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Untersuchungen zur Verbesserung von Wiederaufforstungsmaßnahmen in Südkorea unter besonderer Berücksichtigung des Beitrages verschiedener Mykorrhiza-bildender Mykobionten und unterschiedlicher Bodensubstrate Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Naturwissenschaften - Dr. rer. nat. - vorgelegt dem Fachbereich 2 Biologie/Chemie der Universität Bremen von Seak-Jin Kim Bremen 2002

Untersuchungen zur Verbesserung von ...elib.suub.uni-bremen.de/diss/docs/E-Diss375_Kim.pdf · unterschieden: die ekto-, ektendo- und endotrophe Mykorrhiza. Bei Waldbäumen der gemäßigten

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Untersuchungen zur Verbesserung vonWiederaufforstungsmaßnahmen in Südkorea

unter besonderer Berücksichtigung des Beitragesverschiedener Mykorrhiza-bildender Mykobionten und

unterschiedlicher Bodensubstrate

Dissertation zur Erlangung des akademischen GradesDoktor der Naturwissenschaften

- Dr. rer. nat. -

vorgelegt dem Fachbereich 2Biologie/Chemie der Universität Bremen

von

Seak-Jin Kim

Bremen2002

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Gutachter: Prof. Dr. W. Heyser Prof. Dr. A. Nehrkorn

Prüfer: Prof. Dr. J . FilserDr. H. Bücking

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Im Text verwendete Abkürzungen

AAS AtomabsorptionsspektrometerAm Apikalmeristembidest. bidestilliertBs BauschuttCAL Calciumacetat-LactatCanorg anorganischer KohlenstoffgehaltCcarb CarbonatkohlenstoffgehaltCorg organischer KohlenstoffgehaltCt KohlenstoffgesamtgehaltEDTA EthylendiaminotetraessigsäureEn Endodermisg GrammGm GemischHM-M Hyphenmantel MatrixHM-C Hyphenmantel CytoplasmaHM-V Hyphenmantel VakuoleMMN-Medium Modifiziertes Melin Norkans MediumHm HyphenmantelHN Hartigsches Netzh StundeITS Interne transkribierte Spacermyk. mykorrhizierte Wurzeln bzw. Pflanzenmg Milligrammml MilliliterM MolMax MaximumMin Minimummin Minutenµg Mikrogrammµm Mikrometern Anzahl der Parallelprobennb nicht bestimmtNt StickstoffgesamtgehaltPCR PolymerasekettenreaktionPax. Paxillus involutusPis. Pisolithus tinctoriusRi RhizodermisR. Rhizophogon roseolusrDNA ribosomale DesoxyribonukleinsäureS. Suillus bovinuss. siehe

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sEn suberinisierte EndodermisSd SandsubstratSD Standardabweichung der StichprobeTEM TransmissionselektronenmikroskopieTG Trockengewichtunmyko. unmykorrhizierte Wurzeln bzw. PflanzenW WattWd WaldbodenWh WurzelhaarWR-ZW Wurzelrinde ZellwandWR-C Wurzelrinde CytoplasmaWR-V Wurzelrinde VakuoleZz Zentralzylinder

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Danksagung

Mein herzlicher Dank gilt in erster Linie Prof. Dr. Wolfgang Heyser für das interessante The-

ma, die Diskussionsbereitschaft bei der Bearbeitung und für seine tatkräftige Unterstützung.

Durch sein Interesse und seine unerschöpflichen Bemühungen hat er entscheidend zum Gelingen

der Arbeit beigetragen. Mein Dank gilt ferner Prof. Dr. Alexander Nehrkorn für seine Bereit-

schaft, sich als Gutachter für diese Arbeit zur Verfügung zu stellen und den beiden Prüfungsmit-

gliedern Prof. Dr. Juliane Filser und Dr. Heike Bücking, für ihren Einsatz sich mit meiner Arbeit

intensiv auseinanderzusetzen. Für die Durchführung der Identifikation der isolierten Mykorrhiza-

pilze möchte ich Dr. Carsten Harms danken. Ein besonderer Dank gilt Dr. Heike Bücking, die

stets ansprechbereit war und durch ihre Anregungen und durch ihre Erfahrung erheblich zum Ge-

lingen der Arbeit beigetragen hat.

Ferner danke ich der Arbeitsgruppe für die vorbildliche Zusammenarbeit im Labor und für die

selbstlose Unterstützung meiner Arbeiten. Den Technikerinnen der Arbeitsgruppe, Helga Wehr-

kamp und Anke Toltz, möchte ich für Ihre Hilfe bei der praktischen Durchführung der Arbeit

danken. Ebenso möchte ich Iren Collet und Marlies Rückmann für ihre Hilfe bei zahlreichen

Untersuchungen danken. Allen anderen Mitgliedern der Arbeitsgruppe Heyser möchte ich herz-

lich danken für das angenehme Arbeitsklima und die ausgezeichnete Zusammenarbeit.Eine große Hilfe beim Schreiben und bei der Formulierung waren meine Freunde, Rainer

Hans, Martin Grunwald und Antje Seebeck, die die ganze Arbeit Korrektur gelesen haben. Herrn

Gerlach vom Stadtforstamt Uelzen danke ich für seine freundlichen Hinweise auf bestimmte

Standorte und für die Unterstützung bei der Sammlung der Mykorrhizapilze, die ich für diese

Arbeit verwendet habe. Herrn Ellmers von der Recycling-Anlage Bremen danke ich für die Be-

reitstellung des Bodenmaterials. Mein Dank gilt auch Werner Vogel und Angelika Trambacz im

Biogarten der Universität Bremen für die große Hilfe bei den Versuchen zur Pflanzenanzucht.

Ebenso geht mein Dank an Won-Yeal Lee vom National Arboretum, Korea Forest Service, der

mir für meine Arbeiten Saatgut zur Verfügung gestellt hat.

Zum Schluß möchte ich mich ganz herzlich bei meinen Eltern, Geschwistern und Schwieger-

eltern, die mich während des Studiums und der Promotion immer unterstützt haben, bedanken.

Besonders herzlich danke ich meiner Frau und meiner Tochter Sun-Mi für das Verständnis und

für die Geduld mir die ganze Zeit zur Seite zu stehen. Die vorliegende Arbeit wurde durch ein

Stipendium der Universität Bremen (Fachbereich 2) unterstützt.

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Inhaltsverzeichnis

Seite

1. Einleitung .................................................................................................................1

1.1. Allgemeine Einführung.................................................................................................11.2. Das technogene Substrat “Bauschuttgemenge“ als Bodensubstrat ..............................41.3. Die Bedeutung der Ektomykorrhiza für das Baumwachstum.......................................41.4. Elementaufnahme über die Wurzel und Transport .......................................................61.5. Die praktische Bedeutung der Ektomykorrhiza ............................................................71.6. Zielsetzung und Fragestellung dieser Arbeit ................................................................9

2. Material und Methoden ....................................................................................10

2.1. Pflanzen und Mykorrhizapilze....................................................................................10

2.1.1. Herkunft der Pflanzen.................................................................................................102.1.2. Auswahl der Mykorrhizapilze ....................................................................................112.1.3. Bodensubstrate............................................................................................................122.1.4. Anzucht der Pflanzen..................................................................................................122.1.5. Kultivierung der Mykobionten ...................................................................................132.1.6. Herstellung von Flüssigkulturen.................................................................................13

2.2. Experimentelles Design ..............................................................................................14

2.2.1. Gewinnung von Reinkulturen aus dem Freiland ........................................................142.2.1.1. Isolierungsversuche aus Fruchtkörpern ......................................................................142.2.1.2. Isolierungsversuche aus mykorrhizierten Wurzeln.....................................................15

2.2.2. Methodenentwicklung der in-vitro-Mykorrhizierung.................................................152.2.2.1. Petrischalen-Methode .................................................................................................152.2.2.2. Inokulierung mit Flüssigkulturen (Vegetative Inokulation) .......................................172.2.2.3. Optimierung der “Nylon-Mesh“ Methode zur Inokulation .........................................182.2.2.4. Biokompost als Zusatzstoff für die Bodensubstrate ...................................................19

2.2.3. In-vitro Untersuchungen zum Einfluß des pH-Wertes auf das Myzelwachstum........192.2.4. Bestimmung der Mykorrhizierungsrate ......................................................................202.2.5. Identifizierung der isolierten Mykorrhizen aus dem Freiland ....................................20

2.3. Morphologische und anatomische Untersuchungen ...................................................22

2.3.1. Dokumentation des Mykorrhizierungsverlaufes.........................................................222.3.2. Fixierung und Einbettung (LM)..................................................................................222.3.3. Gefriertrocknung und Einbettung ...............................................................................23

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2.3.4. Mikrotomie und Bedampfung.....................................................................................242.3.5. Rasterelektronenmikroskopie (REM).........................................................................242.3.6. Röntgenmikroanalyse (EDXS) ...................................................................................252.3.7. Fotographische Dokumentation..................................................................................25

2.4. Chemische Charakterisierung der Böden und Pflanzen..............................................26

2.4.1. Bestimmung des pH-Wertes im Boden ......................................................................262.4.2. Bestimmung der elektrischen Leitfähigkeit des Bodens.............................................262.4.3. Bestimmung des pflanzenverfügbaren Phosphat- und Kalium-Gehalts nach dem

CAL-Auszug (nach SCHÜLLER, 1969) ........................................................................262.4.4. Bestimmung des Ct- und Nt-Gehaltes im Elementaranalysator ..................................272.4.5. Bestimmung des Carbonatgehaltes .............................................................................272.4.6. Bestimmung der pflanzenverfügbaren Kationen im Boden........................................282.4.7. Ermittlung des Gesamt-Kationengehaltes von Sproß und Wurzel .............................282.4.8. Bestimmung der Anionen im Boden ..........................................................................292.4.9. Mikrowellenaufschluß ................................................................................................292.4.10. Aufschlußverfahren ....................................................................................................302.4.11. Bestimmung der Schwermetalle .................................................................................31

2.4.11.1. Reproduzierbarkeit .....................................................................................................312.4.11.2. Pflanzenverfügbare Schwermetalle im Boden............................................................312.4.11.3. Schwermetall-Gesamtgehalte in Pflanzen und Böden................................................32

2.4.12. Datenverarbeitung.......................................................................................................32

3. Ergebnisse ..............................................................................................................33

3.1. Pflanzen und Pilze ......................................................................................................33

3.1.1. Methodenentwicklung ................................................................................................333.1.1.1. Isolierung von Mykorrhizapilzen aus Fruchtkörpern und mykorrhizierten

Wurzeln aus dem Freiland ..........................................................................................333.1.1.2. Identifizierung der isolierten Freilandmykorrhizen ....................................................343.1.1.3. Inokulationsversuch mit Flüssigkulturen....................................................................373.1.1.4. Optimierung der Inokulationsmethode .......................................................................403.1.1.5. Wachstum der Pflanzen auf den eingesetzten Bodensubstraten mit Biokompost

als Zusatzstoff ...........................................................................................................413.1.1.6. Einfluß des pH-Wertes auf das Myzelwachstum........................................................44

3.2 Untersuchungen zu den unterschiedlichen Bodensubstraten......................................46

3.2.1 Weitere Bodendaten....................................................................................................463.2.1.1. pH-Wert des Bodens...................................................................................................46

