcAMP, PHA, PMA und NA aus

n = 5

Es wurde über 10 h mit den in Tabelle 3 aufgeführten Endkonzentrationen der einzelnen Stimulantien

stimuliert. Die Intensität der spezifischen Banden bezogen auf die Intensität der gesamten Spur ist für

cptcAMP+PHA+PMA deutlich höher als für die unstimulierte Kontrolle

K = unstimulierte, aqua = Wasserkontrolle (absolute Kontrolle)

3.2.2 Versuch des Nachweises einer möglichen PRL-Synthese auf Ebene der mRNA

Mittels GEArray sowie RT-PCR wurde die Fragestellung auf Ebene der mRNA untersucht.

3.2.2.1 Untersuchung mittels GEArray: Hierfür wurde ein kommerziell erhältlicherCustomer Array, auf dem ein DNA-Stück aus dem plazentaren humanen PRL-Gen aufgetra-gen ist, verwendet. Zudem wurde mit dieser Methode die Expression von mRNA für IFN-γ,

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IRF-1 und für den Prolaktinrezeptor untersucht. Als interne Kontrolle dafür, dass die un-tersuchte Probe auch tatsächlich RNA enthält, sind auf jeder Membran DNA-Abschnitte fürGlyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) und β-Aktin als typische Housekeeping-Gene, welche auch in anderen Methoden wie der PCR als solche verwendet werden, aufge-tragen. GAPDH ist ein wichtiges Enzym der Glykolyse, das in fast allen Geweben in hohemMaße synthetisiert wird und damit als stimulationsunabhängige Positivkontrolle gilt. Auchβ-Aktin wird von nahezu allen Geweben gebildet.In diesem Versuchsaufbau wurden ebenfalls zunächst mögliche rückkoppelnde Mechanis-men von PRL auf seine Synthese durch Stimulation mit PHA, PRL und PHA + PRL unter-sucht. Die RNA-Extraktion wurde nach 30 min Stimulation gestartet.Abbildung 25 zeigt einen typischen GEArray aus n = 7 für mit PHA und PHA+PRL stimu-lierte PBMC.Es fanden sich in allen Versuchsreihen starke Signale für die Positivkontrollen und in mitPHA, PRL oder PHA + PRL inkubierten Ansätzen Signale für IFN-γ. In einer Versuchsreihekonnten wir im mit PHA+PRL inkubierten Ansatz RNA für IRF-1 nachweisen.In keinem der Versuche fanden sich Signale für PRL oder den PRL-Rezeptor.

Abbildung 25: Repräsentativer Gearray nach Stimulation mit PHA und PRL aus n = 7Stimulation über 30 min mit einer PHA-Konzentration von 5 µg/ml und einer PRL-Konzentration von300 ng/ml. Es sind deutliche Signale für die beiden Positivkontrollen und bei PHA und PHA+PRLfür IFN-γ zu sehen. K = unstimulierte Kontrolle

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Weiter wurden PBMC aus vier Buffycoats mit cptcAMP, PMA, PHA und Noradrenalin (NA)über 20 min, 1 h, 3 h, 7 h, 10 h, 14 h, 17 h, 21 h und 24 h mit den in Tabelle 3 aufgelistetenEndkonzentrationen stimuliert. Es zeigten sich in allen Ansätzen deutliche Signale für diebeiden Positivkontrollen. In den mit cptcAMP + PMA, cptcAMP + PHA und cptcAMP +PMA + PHA stimulierten Ansätzen fanden sich zudem Signale für IFN-γ. Nach Stimulationmit cptcAMP + PHA + PMA trat weiter ein Signal für IRF-1 auf.Abbildung 26 zeigt einen typischen GEArray für Stimulation mit cptcAMP, cptcAMP+PHA,cptcAMP+PMA und cptcAMP+PHA+PMA. Unter allen Stimulationsbedingungen sind diebeiden Positivkontrollen deutlich zu erkennen, weiter finden sich in den mit cptcAMP +PMA, cptcAMP + PHA und cptcAMP + PMA + PHA stimulierten Ansätzen Signale fürIFN-γ. Ebenfalls zeigt sich das oben beschriebene Signal für IRF-1 nach Stimulation mitcptcAMP+PHA+PMA.Auch in diesem Versuchsaufbau wurde kein Signal für PRL oder seinen Rezeptor detektiert.

Abbildung 26: Repräsentativer GEArray nach Stimulation mit cAMP, PHA und PMAStimulation über 14 h; die Endkonzentrationen der Stimulantien sind in Tabelle 3 aufgelistetEs sind deutliche Signale für die beiden Positivkontrollen auf allen Membranen zu sehen; nach Sti-mulationen mit cptcAMP + PMA, cptcAMP + PHA und cptcAMP + PMA + PHA traten Signale fürIFN-γ auf; in Kostimulation von cptcAMP mit PHA und PMA ist ein Signal für IRF-1 zu sehen. K =unstimulierte Kontrolle

Da entsprechend einschlägiger Literatur [26] der PRLR von PBMC synthestisiert wird, sichaber in keinem unserer Experimente ein Signal für den PRLR fand, wurde als Positivkon-trolle RNA aus duktalen Mamma-Karzinom-Zellen isoliert, um mögliche Fehler in dem Ver-suchssystem auszuschließen. Diese Zellen synthetisieren in hohem Maße den Prolaktinre-zeptor. In dem entsprechenden GEArray zeigte sich ein deutliches Signal für den Prolaktin-

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rezeptor neben den beiden Signalen für die Positivkontrollen (siehe Abbildung 27).

Abbildung 27: Repräsentativer GEArray mit RNA aus Mamma-Karzinom-ZellenEs sind deutliche Signale für die beiden Positivkontrollen zu sehen, zudem ist ein vergleichbar starkes

Signal für den PRLR zu erkennen

3.2.2.2 Untersuchungen mittels RT-PCR: Da die dargestellten Ergebnisse in Wider-spruch zu den bisher in der Literatur publizierten Daten stehen, diese allerdings nicht aufUntersuchungen mittels GEArray, sondern auf RT-PCR-Daten beruhen (siehe Einleitung),sind Unterschiede in der Sensitivität der Methoden als Ursache für die Abweichung derdargestellten Ergebnisse von denen anderer Arbeitsgruppen anzunehmen. Es wurden daherdieselben Proben, die zuvor mittels GEArray untersucht worden waren, mittels RT-PCR un-tersucht. Als Primer wurden kommerziell erhältliche Testkits für PRL, IFN-γ, PRLR undIRF-1 der Firma Superarray eingesetzt. Diese entsprechen exakt den auf den GEArrays auf-getragenen Sequenzen. Als Kontrolle wurden für PRL und PRLR zudem Primer eingesetzt,die mit dem Programm Oligo Explorer (Version 1.1.0) erstellt worden waren, um ein Pro-blem auf Ebene der verwendeten DNA-Sequenzen auszuschließen. Abbildungen 28 und 29

zeigen die Sequenzen und die Annealing-Temperaturen der eingesetzten Primer.

5’ - CTC TGG TGA AGT GTG TTT CC - 3’ upper primer

5’ - CTG AGG AGA GGT TAT GGA TG - 3’ lower primer

Annealing-Temperatur: Tm (annealing) = 59,3◦C

Abbildung 28: Primer für PRL, upper primer blau unterlegt, lower primer gelb unterlegt

Primer mit Programm Oligo Explorer 1.1.0 erstellt

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5’ - GCG ACC TTC ATT CAG ATA CC - 3’ upper primer

5’ - TCA GAA GTG GGA GGA AAG TC - 3’ lower primer

Annealing-Temperatur: Tm (annealing) = 59,3◦C

Abbildung 29: Primer für PRL, upper primer blau unterlegt, lower primer gelb unterlegt

Primer mit Oligo Explorer 1.1.0 erstellt

Für die Synthese der cDNA wurden Proben derselben mRNA wie in den oben beschriebenenVersuchen mit dem Customer Array eingesetzt. Für die Stimulationsreihen mit PHA undPRL ergab sich nach elektrophoretischer Auftrennung des fluoreszierenden PCR-Produktesdas in Abbildung 30 dargestellte Ergebnis.

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Abbildung 30: Ausschnitt aus der elektrophoretische Auftrennung des PCR-Gemisches nachInkubation mit PHA und PRLEs wurde über 30 min mit einer PHA-Konzentration von 5 µg/ml und einer PRL-Konzentration von

300 ng/ml inkubiert. Bei gleicher Intensität der GAPDH-Banden ist ein deutliches Signal für IRF-1

nach PRL-Inkubation zu sehen und Signale für IFN-γ nach Stimulation mit PHA und PHA+PRL.

Der PRLR zeigt das stärkste Signal in der unstimulierten Kontrolle gefolgt von der PRL-inkubierten

Probe. Nach Stimulation mit PHA und PHA+PRL zeigen sich keine Signale. Bei alleiniger PRL-

Inkubation ist in keinem der Ansätze ein Signal zu finden

K = unstimulierte Kontrolle, OE = Der verwendete Primer wurde mit dem Oligo Explorer kreiert. Bei

fehlender Angabe wurden Primer der Firma SuperArray benutzt.

Es zeigt sich, dass wie in den GEArray-Experimenten auch hier weder in der unstimuliertenKontrolle noch nach Inkubation mit PHA und PRL oder PHA + PRL Signale für PRL zusehen sind - weder bei Verwendung des Primers von SuperArray noch bei Benutzung desmit Oligo Explorer hergestellten.Die PCR des PRLR zeigt nach elektrophoretischer Auftrennung des Gemisches deutlicheSignale für die unstimulierte Kontrolle und ein etwas schwächeres Signal bei der PRL-Inkubation bei etwa gleicher Intensität der GAPDH-Kontrolle in beiden Proben. Sowohlbei Stimulation mit PHA als auch bei Inkubation mit PHA und PRL lässt sich ein deutlichschwächeres Signal für PRLR erkennen als in der unstimulierten Kontrolle.Für den Transkriptionsfaktor IRF-1 ist ein deutliches Signal nach Inkubation mit PRL zusehen, die übrigen Signale entsprechen denen der Kontrolle. Auch die zusätzliche Stimulati-on mit PHA wirkt keinesfalls additiv auf die IRF-1-Synthese, sondern vielmehr scheint die

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Wirkung von PRL hier durch zusätzliche Stimulation mit PHA vermindert zu werden.Die PCR für IFN-γ zeigt starke Signale für Stimulationen mit PHA und PHA+PRL, aller-dings kein Signal bei alleiniger Inkubation mit PRL.Die Abbildungen 31 und 32 zeigen die Ergebnisse der PCR nach Stimulationsexperimentenmit cptcAMP, PMA und PHA. Die cDNA wurde aus derselben RNA synthetisiert, die auchmittels GEArrays untersucht wurde. Dementsprechend sind die Stimulationsbedingungenidentisch mit den oben beschriebenen.Abbildung 31 zeigt das PCR-Ergebnis nach 7 h Stimulation der Zellkulturen mit cptcAMP,cptcAMP+PMA, cptcAMP+PHA und cptcAMP+PHA+PMA sowie die unstimulierte Kon-trolle. Bei etwa gleicher Intensität der Banden der GAPDH-Kontrolle finden sich deutlicheSignale für PRL nach Stimulation mit cAMP und cAMP+PHA, während die unstimulierteKontrolle, cAMP+PHA und cAMP+PMA+PHA Signale von deutlicher geringerer Intensitätzeigen. Ebenfalls sind Signale für den PRLR vorhanden, die etwa gleich intensiv sind mitleicht erhöhten Werten bei cAMP+PHA und cAMP.Abbildung 32 stellt das Ergebnis von Zellen desselben Buffycoats nach 14 h Stimulationdar. Für IFN-γ sieht man sehr starke Banden nach Stimulation mit cptcAMP+PHA und cpt-cAMP+PHA+PMA.Der PRLR liefert in der unstimulierten Kontrolle das stärkste Signal. Damit scheint die Neu-synthese des PRLR im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle nach 14 h Stimulation unterallen Stimulationsbedingungen abzunehmen. Dieses Ergebnis zeigte sich sowohl bei Ver-wendung des Primers der Firma SuperArray als auch bei Verwendung des mit dem OligoExplorer entworfenen.Für PRL sind auch nach 14 h Stimulation Signale bei der Stimulation mit cptcAMP undcptcAMP+PHA zu sehen, allerdings tritt nach dieser Zeit auch ein Signal für die Stimulationmit cptcAMP+PMA auf, das in der Versuchsreihe das stärkste ist. Die Synthese von mRNA,die für PRL kodiert, scheint für letztere Bedingungen daher später ein Maximum zu erreichenals bei Stimulation mit cptcAMP+PHA oder cptcAMP. Dieses Ergebnis ließ sich mit beideneingesetzten Primern für PRL reproduzieren.Für IRF-1 entsprechen die Signale in allen Versuchsreihen Signale denen der unstimuliertenKontrolle.