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3.2.1.2. Elektrische Leitfähigkeit.............................................................................................463.2.1.3. CAL-lösliche Gehalte von P und K im Boden ...........................................................483.2.1.4. Corg- und Canorg-Gehalt im Boden ...............................................................................493.2.1.5. Nt-Gehalt und C/N-Verhältnis im Boden ...................................................................503.2.1.6. Pflanzenverfügbaren Kationen im Boden...................................................................513.2.1.7. Anionengehalte im Boden ..........................................................................................533.2.1.8. Schwermetallgesamtgehalte im Boden.......................................................................553.2.1.9. CaCl2-extrahierbare Schwermetallgehalte im Boden .................................................57

3.3. Untersuchungen der Pflanzen .....................................................................................60

3.3.1. In-vitro Mykorrhizierungsverlauf ...............................................................................603.3.2 Morphologische und anatomische Charakterisierung der Mykorrhizen.....................633.3.3. Sproß- und Wurzelentwicklung..................................................................................703.3.4. Sproß- und Wurzel-Trockengewicht und Sproß/Wurzel-Verhältnis ..........................743.3.5. Makroskopische Bewertung des Mykorrhizierungsrate .............................................773.3.6. Chemische Untersuchungen der Pflanzen ..................................................................78

3.3.6.1. Kationengesamtgehalte in Sproß und Wurzeln mykorrhizierter Pflanzen .................783.3.6.2. EDXS-Messungen zur Lokalisation verschiedener Elemente in der Wurzel .............813.3.6.3. Schwermetallgesamtgehalte in Sproß und Wurzeln mykorrhizierter und

unmykorrhizierter Pflanzen ........................................................................................83

4. Diskussion...............................................................................................................88

4.1. Selektion der Mykorrhizapilze und die Isolierung aus Fruchtkörpern und mykorrhi-zierten Wurzeln aus dem Freiland .............................................................................88

4.2. Identifizierung der Mykorrhizapilze an Hand von mykorrhizierten Wurzeln bzw.Fruchtkörpern .............................................................................................................90

4.3. In-vitro Inokulation ....................................................................................................91

4.3.1. Entwicklung der in-vitro Inokulationsmethode (Petrischalen- und Nylon-Mesh-Methode).....................................................................................................................91

4.3.2 Inokulationsversuche mit Flüssigkulturen und entsprechende Vorbehandlungder verwendeten Bodensubstrate (Vermiculit und Biokompost)................................93

4.3.3. Mykorrhizierungsfähigkeit ........................................................................................954.3.4. Einfluß des pH-Wertes auf das Wachstumsverhalten der Pilzkultur .........................964.3.5. In-vitro Mykorrhizierungsverlauf ...............................................................................97

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4.4. Chemische Charakterisierung der Bodensubstrate und Pflanzen ...............................99

4.4.1. Bodenchemische Kennwerte.......................................................................................994.4.2. Pflanzenverfügbare Nährstoffmengen im Boden......................................................1044.4.3. Kationengesamtgehalte in Sproß und Wurzel mykorrhizierter Pflanzen .................1054.4.4. EDXS-Messungen zur Lokalisation verschiedener Elemente in der Wurzeln .........1094.4.5. Schwermetallgehalte im Boden (Gesamt- und pflanzenverfügbare Gehalte)...........1124.4.6. Schwermetallaufnahme und –verteilung in der Pflanzen .........................................113

4.5. Pflanzenwachstum auf den Bodensubstraten mit Biokompost als Zusatzstoff ........117

4.6. Anatomische Charakterisierung der Mykorrhiza......................................................119

4.7. Sproß- und Wurzelentwicklung auf den verschiedenen Böden................................121

4.8. Schlußfolgerungen ....................................................................................................124

5. Zusammenfassung und Summary ...............................................................127

5.1. Zusammenfassung ....................................................................................................127

5.2. Summary...................................................................................................................130

6. Literatur................................................................................................................133

7. Anhang ..................................................................................................................146

7.1. Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen .............................................................146

7.1.1. Abbildungsverzeichnis .............................................................................................1467.1.2. Tabellenverzeichnis ..................................................................................................148

7.2. Werteanhang .............................................................................................................149

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Einleitung 1

1. Einleitung

1. 1 Allgemeine Einführung

FRANK (1885) hat erstmalig beschrieben, dass bestimmte Pilze mit den Wurzeln höherer

Pflanzen eine Symbiose eingehen, die als Mykorrhiza (“Pilzwurzel“) bezeichnet wird. Die

Mykorrhizen können sehr unterschiedlich ausgeprägt sein. Es werden dabei drei Formen

unterschieden: die ekto-, ektendo- und endotrophe Mykorrhiza. Bei Waldbäumen der

gemäßigten Zone wozu auch unsere Waldbäume, wie Kiefer, Fichte und Buche gehören,

ist die ektotrophe Mykorrhiza von besonderer Bedeutung. Sie wird überwiegend von

Basidiomyceten und z. T. auch Ascomyceten gebildet.

Die ektotrope Mykorrhiza wird nach HARLEY & SMITH (1983) charakterisiert durch:

� die Bildung eines dichten Hyphenmantels aus Pilzhyphen, der die Wurzel vollständigumschließt und unterschiedliche Farben und Formen zeigt (s. Abb. 3).Dieser Hyphenmantel erreicht eine Dicke von 20-100 µm und macht ca. 25-40% des Trocken-gewichtes einer mykorrhizierten Wurzel aus.

� die Ausbildung eines Hartigschen Netzes, das durch das interzelluläre Eindringen von Pilz-hyphen in die Rhizodermis und die primäre Rinde einen intensiven Kontakt zwischen denSymbiosepartnern herstellt.

Mykorrhizierte Wurzeln besitzen in der Regel keine Wurzelhaare, aber Pilzhyphen oder

Rhizomorphen, die weiter in das Substrat abziehen (HOCK et al., 1984). Eine wichtige

Funktion der Mykorrhiza ist ein bidirektionaler Stoffaustausch zwischen beiden

Symbiosepartnern. Die Mykorrhizapilze sorgen bei den Wirtspflanzen für eine bessere

Nährstoffversorgung und bilden einen Zwischenspeicher für Makronährstoffe im

Hyphenmantel (HARLEY & SMITH, 1983). Dieser fördernde Einfluß der Mykorrhizapilze

ist besonders auf nährstoffarmen Standorten - wie z.B. Halden- und Schuttflächen- von

großer Bedeutung, wie bereits von MEYER (1987) festgestellt wurde. Die mykorrhizierten

Pflanzen wachsen auf nährstoffarmen Böden mit niedriger Basensättigung besser als

unmykorrhizierte Pflanzen.

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Einleitung 2

Sie erhöhen des Weiteren die Toleranz z. B. gegenüber Schadstoffen (Schwermetallen)

und pathogenen Pilzen (MARX & DAVEY, 1969). Durch das Bodenmyzel und die

resorbierende Oberfläche wird die Nährstoff- und Wasseraufnahme verbessert (LYR et al.,

1992). Diese Nährstoffe kann der Pilz über größere Entfernung zu den Wirtspflanzen

transportieren, und vermag durch die feinen Hyphen kleinste Kapillarräume zu erschließen

(MEYER, 1986). Viele Autoren haben verschiedene Versuche durchgeführt mit dem Ziel,

das Wachstum von Waldbäumen auf (ärmeren) Standorten zu fördern. Mit geeigneten

Mykorrhizapilzen (TRAPPE, 1962) und einer gezielten künstlichen Beimpfung (MARX,

1980; HASELWANDTER, 1984) wurden bei der Wiederaufforstung extremer Standorte

Erfolge erzielt (MEYER, 1987; ROLDAN et al., 1996; QUEREJETA et al., 1998).

Die gezielte Mykorrhiza-Synthese erfordert zwei Schritte:

1. Isolierung und Reinkultur geeigneter Pilzpartner aus Fruchtkörpern oder aus Sporen(PARLADÉ, et al., 1996b) oder direkt aus mykorrhizierten Wurzeln (MOLINA & PALMER,1982; MARX & KENNEY, 1982).

2. Inokulation und Ausbringung geeigneter Wirtspflanzen bei Wiederaufforstungs-maßnahmen (MOSER, 1963; LEE & KOO, 1983, 1992; LEE, K.J., 1984; MARX & CORDEL,1988; MARX et al., 1991).

Korea:

Korea liegt am Ostrand des asiatischen Kontinents und erstreckt sich rund 1100 km

in nord-südlicher Richtung (in 43°01’ N bis in 33°06’ N ). In Korea sind die Berge

bestimmend für das geographische Gesamtbild des Landes. Sie wirken auf das Klima

ein, und bestimmen den Lauf sowie die Wasserführung der Flüsse. Das Klima Koreas

hat eine besondere Vegetation hervorgebracht. Die Artenvielfalt und die Fülle der

subtropischen bis alpinen Formationen (z.B. sommergrüner Laubwald und immergrüne

Mischwälder) sind bemerkenswert. Die Waldfläche in Südkorea beträgt 13,188 km2.

Das sind ca. 13,3 % des gesamten Staatsraumes. Der Waldbestand in Südkorea ist noch

relativ jung; die meisten Bäume sind nicht älter als 30 Jahre (JAHRESBERICHT des

UMWELT MINISTERUMS KOREAS, 1994).

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Einleitung 3

In den letzten 40 Jahren erreichte Südkorea einen großen Aufstieg im wirtschaft-

lichen Wachstum (DEGE, 1986). Jedoch sind die Folgen der starken Industrialisierung

Südkoreas fast überall spürbar. Die unmittelbare Folge der intensiven, schnellen

Industrialisierung und das zunehmende Bevölkerungswachstum sind eine große

Belastung für die Umwelt. Die Umweltbelastung und die Zerstörung von Natur-

landschaften haben zugenommen. Durch die intensiven Industrialisierungsprozesse und

durch die Erweiterung des Siedlungsgebietes wurden die Grünflächen und die Wälder

immer weiter zurückgedrängt, wobei die ökologischen Gleichgewichte direkt und

indirekt sehr beeinflusst wurden. Im Laufe der Zeit wurde der größte Teil des

industrienahen Gebietes immer wieder mit Bauschutt und anderen Haushaltsabfällen

aufgeschüttet, um Industrie- bzw. Siedlungsflächen zu erweitern. Auf diesen neu

entstandenen Schuttflächen, die als Pionierstandorte oder als extreme Standorte zu

bezeichnen sind, ist eine Wiederbegrünung notwendig.

Trotz großer Bemühungen gab es bei den Bepflanzungsversuchen dieser extremen

Standorte, insbesondere in den Ballungsgebieten, immer wieder Probleme. Es wurde

beobachtet, dass die Pflanzen nach dem Einpflanzen kein gutes Wachstum zeigten und

schließlich abstarben. Bei Koniferen und anderen Mykorrhiza-abhängigen Pflanzen ist

zu vermuten, dass keine passenden Symbiose-Partner im Boden vorhanden waren oder

keine Symbiose mit den Wurzeln eingegangen wurde. Es stehen zur Zeit nur einige

wenige Forschungsberichte über die Nutzung der Mykorrhiza (LEE & KOO, 1983,

1992), aber keine ausreichenden Untersuchungen über mykorrhizabasierte Auf-

forstungsmaßnahmen an derartig extremen Standorten in Südkorea zur Verfügung.

Die rasche Industrialisierung hat weiterhin zur Folge, dass gesamte Ökosysteme

(z.B. Böden, Flüsse, und Grundwasser) durch Einleitung ungeklärter Industrieabwässer

und durch anthropogene Luftverunreinigungen (z.B. Autos und Industrie) in großem

Maße belastet werden. Dies äußert sich u.a. in der Beeinträchtigung des Baum-

wachstums, insbesondere von Tanne und Kiefer. Die nur wachstumsorientierte

Umweltpolitik mildert nicht die gravierenden ökologischen Probleme im Lande. Trotz

der strengen Kontrollen, Strafmaßnahmen und des neuen Umweltschutzgesetzes konnte

Südkorea bis jetzt keine Verringerung der Umweltzerstörung erreichen.

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Einleitung 4

1.2. Das technogene Substrat “Bauschuttgemenge“ als Bodensubstrat

Das technogene Substrat Bauschutt ist sehr heterogen zusammengesetzt. Die

Hauptkomponenten sind Ziegel, Mörtelschutt und Beton aus dem Siedlungsbau.

Weitere häufig vorkommende Komponenten des Bauschutts sind Kunststoffe (mit

Styroporbeimengungen), Glas, Keramik, Holz (z.B. Spanholz), Problemabfälle, Gipse

und Aschen (MEUSER, 1993). Die chemischen Eigenschaften von Bauschutt zeichnen

sich insbesondere durch sehr hohe CaCO3-Gehalte und pH-Werte im neutralen bis

schwach alkalischen Bereich aus (s. Tab. 15 im Anhang). Über die physiko-chemischen

Eigenschaften des Bauschutts ist bis heute noch relativ wenig bekannt (MEUSER, 1996).

Die technogenen Substrate wie Bauschuttgemenge (Ziegel, Mörtelschutt und Beton)

sind allgemein höher mit potenziell toxischen Substanzen wie z.B. Cd, Pb und Zn

belastet (BLUME, 1992; MEUSER, 1996). Bauschutt der natürlich auch Erdbeimengungen

enthält, kann trotz der hohen Belastung als Bodensubstrat für Pflanzen dienen,

insbesondere wenn am Standort bodenverbessernde Maßnahmen (z.B. Mutterboden und

Kompostbeimischungen) vorgenommen werden und so Vorkehrungen für eine

Mykorrhizaausbildung getroffen werden (ggf. durch eine vorherige Animpfung mit

geeigneten Mykobionten).

1.3. Die Bedeutung der Ektomykorrhiza für das Baumwachstum

Die Ektomykorrhiza als eine Symbiose zwischen Pilzen und Pflanzenwurzeln wird

von vielen angiospermen und gymnospermen Gehölzen der gemäßigten Zone gebildet

und spielt eine große Rolle bei der Nährstoffversorgung der Pflanzen (s. Abb. 1). Die

Mykorrhiza bietet dabei beiden Symbionten einen Vorteil, der durch ein verbessertes

Wasser- und Nährstoffangebot für die Pflanze sowie die Verfügbarkeit von Photo-

assimilaten (Kohlenhydrate) für den Pilz charakterisiert ist (HARLEY & SMITH, 1983).

Der Mykorrhizapilz kann nicht nur im Boden gelöste Nährstoffe aufnehmen, sondern ist

in der Lage, an Bodenkolloide gebundene Nährstoffe zu mobilisieren. Hierzu schließt er

die organisch gebundenen Nährstoffe mittels enzymatischer Reaktionen auf. Hierfür

produzieren die Mykorrhizapilze Enzyme wie Proteasen und Phosphatasen (SMITH &

READ, 1997).

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Einleitung 5

Abb. 1: Vereinfachtes Schema der Transportprozesse in einem mykorrhizierten Wurzelsystem.Die vom Mykorrhizapilz aus dem Boden aufgenommenen Nährelemente werden zur Pflanzetransportiert oder im Hyphenmantel gespeichert. Die organischen Assimilate (Kohlenhydrate)werden an den Pilz abgegeben, wobei der Hyphenmantel jeweils als Speicher dient (verändertnach NENNINGER, 1999).

Viele Untersuchungen zeigten, dass die Mykorrhiza z.B. mit dem Pilz Pisolithus

tinctorius das Wachstum von autotrophen Pflanzen insbesondere auf ärmeren

Standorten fördert (ROLDAN et al., 1996; QUEREJETA et al., 1998). Die Pilzmyzelien

durchziehen den Bodenraum dichter als Pflanzenwurzeln. Darüber hinaus erfolgt die

Nährstoffaufnahme durch das gesamte Pilzmyzel im Gegensatz zu einer lokalisierten

und begrenzten Aufnahme durch die Wurzelhaare an den Wurzelspitzen von Pflanzen.

Über den Pilz erhält die Pflanze nicht nur Makronährelemente wie z. B. Phosphor

(HARLEY & SMITH, 1983) und Stickstoff (LITTKE et al., 1984), sondern auch

Schwermetalle, die zum Teil essentielle Spurenelemente sind, aber in höheren

Konzentrationen toxisch wirken. Für die Ernährung der Bäume ist die Aufnahme von

Spurenelementen und die Wirkung von toxischen Stoffen ein wichtiger Aspekt (BOWEN

et al., 1974). Zum Beispiel kann es im Vergleich zu unmykorrhizierten Pflanzen zu

einer Akkumulation dieser Stoffe in den Pilzhyphen kommen und damit zu einer

Reduzierung der Schwermetall-Konzentration im Sproß der Pflanze. So konnten

COLPAERT und VAN ASSCHE (1992) eine Reduzierung des Zn-Gehaltes im Sproß

mykorrhizierter Kiefern gegenüber unmykorrhizierten Pflanzen nachweisen. Darüber

hinaus wird dem die Wurzel umschließenden Hyphenmantel auch eine gewisse

Schutzfunktion gegenüber pathogenen Organismen zugesprochen.

Hyphen desMykorrhiza-

pilzes

Boden

Aufnahme

Kohlenhydrate

Hyphenmantel HartischesNetz

Wurzel-cortex

Nährstoffe (P, N, Ca, Zn , Cu etc.)

TransferSpeicher

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Einleitung 6

MARX und DAVEY (1969) konnten z. B. zeigen, dass manche Mykorrhizapilze in der

Lage sind, wurzelpathogene Pilze wie Hallimasch (Armillariella mellea) und andere

Wurzelschädlinge zu inhibieren. Zudem erfüllt die Mykorrhiza auch eine mechanisch-

physikalische Schutzfunktion. Der Hyphenmantel schützt die Wurzel während

Trockenperioden vor Austrocknung. Die Funktion des Hyphenmantels liegt

hauptsächlich in der Absorption, Zwischenspeicherung und Weiterleitung von

Nährstoffen. Die Bedeutung des Pilzmantels als separierendes Element zwischen der

Pflanzenwurzel und der Bodenlösung wird kontrovers diskutiert. Die Aktivität der

Mykorrhizapilze und damit die Intensität der Mykorrhizabildung wird beeinflußt durch

verschiedene chemische und physikalische Bodeneigenschaften wie z.B. pH-Wert, N-

und P-Gehalt, Wasser- und Nährstoffgehalt, Struktur und Durchlüftung des Bodens. Ein

besonders wichtiger Faktor für das Wachstum und das Vorkommen von Mykorrhizen

ist in erster Linie der pH-Wert des Bodens. So stellten HUNG und TRAPPE (1983) fest,

dass das Vorkommen bestimmter Mykorrhiza-Arten direkt mit dem Boden-pH-Wert

korreliert ist. Auch die Keimungsrate der Pilzsporen ist vom pH-Wert abhängig, wobei

die pH-Optima für die verschiedenen Pilzarten in unterschied-lichen Bereichen liegen

können (MARX & ZAK, 1965).

1.4. Elementaufnahme über die Wurzel und Transport

Die wichtigste Funktion der Wurzel ist sowohl die Aufnahme von Wasser und

Elementen als auch die Speicherung dieser Elemente. Die Nähr- und Spurenelemente

sowie Schwermetalle werden nur dann von den Wurzeln in Form von Kationen und

Anionen aus der Bodenlösung aufgenommen, wenn sie pflanzenverfügbar sind. Die

Nährstoffe können durch Diffusion, Ionenaustausch und Membrandurchtritte (aktive

Prozesse) von den Pflanzenwurzeln aufgenommen werden. Das Wachstum der

Pflanzenwurzeln orientiert sich zu den nährstoffreichen Bodenzonen hin. Die Wurzeln

nehmen einen Teil der Nährstoffe (z.B. Stickstoff) mit Hilfe von Bakterien (Rhizobium)

und den Hyphen von Mykorrhizapilzen auf (LYR et al., 1992). Dabei werden Bakterien

und Pilze für die Nährstoffmobilisierung und für die Nährstoffaufnahme genutzt. Die

Konzentrationsgradienten bestimmter Ionen entstehen in der Rhizosphäre und im

Apoplasten durch die Aufnahmeaktivität der Wurzel.

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Einleitung 7

Durch Diffusion und mit dem durch den Transpirationsstrom bewegtem Wasser

gelangen die Stoffe in den Apoplasten („free space“) und den Symplasten der

Wurzelrinde (s. Abb. 2). Die Aufnahme in den Apoplasten erfolgt ohne Zuhilfenahme

von Stoffwechselenergie und wird somit als passive Aufnahme bezeichnet. Der

Apoplast der Wurzel ist sowohl für Mineralstoffe als auch für Schwermetalle bis zum

Caspary´schen Streifen frei zugänglich. Am wasserundurchlässigen Caspary´schen

Streifen der intakten Endodermiszellen wird der Stoffstrom gestoppt und die Nährstoffe

müssen für den Weitertransport ins Innere, in den Symplasten, übertreten. Hierdurch

wird die Aufnahme von Nährstoffen kontrolliert und selektiert. Um vom Apoplasten in

das Innere der lebenden Zellen zu gelangen, müssen die Nähr- und Schadstoffe die

äußere Plasmagrenzschicht, das Plasmalemma, passieren. In dieser Membran sind die

verschiedenen Transporter und ionenspezifischen Kanäle lokalisiert. Der symplastische

Transport der Stoffe erfolgt in der Wurzel über Plasmodesmen. In der Abb. 2 sind die

Transportwege in der Wurzel dargestellt.

Abb. 2: Vereinfachte schematischeDarstellung der Stofftransport-

1.

Au

prozesse. Stoffe, die über dieBodenlösung die Wurzel erreichthaben, können auf apoplastischemund symplastischem Transportwegtransportiert werden (aus BARGAGLI,1998).

5. Die praktische Bedeutung der Ektomykorrhiza

Das Wissen über die Mykorrhizabildung und –funktion lässt sich vorteilhaft für

fforstungsmaßnahmen von Problemstandorten verwenden, insbesondere bei Böden,

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Einleitung 8

die nicht über eine geeignete Mykorrhizapilz-Population verfügen. Die praktische

Anwendung ist dann besonderes effektiv, wenn Bäume in Gebieten angepflanzt werden

sollen, in denen die geeigneten Mykorrhizapilze fehlen (WERNER, 1987). Die große

Bedeutung der Mykorrhiza für das Baumwachstum wurde insbesondere nach

Beimpfungsversuchen auf extremen Standorten offensichtlich. Für extreme Standorte

ist es notwendig eine gezielte Auswahl an Symbiosepartnern zu treffen, damit das

Baumwachstum gefördert wird. Extreme Standorte sind durch den Mangel eines für das

Baumwachstum wichtigen Standortfaktors wie z.B. Wasser und einzelne Nährstoffe

oder durch den Überschuss eines solchen (wie z.B. Schwermetalle) gekennzeichnet

(MEYER, 1987). Um suboptimale Bedingungen auszugleichen, müssen die ausgewählten

Bäume mit geeigneten Mykorrhizapilzen inokuliert werden, da die einzelnen Pilzarten

das Baumwachstum unterschiedlich beeinflussen können, so dass eine standort-

abhängige optimale Partnerkombination etabliert wird (TRAPPE, 1962; MOLINA et al.,

1992). Es gibt sowohl zwischen verschiedenen Pilzarten als auch innerhalb einer Art,

Unterschiede in der Effizienz das Baumwachstum günstig zu beeinflussen (SCHMITZ &

WILLENBORG, 1992).