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Abbildung 31: Ausschnitt aus der elektrophoretischen Auftrennung des PCR-Gemisches nachStimulation mit cptcAMP, PHA und PMAStimulation über 7 h; die Endkonzentrationen der Stimulantien sind in Tabelle 2 aufgelistetBei etwa gleicher Intensität der GAPDH-Banden sind die Banden für den PRLR in allen Stimulatio-nen etwa entsprechend der Intensität der Bande der unstimulierten Kontrolle. Deutliche Banden fürPRL sind bei Stimulation mit cptcAMP und cptcAMP+PHA zu sehenK = unstimulierte Kontrolle, cAMP = cptcAMP, CPP = cptcAMP+PHA+PMAOE = Der verwendete Primer wurde mit dem Oligo Explorer kreiert. Bei fehlender Angabe wurdenPrimer der Firma SuperArray benutzt.

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Abbildung 32: Ausschnitt aus der elektrophoretischen Auftrennung des PCR-Gemisches nachStimulation mit cAMP, PHA und PMAStimulation über 14 h; die Endkonzentrationen der Stimulantien sind in Tabelle 3 aufgelistetBei etwa gleicher Intensität der GAPDH-Banden sind bei Stimulation mit cptcAMP+PHA und cpt-cAMP+PHA+PMA deutliche Banden für IFN-γ zu sehen. Die stärksten Signale für den PRLR tre-ten bei der unstimulierten Kontrolle auf. Banden für PRL sind bei Stimulation mit cptcAMP, cpt-cAPMP+PMA und cptcAMP+PHA zu sehen, die stärkste Bande tritt hier bei Stimulation mit cpt-cAMP+PMA auf. Die IRF-1-Banden entsprechen in ihrer Intensität in allen Ansätzen der Intensitätder Bande der unstimulierten Kontrolle.K = unstimulierte Kontrolle, cAMP = cptcAMP, CPP = cptcAMP+PHA+PMAOE = Der verwendete Primer wurde mit dem Oligo Explorer kreiert. Bei fehlender Angabe wurdenPrimer der Firma SuperArray benutzt.

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Abbildung 33: Ausschnitt der elektrophoretischen Auftrennung des PCR-Gemisches aus cDNAvon Mamma-Karzinom-Zellen Es ist ein deutliches Signal für den PRLR zu erkennen bei fehlendem

Signal für PRL

OE = Der verwendete Primer wurde mit dem Oligo Explorer kreiert. Bei fehlender Angabe wurden

Primer der Firma SuperArray benutzt.

Abbildung 33 zeigt das Ergebnis der PCR mit cDNA, die aus mRNA einer duktalen Mamma-Karzinom-Zelllinie gewonnen wurde. Hier findet sich ein deutliches Signal für den PRLRund kein Signal für PRL. Bei einer Zyklenzahl von 35 und Verwendung des Primers, dermit dem Oligo Explorer entworfen wurde, ist das Signal für den PRLR deutlich stärker alsdie entsprechenden Signale in den vorangegangenen Abbildungen. Da diese Probe auch zueinem Signal für PRLR im GEArray führte, lässt sich aufgrund der Signalunterschiede fol-gern, dass der Grund der Differenzen zu den Ergebnissen der GEArrays in der geringerenSensitivität des GEArrays zu suchen ist (siehe Diskussion).

3.2.3 Versuch des Nachweises auf Ebene des Proteins

Um zu klären, ob das fertige Protein PRL im Überstand der PBMC in endokrin bedeutsa-men Konzentrationen nachzuweisen ist, benutzten wir einen ELISA von der Firma Roche(Elecsys-System). Wir stimulierten Zellen mit cAMP, cAMP + PHA, cAMP + PMA, cAMP+ PHA + PMA und Noradrenalin unter denselben Bedingungen wie oben dargestellt. In denÜberständen konnten wir - bei einer unteren Nachweisgrenze von 5,6 ng/ml - kein PRL de-tektieren. Geht man davon aus, dass das PRL von PBMC in denselben Konzentrationen wie

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andere Zytokine, z.B. IL-12 und TNF-α, immunologisch akiv ist, so ist die Sensitivität desElecsys zu gering, um Aussagen über die PRL-Synthese in PBMC treffen zu können.

70

4 DISKUSSION

4 DISKUSSION

In der vorliegenden Arbeit wurde das zytokinartige Verhalten des Hormons PRL untersucht.Zum einen wurde der Einfluss von PRL auf die Zellen des Immunsystems bzw. auf PBMCbeleuchtet, zum anderen die Frage einer etwaigen Synthese von PRL durch Immunzellen.Wie in der Einleitung bereits dargestellt, ist die Zytokin-Sekretion durch Immunzellen nichtFolge einer Freisetzung aus intrazellulären Speichern, sondern Zytokine werden nach ent-sprechender Zellaktivierung neu synthetisiert und anschließend schlagartig freigesetzt. Daaufgrund der starken Bindung der Zytokine an ihren Rezeptor extrem geringe Mengen ei-nes Zytokins genügen, um einen biologischen Effekt zu erzielen, können mit kommerziellerhältlichen Nachweissystemen für PRL, die endokrine und damit systemisch aktive Kon-zentrationen von PRL messen, keine definitive Aussage zu einer etwaigen Synthese immu-nologisch aktiver Konzentrationen von PRL durch PBMC getroffen werden. Da aber dieZytokin-Sekretion auf Neusynthese beruht, untersuchten wir die Synthese von PRL auf Ebe-ne der Aktivierung von Transkriptionsfaktoren und der Bildung von mRNA für PRL.Eine weitere Eigenschaft von Zytokinen ist die Beeinflussung der Synthese anderer Zytoki-ne. Diesbezüglich führten wir ausführliche Untersuchungen zum Einfluss von PRL auf dieSynthese von TNF-α, IL-12, IFN-γ und IL-10 sowie auf die Aktivierung der Transkriptions-faktoren IRF-1 und IFN-γ durch.Da Zytokine nicht antigenspezifisch sind, ist es von großer Wichtigkeit für die Spezifitätdes Immunsystems, dass die Empfindlichkeit der Zielzellen für ein Zytokin und damit dieExpression von Zytokinrezeptoren durch äußere Signale reguliert werden kann. Wir unter-suchten in diesem Zusammenhang die Neusynthese von PRLR unter unterschiedlichen Sti-mulationsbedingungen. Ein besonders interessanter Aspekt war hier die Frage des Verhaltensunter PRL-Inkubation. Zum einen könnte man eine verminderte Neusynthese im Sinne einesSchutzes vor Überaktivierung erwarten, wie es für Hormone typisch ist. Es wäre zum ande-ren auch plausibel, dass eine vermehrte Neusynthese von PRLR im Sinne einer gesteigertenEmpfindlichkeit der Zielzelle für weitere PRL-Moleküle stattfindet, wie man es von Zyto-kinen kennt, die in deutlich geringeren Konzentrationen an einer immunologischen Synapsewirken.

4.1 Einfluss von hypophysärem Prolaktin auf das Immunsystem

Es sei deutlich darauf hingewiesen, dass bei unseren Untersuchungen zu der Wirkung vonPRL auf Immunzellen hypophysäres humanes PRL verwendet wurde. Die Frage, ob sichetwaiges von Immunzellen synthetisiertes PRL genauso verhält, kann nach dem aktuellen

71

4.1 Einfluss von hypophysärem Prolaktin auf das Immunsystem 4 DISKUSSION

Stand der Literatur nicht beantwortet werden.In der Einleitung wurde in Kapitel 1.5 die in der Literatur vielfach vorbeschriebene im-munmodulatorische Wirkung von hypophysärem PRL dargestellt. Da es jedoch zumindestscheinbar gegensätzliche Ergebnisse einzelner Arbeitsgruppen gibt, ist die in Kapitel 1.5 dar-gestellte Wirkung keinesfalls unumstritten. In Experimenten mit PRLR-defizienten Mäusenbeispielsweise konnte die Arbeitsgruppe um Bouchard keine nennenswerten Immundefektefeststellen [9].Im Folgenden sind zwei offensichtlich konträre Ergebnisse einander gegenübergestellt:

Our results (...) directly show that the PRL/PRLR ligand receptor system is not essen-tial for normal immune system develop-ment.Our data further demonstrate that PRLRsignaling is not required for normal immu-nity and call into question the numerous re-ports attributing a major role for PRL inimmunoregulation.

In vivo scheint Prolaktin vielfältige Wir-kungen auf immunologische Funktionenzu haben (...).Bei Mäusen, denen einmal täglichmehrere Tage lang pharmakologische Do-sen von Prolaktin subkutan appliziert wur-de, zeigte sich bei den Lymphozyten in derMilz ein dosisabhängiger Anstieg in B- undT-Zellaktivität.

Bouchard B, Ormandy CJ, Di Santo JP, Kelly PA.,Immune system development and function in pro-lactin receptor-deficient mice, J Immunol. 1999,[9]

Schedlowski, Tewes; Psychoneuroimmunologie,1996, [69]

Ob und wie diese Ergebnisse miteinander zu vereinbaren sind, ist Gegenstand aktueller Dis-kussionen. Ein möglicher Aspekt zur Erklärung ist, dass Zytokinfunktionen immer redundantsind und somit andere Zytokine die Funktion von PRL bei den knock out Mäusen überneh-men können [79]. Somit wäre der aufgezeigte Gegensatz nur ein scheinbarer.Ein Ziel unserer Untersuchungen war es, durch in vitro-Versuche die Wirkungen von PRL aufmenschliche Immunzellen möglichst genau zu untersuchen, um Effekte für den Makroorga-nismus und Beeinflussungen im Mikromileu der Zelle fundiert diskutieren zu können. Dazuwar es nötig, Signalverstärkungen und -auslöschungen auf Ebene der Transkriptionsfaktorenzu untersuchen. In der Literatur ist IRF-1 als ein von PRL aktivierter Transkriptionsfaktorweitaus am meisten und besten untersucht. Zu einer direkten Beeinflussung des nach demaktuellen Wissensstand wichtigsten proinflammatorischen Transkriptionsfaktor NF-κB lie-gen bis auf die von uns erhobenen, in dieser Arbeit dargestellten und in [10] publiziertenDaten bisher keine Ergebnisse vor.Es werden daher zunächst die bisher veröffentlichten Daten zu der Aktivierung von IRF-1durch PRL dargestellt und im Hinblick auf unsere Ergebnisse zu IRF-1 und NF-κB diskutiert.

72


4.1.1 Aktivierung von IRF-1 durch PRL

In der Einleitung wurde die Bedeutung von IRF-1 für das Immunsystem dargestellt. DasIRF-1-Gen wird in hohem Maße durch PRL aktiviert. Der Promotor enthält unter anderemBindungsstellen für NF-κB, Specificity Protein-1 (Sp1) und eine Interferon γ activated site(GAS). Die meisten Zytokine beeinflussen das IRF-1 Gen durch Aktivierung von STATs, diewiederum entweder mit dem GAS Element interagieren oder durch Translokation von NF-κB in den Zellkern das IRF-1 Gen aktivieren [79]. Wie in der Einleitung dargestellt, ist derPrototyp der Signaltransduktion nach Aktivierung des PRL-Rezeptors der Jak/STAT-Weg.Die funktionelle Aktivierung der STATs erfolgt dabei nicht nach dem “Alles-oder-Nichts-Prinzip”, sondern wird vielmehr durch Interaktion mit Kernproteinen - den Koaktivatoren- moduliert. Am besten untersucht sind dabei die sogenannten Adapterproteine p300/CBP.Diese binden nicht direkt an DNA, sondern modulieren als größere Einheit viele Proteinein ihrer Aktivität, die wiederum an DNA binden [32]. Sie entscheiden dabei über die Rei-henfolge, in der Gene einer Zelle transkribiert werden. Unterschiedliche Untereinheiten vonp300/CBP scheinen mit STAT1 zu interagieren [32], eine dieser auch mit STAT5 [63]. Obhierbei kompetetive Effekte auftreten, ist bislang nicht bekannt [79].Die Beeinflussung des IRF-1 Gens durch PRL geschieht nun auf zwei unterschiedlichenWegen [79]:

1. PRL aktiviert STAT1. Dieses transloziert in den Kern und bindet an das GAS-Elementdes IRF-1 Promotors, was dessen Aktivierung nach sich zieht. Zudem ist eine Sp1 -Bindungsstelle entscheidend für die Aktivierung des IRF-1 Gens. Voraussetzung ist dieAnwesenheit von p300/CBP. Wahrscheinlich wird das IRF-1 Gen durch die Bildungeines Komplexes aus Sp1, STAT1 und p300/CBP aktiviert.