Eine Reihe von Autoren haben die Ausbildung der Mykorrhiza mit verschiedenen

Pflanzen und Mykobionten untersucht: eine Zahl geeigneter Symbiosepartner (Wirts-

pflanze und Mykorrhizapilz) hat sich sowohl bei der Inokulation im Labor (in-vitro) als

auch im Freiland bewährt. Die am häufigsten verwendeten pflanzlichen Partner sind

Pinus-Arten, Picea abies und Eucalyptus sp., als häufigster Mykobiont wird Pisolithus

tinctorius eingesetzt. Dieser Pilz hat sich als universeller Symbiosepartner etabliert, da

er nachweislich mit 48 Baumarten Mykorrhizen bilden kann und tolerant gegenüber

hohen Bodentemperaturen, Feuchte-Streß und Bodentoxizität ist (MARX, 1977).

Obwohl sich viele Arbeitsgruppen mit diesen Techniken beschäftigt haben, sind weitere

Forschungsaktivitäten nötig, da sich bei unterschiedlichen Aufforstungsbedingungen

verschiedene Ansprüche ergeben (HOCK et al., 1984).

Um eine gezielte Auswahl von Symbiosepartnern zu treffen, müssen die

Mykorrhizapilze der Aufforstungs- bzw. Untersuchungsstandorte zunächst identifiziert

werden. Die genaue Identifikation anhand mykorrhizierter Wurzeln ist im Gegensatz zu

Fruchtkörpern besonders schwierig. Mit Hilfe von morphologischen und anatomischen

Merkmalen (AGERER, 1987; AGERER & RAMBOLD, 1996) ist es nur im begrenzten

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Einleitung 9

Umfang möglich Mykorrhizapilze zu identifizieren. Bisher konnten Mykorrhizapilze

durch morphologisch anatomische Merkmale wie z. B. die Form, die Farbe der Hyphen,

die Oberflächenstruktur und die Struktur des Hartigschen Netzes (Dicke) oft nicht

eindeutig bestimmt werden. Hier bieten neue molekularbiologische Verfahren die

Möglichkeit die Gattung bzw. sogar die Art eindeutig zu identifizieren. In den letzten

Jahren haben viele Autoren Mykorrhizapilze mittels molekularbiologischer Methoden

über PCR (Polymerase chain reaction) mit anschließender DNA-Sequenzbestimmung

identifiziert (REDECKER, 2000; PRITSCH et al., 1997, 2000; LEE & HONG, 1998).

1.6. Zielsetzung und Fragestellung dieser Arbeit

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, ein Modellsystem zu entwickeln, mit dem

mykorrhizabasierte Aufforstungsmaßnahmen von Halden, Schuttflächen und anderen

extremen Standorten in Südkorea optimiert werden können. In einem ausgewählten

Modellsystem wird das Pflanzenwachstum mit verschiedenen Mykorrhizapilzen -

darunter auch Freilandisolate - unter Optimierung der Inokulationsmethode betrachtet.

Es soll herausgefunden werden, welche Baumarten mit welchen Mykorrhizapilzen in

Abhängigkeit der unterschiedlichen Bodensubstrate ein optimales Wachstum zeigen.

Weiterhin ist zu klären, unter welchen Kulturbedingungen eine gute Mykorrhizierungs-

rate erreicht werden kann. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit folgenden

Fragestellungen:

� Welche Inokulationsverfahren führen bei ausgewählten Baumarten zu gutenMykorrhizierungsraten?

� Wie wirken sich Bodenunterschiede auf die Entwicklung des Wurzelsystems und dieMykorrhizierung aus?

� Verbessert eine Mykorrhizierung unter diesen Bedingungen die Nährstoffversorgungder Pflanzen?

� Welchen Einfluß haben Schwermetalle (z.B. Cd, Pb, Cu, Mn und Zn) auf diePflanzenentwicklung und führt eine Mykorrhizierung zu einer Veränderung derAufnahme und Verteilung von Schwermetallen in der Pflanze?

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Material und Methoden 10

2. Material und Methoden

2.1. Pflanzen und Mykorrhizapilze

2.1.1. Herkunft der Pflanzen

Als Versuchspflanzen wurden zwei der in Korea einheimischen Baumarten Pinus

thunbergii Parl. (Japanische Schwarz-Kiefer) und Pinus densiflora Sieb. & Zucc.

(Japanische Rot-Kiefer) ausgewählt. Die Auswahl der beiden Baumarten richtete sich

vor allem nach der Nutzung bei Aufforstungsmaßnahmen in Südkorea. Beispielsweise

wurden im Jahr 1983 über 800.000 Exemplare Pinus densiflora auf Wald- und Kahl-

flächen kultiviert. Pinus thunbergii (nachfolgend P. thunbergii) und Pinus densiflora

(nachfolgend P. densiflora) gehören zur Familie der Pinaceae innerhalb der Klasse der

Nadelgehölze (Coniferae). Die beiden in Südkorea heimischen Kiefernarten P.

thunbergii und P. densiflora kommen auf unterschiedlichen Standorten vor und haben

unterschiedliche Ansprüche im Hinblick auf die ökologischen Bedingungen.

Die japanische Schwarz- oder Thunbergskiefer (P. thunbergii) ist der europäischen

Schwarz-Kiefer (Pinus nigra) ähnlich und kommt besonders an der Küste auf Sand-

böden vor (als Windschutzbaum bewährt), während die japanische Rot-Kiefer (P.

densiflora), Ähnlichkeiten mit der in Europa beheimateten Gemeinen Kiefer Pinus

sylvestris L. (nachfolgend P. sylvestris) aufweist, und in Korea und in Japan bis zu

1600 m hohen Lagen vorkommt (s. Tab. 22 im Anhang). P. thunbergii läßt sich anhand

der weißlichen Knospen von anderen 2-nadeligen Kiefern wie P. densiflora

unterscheiden (KINDEL, 1995).

Das Saatgut wurde im Herbst 1995 geerntet und anschließend bei -4 °C gelagert und

einmal im Monat belüftet, so dass es nicht zur Keimung kommen konnte. Das Saatgut

für die Untersuchungen wurde freundlicherweise vom Koreanischen Forstministerium

für Baumzüchtung zur Verfügung gestellt. Für das Kiefern-Saatgut brauchte keine

Stratifikationsbehandlung durchgeführt werden. Die Kultivierung der Pflanzen wird in

den folgenden Abschnitten dargestellt.

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Material und Methoden 11

2.1.2. Auswahl der Mykorrhizapilze

Als Mykobionten wurden Pisolithus tinctorius (Pers.) Coker et Couch, Suillus

bovinus (L. ex. Fr.) Kuntze und Rhizopogon roseolus (Fr.: Fr.) Th. Fr. ausgewählt.

Pisolithus tinctorius (nachfolgend Pis. tinctorius) gehört zur Gruppe der

Basidiomyceten (Ständerpilze) und zur Familie der Sclerodermataceae. Diese Kultur

wurde von I. KOTTKE (Universität Tübingen) zur Verfügung gestellt. Er kommt in

sandigen Nadelwäldern, bevorzugt unter Kiefern vor und bildet einen gelbbraunen

Hyphenmantel (s. Abb. 5a) (GERHARDT, 1997). Suillus bovinus (nachfolgend S.

bovinus) gehört zur Gruppe der Basidiomyceten und zur Familie der Boletaceae. Diese

Kultur wurde freundlicherweise von R.D. FINLAY (Universität Lund) zur Verfügung

gestellt. Dieser Pilz kommt häufig in Kiefernwäldern vorwiegend auf sauren Böden vor

und bildet einen weißen Hyphenmantel (s. Abb. 5b). Rhizopogon roseolus (nachfolgend

R. roseolus) gehört zur Familie der Rhizopogonaceae und kommt in Nadelwäldern

unter Kiefern oder Fichten vor allem auf Kalkböden vor. Er bildet ebenfalls einen

weißen Hyphenmantel (s. Abb. 5c). Die Reinkultur von R. roseolus wurde aus Freiland-

Mykorrhizen der Kiefer (P. sylvestris) isoliert.

Der aus dem Freiland isolierte Mykobiont konnte mit Hilfe der PCR (Polymerase-

kettenreaktion, NEWTON & GRAHAM, 1997) und der DNA-Sequenzierung identifiziert

werden. Einen wichtigen Bestandteil der vorliegenden Arbeit bildete die Isolierung von

Freilandkulturen einiger Mykorrhizapilze, deren pH-Optimum im neutralen bis schwach

alkalischen Bereich liegen sollte. Ein geeigneter Waldstandort wurde mit Hilfe von

Herrn GERLACH vom Stadtforstamt Uelzen (150 km östlich von Bremen) gefunden, wo

der pH-Wert des Bodens über 7,0 liegt und überwiegend Kiefern (P. sylvestris) und

zum Teil auch Fichten (Picea abies [L.] Karst.) vorkommen. Die Eigenschaften und

Merkmale dieses Bodentyps werden nachfolgend beschrieben.

Dieser Sondertyp ist durch frühere anthropogene Einwirkung entstanden. Die alten

Deckschichten sind hier bis auf den Mergel abgetragen. Durch Einhänge zu einer Mulde

von der Umgebung auch orographisch deutlich abgegrenzt, liegt hier direkt an der

Oberfläche ein schwerer, toniger Lehm. Er enthält viel freies CaCO3. Ausgangsgestein ist

Geschiebemergel und die bodentypologische Bezeichnung ist Braunerde. Neben der

basischen Natur und dem hohen Kalkgehalt zeigt der Boden eine nicht sehr hohe Nähr-

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Material und Methoden 12

stoff-Konzentration. Die entsprechenden Nährstoffverhältnisse sind der Tabelle 14 im

Anhang zu entnehmen. Die Isolierung und Kultivierung der Mykorrhizapilze wird in den

folgenden Abschnitten dargestellt.

2.1.3. Bodensubstrate

Der in den Experimenten eingesetzte Boden wurde zum Teil aus Gemengen von

Sand, Bauschutt und Biokompost hergestellt. Es werden 4 unterschiedliche Substrate

für diese Untersuchungen eingesetzt:

1 Waldboden: Aus einem Mischwald in Harpstedt (ca. 35 km südwestlich von Bremen)mit großem Anteil an Kiefern und Fichten. Die Bodendecke des schwach lehmigen,podsolierten Sandbodens besteht aus Streu (ZOLONDEK, 1989).

2 Sand: Flußsand, Herkunft aus der Weser nahe Bremen.3 Bauschutt: Der Bauschutt wurde von der Recycling-Anlage in Bremen bezogen. Er

besteht vorwiegend aus Beton, Mörtel, Ziegel, Staub und Straßenaufbruch (Ø 10 mm)(s. Tab. 15 im Anhang).

4 Biokompost: Der Biokompost wurde von der Kompostierungsanlage in Bremenbezogen. Hauptsächlich aus Grünabfällen mit Ton und Kokosfasern zur Boden-verbesserung, aber ohne Torfbeimengungen (s. Tab. 16 im Anhang).

2.1.4. Anzucht der Pflanzen

Zuerst wurde das Saatgut von P. thunbergii und P. densiflora 30 min. unter

fließendem Leitungswasser gespült und für 20 min. mit 30-%igem H2O2 oberflächen-

sterilisiert und anschließend in sterilem Leitungswasser (autoklaviert) gespült. Das so

behandelte Saatgut wurde über Nacht vorgequollen. Für die Aussaat wurde zunächst

Sand solange mit Leitungswasser gewaschen, bis das Wasser keine Trübung mehr

zeigte und dann mit Perlite im Verhältnis 4:1 (v/v) gemischt. Anschließend wurde das

Substrat (Gemisch aus Sand und Perlite) 30 min. bei 121 °C autoklaviert. Das vorge-

quollene Saatgut wurde in mit Sand und Perlite gefüllte Pflanzenschalen überführt,

wobei die einzelnen Samen mit einem Abstand von 3 bis 4 cm in das Substrat einge-

bracht wurden.

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Material und Methoden 13

Bei der Einbringung des Saatgutes war darauf zu achten, dass die Samen nicht tiefer

als 1 cm in den Sand eingedrückt wurden. Durch Vorversuche konnten die wichtigsten

Faktoren für die Anzucht- und Wachstumsbedingungen wie z.B. Lichtintensität und

Luftfeuchtigkeit im Gewächshaus optimiert werden. Die Keimung erfolgte unter kon-

trollierten, semisterilen Bedingungen im Biologischen Garten der Universität Bremen.

Die Lichtstärke betrug ca. 7.000-11.000 Lux mit einem Tages- und Nachtrhythmus von

14 bzw. 10 Stunden und einer Temperatur von 21°C bzw. 15°C. Die relative

Luftfeuchtigkeit betrug 70%-75%. Die Pflanzen wurden im Sommer (April bis Oktober)

nicht zusätzlich beleuchtet und nach Bedarf 2-3 mal in der Woche gewässert. Nach 10

bis 12 Wochen bildeten die Kiefernsämlinge ein gut verzweigtes Wurzelsystem und

konnten für die Inokulation in vorbereitete Rhizotrone (s. Abb. 3) umgesetzt werden.

Auf eine Düngung der Pflanzen wurde verzichtet.

2.1.5. Kultivierung der Mykobionten

Für die verschiedenen Untersuchungen wurden Kulturen von Pis. tinctorius und S.

bovinus sowie ein R. roseolus-Isolat aus dem Freiland verwendet. Dazu wurden die

Mykobionten auf dem von MARX modifizierten Melin-Norkrans-Medium (MMN) (s.

Tab. 17 im Anhang) mit einem Zusatz von 2 % Agar Agar (high gel strength) bei

Raumtemperatur im Dunklen kultiviert. Alle 4 bis 5 Wochen wurde der Pilz durch

Ausstechen von Myzelstückchen aus dem Randbereich der Kultur mit Hilfe eines

Korkbohrers auf frisches Medium übertragen.

2.1.6. Herstellung von Flüssigkulturen

Zusätzlich wurden die ausgewählten Mykobionten in flüssigem Nährmedium

angesetzt (MMN-Nährmedium ohne Agar-Agar), um große Pflanzenmengen inokulieren

zu können. Dazu wurden 1000 ml MMN-Nährlösung erstellt und jeweils 250 ml

Nährmedium auf Erlenmeyerkolben verteilt und 20 min. bei 121°C autoklaviert. Zur

Optimierung der Flüssigkultur wurde das Glukoseangebot halbiert (5 g/l). Nach

Abkühlung des MMN-Nährmediums wurden von auf MMN-Agar-Platten vorgezogenen

Pilzkulturen mit einem Korbohrer (Ø 8 mm) Myzelstückchen ausgestanzt und mit einer

Impföse 2 bis 3 Myzelstückchen in einen vorbereiteten Erlenmeyerkolben überführt.

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Material und Methoden 14

Die Flüssigkulturen wurden auf einem Schüttler (125 Upm) bei Raumtemperatur

inkubiert. Die Inkubationszeit betrug je nach Pilzart 20-30 Tage.

2.2. Experimentelles Design

Zur Unterstützung von Wiederaufforstungsmaßnahmen extremer Standorte durch

mykorrizierte Pflanzen wurden verschiedene Experimente durchgeführt. Hierfür ist es

von Bedeutung, für verschiedene Bodensubstrate die geeigneten Pflanzen/Pilz-

Assoziationen zu ermitteln. Dies beinhaltete die Suche nach passenden Mykobionten,

die Isolierung und Identifizierung (morphologisch und z.T. molekularbiologisch) von

Freilandproben sowie die Entwicklung geeigneter Inokulationsmethoden. Um nähere

Aussagen über das Wachstum der ausgewählten Organismen auf verschiedenen

Substraten machen zu können, wurden sowohl bodenchemische Parameter (z.B. pH-

Wert, C/N-Verhältnis, Kationen- und Schwermetallgehalt) als auch die optimalen

Wachstumsbedingungen verschiedener Mykobionten (z.B. pH-Optimum, Optimierung

des Bodens) untersucht. Zur Klärung der Frage, ob die Mykorrhizierung einen positiven

Effekt auf das Pflanzenwachstum auf belasteten Bodensubstraten zeigt, wurde das

Wachstumsverhalten steriler und mykorrhizierter Pflanzen auf verschiedenen belasteten

Böden beobachtet (morphologische Untersuchungen, Mykorrhizierungsrate und

Sproß/Wurzel-Verhältnis). Die Durchführung dieser Versuche soll nachfolgend

beschrieben werden.

2.2.1. Gewinnung von Reinkulturen aus dem Freiland

2.2.1.1. Isolierungsversuche aus Fruchtkörpern

Die Isolierung von Mykorrhizapilzen aus dem Freiland war bei dieser Arbeit ein

wichtiger Bestandteil, um Reinkulturen von entsprechenden Pilzarten für die

Inokulation zu erhalten. Mit Hilfe des Forstamtes der Stadt Uelzen wurde ein

geeigneter Standort gefunden. Dort wurden im Mai 1998, September und Oktober 1999

geeignete Mykorrhizapilze in Form von (bestimmbaren) Fruchtkörpern unter Kiefern

(P. sylvestris) und mykorrhizierten Wurzeln gesammelt und im Labor weiterverarbeitet.

Zuerst wurden die Pilze unter fließendem Leitungswasser gründlich gereinigt, ohne sie

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Material und Methoden 15

zu verletzen. Mittels eines sterilen Skalpells wurde die Haut des Pilzhutes entfernt und

so das Fruchtfleisch freigelegt. Dieses konnte in kleinen Stückchen (Kantenlänge ca. 2-

4mm) aus der Mitte des Pilzhutes herausgeschnitten und mit einer Pinzette unter

sterilen Bedingungen direkt auf MMN-Nährböden (6-10 Stück) überimpft werden

(MOLINA & PALMER, 1982). Nach dem Auswachsen des Myzels konnten Reinkulturen

durch wiederholtes Überimpfen hergestellt werden.

2.2.1.2. Isolierungsversuche aus mykorrhizierten Wurzeln

Durch vorsichtiges Ausschütteln wurden die mykorrhizierten Kiefernwurzeln von

anhaftenden Bodenpartikeln befreit und anschließend unter fließendem Leitungswasser

abgespült. Dann wurden die Wurzeln in mit sterilem Leitungswasser gefüllten

Glasschälchen gesammelt. Unter einem Binokular wurden Kurzwurzeln mit Hilfe eines

scharfen Skalpells und einer feinen Pinzette abpräpariert und von den restlichen

Verunreinigungen befreit. Zur Oberflächensterilisation wurden die mykorrhizierten

Wurzeln 10 bis 20 sec. einer 30%igen H2O2-Lösung ausgesetzt (MOLINA & PALMER,

1982). Die Dauer der Sterilisation richtete sich einerseits nach dem Durchmesser der

Mykorrhizen und andererseits nach ihrem ursprünglichen Verschmutzungsgrad. Nach

der Oberflächensterilisation wurden die mykorrhizierten Wurzeln sofort mit

autoklaviertem Leitungswasser 2- bis 3mal gespült und dann mit sterilem Papier

abgetrocknet und auf Agarplatten (MMN) übertragen (ZAK & BRYAN, 1963; ZAK &

MARX, 1964). Der pH-Wert im MMN-Nährmedium wurde gemäß des Bodenstandortes

der Fundstelle des Mykorrhizapilzes auf pH 7 eingestellt (s. Tab. 14 im Anhang). Die

beimpften Platten wurden unter Lichtabschluß bei Raumtemperatur (19-22 °C)

aufbewahrt. Bereits nach 2 bis 4 Tagen konnte die Ausbildung von neuem Myzel

beobachtet werden. Mit dieser Methode konnten durch mehrfaches Überimpfen

Reinkulturen angelegt werden.

2.2.2. Methodenentwicklung der in-vitro-Mykorrhizierung

2.2.2.1. Petrischalen-Methode

Nach 10-12 Wochen wurden die Kiefernsämlinge der Sandkultur entnommen.

Hierfür wurde das Substrat angefeuchtet, um die Wurzeln möglichst ohne Verletzung

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Material und Methoden 16

vom Sand zu befreien. Anschließend

wurden die Wurzeln unter

Leitungswasser von anhaftenden

Substratresten gesäubert. Danach

wurden die Wurzeln mit Hilfe fussel-

und kontaminationsfreier Tücher

vorgetrocknet. Nach der Bestimmung

des Frischgewichtes folgte die

Überführung der jungen Pflanzen in

vorbereitete Kunststoffpetrischalen (�

9 cm), welche im weiteren auch als

Rhizotrone (s. Abb. 3) bezeichnet

werden. Die Rhizotrone wurden mit

sterilem Perlite (als Feuchtigkeits-

speicher) gefüllt und mit einem

ebenfalls sterilen Stück Aktiv-

Kohlepapier (Nr. 508, Fa. Schleicher

und Schüll, Dassel) bedeckt (KOTTKE

et al., 1987). Auf das Aktivkohlepapier

wurde anschließend die Wurzel der

jungen Pflanze gelegt und mit dem Deckel des Rhizotrons bedeckt, so dass die Wurzel

direkt unterhalb der Petrischalenoberseite lag. Zum Schluß wurde die Petrischale mit 2

Klebestreifen verschlossen. Nach ca. 2 Wochen wurden zur Mykorrhizierung je

Rhizotron 3 bis 4 vorinokulierte Myzelstücke (aus der Plattenkultur) mit dem Myzel

nach unten neben neu ausgetriebene Kurzwurzeln platziert, wobei direkter Kontakt

zwischen Myzel und Wurzel vermieden wurde (s. Abb. 3). Für die Plattenkulturen

wurden aus den gut ausgebildeten Pilzkulturen mit einem Korkbohrer Inokulate

ausgestochen und auf MMN-Agar-Platten überimpft (ca. 15 bis 20 Inokulate/Platte).

Dies ist eine Maßnahme zur Regeneration des Pilzmyzels und schafft somit opti-

male Voraussetzungen für eine Mykorrhizierung. Die Mykorrhizierung erfolgte im

“Biologischen Garten“ unter den in Punkt 2.1.4 beschriebenen Bedingungen, wobei alle

3-4 Tage die Feuchtigkeit der einzelnen Rhizotrone kontrolliert wurde. Die Rhizotrone

wurden bei Bedarf vorsichtig mit Hilfe einer Spritze mit Leitungswasser befeuchtet.