2. PRL aktiviert STAT5b. Yu-Lee et al. diskutieren, dass Stat5b vermutlich das in be-grenztem Ausmaß vorhandene p300/CBP verbraucht und damit die Bildung des Kom-plexes aus STAT1, Sp1 und p300/CBP verhindert [79].

Zudem kann durch eine TNF-α-vermittelte Aktivierung von NF-κB und anschließende Bin-dung von NF-κB an die entsprechende Bindungsstelle des IRF-1 Promotors das IRF-1 Genaktiviert werden. Auch hierzu ist die Anwesenheit von p300/CBP Voraussetzung, so dassSTAT5b die Wirkungen von NF-κB auf IRF-1 hemmen kann [79]. NF-κB wirkt synergi-stisch mit STAT1 auf die Aktivierung des IRF-1 Promotors, jedoch antagonisiert STAT5bdie Wirkungen von NF-κB auf das IRF-1 Gen. Sowohl STAT1 als auch STAT5b werdendurch PRL aktiviert [79].Die beschriebenen Mechanismen sind in Abbildung 34 zusammengefasst.

73


Abbildung 34: Mechanismus der Regulation der Transkription des IRF-1 Gens durch PRL1. Viele Mediatoren verstärken die IRF-1 Aktivierung durch PRL wie STAT1, Sp1 und p300/CBP2. STAT5b inhibiert die Transkription von IRF-13. Der IRF-1 Promotor kann durch STAT1 und durch TNFα-aktiviertes NF-κB aktiviert werden.Somit kann PRL über STAT5b die TNF-α-induzierte IRF-1-Aktivierung inhibierenAbbildung modifiziert nach Yu-Lee L-Y. Stimulation of interferon regulatory factor-1 by prolactin.Lupus 10(2001), 591-599, [79]

74


4.1.2 Aktivierung von NF-κB durch PRL

Die umfassende Bedeutung von NF-κB für das Immunsystem wurde bereits in der Einlei-tung dargestellt. Eine Aktivierung von NK-κB durch PRL ist bisher in der Literatur nichtbeschrieben. Die Ergebnisse von Yu-Lee et al. legen ganz im Gegenteil eine indirekte nega-tive Beeinflussung der NF-κB-vermittelten Wirkungen durch PRL nahe (siehe Kapitel 4.1.1)

4.1.3 Einordnung der eigenen Ergebnisse zur Beeinflussung von IRF-1 und NF-κBdurch PRL

Die in dieser Arbeit dargestellten Untersuchungen zeigen, dass PRL auch in PBMC denIRF-1 Promotor aktiviert. Dies entspricht den von Yu-Lee et al. publizierten Ergebnissen[79]. Dass die Aktivierung vom Ausmaß her dem außerordentlich starken Stimulus LPSentspricht, ist in der Tat sehr überraschend und wird im Hinblick auf die zu erwartendeAktivierung von Zytokinen diskutiert (siehe Kapitel 4.1.4).LPS bewirkt die Aktivierung und Translokation von NF-κB in den Kern. Da NF-κB denIRF-1-Promotor durch Bindung an seine NF-κB-Bindungsstelle aktiviert, liegt die Vermu-tung nahe, dass die Aktivierung des IRF-1 Gens unter LPS-Stimulation Folge der erhöhtenintranukleären NF-κB-Spiegel ist. Unsere Ergebnisse zeigen, dass LPS sowohl NF-κB alsauch IRF-1 um das etwa 1,5fache verglichen mit der unstimulierten Kontrolle aktiviert. Die-se Daten stützen die Hypothese, dass eine durch LPS induzierte Aktivierung von IRF-1 Folgeerhöhter intranukleärer Konzentrationen von aktiviertem NF-κB ist.Weiter konnten wir zeigen, dass eine PRL-Inkubation ebenfalls eine direkte Aktivierung undTranslokation von NF-κB in den Zellkern zur Folge hat - und zwar in demselben bzw. ehernoch höherem Ausmaß als LPS.Geht man unseren Ergebnissen zufolge davon aus, dass PRL NF-κB in vergleichbarem Aus-maß wie LPS aktiviert, und verknüpft man dies mit der Tatsache, dass PRL eine starkeAktivierung von STAT1 bewirkt [80], so sollte man sogar erwarten, dass PRL den IRF-1-Promotor weitaus stärker aktiviert als LPS. Unseren Ergebnissen zufolge aktivieren PRLund LPS den IRF-1-Promotor jedoch in vergleichbarem Außmaß.Eine Erklärungsmöglichkeit für diesen scheinbar widersprüchlichen Sachverhalt ist die gleich-zeitige Aktivierung von STAT1 und STAT5b durch PRL. Dabei wird die Wirkung von NF-κBauf den IRF-1-Promotor durch STAT5b stark limiert, gleichzeitig wird das IRF-1 Gen jedochan anderer Stelle des Promotors unabhängig davon durch STAT1 aktiviert.In Kostimulation mit LPS und PRL wurde gezeigt, dass sowohl NF-κB als auch IRF-1 inihrer Aktivität um das 3- bis 3,5-fache erhöht werden im Vergleich zur unstimulierten Kon-trolle. Bezüglich der Aktivierung von NF-κB lässt sich dies als additive Wirkung der Ein-

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zeleffekte von LPS und PRL auffassen. Für IRF-1 müsste man jedoch eigentlich - dem inKapitel 4.1.1 dargestellten und in der Literatur beschriebenen Mechanismus [80, 79] folgend- eine Limitierung der Wirkung von NF-κB und STAT1 auf IRF-1 durch STAT5b erwarten.Die in unseren Ergebnissen nachgewiesene 3,5- bis 4-fache Erhöhung der intranukleärenIRF-1 Spiegel bei Kostimulation mit PRL und LPS ist jedoch überadditiv synergistisch. InKontradiktion zu dem von Yu-Lee et al. publizierten, in Kapitel 4.1.1 dargestellten Modellzeigen wir zumindest eine uneingeschränkte additive Wirkung, eher sogar einen superaddi-tiven synergistischen Effekt, keinesfalls jedoch eine Effektlimitierung.In einer PCR im Rahmen ähnlicher Stimulationsexperimente mit PHA, führt Kostimulationvon PHA+PRL zu einer Transkription von IRF-1 in ähnlichem Ausmaß wie alleinige Stimu-lation mit PHA. Die höchsten Konzentrationen an IRF-1 mRNA finden sich in diesem Ver-suchsaufbau bei alleiniger Inkubation mit PRL. Dementsprechend scheint die beschriebenesuperadditive synergistische Beeinflussung einer Reaktion auf inflammatorische Stimuli füreine Kostimulation mit LPS spezifisch zu sein.Diese Ergebnisse könnten durch ein Zusammenspiel folgender Mechanismen erklärt werden:

1. LPS und PRL induzieren durch additive Wirkung eine starke NF-κB-Aktivierung,sodass - relativ gesehen zum nur durch PRL aktivierten STAT5b - ein großer Über-schuss an NF-κB vorliegt. Die Mengen an STAT5b im Kern reichen daher nicht aus,um die Wirkung von NF-κB, das zusätzlich durch LPS aktiviert wird, zu limitieren.

2. LPS und PRL bewirken eine geringere Aktivierung von STAT5b als PRL allein, sodass zusätzlich zum relativen Überschuss an NF-κB auch absolut gesehen wenigerSTAT5b im Kern vorhanden ist.

Der erste Mechanismus würde einen additiven Effekt bei Kostimulation erklären, im Zusam-menwirken mit dem zweiten auch eine gegenseitige Verstärkung der Einzelwirkungen.In Dotblot-Versuchen, die wir mit einer unstimulierten Kontrolle, PRL- und LPS-stimuliertenPBMC sowie mit PRL und LPS- kostimulierten Zellen durchführten, fanden wir eine starkvermehrte Konzentration von STAT5b im Kern nach alleiniger Inkubation mit PRL vergli-chen mit der Kostimulation mit PRL und LPS. Dies stützt die Annahme einer vermindertenAktivierung von STAT5b bei Kostimulation.Dementsprechend lässt sich die Abbildung 34 wie in Abbildung 35 dargestellt erweitern.Ein möglicher Mechanismus zur LPS-spezifischen verminderten Aktivierung von Stat 5 beiKostimulation ist die Inhibition über Src homology 2-containing protein tyrosine phosphatase-1 (SHP-1) . Das Prinzip der Wirkung von SHP-1 auf Stat 5 wurde in der Einleitung dargestelltund ist in Abbildung 36 zusammengefasst.

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Abbildung 35: Möglicher Mechanismus der Regulation der Transkription des IRF-1 Gensdurch PRL und LPS in Kostimulation1. PRL aktiviert das IRF-1 Gen durch Aktivierung von STAT1 und NF-κB. Die Akitivierung vonSTAT5b durch PRL limitiert diesen Effekt.2. LPS wirkt kostimulatorisch zu PRL durch zusätzliche Aktivierung von NF-κB und verminderteAktivierung von STAT5b

Abbildung 36: Inhibitorische Rolle von SHP-1 in der Jak2/STAT5-Kaskade;1. Bindung an Rezeptor / Jak2-Komplex

2. Phosphorylierung der SHP-1-Tyrosinreste und Aktivierung von Grb2 und SOCS-1

3. SOCS-1 bindet an Jak2

4. Hemmung der Aktivierung von STAT5

nach Minoo et al., A novel SHP-1/Grb2-dependent mechanism of negative regulation of cytokine-

receptor signaling: contribution of SHP-1 C-terminal tyrosines in cytokine signalling; Blood, 103(4),

2004, [55]

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SHP-1 ist ein Protein, von dem andererseits berichtet wurde, dass es in Zusammenhang mitSignaltransduktion von LPS über CD14/Toll-like-Rezeptor (TLR) 4 steht und hier eine Re-gulatorfunktion für das Ausmaß der inflammatorischen Reaktion einer Zelle auf LPS ausübt[61]. Es scheint damit wahrscheinlich, dass LPS über Aktivierung von SHP-1 auch die In-aktivierung von STAT5 bewirkt. Dieses entspräche einem LPS-spezifischen Effekt, der imEinklang mit unseren PCR-Ergebnissen bei Stimulationsreihen mit PHA und PRL steht.

4.1.4 Beeinflussung der Zytokinsynthese durch PRL

Um die Bedeutung erhöhter Prolaktinspiegel im Blut für das Geschehen proinflammatori-scher Prozesse zu erfassen, haben wir in Vollblutansätzen die Konzentrationen von TNF-α,IL-12, IFN-γ und IL-10 nach Stimulation mit PRL und LPS + PRL gemessen und mit der un-stimulierten Kontrolle verglichen. Die Stimulation mit LPS + PRL stellt ein in vitro-Abbilddes Einflusses von PRL auf einen bereits initiierten proinflammatorischen Prozess dar. Diealleinige Stimulation mit PRL zeigt den Effekt ohne weitere proinflammatorische Agentien.Unsere Versuchsreihen zeigten zunächst, dass die alleinige Inkubation mit PRL die Konzen-tration keines der gemessenen Zytokine in statistisch signifikantem Ausmaß beeinflusst. Diesscheint im Widerspruch zur vermehrten Aktivierung der Transkriptionsfaktoren NF-κB undIRF-1 zu stehen, denn schließlich sollten erhöhte IFN-γ-Spiegel als unmittelbare Folge ver-mehrter Aktivierung von IRF-1 entstehen. Es müssen hier noch weitere, bisher unbekannteMechanismen eine Rolle spielen, durch die nach der Aktivierung der entsprechenden Tran-skriptionsfaktoren die Synthese des Zytokins inhibiert wird. Da wir auch in der PCR nachStimulation mit PRL zwar starke Banden in der IRF-1-PCR, jedoch keine in der IFN-γ-PCRdetektieren konnten, liegt die Vermutung nahe, dass diese Inhibierung durch Deaktivierungder Transkriptionsfaktoren stattfinden muss, da es nicht zur Synthese von mRNA zu kommenscheint, oder aber auch posttranskriptionelle Mechanismen wären denkbar.Für Zytokine wie IL-12, die als Folge der Aktivierung von NF-κB entstehen, könnte auch dieAktivierung von STAT5b durch PRL eine entscheidende Rolle spielen, da hier ein analogerEinfluss zur Limitierung der NF-κB-bedingten IRF-1-Aktivierung möglich wäre.In Kostimulation von PRL und LPS ergibt sich eine vermehrte Sekretion von TNF-α, IFN-γund IL-12 verglichen zur alleinigen Stimulation mit LPS. Dabei besteht eine Abhängigkeitvon der Konzentration an PRL. Diese Effekte entsprechen denen auf der Ebene der Tran-skriptionsfaktoren beschriebenen.Zusammenfassend sind die einzelnen Ergebnisse nochmals in Tabelle 7 dargstellt.