Abb. 3: Darstellung der Rhizotrontechnik;Semisteriles System zur Beimpfung vonP. thunbergii mit dem Mykorrhizapilz R.roseolus. Die Petrischale ist mit sterilemPerlite befüllt (nur am Rande erkennbar)und mit einer Lage Kohlepapierabgedeckt.

Inokulat

Kohlepapier

MykorrhizierteKurzwurzel

Perlite

Myzel

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Material und Methoden 17

Etwa 10 bis 15 Tage nach der Inokulation waren die Wurzeln weitestgehend

mykorrhiziert und konnten aus den Rhizotronen entnommen werden. Anschließend

wurden die Pflanzen in die mit verschiedenen Bodensubstraten gefüllten Rhizotrone

übertragen und unter kontrollierten Bedingungen in Gewächshauskabinen des

Biologischen Gartens der Universität weiter kultiviert. Auf eine zusätzliche Düngung

wurde bei allen Versuchsansätzen verzichtet.

2.2.2.2. Inokulierung mit Flüssigkulturen (vegetative Inokulation)

Um eine Inokulationsmethode für große Pflanzenmengen zu entwickeln, wurden

Flüssigkulturen von Pis. tinctorius und R. roseolus hergestellt (s. Punkt 2.1.6). Diese

Flüssigkulturen wurden anschließend zur Inokulation verwendet. Für diese Unter-

suchung wurde ein Gemisch aus Vermiculit und Biokompost (4:1 v/v) als Boden-

substrat verwendet und als Versuchspflanzen P. thunbergii und P. densiflora

ausgewählt. Die Pilzkulturen in flüssigem MMN-Medium (5 g Glukose/l) zeigten ein

kugelförmiges Wachstum (Ø 2-4 mm), so dass sie ohne mechanische Zerkleinerung

verwendet werden konnten. Zuerst wurden die Flüssigkulturen durch ein Sieb (Ø 0,8

mm) filtriert und mit sterilem Leitungswasser 2 bis 3 mal gewaschen. Danach wurden

sie mit steriler Ingestad-Nährlösung 2 mal gespült und bis zur Inokulierung in der

Ingestad-Nährlösung (s. Tab. 18 im Anhang) kurzfristig aufbewahrt.

Nachdem die Pflanzen ausreichend Kurzwurzeln gebildet hatten, wurden sie aus der

Sandkultur entnommen und unter Leitungswasser gründlich von anhaftendem Sand

gereinigt und schließlich mit sterilem Leitungswasser gespült. Die so behandelten

Sämlinge wurden in Pflanzenschalen (32 x 24 x 5 cm) übertragen und im Gewächshaus

kultiviert. Die Pflanzenschalen wurden vorher mit einem Vermiculit und Biokompost-

Gemisch gefüllt und mit Leitungswasser angefeuchtet. Zuvor wurde Vermiculit und

Biokompost im Verhältnis von 4:1 (v/v) gemischt und an der Luft 5 Tage getrocknet.

Nach ausreichender Kurzwurzelbildung (ca. 15 Tage) wurden die Flüssigkulturen

(pro Pflanzen ca. 2 ml) mit Hilfe einer Spritze vorsichtig in den Wurzelbereich der

Sämlinge direkt eingespritzt. Etwa 2-3 Wochen nach der Inokulation wurden die

Wurzeln auf eine ausreichende Mykorrhizierung mit Hilfe eines Binokulars hin

überprüft. Um eine sichere Mykorrhizierung zu gewährleisten, wurden die Pflanzen mit

dem gleichen Verfahren noch einmal inokuliert.

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Material und Methoden 18

Abb. 4: Schematische Darstellung eines sterilenRhizotronsystems zur Verbesserung derMykorrhizierungsrate. Die Pflanzen wurdensteril angezogen.

2.2.2.3. Optimierung der “Nylon-Mesh“ Methode zur Inokulation

Um eine höhere Mykorrhizierungsrate zu erreichen, wurden die semisteril angezogenen

Pflanzen (P. thunbergii) ebenfalls nach der “nylon-mesh Methode“ von WONG und FORTIN

(1989) inokuliert. Als Mykobionten wurden P. tinctorius und R. roseolus ausgewählt. Die Ino-

kulate wurden aus den gut ausgebildeten Pilzkulturen mit einem Korkbohrer entnommen und

auf MMN-Agar-Platten überimpft (3 bis 4 Inokulate je Agar-Platte). Die Kultivierung der

Pilzkulturen erfolgte wie unter Punkt 2.1.5. beschrieben. Bei der Übertragung der Wurzeln auf

Agar-Platten könnte bei direktem Kontakt

zwischen Wurzel und Agar-Nährboden eine

Kontamination durch Bakterien oder

Fremdpilze erfolgen. Deshalb sollten die

Agar-Platten vor der Aufbringung der

Pflanzen vollständig mit Pilzmyzel

bewachsen sein. Die Pflanzen wurden aus

den Pflanzschalen (Sand/Perlite) ent-

nommen und die Wurzeln entsprechend den

bereits unter Punkt 2.1.4. erwähnten Bedin-

gungen behandelt. Etwa 13 bis 16 Tage

nach der Kurzwurzelbildung wurden die

Pflanzen unter sterilen Bedingungen direkt

auf die mit Myzel überzogenen Agar-Plat-

ten übertragen und mit sterilem Cellophan

(Ø 8,0 cm) bedeckt, so dass die Wurzel in

direkten Kontakt zum Myzel treten kann (s.

Abb. 4). 10-12 Tage (je nach Pilzart) nach

der Inokulation wurden die Pflanzen von

den Agar-Platten entnommen und in die

unterschiedlichen Bodensubstrate wie

Waldboden, Sand, Bauschutt und Bau-

schutt/Sand-Gemischen eingebracht.

Agar-NährmediumSterile Watte

MyzelCellophan

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Material und Methoden 19

2.2.2.4. Biokompost als Zusatzstoff für die Bodensubstrate

Um optimale Bodensubstrate für das Pflanzenwachstum und eine Erhöhung der

Mykorrhizierungsrate der Pflanzen zu erreichen, wurde das Sand/Bauschutt-Misch-

substrat zusätzlich mit Biokompost (aus Grünabfällen nach DIN 18915, Hilfsstoffe zur

Bodenverbesserung) im Verhältnis 4:2:1 (v/v) gemischt. Hierzu wurden die Boden-

substrate nicht autoklaviert, sondern einfach luftgetrocknet und anschließend gesiebt (Ø

2,0 mm). Bei der Herstellung der Mischprobe wurde diese mit sterilem Leitungswasser

befeuchtet und gut vermischt. Als Mykobionten wurden verschiedene Mykorrhizapilze

Pis. tinctorius, S. bovinus und R. roseolus ausgewählt. Die R. roseolus-Kultur wurde

aus mykorrhizierten Wurzeln von Freiland-Kiefern (P. sylvestris) isoliert. Die Anzucht

der Pflanzen (P. thunbergii) erfolgte unter den in Punkt 2.1.4. beschriebenen

Bedingungen über 14 Monate im Biologischen Garten. Die Nährstoffzusammensetzung

des Biokompostes ist dem Anhang (s. Tab. 16) zu entnehmen.

2.2.3. In-vitro Untersuchungen zum Einfluß des pH-Wertes auf das Myzelwachstum

Die Pilzkulturen von Pis. tinctorius und R. roseolus wurden hinsichtlich des

Einflusses des pH-Wertes auf ein optimales Myzelwachstum untersucht. Es hatte sich

in einem Vorversuch gezeigt, dass die Freiland-Isolate von R. roseolus auf schwach

alkalischem Boden (pH 7,5-8,0) ein stärkeres Wachstum zeigten als auf saurem Boden.

Aus diesem Grund wurde das Wachstumsverhalten von Pis. tinctorius ebenfalls bei

unterschiedlichen pH-Werten untersucht. Diese Versuche wurden in 100 ml Erlen-

meyerkolben mit 50 ml MMN-Flüssigmedium ohne Zusatz von Agar durchgeführt. Bei

allen Versuchsansätzen wurden die pH-Werte des Flüssigmediums mit Salzsäure bzw.

Natronlauge eingestellt. Nach Abkühlen des Flüssigmediums wurde dieses unter

sterilen Bedingungen mit Agar-Myzel beimpft und in Dunkelheit kultiviert. Vorher

wurde das Trockengewicht des Pilzmyzels bestimmt. Für jeden pH-Wert wurden

jeweils vier Ansätze mit Pis. tinctorius und R. roseolus angelegt. Nach einer Inku-

bationszeit von ca. 21 Tagen erfolgte die Ernte des Myzels und die anschließende

Messung des pH-Wertes des Flüssigmediums. Zur Bestimmung des Trockengewichtes

wurden die Pilzkulturen filtriert und das zurückbleibende Myzel nach 5-stündiger

Trocknung bei 75 °C mit einer Feinwaage gewogen.

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Material und Methode 20

2.2.4. Bestimmung der Mykorrhizierungsrate

Die in dieser Untersuchung ermittelte Mykorrhizierungsrate erfolgte durch eine

Abschätzung (in Prozent) des Anteils mykorrhizierter Kurzwurzeln im Verhältnis zur

Gesamtkurzwurzelmenge. Hierfür wurden mykorrhizierte und unmykorrhizierte

Kurzwurzeln von etwa einem Viertel der Rhizotronfläche ausgezählt. Der verbleibende

Rest des Wurzelsystems wurde abgeschätzt (s. Abb. 5a-c). Aufgrund der verschiedenen

Bodensubstrate und unterschiedlicher Entwicklungsstufen der Mykorrhizierung bei den

verwendeten Mykobionten ist die makroskopische Abschätzung allerdings nur

begrenzt zuverlässig.

2.2.5. Identifizierung

Das Identifikationssys

Diskriminierung der ver

Hilfe der PCR-Analytik

transkribierten Spacer 1“

haben ihre Bindungsstell

und ermöglichen die Amp

Abb. 5a-c : Mykorrhiziebovinus und c. R. roseolus

a

der isolierten Mykorrhizen a

tem basiert auf den Sequen

schiedenen Mykorrhizen au

durchgeführt. Hierzu wur

(ITS1) verwendet. Die ein

e in den konservierten Bere

lifikation des variablen Spac

rung des Wurzelsystems von P (24 x).

b

us dem Freiland

zen der ribosomalen DNA.

f Gattungs/Art-Ebene wurde

den aus der rDNA die “int

gesetzten Primer ITS1 und IT

ichen der 18S- und 5,8S rD

ers ITS1.

. thunbergii, a. P. tinctorius, b

c

Die

mit

ern

S7

NA

. S.

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Material und Methode 21

Die Abbildung 6 zeigt die Anordnung der ribosomalen Sequenzen und die Position

der PCR-Primer. Die Reinkulturen wurden mit einem sterilen Spatel von einer MMN-

Agarplatte in Lysis-Puffer (SDS-Puffer; Bio101) aufgenommen und die DNA gemäß

dem modifizierten Protokoll von Bio 101 isoliert. Anschließend wurden 10-50 ng der

extrahierten DNA in eine PCR-Reaktion (Stratagene Robocycler) eingesetzt und die

Reaktionsprodukte gelelektrophoretisch aufgetrennt. Alle PCR-Lösungen wurden von

der Firma Pharmacia bezogen. Die Amplikons (PCR-Fragmente) wurden nach

Beendigung der PCR-Reaktion aus dem Gel eluiert (Gibco) und zur weiteren Charak-

terisierung sequenziert. Anschließend wurden die ermittelten Sequenzdaten via

Internet mit dem Basic Local Alignment Search Tool (Search-Blast) gegen bereits in

der Gen-Bank publizierte Sequenzen abgeglichen (Alignement). Die gewonnenen

Daten wurden zur Identifizierung der isolierten Mykorrhizen herangezogen. Die

gesamte PCR-Analytik wurde von Herrn Dr. Harms (Labor für Bioanalytik) der

Arbeitsgruppe Prof. Hildebrandt, Universität Bremen, Zentrum für Umweltforschung

und Umwelttechnologie (UFT) durchgeführt.