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Stimulans Wirkung auf die Freisetzungvon TNF-α, IL-12, IFN-γ durchPBMC

Wirkung auf Transkriptionsfak-toren

PRL keine vermehrte Freisetzung imVergelich zur unstimulierten Kon-trolle

Aktivierung von NF-κB und IRF-1

= ↑LPS deutlich vermehrte Freisetzung im

Vergleich zur unstimulierten Kon-trolle

Aktivierung von NF-κB und konse-kutiv IRF-1

↑ ↑PRL + LPS vermehrte Freisetzung im Vergleich

zur LPS-StimulationAddition der Einzeleffekte in Be-zug auf die Aktivierung von NF-κBüberadditiver synergistischer Effektauf die Aktivierung von IRF-1

↑ ↑ ↑ ↑

Tabelle 7: Wirkung von PRL auf proinflammatorische Prozesse

4.1.5 Zustände von Hyperprolaktinämie und mögliche klinische Bedeutungen

Um den in vitro-Ergebnissen, nach denen PRL proinflammatorische Prozesse verstärkt, in vi-

vo-Situationen zuzuordnen, werden im Folgenden markante Zustände erhöhter PRL-Spiegeldiskutiert.

4.1.5.1 Tumoren der Adenohypophyse Einen weit bekannten Zustand mit erhöhten Pro-laktinwerten im Serum stellt das Prolaktinom dar. Es handelt sich hierbei um den häufigstenendokrin aktiven Hypophysentumor. Man unterscheidet Mikroprolaktinome mit Prolaktin-Serumkonzentrationen < 200 ng/ml und einer Tumorgröße von <1 cm Durchmesser vonMakroprolaktinomen. Klinisch äußert sich dieser Tumor neben Zeichen der Raumforderungbei Frauen durch sekundäre Amenorrhö, Anovulation mit Sterilität, eventuell Osteoporose,Libidoverlust und in einigen Fällen Galaktorrhö, bei Männern durch Libido- und Potenzver-lust mit eventueller Gynäkomastie.

Inwieweit es hier zu einer relevanten Beeinträchtigung der Immunfunktion kommt, wirddurchaus kontrovers beurteilt.

Kardioglu et al. fanden bei diesen Patienten eine absolute und relative Verminderung derNK-Zellen und der CD3/CD25-Lymphozyten, wobei keine Korrelation zur Höhe der Pro-laktinspiegel im Serum hergestellt werden konnte. Weiter kann die Zellzahl auch nicht durch

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Behandlung mit dem Dopamin-Agonisten Bromocriptin angehoben werden, während es un-ter dieser Behandlung zu einem Anstieg der CD8-Zellen mit Erniedrigung des CD4/CD8-Verhältnisses kommt. Diesen Ergebnissen entspricht eine Verschlechterung der zytotoxi-schen Funktion bei Hyperprolaktinämie [38].

In PBMC von Patienten mit Hypophysenadenomen findet man nur bei solchen mit Makro-adenomen und hier nur auf CD8-Zellen eine erhöhte Dichte von Prolaktinrezeptoren, diewiederum nicht mit dem Prolaktinspiegeln im Serum korreliert. Auch die Reaktionsinten-sität von PBMC dieser Patienten auf T-Zell-Mitogene unterscheidet sich nicht von der mitBromocriptin behandelter Patienten [44].

Allerdings scheint es durch die erhöhten Spiegel an hypophysärem PRL beim Adenom zueiner Beeinflussung der Chemotaxis Neutrophiler Granulozyten [25] und einer erhöhten In-zidenz von Schilddrüsen-Antikörpern zu kommen [34].

Zusammenfassend kann also gesagt werden, dass erhöhte PRL-Spiegel im Zusammenhangmit Hypophysenadenomen nicht mit wesentlichen Beeinträchtigungen der Immunität ein-hergehen. Ein möglicher Mechanismus ist eine erniedrigte Expression des Rezeptors aufImmunzellen.

4.1.5.2 Systemischer Lupus erythematodes (SLE) Der systemische Lupus erythema-todes ist eine Systemerkrankung der Haut und des Gefäßbindegewebes zahlreicher Organemit Vaskulitis / Perivaskulitis der kleinen Arterien und Arteriolen in Kombination mit Abla-gerung von Immunkomplexen aus DNS, Anti-DNS, Komplement und Fibrin.

Immer wieder wird von erhöhten PRL-Serumspiegeln im Zusammenhang mit dieser Erkran-kung berichtet [56] [37].

Tatsächlich scheinen PBMC von Patienten mit SLE sehr empfindlich auf v.a. nur leicht er-höhte Konzentrationen von PRL zu reagieren. Bei Stimulation mit PRL kommt es hier zueiner starken IgG-Produktion, die mit der Krankheitsaktivität korreliert [36].

Es konnte beobachtet werden, dass T-Lymphozyten von Patienten mit SLE im Verhältnis zusolchen gesunder Spender zudem vermehrt PRL sezernieren. Dies wurde in Zusammenhangmit bestimmtem Genpolymorphismen im PRL-Gen bei SLE-Patienten gebracht [71].

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4.1.5.3 Hyperprolaktinämie und Narkose Während der Vollnarkose kommt es - abhän-gig vom Narkotikum - zu einer unterschiedlich starken Ausschüttung von PRL [49][14, 2].20 Minuten nach Narkoseeinleitung konnten Brand et al. im peripheren Blut von Patien-ten eine Zunahme der Konzentration an proinflammatorischen Zytokinen messen sowie eineVeränderung der Zusammensetzung peripherer Blutzellen in Richtung der B- und T-Zellenfeststellen [11].

V.a. Opioide bewirken kurzfristig eine extreme Zunahme der PRL-Plasmakonzentration,während gleichzeitig das Plasmakortisol abnimmt [14]. Bei opioidbasierter Narkoseführungkonnten Crozier et al. sowohl unter balanzierter Anästhesie als auch unter totaler intrave-nöser Anästhesie (TIVA) eine bis zu 10-fache Zunahme der Prolaktinspiegel intraoperativmessen [21].

Unsere Versuche zeigen, dass verstärkte inflammatorische Reaktionen auf Stimuli wie LPSin vitro auch bei alleiniger Stimulation mit PRL auftreten und deuten damit daraufhin, dassdie von Brand et al. gemessenen Effekte nicht nur Folge erniedrigter Kortisolspiegel, son-dern ebenfalls Resultat erhöhter PRL-Spiegel sind.

Während einer Operation am Darm kommt es regelmäßig zur Überwindung der Mukosa-barriere durch LPS [8]. Hier könnte eine Narkose, die auf Opioiden basiert, über eine Er-höhung der Plasmakonzentration an PRL eine höhere intra- und postoperative Freisetzungvon proinflammatorischen Zytokinen bewirken, was wiederum an der Pathophysiologie vonseptischem Schock und Multiorganversagen beteiligt sein kann.

Gerade im Rahmen der Fast track surgery wird in den letzten Jahren bei Narkosen für ab-dominalchirurgische Eingriffe - bei Fehlen von Kontraindikationen - dazu übergegangen,Opioide durch Supplementierung der Analgesie durch regionale Verfahren einzusparen. Dasbessere Outcome der entsprechenden Patienten auf alleinige Effekte von PRL zurückzufüh-ren, wäre sicherlich vermessen und zudem falsch, doch lässt sich ein gewisser Miteffektin Form einer geringeren “Anfälligkeit” solcher Patienten gegenüber proinflammatorischenReizen durch verminderte PRL-Spiegel postulieren.

Zudem bedeutet das Eintreffen im Operationstrakt für einen Patienten oft Stress, da nahe-zu jeder Mensch dies als eine extrem ungewohnte und damit auch Angst besetzte Situationempfindet. Wie bereits in der Einleitung erwähnt, stellt Stress einen Trigger für die hypophy-säre Prolaktinfreisetzung dar. Dementsprechend bedeutet präoperativer Stress - zusätzlich zu

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negativen Auswirkungen auf das kardiovaskuläre System - eine vermehrte Disposition zuüberschießenden Reaktionen auf inflammatorische Reize wie LPS. Hier helfen eine gutePrämedikation sowie eine ruhige Atmosphäre während der Narkoseeinleitung, den Patien-ten möglichst weit von Stressoren abzuschirmen. Auch sei hier wiederum das Konzept derFast track surgery erwähnt, das ja letztendlich darauf basiert, den Stress des Patienten prä-,peri- und postoperativ zu minimieren. Auch hier geht weniger Stress mit niedrigeren PRL-Spiegeln und einer verminderten Antwort auf proinflammatorische Reize einher.

4.1.5.4 Weitere Zustände von Hyperprolaktinämie Unter Behandlung mit Dopamin-antagonisierenden Medikamenten wie Neuroleptika kommt es gehäuft zu Autoimmunphä-nomenen [73]. Ein möglicher Mechanismus wäre hier, dass Lymphozyten in dem durch PRLveränderten Zytokinmilieu vermehrt auf Signale reagieren, die normalerweise keine Immun-reaktion bewirken. Zudem können Antigen-präsentierende-Zellen (APCs) unter Einfluss vonPRL die Immunantwort abnormal stimulieren.

Auch in Schwangerschaft und Postpartalperiode kommt es - neben vielen anderen hormo-nellen Veränderungen - zu einer ausgeprägten Hyperprolaktinämie. In dieser Zeit tretenebenfalls vermehrt Autoimmunkrankheiten auf bzw. der Verlauf vorbestehender Krankhei-ten wird negativ beeinflusst [62, 39]. Dieser Effekt ist vermutlich auch als eine Summationder Wirkung einzelner Hormone wie Cortisol und PRL auf Immunsystem zu begreifen.

4.1.6 Zusammenfassende Darstellung des Einflusses von PRL auf das Immunsystem

Erhöhte PRL-Spiegel gehen in vivo häufig mit erniedrigten Kortisolspiegeln einher. Hierist somit der Effekt von PRL isoliert schlecht messbar. Bezeichnend ist, dass bei Patientenmit Autoimmunerkrankungen wie Lupus erythematodes, Hashimoto-Thyreoiditis oder rheu-matoider Arthritis signifikant erhöhte Prolaktinkonzentrationen im Serum gemessen werdenkönnen. Zudem ging aus Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe hervor, dass nach Narkose-einleitung sowohl erhöhte PRL- als auch erniedrigte Kortisolspiegel gemessen werden kön-nen und in Überständen entsprechender Vollblutproben nach in vivo Stimulation mit LPS er-höhte Konzentrationen an inflammatorischen Zytokinen auftreten. Unsere Experimente stel-len diese Situation in vitro nach und lassen Aussagen über den isolierten Effekt von PRL zu.

• Die Stimulation von Vollblutzellen mit bis zu 300 ng/ml PRL, was typischen PRL-

82

4.2 Prolaktinsynthese durch PBMC 4 DISKUSSION

Plasmaspiegeln entspricht, die nach Narkoseeinleitung erreicht werden können, hatselbst keinen Effekt auf die Freisetzung von Zytokinen. Unter denselben Stimulations-bedingungen findet man in PBMC allerdings vermehrt NF-κB und IRF-1 im Zellkern.

• Kostimulation mit LPS (100 ng/ml) bewirkt eine inflammatorische Reaktion, derenAusmaß von der Konzentration an PRL abhängt. Die Verstärkung der Antwort aufLPS durch PRL findet sich auch auf Ebene der Transkriptionsfaktoren NF-κB undIRF-1.

4.2 Prolaktinsynthese durch PBMC

Schon 1989 berichtete Russell erstmalig von einem Prolaktin-ähnlichem Produkt aus Lym-phozyten [67].Sabharwal et al. konnten 1992 zeigen, dass PBMC ein 60kD schweres PRL-ähnliches Pro-tein synthetisieren und sezernieren. Diesem schreiben sie eine autokrine Funktion zu [68].