Abb. 6: Schematische Darstellung der ribosomalen Transkriptionseinheit und der ITS-Region. DieSchemazeichnung zeigt die codierenden Regionen für die 18S-, 5,8S- und 28-rRNA sowie drei Artenvon Spacern: äußere transkribierte (ETS), interne transkribierte (ITS) und intergene (IGS) Spacer. Dieuntere Vergrößerung zeigt die Bindungsstellen der wichtigsten ITS-Primer. Zusammengestellt nachLewin & Singer (LEWIN & SINGER, 1992) und Egger (EGGER, 1994).

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Material und Methoden 22

2.3. Morphologische und anatomische Untersuchungen

2.3.1. Dokumentation des Mykorrhizierungsverlaufes

Die verwendeten Rhizotronkulturen ermöglichten eine direkte Beobachtung des

Mykorrhizierungsverlaufes nach der Inokulierung. Zur Erfassung des Mykorrhi-

zierungsverlaufes wurden die Kurzwurzeln auf dem Petrischalendeckel markiert und

das Datum notiert. Die Entwicklung der verschiedenen Mykorrhizierungsstadien

wurden mittels eines Binokulares beobachtet und fotografisch dokumentiert.

2.3.2. Fixierung und Einbettung (LM)

Für die lichtmikroskopischen Untersuchungen wurden mykorrhizierte und unmy-

korrhizierte Kurzwurzeln unter dem Binokular mit Hilfe einer “single edge“-Klinge

abpräpariert und anschließend in mit Aqua bidest gefüllten Schalen bis zur Fixierung

zwischengelagert. Die Fixierung erfolgte in 3 %iger Glutaraldehydlösung in 0,05 M Na-

Cacodylatpuffer (pH 7.0) unter Zusatz von 1 % Coffein zur Fixierung der wasser-

löslichen Polyphenole (MUELLER & GREENWOOD, 1978) über 12 h bei Raum-temperatur

(Rotator). Teilweise war das Anlegen eines schwachen Vakuums zur Entfernung kleiner

Lufteinschlüsse im Hyphenmantel notwendig. Möglichst kleine Objekte (Länge ca. 2-3

mm) ermöglichen ein gutes Eindringen der Fixanzien und des Kunststoffes, welches

durch die Tanninschicht unterhalb des Pilzmantels und durch die Endodermis behindert

werden kann. Die Fixierung soll den jeweiligen Strukturzustand der Zellen erhalten und

stabilisieren. Nach der Fixierung erfolgte ein 5-maliges Waschen der Wurzelsegmente

in Cacodylatpuffer (pH 7.0). Danach wurden die Pro-ben in einer aufsteigenden

Ethanolreihe entwässert (15%, 30%, 50% - jeweils 10 min., 70%, 90% - jeweils 20

min., 3 x 100% - jeweils 15 min.). Nach der Entwässerung wurden die Proben in einem

Kunststoff (Spurr)-Ethanolgemisch im Verhältnis 1:4, 1:1 und 4:1 für jeweils 12 h

inkubiert. Danach wurden die Proben mit 100 % Kunststoff (SPURR, 1969) infiltriert

(mehrmaliges Wechseln des Kunststoffes). Die Proben wurden für die Längs- bzw.

Querschnitte in Gelatinekapseln bzw. Flacheinbettformen ausgerichtet. Die

Polymerisation erfolgte bei 70°C im Wärmeschrank über 15 Stunden.

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Material und Methoden 23

2.3.3. Gefriertrocknung und Einbettung

Die mykorrhizierten Kurzwurzeln wurden aus dem Wurzelsystem mit Hilfe einer

Stereolupe herauspräpariert. Durch Eintauchen in schmelzendem Stickstoff wurden die

Proben bei einer Temperatur von ca. - 205 °C schockgefroren. Durch die Unter-kühlung

des Stickstoffes wird das sogenannte Leidenfrost‘sche-Phänomen vermindert (ROBARDS

& SLEYTR, 1985). Die gefrorenen Proben wurden auf den gekühlten Probenteller und in

die Probenkammer der Gefriertrocknungsanlage (Leica, EM CFD) überführt. Mit einer

Pumpe wurde in der Proben-Kammer ein Vorvakuum von 16 mbar erzeugt und nach

Öffnung des Ventils zur Zeolithkammer ein Vakuum um 4 x 10-4 mbar erreicht. Die

Trocknung der Proben erfolgte nach folgendem Schema:

Tab. 1 : Trocknungsverlauf der Gefriertrocknung.

Trocknungsverlauf Temperatur Dauer1 - 100 °C 169 h

Temperaturanstieg 1°C / h 10 h2 - 90 °C 48 h

Temperaturanstieg 1°C / h 10 h3 - 80 °C 48 h

Temperaturanstieg 2°C / h 10 h4 - 60 °C 24 h

Temperaturanstieg 3°C / h 29 h5 27 °C bis zur Probenentnahme

Nach erfolgreicher Gefriertrocknung wurden die Kurzwurzeln nach der von FRITZ

(1980) beschriebenen Methode druckeingebettet, um eine Feinstruktur des Gewebes zu

erhalten. Zur Probenvorbereitung für die Röntgenmikroanalyse (EDXS) wurden die

Kurzwurzeln unter der Lupe fein präpariert. Für die Evakuierung wurden die Proben in

Druckgefäße überführt und über 15 min. mit einer Rotationspumpe (Vakuubrand RD 4)

evakuiert. Die Druckinfiltration erfolgte mit reinem Epoxidharz (SPURR, 1969).

Anschließend wurden die Proben durch mehrfachen Druckaufbau und Druckentlastung

bis zum Absinken infiltriert. Nach ca. 2 Tagen wurden die Proben in mit Kunstharz

gefüllte Flacheinbettformen überführt (zur Orientierung) und bei 70°C für 12-14 Stun-

den polymerisiert.

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Material und Methoden 24

2.3.4. Mikrotomie und Bedampfung

Die eingebetteten Proben wurden zuerst zugetrimmt und anschließend wurden mit

einem Ultracut E Mikrotom (Fa. Reichert-Jung) mit Glasmessern (LKB, Gräfelfing)

990 nm starke Semidünnschnitte (Längs- und Querschnitte) hergestellt. Die Dünn-

schnitte wurden mit Aqua bidest auf Glasobjektträger überführt, getrocknet und mit

Toluidinblau (0,05 % Toluidinblau in 0,2 M Phosphatpuffer pH 7,5) angefärbt. Die

getrockneten Schnitte wurden mit Merckoglas (Merck, Darmstadt) eingedeckelt. Die

lichtmikroskopische Auswertung wurde an einem Zeiss Universalmikroskop (Zeiss,

Oberkochen) mit einer angeschlossenen Photoeinrichtung (MC 63) vorgenommen.

Mit Hilfe von teflonbeschichteten (hochreines Teflonspray der Fa. Reichelt) Glas-

messern wurden am Mikrotom 500 nm starke Trockenschnitte angefertigt. Für die

Röntgenmikroanalyse ist zur Vermeidung von Elementverlagerungen das Trocken-

schneiden notwendig. Die Schnitte wurden mit einer Pinzette auf befilmte (Pioloform)

Cu- bzw. Ni-Faltgrids (Maschenweite 100) der Fa. Plano übertragen. Anschließend

wurden die Schnitte mit Kohlefilm (ca. 20 nm Dicke) bedampft (CED 20 der Fa.

Balzers) zur Vermeidung einer übermäßigen Aufladung der Proben im TEM. Die

Schnitte wurden bis zur Analyse in Gridboxen im Exsikkator mit Trockenmittel

gelagert.

2.3.5. Rasterelektronenmikroskopie (REM)

Abpräparierte mykorrhizierte und unmykorrhizierte Wurzeln wurden wie unter Punkt

2.3.2 beschrieben in Glutaraldehyd fixiert, in Ethanol entwässert und anschließend über

eine “Kritisch-Punkt-Trocknung“ (CPD 010; Balzers Union, Liechtenstein) entwässert.

Die getrockneten Proben wurden unter Verwendung von Leit-Tabs (Plano, Marburg)

auf Aluminiumplättchen geklebt, 20 nm dick mit Gold besputtert (SCD 040 mit Quarz-

Schichtdickenmesseinrichtung; Balzers Union, Liechtenstein) und in einem Raster-

elektronenmikroskop (ISI 100B, Leitz, Wetzlar) ausgewertet.

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Material und Methoden 25

2.3.6. Röntgenmikroanalyse (EDXS)

Für diese Methode ist eine spezielle Präparation der Pflanzenwurzeln notwendig (s.

Punkt 2.3.3. und 2.3.4.). Die energiedispersive Röntgenmikroanalyse (energy-

dispersive-X-ray microanalysis, EDXS) erfolgte anhand von Querschnitten (Dicke 500

nm) mykorrhizierter Kurzwurzeln bei 6400-facher Vergrößerung. Beim hier

verwendeten Punktanalyse-Modus wird der Elektronenstrahl auf distinkte Punkte

fokussiert, was eine Unterscheidung einzelner subzellulärer Bereiche wie Zellwand,

Cytoplasma und Vakuole ermöglicht. Die Resultate der EDXS-Punktanalyse werden als

Peak/Background-Verhältnis (P/B-Verhältnis) für alle nachweisbaren Elemente an

einem bestimmten Punkt der Probe angegeben. Das P/B-Verhältnis eines Elementes ist

hierbei proportional zu seiner Konzentration im untersuchten Bereich, wobei die Fläche

des Peaks eines Elementes in Relation zur unspezifischen Hintergrundstrahlung (auch

Bremsstrahlung) gesetzt wird. Die röntgenmikroanalytische Untersuchung erfolgte an

einem Philips EM 420 mit einem EDAX DX4 System im STEM-Modus (Scanning

transmission electron microscopy). Die Messungen wurden unter standar-disierten

Bedingungen durchgeführt (s. Tab. 2).

Tab. 2 : Geräteparameter der röntgenmikroanalytischen Untersuchungen.

Parameter EinstellungBeschleunigungsspannung: 120 kVKondensorblende 70 µmSpot size (Geräteeinstellung) 3D eff (effective spot size) < 21 nmObjektivblende keineProbenkippung 20 °Analysendauer 120 live sec

2.3.7. Fotographische Dokumentation

Die Fotographische Dokumentation der Semidünnschnitte und REM-Proben erfolgte

auf dem S/W-Kleinbildfilm Ilford Pan F 50 ASA oder Ektachrome 160 ASA (Kunst-

lichtfilm). Die Schwarz/Weiß-Vergrößerungen konnten auf Ilford Multigrade III-Papier

im eigenen Fotolabor hergestellt werden. Die Entwicklung und Vergrößerung von

Farbnegativen erfolgte durch den Handel. Die Diapositive wurden teilweise mit einem

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Material und Methoden 26

Personal Computer mit der Software Fotolook eingescannt und mit dem Programm

Photoshop weiterbearbeitet.