Reem et al. zeigten 10 Jahre nach Russell mittels EMSA, dass T-Zell Aktivatoren und eineerhöhte Konzentration an intrazellulärem cAMP den Promotor für Prolaktin in Lymphozy-ten aktivieren [64]. Die Arbeitsgruppe führte diesen Nachweis mit einer T-lymphozytärenJurkat-Zelllinie durch. Sie nutzten doppelsträngige Oligonukleotide aus dem Bereich desExon 1a, der das in Abbildung 1 markierte CRE enthielt. Eine erhöhte intrazelluläre cAMP-Konzentration zeigte dabei einen synergistischen Effekt mit PHA und PMA, während PHAund PMA allein kaum wirksam waren. Eine Transkriptionsinduktion konnte nach zwei Stun-den festgestellt werden und erreichte nach ca. sechs Stunden ihr Maximum, um dann langsamabzunehmen.

Gerlo et al. [30] wiesen 2003 an leukämischen Zelllinien und peripheren mononukleärenZellen (PBMC) eine Transkriptionsinduktion durch intrazellulär erhöhtes cAMP via RT-PCR und Southernbloting als auch eine Translation über ELISA nach. Die Arbeitsgruppefand erhöhte hPRL-mRNA-Konzentrationen in PBMC nach Stimulation mit dem zellmem-brangängigen cAMP Chlorophenylthio-cAMP (cptcAMP). Stimulation mit PMA ergab eineAbnahme der basalen mRNA-Konzentration und in den meisten Fällen bewirkte PMA auchin Kostimulation eine Minderung des Effektes von cptcAMP. Zudem konnte die Arbeits-gruppe in einigen Fällen eine Zunahme der hPRL-mRNA-Konzentration nach Stimulationmit Prostaglandin E2, einem Stoff, der über eine Erhöhung des cAMP-Spiegels wirkt, fest-stellen. 2006 wiesen Gerlo et al. eine Aktivierung des extrahypophysären PRL-Promotorsdurch TNF-α über Proteinkinase C nach [31].

83


Die Publikation von Gerlo et al. aus dem Jahr 2003 ist die einzige uns bekannte, in der ein po-sitiver Nachweis des Proteins PRL via ELISA geführt wurde. Alle anderen Arbeitsgruppenführten den Nachweis ausschließlich über die Messung von Transkriptionsfaktoren (EMSA)oder RNA (RT-PCR).

Für einen sicheren Nachweis der Synthese von PRL in PBMC untersuchten wir möglichstviele Schritte der Synthese von PRL.Die Synthese eines Proteins läuft in einer Zelle in der folgenden Reihenfolge ab (siehe Ab-

bildung 37):

1. Aktivierung von Transkriptionsfaktoren

2. Transkription des gesamten Gens inklusive nicht-kodierender Abschnitte (Introns)

3. Capping, Polyadenylierung und Splicen des primären RNA-Transkripts

4. Die reife mRNA verlässt den Kern und wird an den Ribosomen translatiert

Abbildung 37: Schematische Darstellung des Ablaufs der Proteinsynthese in einerEukaryonten-ZelleEin menschliches Gen besteht aus kodierenden (Exons) und nicht kodierenden Abschnitten (Introns).

Nach Reifung der RNA verlässt diese den Kern und wird an den Ribosomen translatiert

Abbildung aus dem Internet entnommen

84


Dementsprechend untersuchten wir PBMC auf die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren,das Vorhandensein von mRNA und letztendlich bestimmten wir die PRL-Konzentration imZellüberstand.

4.2.1 Aktivität der Transkriptionsfaktoren in Kernextrakten aus PBMC bezüglichder Bindung an den Prolaktin-Promotor

Um den häufig geführten Nachweis einer Prolaktinsynthese über Transkriptionsfaktoren zuüberprüfen, benutzten wir ebenfalls Oligonukleotide, die die in Abbildung 1 gelb unterlegteSequenz des cAMP responsive element enthielten.In einer Versuchsreihe benutzten wir PMA, PHA und cptcAMP als Stimulantien, da vondiesen berichtet ist, dass sie die Prolaktinsynthese in Immunzellen induzieren [30, 64]. Zu-sätzlich stimulierten wir mit Noradrenalin, weil von Immunzellen bekannt ist, dass sie β2-Rezeptoren besitzen [77], an welchen Katecholamine durch Erhöhung intrazellulärer cAMP-Spiegel wirken. Dieser Sachverhalt ließ für uns eine Beeinflussung der PRL-Synthese inPBMC durch Katecholamine als wahrscheinlich erscheinen.In einer weiteren Versuchsreihe stimulierten wir mit humanem rekombinanten Prolaktin undmit PRL in Kostimulation mit PHA, um einen möglichen positiv rückkoppelnden Effekt vonPRL auf seine eigene Synthese zu erfassen.In unseren Stimulationsexperimenten mit PHA, PMA und cptcAMP konnten wir die Ergeb-nisse von Reem et al. [64] für PBMC reproduzieren, nur maßen wir bereits nach 20 mineine vermehrte Bindungsaktivität von CRE im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle nachStimulation mit cptcAMP oder cptcAMP + PHA und eine noch stärkere Bindungsaktivitätbei Stimulation mit cptcAMP + PMA + PHA, jedoch nicht bei Stimulation mit cptcAMP +PMA. Damit stehen unsere Untersuchungen bezüglich der Aktivität der Transkriptionsfak-toren ebenfalls im Einklang mit denen von Gerlo et al. [30]Nach Stimulation mit PRL, PHA und PRL+PHA konnten wir keine vermehrte Aktivität anTranskriptionsfaktoren im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle messen. PRL scheint daherin Bezug auf die eigene Synthese nicht im Sinne eines Zytokins zu wirken, welche stimu-lierend auf die eigene Freisetzung im Sinne einer Effektpotenzierung agieren. Dies ist imKontext der Wirkung von PRL als Hormon sinnvoll, um vor überschießenden Reaktionen zuschützen.Auch nach Stimulation mit Noradrenalin fand sich in den Kernextrakten keine erhöhte Bin-dungsaktivität der Transkriptionsfaktoren. Die Aktivierung von cAMP durch Noradrenalinscheint demnach nicht ausreichend für eine Aktivierung des PRL-Promotors zu sein.

85


4.2.2 Untersuchung von PBMC auf PRL-mRNA mittels GEArray und RT-PCR

PBMC aus denselben Buffycoats, die wir auch für die Untersuchung der Transkriptions-faktoren verwendet hatten, untersuchten wir auf das Vorhandensein von PRL-mRNA undPRLR-mRNA via GEArray. Wir konnten hier im Rahmen der Sensitivität des GEArrayskeine PRL-mRNA detektieren, während wir für die Positivkontrollen GAPDH und β-Aktindeutliche mRNA-Signale sehen konnten. Als weitere Kontrolle für die Validität unserer Un-tersuchungen setzten wir eine Mamma-Karzinom-Zelllinie ein, die laut Angaben des Herstel-lers den Prolaktinrezeptor jedoch kein PRL exprimiert. Hier erhielten wir mittels GEArraywie erwartet ein deutliches Signal für PRLR-mRNA und keinen Nachweis von PRL-mRNA.

Um den offensichtlichen Widerspruch zu klären, in dem unsere Ergebnisse zu denen vonReem et al. und Gerlo et al. [64, 30] stehen, untersuchten wir mRNA einiger der mittelsGEArray getesteten Proben mittels RT-PCR für PRL. Wir setzten zum einen kommerziellePrimer der Firma SuperArray zum anderen den selbstkreierten Primer ein. Da wir mittels derPRL-PCR in einigen der Proben Signale erhielten, die mit der Literatur im Einklang stehen,lassen sich die negativen Ergebnisse mittels GEArray auf die unterschiedliche Sensitivitätder einzelnen Methoden bei vermutlich sehr geringen PRL-Konzentrationen im Überstandzurückführen.

Dabei traten auch in der unstimulierten Kontrolle nach PRL-PCR teilweise Signale auf, dieallerdings recht schwach waren. Dementsprechend scheint auch im Ruhezustand von PBMCin geringen Mengen PRL mRNA transkribiert zu werden. Eine eventuelle Basalsynthesekönnte einer Auffüllung intrazellulärer PRL-Speicher dienen. Dies entspräche der bereitsvon Sabharwal et al. für PRL-ähnliche Proteine postulierten Hypothese, dass PRL intrazel-lulär gespeichert wird und nach Stimulation im Sinne einer immunologischen Synapse anPRLRs bindet, um anschließend vermehrt synthetisiert zu werden [68]. Die Vorstellung ei-ner Wirkung von PRL an einer immunologischen Synapse stünde auch im Einklang mit denim ELISA erhobenen Daten.

Zudem konnten wir feststellen, dass intrazelluläre Erhöhung der Konzentration an cAMPtatsächlich im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle zu vermehrter Transkription von PRL-mRNA führt. Zustände erhöhter intrazellulärer cAMP-Konzentrationen stellten wir durchStimulation mit zellmembrangängigem cptcAMP nach. Hier fanden wir die stärksten Si-gnale nach Stimulation über 7h. Ein geringfügig stärkeres Signal trat bei Kostimulation mitcptcAMP und PHA auf. In Kostimulation mit PMA fanden wir ein Signal, das in seiner

86


Intensität etwa der Intensität des Signals der unstimulierten Kontrolle entspricht. Demzufol-ge scheint PMA im Gegensatz zu PHA die cAMP-induzierte Transkription des PRL-Gensinhibieren zu können, während PHA eine leichten kostimulatorischen Effekt ausübt. DieseErgebnisse entsprechen unseren Resultaten der Untersuchungen an Transkriptionsfaktorenund gehen konform mit der Literatur [30].

Bei Stimulation über 14 h detektierten wir allerdings in cptcAMP + PMA kostimuliertenZellkulturen ein Signal in der PRL-PCR. Dieses war deutlich intensiver als die Signale fürdie alleinige Stimulation mit cptcAMP und cptcAMP+PHA. Es wäre also auch möglich,dass in Kostimulation mit PMA die cAMP-induzierte Transkription des PRL-Gens zu späte-ren Zeitpunkten verschoben ist.

Erstaunlich ist, dass wir in keiner untersuchten Probe ein Signal für PRL bei Kostimulationvon cAMP mit PHA und PMA fanden. Dies war unseren Untersuchungen an Transkripti-onsfaktoren zufolge nicht zu erwarten und lässt eine noch unbekannte Beeinflussung derTranskription des PRL-Gens vermuten.

Zusammenfassend lässt sich formulieren, dass es bei Erhöhung intrazellulärer cAMP-Spiegelzu einer verstärkten Synthese von PRL mRNA kommt. Dieser Effekt von cAMP wird in Ko-stimulation mit PHA leicht verstärkt. Allerdings sind die Mengen an mRNA, die entstehen,unterhalb der Nachweisgrenze eines GEArrays, was eine Synthese von PRL durch PBMC infür den Makroorganismen relevanten Konzentrationen unwahrscheinlich macht.

4.2.3 Untersuchung der Überstände von PBMC-Kulturen auf PRL mittels ELISA

Aufgrund der schwierigen Interpretierbarkeit unserer Ergebnisse einerseits und der wenigenPublikationen, die von messbaren Konzentrationen an PRL im Überstand von stimuliertenPBMC berichten, andererseits, bestimmten wir die PRL-Konzentration unserer Zellkultur-überstände via ELISA. Hier benutzten wir - wie Gerlo et al. [30] - den PRL Elecsys derFirma Roche. Wir fanden in keinem unserer Zellüberstände messbare PRL-Konzentrationen.Dies steht im Einklang mit der Tatsache, dass kaum Publikationen zu diesem Thema vorhan-den sind, die von einem PRL-Nachweis in Überständen stimulierter Immunzellen gesunderSpender via ELISA berichten. Allerdings liegt die untere Nachweisgrenze dieses Testsy-stems bei PRL-Konzentrationen von 0,470 ng/ml. Zum Vergleich bewirkt eine Stimulationvon Vollblutzellen mit LPS eine Endkonzentration an IFN-γ von etwa 0,4 ng/ml im Über-stand. Dies zeigt eindrucksvoll, dass ein ELISA mit einer derart geringen Sensitivität für die

87


Messung an Zytokinen nur bedingt geeignet ist. Gerade wenn man davon ausgeht, dass inPBMC synthetisiertes PRL ausschließlich an einer immunologischen Synapse wirkt, ist dasErgebnis nicht verwunderlich. Allerdings zeigt es eindeutig, dass eine mögliche endokrineWirkung von durch PBMC synthetisiertes PRL sehr unwahrscheinlich ist.

4.2.4 Zusammenfassende Darstellung

Wir konnten in PBMC gesunder Blutspender nachweisen, dass Stimulation mit cptcAMPzu einer Aktivierung von Transkriptionsfaktoren führt, die an das CRE des PRL-Promotorsbinden. Dieser Effekt wird potenziert durch Kostimulation mit PHA und PHA+PMA, nichtjedoch durch Kostimulation nur mit PMA.

Die in der Literatur beschriebenen Hinweise auf die Synthese von PRL-mRNA in PBMCgesunder Spender beruhen größtenteils auf Untersuchungen via PCR, die wir größtenteilsbestätigen konnten. Unsere Untersuchungen mittels GEArray zeigten jedoch in keiner Sti-mulation Signale für PRL-mRNA. Wir erklären diesen Widerspruch dadurch, dass die Men-gen an synthetisierten PRL-mRNA so gering sind, dass sie mit einer Nachweismethode einerSensitivität der des GEArrays nicht erfasst werden. Unsere Untersuchungen via ELISA zei-gen, dass PRL von PBMC nicht in einer für das endokrine System relevanten Konzentrationsezerniert wird. Sie gehen konform mit den Ergebnissen des GEArray. Die mittels EMSA ge-wonnenen Ergebnisse zeigen jedoch sehr starke Banden. Wir müssen daher annehmen, dassdie Mengen an mRNA, die synthetisiert werden, entweder nicht transkribiert werden oder indeutlich geringerer Menge als es dem Maß der Aktivierung der Transkriptionsfaktoren ent-spricht. Es scheint also Mechanismen zu geben, die die PRL-Synthese in PBMC gesunderBlutspender nach Aktivierung der Transkriptionsfaktoren inhibieren. Mögliche Mechanis-men bedürfen der weiteren Untersuchung.

Eine endokrine Wirkung von PRL, das in PBMC synthetisiert wird, schließen unsere Ergeb-nisse somit aus, eine autokrine Wirkung wäre jedoch möglich und auch wahrscheinlich.

4.2.5 Diskussion von autokrinen und parakrinen Wirkungen von möglicherweise inPBMC synthetisiertem PRL

Geht man von der Hypothese aus, dass PRL zwar als Protein von PBMC gebildet wird, je-doch in sehr geringen Mengen, so sollte man an entsprechenden Zellkulturen einige Stundennach Bildung der mRNA die Wirkungen des gebildeten PRL auf die eigene Zellkultur er-warten. Nimmt man unseren Ergebnissen zufolge an, dass cptcAMP+PHA und cptcAMP

88

4.3 Wirkung von hypophysärem PRL auf die Synthese von PRLR in PBMC4 DISKUSSION

stimulierte PBMC-Kulturen nach 7 h das Maximum der Synthese an PRL-mRNA erreichen,so sollte man nach 14 h Wirkungen des gebildeten PRL auf Ebene der mRNA detektierenkönnen. Wie wir zeigen konnten, bewirkt die Zugabe von exogenem PRL eine Aktivierungdes IRF-1-Promotors und eine Synthese von IRF-1-mRNA (siehe Kapitel 3.1). In unserenVersuchsreihen konnten wir weder nach Stimulation mit cptcAMP noch mit cptcAMP+PHAvermehrte Signale für IRF-1 in der IRF-1-PCR bis zu einer Stimulation von 14 h feststellen.Daher lässt sich annehmen, dass endogenes PRL, falls es von PBMC in geringsten Mengensynthetisiert wird, zumindest keine autokrinen Wirkungen entwickelt, die denen von exo-genem hypophysärem PRL entsprechen. Auch eine mögliche autokrine Wirkung im Sinneeiner vermehrten Synthese des PRLR scheint nicht zu bestehen, da die Signale für PRLR inder PRLR-PCR unabhängig von dem Auftreten von Banden für PRL in der PRL-PCR in denentsprechendne Versuchsreihen stets etwa denen der unstimulierten Kontrolle entsprachen.

4.3 Wirkung von hypophysärem PRL auf die Synthese von PRLR inPBMC

Von einem Hormon erwartet man, dass bei erhöhten Plasmakonzentrationen die Rezeptor-dichte auf den Zielzellen abnimmt, von einem Zytokin könnte man erwarten, dass die Rezep-tordichte zunimmt. Ersteres würde einen vermehrten Abbau von PRLR und eine verminder-te Neusynthese, letzteres eine vermehrte Neusynthese bedeuten. Da das Maß an mRNA desPRLR in der Zelle dem Maß der Neusynthese entspricht, untersuchten wir unsere wie im Er-gebnisteil beschrieben stimulierten Zellkulturen mit GEArray und RT-PCR auf PRL-mRNA.Die Schlussfolgerungen aus den Untersuchungen an Stimulationsreihen mit cptcAMP sindin Kapitel 4.2 dargestellt.Unsere Untersuchungen an PRL-, PHA- und PRL+PHA-stimulierten PBMCs zeigten dasdeutlichste Signal für die unstimulierte Kontrolle, ein abgeschwächtes Signal für PRL-Stimulationund die schwächsten Signale für PHA- und PHA+PRL-Stimulation. Eine diskrete Abschwä-chung der Signalintensität für PRL-Stimulation bedeutet letztendlich eine verminderte Syn-these von PRLR-mRNA nach Stimulation mit exogenem PRL und entspräche dem Effekteines klassischen Hormons. Eine extreme Abschwächung der Signalintensität und damit ei-ne kaum vorhandene Neusynthese von PRLR finden wir nach Stimulation mit PHA. Dieskönnte den Effekt erklären, dass unter Kostimulation mit PRL + PHA die PRL-induzierteIRF-1-Synthese gedrosselt wird, da durch eine stärkere Herunterregulation der Dichte anPRLRs auf der Zelloberfläche eine verminderte Aktivierung des IRF-1-Promotors über denPRLR bewirkt wird.Die PRL-induzierte Erniedrigung der Transkription des PRLR-Gens könnte den biologi-

89

4.4 Prolaktin - ein Zytokin ? 4 DISKUSSION

schen Effekt haben, das Immunsystem vor zu hohen PRL-Konzentrationen aus der Hypo-physe zu schützen - ein Effekt, der von klassischen Hormonen und ihren Zielzellen bekanntist. Eine weitere Herunterregulation durch PHA könnte einen Schutz des Organismus vorüberschießender Reaktion auf inflammatorische Reize durch PRL bedeuten. Eine interes-sante Frage, die in diesem Zusammenhang zu klären wäre, ist, inwiefern sich Stimulationmit LPS auf die PRLR-Dichte auf PBMC auswirkt.

4.4 Prolaktin - ein Zytokin ?

Um diese Frage abschließend zu klären, sei nochmals auf die Definition von Abbas verwie-sen [1]:

• Die Zytokin-Sekretion ist ein kurzer, selbstlimitierender Prozess. Die Zytokine sindnormalerweise nicht als präformierte Moleküle gespeichert und ihre Synthese ist ge-wöhnlich durch Transkription nach vorausgehender Zellaktivierung geregelt. Anschlie-ßend werden Zytokine schnell sezerniert und schlagartig freigesetzt.

Ob Blutzellen in der Lage sind, PRL tatsächlich in sehr geringen Mengen zu synthetisieren,konnten wir nicht mit abschließender Sicherheit klären, da wir keinen Nachweis des Proteinsführen konnten.

• Die Wirkungen der Zytokine sind pleiotrop, d.h. ein Zytokin wirkt auf verschiede-ne Zelltypen, und redundant, d.h. einen bestimmten Effekt können mehrere Zytokinelosgelöst voneinander bewirken.

PRLRs sind - wie in der Einleitung dargestellt - auf den verschiedensten Zelltypen expri-miert und PRL entfalten diverse Wirkungen an diesen. Auch die Redundanz der Wirkung istgegeben, da kein spezifischer PRL-Effekt bekannt ist.

• Zytokine beeinflussen oft die Synthese und die Eigenschaften anderer Zytokine.

PRL allein ist nicht in der Lage, die Synthese der von uns untersuchten Zytokine zu beein-flussen, doch verstärkt es eine proinflammatorische Antwort von Blutzellen auf LPS.

• Die Wirkung der Zytokine kann lokal oder systemisch sein, v.a. autokrin und parakrin,aber bei massiver Freisetzung ist auch ein Übertritt in die Blutbahn mit Wirkung überlängere Distanz möglich.

90

4.4 Prolaktin - ein Zytokin ? 4 DISKUSSION

Eine autokrine oder parakrine Wirkung von eventuell in PBMC synthetisiertem PRL konntenwir nicht nachweisen. Die Frage nach der Bedeutung der PRL-Synthese durch Immunzellenbleibt ungeklärt.

• Die Wirkung wird durch Bindung an spezifische Membranrezeptoren auf Zielzellenvermittelt, wobei die Dissoziationskonstanten zwischen 10−10 bis 10−12 M liegen.Durch diese starke Bindung reichen oft nur geringe Mengen eines Zytokins aus, umeinen biologischen Effekt zu erzielen.

Der PRLR als Zytokinrezeptor vom Typ I erfüllt diese Eigenschaften.

• Äußere Signale regulieren die Expression von Zytokinrezeptoren und damit die Emp-findlichkeit der Zielzelle für das Zytokin. Dies ist unabdingbar für die Spezifität desImmunsystems, da Zytokine nicht antigenspezifisch sind.

Exogenes PRL und PHA sind in der Lage, die Transkription des PRLR-Gens zu beeinflussen.

• Die zelluläre Antwort auf die meisten Zytokine beruht auf einer Änderung der Genex-pression von Zielgenen.

Die zelluläre Antwort auf PRL beruht v.a. auf vermehrter Expression con IRF-1.

Es lässt sich also zusammenfassen, dass PRL zwar viele Eigenschaften eines Zytokins erfüllt,andere jedoch nicht.Derzeit PRL als Zytokin zu bezeichnen, wäre daher voreilig, aber von einem Hormon mitzytokinartigen Eigenschaften kann zu Recht gesprochen werden.

91

5 ZUSAMMENFASSUNG

5 ZUSAMMENFASSUNG

Prolaktin (PRL) ist ein Hormon, dem in vielerlei Hinsicht Eigenschaften eines proinflammatorischen Zytokins

zukommen. Wie bei vielen Zytokinen wird die Wirkung von PRL über Zytokinrezeptoren vom Typ I vermittelt,

die von Immunzellen exprimiert werden. Äußere Signale, die die Expression von dem PRL-Rezeptor (PRLR)

und damit die Empfindlichkeit der Zielzelle für PRL beeinflussen, sind größtenteils noch nicht identifiziert. Wie

Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)-Untersuchungen zeigten, scheint Stimulation mit PRL selbst die Neusyn-

these von PRLR negativ zu beeinflussen.

Wie ein typisches Zytokin beeinflusst PRL die Synthese anderer proinflammatorischer Zytokine positiv, doch

bedarf es hierzu der Kostimulation mit beispielsweise Lipopolysaccharid (LPS). Dies wurde an Hand der Zy-

tokine Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α), Interleukin-12 (IL-12) und Interferon-γ (IFN-γ) mittels Enzym-

Immunoassay (ELISA) gezeigt. Allein hat PRL keine Wirkung auf die Sekretion von Zytokinen durch Zellen

des peripheren Blutes, allerdings ist es Gel-Shift-Assays (electrophoretic mobility shift assays, EMSAs) zu-

folge in der Lage, Transkriptionsfaktoren wie Interferon-Regulatory-Factor-1 (IRF-1) und Nuclear Factor-κB

(NF-κB) zu aktivieren. Dabei ist die Wirkung von NF-κB auf den IRF-1-Promotor und damit auf die Frei-

setzung von IFN-γ über die gleichzeitige Aktivierung von Signal transducer and activator of transcription 5b

(STAT5b) durch PRL limitiert. Für die mangelnde Aktivierung der Synthese anderer Zytokine wie IL-12 und

TNF-α trotz vermehrter Translokation von NF-κB in den Kern müssen weitere inhibitorische Prinzipien eine

Rolle spielen, welche weiterer Untersuchungen bedürfen.

Anders als klassische Zytokine scheint PRL jedoch nicht in relevantem Ausmaß von mononukleären Zellen

des peripheren Blutes synthetisiert und sezerniert zu werden. EMSAs zufolge werden jedoch Transkriptions-

faktoren, die an den Prolaktin-Promotor binden, durch erhöhte intrazelluläre Spiegel an zyklischem Adeno-

sinmonophpsphat (cAMP) in hohem Maße aktiviert. Zudem entstehen - wie PCR-Versuche zeigen - geringe

Konzentrationen an PRL-mRNA. Die Synthese muss hier auf dem Weg von der Bindung des Transkriptionsfak-

tors an den Promotor zur Bildung der mRNA gedrosselt werden. Die Mechanismen hierfür bleiben unbekannt.

Sollte PRL von PBMC sezerniert werden, dann müsste es an einer immunologischen Synapse und gänzlich

anders als hypophysäres PRL auf PBMC wirken.

Hypophysärem PRL kommt eine bedeutende Rolle für das Immunsystem zu. So lassen sich signifikant erhöhte

PRL-Spiegel bei Patienten mit Autoimmunkrankheiten messen.

Eine klinische Bedeutung der Beeinflussung proinflammatorischer Prozesse durch PRL wurde im Zusammen-

hang mit der Narkose untersucht. Hier erhöhen v.a. Opioide die hypophysäre PRL-Freisetzung, was eine ver-

mehrte Disposition des Organismus für überschießende Reaktionen auf inflammatorische Stimuli wie LPS zur

Folge hat. Es wäre somit denkbar, dass durch Einsparen von Opioiden über z.B. Supplementierung der Anal-

gesie durch regionale Verfahren das Risiko einer systemischen inflammatorischen Reaktion im Rahmen einer

verminderten Disposition für proinflammatorische Stimuli herabgesetzt wird.

92

APPENDIX

A PROTOKOLLE

A Protokolle

Die Versuchsprotokolle basieren allesamt auf im Institut etablierten Methoden und wurdenzum größten Teil in der Promotionsarbeit von Dr. Jürgen Luhm publiziert.

A.1 Isolierung von PBMC

Die mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) lassen sich aus dem Buffycoatmittels Dichtegradientenzentrifugtion aus der Interphase - zwischen dem Serum und demTrennmedium mit Erythrozyten und Granulozyten - gewinnen. Sie werden durch Absaugenisoliert, gewaschen und in gewünschter Konzentration im jeweiligen Kulturmedium suspen-diert.

A.1.1 Lösungen

Wasch-Lösung (pH 7,4) PBS-PufferDichtegradienten-Lösung Ficoll: 1,077 g/mlKulturmedium RPMI 1640 mit Zusatz

- 10 % FCS (hitzeinaktiviertes fetales Kälberserum;30min bei 56◦C inaktiviert)

- 1 % L-Glutamin- 1 % Penicillin/Streptomycin

A.1.2 Protokoll

• Buffycoat zu gleichen Teilen mit PBS verdünnen und das gleiche Volumen Ficoll-Trennlösung damit überschichten

• 20 min bei 600 g (20 ◦C) zentrifugieren, dabei möglichst langsam beschleunigen undabbremsen

• Zellfraktion aus der Interphase mittels Pipette absaugen

• 2x in PBS waschen (300 g, 10 min, 20 ◦C)

• PBMC in Kulturmedium überführen und die Zellkonzentration am Vollblutzellzählerbestimmen

• die benötigte Zellkonzentration (3 x 106 Zellen/ml für die Protein- und RNA-Ansätzebzw. 5 - 10 x 106 für die Bandshift-Ansätze) durch Verdünnung mit Medium herstellen

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A.2 Protokoll zur Herstellung von Kernextrakten A PROTOKOLLE

A.2 Protokoll zur Herstellung von Kernextrakten

A.2.1 Erforderliche Reagenzien:

Extraktions-Puffer 1: 20 mM HEPES; pH=7,810 mM KCl0,1 mM EDTA0,5 mM Pefa Block (oder PMSF)1 mM DTT

Extraktionspuffer 2: Extraktionspuffer 1 + 400 mM NaCl

10 % (w/v) Nonidet NP40-Lösung

PBS

A.2.2 Protokoll:

• Stimulation von 4 x 106 Zellen und Inkubation für die jeweilige Zeit im Brutschrank

• Kühlzentrifuge Centrikon T324 und für Eppendorf-Reagenzgefäße geeignete Zentri-fuge Omnifuge 2.0RS vorkühlen

• Zellen ernten: adhärente Monozyten mit dem Zellscraper abschaben, Zellen in ein ste-riles 15 ml Tube überführen, zweimal bei 1000 g und 4 ◦C für 5 min waschen und dazubei der zweiten Zentrifugation mit 15 ml PBS waschen

• Überstand dekantieren, Röhrchen kopfüber auf Filterpapier stellen, Resuspension desPellets in 1 ml eiskaltem PBS, Überführung der Suspension in ein 1,5 ml-Eppendorf-Tube

Die nachfolgend geschilderten Arbeitsvorgänge unbedingt auf Eis durchführen:

• kurze (15 s, max. 30 s) Zentrifugation bei 13000 g, dabei extrem schnell arbeiten

• Pellet vorsichtig in 500 ml eiskaltem Extraktionspuffer 1 resuspendieren (Vorsicht: DieZellen dürfen kaum DNA verlieren)

• 15 min auf Eis stellen (mind. 5 min, max. 2 h)

• 25 - 30 ml 10 %ige NP-40-Lsg. dazugeben, das Eppendorf-Tube vorsichtig anschnip-pen, dabei wiederum extrem schnell arbeiten

• kurze (15 - 30 s) Zentrifugation bei 13.000 g

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A.3 Bestimmung des RNA-Gehaltes einer Probe A PROTOKOLLE

• Überstand (enthält die RNA- sowie die Zytoplasmafraktion) schnell dekantieren (kannggf. auch für RNA-Extraktion verwendet werden)

• zum Pellet (= viskose, zumeist farblose Kernfraktion) 50 ml Extraktionspuffer 2 geben(nicht resuspendieren)

• 15 min auf Eis stehen lassen (Kernlyse)

• 5 min bei 4 ◦C und 13.000 g zentrifugieren

• ca. 70 ml Überstand (= Kernextrakt) vorsichtig abnehmen (Vorsicht: Pellet löst sichleicht ab!), in 3 Aliquots à 20 ml bei - 80 ◦C einfrieren

• außerdem ein 10 ml-Aliquot zur Proteinbestimmung abnehmen

A.3 Bestimmung des RNA-Gehaltes einer Probe

• in einer Quarzküvette 5 µl RNA-Lösung mit 95 ml ddH2O-DEPC verdünnen (1:20-Verdünnung)

• bei 260 und 280 nm Extinktion gegen ddH2O-DEPC photometrisch bestimmen

• zum Errechnen des RNA-Gehaltes in µg/ml den Extinktionswert bei 260 nm mit 800multiplizieren (dabei muß der Quotient E (260 nm)/E (280 nm) zwischen 1,6 und 2,0liegen, optimal > 1,8)

• Proben entweder sofort im GEArray einsetzen oder bei - 80 ◦C lagern

A.4 Bandshift-Experimente

A.4.1 5´-32P-Oligonukleotidlabeling

Das 5´-Endlabeling erfolgte mit Hilfe eines wie folgt beschriebenen modifizierten Ready-To-Go-T4-Polynukleotid-Kinase (PNK)-Kits der Firma Pharmacia.

A.4.1.1 Protokoll: pro Ansatz:

• 1 PNK-Kit-Eppendorf-Tube (umgerechnet auf 50 ml: 8 - 10 U PNK, 50 mM Tris-HCl(pH 7,6), 10 mM Magnesiumchlorid, 5 mM DTT, 0,1 mM Heringssperma-DNA, 0,1mM EDTA (pH 8,0), 0,2 mM ATP, Stabilisatoren) verwenden

• 25 µl aqua dest. hinzufügen

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A.4 Bandshift-Experimente A PROTOKOLLE

• 2 - 5 min bei Raumtemperatur inkubieren, anschließend mit der Pipette vorsichtig,aber sehr gründlich mischen

• 10 pmol (mind. 5 pmol) jedes Oligonukleotids (= 5 µl bei einer Konz. von 2 pmol/ml;Vorverdünnung: 10 µl des 50 pmol/ml-Oligonukleotids + 240 µl aqua dest.) hinzufü-gen

• 18 µl aqua bidest. ad Gesamtmenge 50 µl hinzufügen

• 2 µl γ-ATP32 (3.000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 3,33 pmol/µl), hinzugeben (bis zum Drei-fachen an Radioaktivität einsetzbar, um bessere Signale zu erhalten, dann entsprechendweniger Wasser nehmen; außerdem Halbwertzeit von 32P (14,3 d) berücksichtigen!)

• kurz anzentrifugieren

• 30 min bei 37 ◦C inkubieren

• die beiden Oligonukleotide (Sense- und zugehöriges Antisense-Oligonukleotid) zu-sammengeben (Gesamtvolumen: 100 µl)

• zum Stoppen des Labelings 5 min bei 95 ◦C denaturieren, dann über Nacht oder ei-nige Stunden bis auf Raumtemperatur abkühlen lassen, dabei lagern sich die beidenOligonukleotide zusammen (Annealing)

• Radioaktivität (cpm) im Szintillationszähler bestimmen

• Reinigen von überschüssigem 32P und der PNK, die bei der Bindereaktion stören wür-den, mit Hilfe der Probe Quant Micro Columns auf der Basis einer Gelfiltration gemäßder Anleitung des Herstellers

A.4.2 Bindereaktion

Während der Bindereaktion kommt es zur Bindung der Transkriptionsfaktoren aus demKernextrakt an den 32P-markierten DNA-Abschnitt aus der Promotorregion des nachzu-weisenden Gens. Nach Optimierung der verschiedenen nachfolgend skizzierten Bindungs-Parameter in zahlreichen Vorversuchen wurden die Experimente unter folgenden Bedingun-gen durchgeführt:

97


Bindungsparameter Endkonzentration im 20 µl-AnsatzIonenstärke der Ionen, die für die 100 mM Na,

jeweiligen Protein-DNA-Wechselwirkungen w/o Caerforderlich sind

Stabilität 10 % Glycerin

Reduktion 0,5 mM DTT

Chelatoren, um Nukleasen zu inhibieren 1 mM EDTA

pH-Wert 7,5-8,0 (10 mM Tris-HCl)

Detergentien 0,05 % NP-40

Temperatur Raumtemperatur

Ausschluss unspezifischer Interaktionen 2 µg Poly(dI-dC)*poly(dI-dC)

Um zu gewährleisten, dass der Bandshift unter den gewählten Versuchsbedingungen prin-zipiell funktioniert, wurde als Positiv-Kontrolle ein entsprechendes Experiment mit EBNA-1-DNA (EBNA-1 = Epstein-Barr Virus Nuclear Antigen-1) und EBNA-1-Extrakt (kloniert)durchgeführt.

A.4.2.1 Typische Konzentrationen der einzusetzenden Proteine bzw. DNAs:

• Kernprotein-Extrakt: 5 mg/ml (allg. 0,1 - 10 mg/ml)

• 32P-Target-DNA: 1 ng/ml (allg. 0,1 - 2,5 ng/ml) mit 10000 - 20000 cpm

• bei Vergleichsmessungen im Szintillationszähler die Einbaurate bestimmen (ca. 10 -50 %) und die einzelnen Target-DNA so verdünnen, dass äquivalente Radioaktivitäts-mengen eingesetzt werden

A.4.2.2 Protokoll: Pipettierschema (Standard-Versuchsansatz):

Reagenzien Volumen (µl)

10x Bindepuffer 2

50 % Glycerin 4

1 % NP-40 1

Poly dI-dC 1

98


Reagenzien Volumen (µl)

radioaktiv markierte DNA 2

aqua bidest. + Kern-Protein-Extrakt 10

• Inkubation bei Raumtemperatur für 20 - 30 min,

• dann 2 µl Gel-Ladepuffer hinzufügen und

• Bandshift-Gel starten

A.4.3 Bandshift-Gel und nachfolgende (digitale) Autoradiographie

Im nativen Acrylamid-Gel werden die aufgetragenen Konstrukte elektrophoretisch aufge-trennt und anschließend einer Autoradiographie unterzogen. Dabei wandern die Transkriptionsfaktor-DNA-Komplexe im elektrischen Feld entsprechend ihrem höheren Molekulargewicht lang-samer als die im Überschuss vorhandene radioaktiv markierte DNA, wodurch es zum Shiftder Bande letzterer kommt, dem sogenannten Bandshift.

benötige Lösungen:

10x TBE-Puffer 10,8 g Tris55 g Borsäure40 ml 0,5 M EDTApH 8,0ad 1 l mit aqua dest.

0,25x TBE-Puffer 25 ml 10x TBE-Pufferad 1 l mit aqua dest.

Protokoll:

Gel ein bis zwei Tage vor der Bindereaktion gießen

• Glasplatten besonders intensiv putzen

• großes Gel, ca. 25 cm lang, 1,5 mm dick, 4 % oder 8 %ig in 0,25 x TBE-Puffer wiefolgt gießen:

99


– 51,25 ml (8 %iges Gel) bzw. 75,25 ml H2O (4 %iges Gel)

– + 12 bzw. 24 ml Acrylamid/Bisacrylamid 30 % (29+1)

– + 2,25 ml 10 x TBE (10,8 g Tris, 55 g Borsäure, 40 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0, ad1 l mit aqua dest.)

– + 90 µl TEMED

– + 90 µl APS (40 %) zum radikalvermittelten Start des Polymerisierungsprozesses

• Gel etwa 30 min polymerisieren lassen (bis zu einer Woche bei + 4 ◦C haltbar)

• Gel 30 min bei 200 - 220 V vorlaufen lassen, dann Stromstärke auf 15 mA regulieren

• Proben aus der Bindereaktion mit 2 µl Ladefarbstoff versehen, gut mischen und auf-tragen

• Elektrophorese bei 200 V für ca. 1 - 1,5 h, bis sich die vom Bromphenol-blau an-gezeigte Lauffront etwa 1 cm vom unteren Gelrand entfernt befindet (Vorsicht: keineRadioaktivität auslaufen lassen!)

• 1 Glasplatte mit Gel-Spacer entfernen, Gel vorsichtig mit Bloting-Papier von der an-deren Platte lösen und mit Frischhaltefolie abdecken

• Gel auf dem Geltrockner für ca. 80 min trocknen (80 ◦C); danach auf Hyperfilm-MPbei -80 ◦C in einer Gefriertruhe für 5 - 72 h belichten; Film entwickeln und/oder digitalmit dem DAR autoradiographieren

100

A.5 Genexpressions-Analyse A PROTOKOLLE

A.5 Genexpressions-Analyse

A.5.1 Protokoll zur Herstellung der benötigten Lösungen

20x SSC 175,3 g NaCl88,2 g Natriumcitrat-DihydratWasser ad 900 mlpH auf 7,0 mit 1 M HCl einstellenWasser ad 1000 ml

20x SDS 200 g SDSWasser ad 1000 mlauf 65 ◦C erhitzen um vollständige Lösung zu erreichen

Wasch-Lösung 1 20 ml 20x SSC(pro Probe) 10 ml 20x SDS

Wasser ad 200 ml

Wasch-Lösung 2 20x SSC(pro Probe) 5 ml 20x SDS

Wasser ad 200 ml

dNTP-Gemisch 5 mM dATP5 mM dGTP5 mM dTTP50 µM dCTP

Buffer B 50 µl RT Buffer1 µl 1 M DTT50 µl dNTP-Gemisch

A.5.2 GEArray ASSAY Protokoll

Bei allen Schritten sind unbedingt Handschuhe zu tragen!!

Herstellung der RNA:

Die gesamte RNA der zu untersuchenden Zellen wird mittels Qiagen RNeasy mini kit gemäßAnleitung des Herstellers aus den geernteten PBMC gewonnen.

101


Probensynthese:

Synthese der cDNA - Probe mit α-32P dCTP:RNA 5 - 10 µgGEAprimer Mix (buffer A) 2 µlRNase-freies Wasser ad 20 µl

• In einem sterilen PCR-Gefäß mischen

• Probe für 2 min in einen auf 70 ◦C vorgewärmten Heizblock stellen

• Probe auf 42 ◦C kühlen und bei dieser Temperatur halten

Herstellen des Labeling-Mix (20 µl pro RNA-Probe):Buffer B 8 µlα-32P-dCTP (10 mCi/ml) 5 µlRNase inhibitor 1 µlMMLV Reverse Transkriptase (50 units/µl) 2 µlRNase-freies Wasser 4 µl

Labeling-Reaktion:

• Für 2 min den Labeling Mix bei 42 ◦C erwärmen

• je 20 µl Labeling Mix zu jeder vorbereiteten (s.o.) RNA-Probe geben

• gut vermischen

• Inkubation bei 42 ◦C für 25 min

Stoppen der Labeling-Reaktion durch Zugabe von 5 µl Buffer C.Denaturieren der somit hergestellten cDNA-Probe:

• Buffer E auf 68 ◦C erwärmen

• Zugabe von 5 µl Buffer D

• Inkubation für 20 min bei 68 ◦C

• Zugabe von 50 µl Buffer E

• Inkubation für 10 min bei 68 ◦C

102


A.5.3 Hybridisierung

1. Als ersten Arbeitsschritt des kompletten Versuchs 15 ml der GEAhyb Hybridisati-onslösung pro Probe auf 68 ◦C erwärmen und zur vollständigen Lösung ein wenigSchwenken.

2. Lachs-Sperma-DNA 5 min bei 100 ◦C denaturieren und dann sofort auf Eis stellen

3. Lachs-Sperma-DNA zur Hybridisationslösung geben (Endkonzentration: 100 µg DNA/ml);bis zum Benutzen bei 68 ◦C halten

4. Anfeuchten der Membran mit deionisiertem Wasser und Platzieren der Membran inHybridisationszylinder

5. 10 ml der mit Lachs-Sperma-DNA versehenen Hybridisationslösung dazugeben und1-2 h bei 68 ◦C und 5-10 rpm/min prähybridisieren lassen.

6. Anschließend die Prähybridisationslösung verwerfen

7. Die fertige denaturierte cDNA Probe wird zu den restlichen 5 ml Hybridisationslö-sung gegeben; Hybridisation im Hybridisationszylinder über Nacht bei 68 ◦C und 5-10rpm/min

8. Zweimaliges Waschen der Membran mit 100 ml vorgewärmter Waschlösung 1 für 30min bei 68 ◦C und 30-40 rpm/min

9. Zweimaliges Waschen der Membran mit 100 ml vorgewärmter Waschlösung 2 für 30min bei 68 ◦C und 30-40 rpm/min

10. Die Membran kann nun in Hybridisationsfolie eingeschweißt werden

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B EIGENE PUBLIKATIONEN UND KONGRESSBEITRÄGE

B Eigene Publikationen und Kongressbeiträge

Brand JM, Frohn C, Cziupka K, Brockmann C, Kirchner H, Luhm J. Prolactin triggers pro-infalmmatory immune responses in peripheral immune cells. Eur Cytokine Netw 2004 (15):99-104

Luhm J, Cziupka K, Brockmann C, Kirchner H, Koritke P, Brand JM. Prolactin triggerspro-inflammatory immune responses in peripheral immune cells. Jahrestagung der DGFI2004

Cziupka K, Luhm J, Brockmann C, Kirchner H, Brand JM. Beeinflussung derproinflammatorischen Immunantwort durch Prolaktin. Jahrestagung der NDGFI 2004

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C DANKSAGUNG

C Danksagung

Herrn Prof. HOLGER KIRCHNER, Direktor des Institutes für Immunologie und Transfusi-onsmedizin, danke ich für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes und die hervorragende Un-terstützung bei der Anfertigung dieser Arbeit.

Mein größter Dank gilt meinem Doktorvater Herrn PD Dr. rer. nat. JÜRGEN LUHM für dieÜberlassung des Themas, meine labortechnische Ausbildung und die Einführung in die Weltder Forschung. Ohne seine aufmunternden Worte an den Tiefpunkten, die man während derLaborarbeit immer wieder erlebt, seine ständige Unterstützung und seine vielen Ratschlägehätte diese Arbeit nie entstehen können.

Meinem Betreuer PD Dr. med. JÖRG-MATTHIAS BRAND danke ich für viele hilfreiche Dis-kussionen und Anregungen zum Thema dieser Arbeit aber auch zu anderen medizinischenThemen.

Bei der Laborarbeit wurde ich von vielen MTAs unterstützt, wobei mein besonderer DankPETRA KORITKE und PETRA GLESSING gilt.

Mein besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mich während der ganzen Zeit immer unter-stützt und aufgemuntert haben und mir das Studium der Humanmedizin ermöglichten.

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D LEBENSLAUF

D LebenslaufName Katharina CziupkaGeburtsdatum 20. Dezember 1980Geburtsort StadeEltern Günter Cziupka, Studienrat

Angela Cziupka, LehrerinGeschwister Johannes Cziupka

Schulbildung1987 - 1991 Besuch der Pestalozzi-Grundschule, Stade1991 - 1993 Besuch der Orientierungsstufe Camper Höhe, Stade1993 - 1999 Besuch des Gymnasiums Athenaeum, Stade1996 Überspringen der 10. Klasse1998 - 1999 Teilnahme an allen Runden des deutschen Auswahlverfah-

rens zur 30. und 31. Internationalen Chemieolympiade1999 Nominierung zur Teilnahme an der 31. Internationalen

Chemieolympiade in Bangkok als Mitglied der deutschenMannschaft; dort Gewinn einer Bronze-Medaille

1999 Erwerb der allgemeinen Hochschulreife(Notendurchschnitt 1,0)

Studium1999-2005 Studium der Medizin an der Universität zu Lübeck2001 Ärztliche Vorprüfung2002 Erster Teil der Ärztlichen Prüfung2004 Zweiter Teil der Ärztlichen Prüfung2005 Dritter Teil der Ärztlichen Prüfung

Approbation als Ärztin

12/05 - 10/06 Assistenzärztin an der Klinik für Allgemein-, Thorax-,Viszeral- und Kinderchirurgie des UniversitätsklinikumsGießen-Marburg, Standort Gießen

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D LEBENSLAUF

seit 10/06 Assistenzärztin an der Klinik für Allgemeinchirurgie derErnst-Moritz-Arndt-Universität, Greifswald

seit 2002 Doktorandentätigkeit am Institut für Immunologie undTransfusionsmedizin der Universität zu Lübeck

2000 - 2005 Stipendiatin der Studienstiftung des deutschen Volkes

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ABBILDUNGSVERZEICHNIS ABBILDUNGSVERZEICHNIS

Abbildungsverzeichnis

1 Ausschnitt aus dem PRL-Promotor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 Molekulare Struktur von PRL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 Schema eines Zytokinrezeptors vom Typ I . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124 Isoformen des PRLR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145 Räumliche Struktur und Bindungsstellen von PRL und des PRLR . . . . . 156 Mechanismus der Aktivierung des PRLR . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167 IRF-1 ist ein multifunktionaler Transkriptionsfaktor . . . . . . . . . . . . . 188 Signaltransduktion über den PRLR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 Antagonismus von PRL und Glukokortikoiden . . . . . . . . . . . . . . . . 2310 Prinzip des EMSA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3911 Prinzip des ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4112 Prinzip des GEArrays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4413 Einfluss von PRL auf die IL-12-Konzentration im Überstand von Vollblut-

kulturen nach LPS-Stimulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4814 Einfluss von PRL auf die TNF-α-Konzentration im Überstand von Vollblut-

kulturen nach LPS-Stimulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4915 Einfluss von PRL auf die IL-10-Konzentration im Überstand von Vollblut-

kulturen nach LPS-Stimulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5016 Effekt von PRL auf die IFN-γ-Sekretion LPS-stimulierter Zellen im Vollblu-

tansatz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5117 Prinzip der Vorinkubation mit PRL und anschließenden Stimulation mit LPS 5218 Repräsentativer NF-κB-EMSA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5319 Repräsentativer IRF-1-EMSA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5420 Phosphoimager-basierte quantitative Auswertung dreier EMSAs von NF-κB 5521 Phosphoimager-basierte quantitative Auswertung dreier EMSAs von IRF-1 5622 Dotblot mit Antikörpern gegen STAT5b . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5723 Repräsentativer EMSA nach Stimulation mit PHA und PRL . . . . . . . . 5924 Repräsentativer EMSA nach Stimulation mit cptcAMP, PHA, PMA und NA 6025 Repräsentativer GEArray nach Stimulation mit PHA und PRL . . . . . . . 6126 Repräsentativer GEArray nach Stimulation mit cAMP, PHA und PMA . . . 6227 Repräsentativer GEArray mit RNA aus Mamma-Karzinom-Zellen . . . . . 6328 Primer für PRL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6329 Primer für PRLR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6430 Ergebnis der PCR nach Inkubation mit PHA und PRL . . . . . . . . . . . . 65

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ABBILDUNGSVERZEICHNIS ABBILDUNGSVERZEICHNIS

31 Ergebnis der PCR nach Stimulation mit cptcAMP, PHA und PMA über 7h . 6732 Ergebnis der PCR nach Stimulation mit cAMP, PHA und PMA über 14h . . 6833 Ergebnis der PCR mit cDNA aus Mamma-Karzinom-Zellen . . . . . . . . 6934 Mechanismus der Regulation der Transkription des IRF-1 Gens durch PRL 7435 Möglicher Mechanismus der Regulation der Transkription des IRF-1 Gens

durch PRL und LPS in Kostimulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7736 Inhibitorische Rolle von SHP-1 in der Jak2/STAT5-Kaskade . . . . . . . . 7737 Schematische Darstellung des Ablaufs der Proteinsynthese in einer Eukaryonten-

Zelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

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