2.4. Chemische Charakterisierung der Böden und Pflanzen

2.4.1. Bestimmung des pH-Wertes im Boden

Die Bodenproben wurden auf 2 mm gesiebt und anschließend an der Luft getrocknet.

Von jeder Probe wurde der pH mit H2O und mit CaCl2 bestimmt. Hierzu wurden 4 g

Feinboden in einer 25 ml-PE-Flasche eingewogen und mit jeweils 10 ml bidest. Wasser

bzw. 10 ml 0,01M CaCl2-Lösung versetzt und 60 min. maschinell geschüttelt

(SCHEFFER und SCHACHTSCHABEL, 1992). Nach der Eichung des pH-Meters (WTW

525) erfolgte die Messung des pH-Wertes in der Bodensuspension.

2.4.2. Bestimmung der elektrischen Leitfähigkeit des Bodens

Die elektrische Leitfähigkeit wird mit einem temperaturkompensierenden Leit-

fähigkeitsmeßgerät (WTW, LF 196, Fa. Jürgens) ermittelt. Nach der VDLUFA-Methode

A10.1.1 (modifiziert) wurde eine Einwaage von je 10 g luftgetrockneten Feinboden in

100 ml-PE-Flaschen mit 100 ml deionisiertem Wasser versetzt und 1 h geschüttelt (30

U/min). Der Extrakt wurde auf aschefreie Faltenfilter (Schleicher & Schuell, 602 H ½)

gegeben, wobei der erste Anteil des Filtrates auf den Filter zurück-gegossen wurde.

Nach zeitgleicher Messung von Leitfähigkeit und Temperatur wurden die Salzgehalte

berechnet.

2.4.3. Bestimmung des pflanzenverfügbaren Phosphat- und Kalium-Gehalts

nach dem CAL-Auszug (nach SCHÜLLER, 1969)

Die Bestimmung des pflanzenverfügbaren Phosphat- und Kaliumgehaltes der Böden

erfolgte nach der Calciumacetat-Lactat-Extraktionsmethode (CAL) von SCHÜLLER

(1969). Je 1 g luftgetrockneter Feinboden wurde in einem Polypropylengefäß einge-

wogen, mit 20 ml CAL-Extraktionslösung (besteht aus 0,1 N Ca-Acetat, 0,1 N Ca-

Lactat, und 0,3 N Essigsäure) versetzt und anschließend 90 min. geschüttelt. Die

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Material und Methoden 27

Suspension wurde über einen P-freien Faltenfilter (Schleicher & Schüll, 512 ½)

filtriert, wobei die erste Fraktion des Filtrates wieder zurückgegossen wurde. Jeweils

eine Blindprobe wurde in gleicher Weise angesetzt. Die Bestimmung von Phosphat

erfolgte nach der Reaktion mit Ammoniummolybdat mit einem Spektralphotometer bei

880 nm (CADAS 100 der Fr. Dr. Lange). Dazu wurde 10 ml des Filtrates in ein Poly-

propylengefäß gegeben und mit 2 ml Reaktionslösung gemischt. Nach ca. 10 min.

konnte am Photometer gemessen werden. Die Kaliumbestimmung erfolgte am Atomab-

sorptionsspektrometer (Flammen-AAS).

2.4.4. Bestimmung des Ct- und Nt-Gehaltes im Elementaranalysator

Die Bestimmung des Ct- und Nt-Gehaltes erfolgte bei allen Bodenproben mit dem

Gerät CNS-2000 der Fa. LECO Instrumente GMBH. Etwa 1-2 g luftgetrockneter Fein-

boden wurde in ein ausgeglühtes Schiffchen gefüllt und mit einer Analysenwaage

(Sartorius) auf 0,1 mg genau eingewogen. Vor jedem Messzyklus wurden die Schiff-

chen als Nullwert gemessen und mit einem Standard (EDTA) die Steigung der Kali-

briergerade bestimmt. Zur Bestimmung des Ct- und Nt-Gehaltes wurden die Proben im

geschlossenen System im O2-Strom bei 1200°C verbrannt. Das entstandene CO2 wurde

mittels Infrarotdetektor (IR) und das entstandene N2 mittels Wärme-

leitfähigkeitsdetektor (WLD) detektiert. Um die Gehalte an organischem Kohlenstoff

(Corg) zu errechnen, muß der gesondert ermittelte Carbonatkohlenstoffgehalt (Ccarb)

vom Ct-Gehalt abgezogen werden.

2.4.5. Bestimmung des Carbonatgehaltes

Das gasvolumetrische Bestimmungsprinzip der SCHEIBLER-Apparatur beruht darauf,

dass das Volumen des freigesetzten CO2 aus Calciumcarbonat ermittelt wird und daraus

der Gesamtcarbonatgehalt errechnet wird. 2–5 g luftgetrockneter Feinboden wurden in

einem Erlenmeyerkolben eingewogen und mit 2–4 ml Aqua dest. befeuchtet.

Anschließend wird das Glasgefäß der Apparatur mit ca. 10 ml HCl (10%) versetzt.

Unter Neigung des Kolbens wird die HCl auf den Boden gegossen und geschüttelt.

Nach 5 bis 10 min. Reaktionszeit war die CO2-Entwicklung abgeschlossen und das

Volumen des freigesetzten Gases konnte abgelesen werden.

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Material und Methoden 28

2.4.6. Bestimmung der pflanzenverfügbaren Kationen im Boden

Die Bestimmung der pflanzenverfügbaren Kationen (K, Ca, Na und Mg) im Boden

erfolgte nach der Extraktionsmethode im Gleichgewichtsverfahren (SCHLICHTING et al.,

1989). Als Extraktionslösung wurde eine Ammonium-Lactat-Essigsäure (9,01g

hydrolysierte Milchsäure+18,75ml Essigsäure+7,70g NH4-Acetat/l ) bei pH 3,8

hergestellt. Dazu wurde 5g luftgetrocknete Feinerde in einer Schüttelflasche mit 100 ml

Ammoniumlactatessigsäure-Lösung (AL) versetzt und 4 h maschinell geschüttelt. Die

Bodensuspension wurde durch einen Faltenfilter in eine Plastikflasche filtriert. Die

Bestimmung der Kationen erfolgte mit dem Flammen-AAS (Meßbedingungen s. Tab.

23 im Anhang).

Außerdem wurde die Bestimmung der austauschbaren Kationen mit Hilfe einer

ungepufferten 0,5 M NH4Cl-Lösung durchgeführt (MEIWES et al., 1984). Die im Boden

reversibel gebundenen Kationen werden durch ein Überangebot an NH4-Ionen ausge-

tauscht. Der Austausch erfolgt in einem Perkolationsverfahren. 10 g luftgetrockneter

und gesiebter Feinboden (Ø 2 mm) wurde in eine Spritze eingewogen, mit 25 ml 0,5 M

NH4Cl-Lösung versetzt und 10 bis 12 Stunden inkubiert. Als Filtrationsmaterial wurden

ca. 10 g Quarzsand und ein Rundfilter verwendet. Nach der Perkolation wurden weitere

75 ml Extraktionslösung (0,5 M NH4Cl) durch den Boden perkoliert. Das Perkolat

wurde in einem 100 ml Polypropylenkolben aufgefangen und mit NH4Cl-Lösung auf

100 ml aufgefüllt. Die Blindwerte wurden entsprechend der Bodenproben behandelt.

Die optimierten Meßbedingungen sind in Tabelle 23 im Anhang aufgeführt. Im Perkolat

wurden die Elemente K, Ca, Na und Mg mit dem Flammen-AAS bestimmt. Zur

Bestimmung der wasserlöslichen Kationen mit destilliertem Wasser wurde nach

demselben Verfahren wie beim NH4Cl-Auszug perkoliert.

2.4.7. Ermittlung des Gesamt-Kationengehaltes von Sproß und Wurzel

Zur Bestimmung der K-, Ca-, Na-, und Mg-Gesamtgehalte von Sproß und Wurzeln

wurden diese mit 65% HNO3 durch eine Mikrowelle aufgeschlossen (s. Punkt 2.4.10)

und für die Flammen-AAS-Messung entsprechend verdünnt. Die Bestimmung der

Gesamt-Kationen von Sproß und Wurzel erfolgte ebenfalls mittels Flammen-AAS

(Meßbedingungen s. Tab. 23 im Anhang).

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Material und Methoden 29

2.4.8. Bestimmung der Anionen im Boden

Die Bestimmung der Anionen Nitrat, Chlorid und Sulfat erfolgte mittels einer

Ionenchromatographie (2000 ISP der Fa. Dionex mit Leitfähigkeitsdetektion). Mit dem

Wasserauszug (methodisch wie der zuvor beschriebene NH4Cl-Auszug) konnten die

Anionen bestimmt werden. Ein Aliquot des Bodenextraktes jeder Probe wurde zur

Bestimmung am Ionenchromatographen abgefüllt. Durch eine Vorsäule wurden

zunächst die groben Partikel und organischen Stoffe aus der Probe entfernt. In der

Trennsäule wurden die verschiedenen Anionen nach Ladung und Größe aufgetrennt. Als

Eluent wurde 2 mmol Na2CO3-Lösung verwendet. Im Anschluß an die Auftrennung

erfolgte die quantitative Messung durch eine Leitfähigkeitsmeßzelle.

2.4.9. Mikrowellenaufschluß

Vorbereitung der Probe und Reinigung der Gefäße:

Nach dem Versuchsende wurden die Sämlinge den Rhizotronen entnommen und

anschließend die Bodensubstrate an der Luft getrocknet. Etwa 5 g der Bodenproben

wurden mit einem Mörser fein gemahlen und in PE-Flaschen überführt. Die

Bodenproben wurden bei 70°C 48 Stunden getrocknet und in einem Exsikkator

aufbewahrt. Die aus den Rhizotronen entnommenen Sämlinge wurden zunächst im

Wurzelbereich vom anhaftenden Sand gründlich befreit. Die gereinigten Sämlinge

wurden in Sproß- und Wurzel-Fraktion getrennt. Zur Einwaage wurden die Sämlinge

mit Papiertüchern vorsichtig trocken getupft.

Nachdem das Frischgewicht der Sämlinge bestimmt worden war (Waage: Sartorius

1207 MP2), wurden sie in Papiertüten bei 70°C 48 Stunden bis zur Gewichtskonstanz

getrocknet. Bei der Schwermetallanalytik ist es notwendig, verlustfrei und vor allem

kontaminationsfrei zu arbeiten. Aus diesem Grunde wurden alle Gefäße mit 0,2 %igem

Mucasol–Schnellreiniger (Fa. Merz+Co.) sorgfältig gereinigt, mit Leitungswasser bzw.

entionisiertem Wasser abgespült und anschließend in 3 M 65%ige HNO3 aufgenommen.

Danach wurden die Gefäße 2 bis 3 mal mit Aqua bidest nachgespült und im

Wärmeschrank getrocknet. Bei jedem Aufschluß wurde 1 Blindwert, der jeweils nur 5

ml 65%ige HNO3 (suprapur) enthielt, dem Aufschlußvorgang unterzogen und

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Material und Methoden 30

analysiert. Der Blindwert wurde immer in verschiedenen Teflongefäßen durchgeführt.

Durch diese Blindwerte konnten Memory-Effekte durch Kontaminationen bei den

Aufschlüssen bzw. durch die Waschprozeduren ausgeschlossen werden. In den

folgenden Abschnitten werden die Aufschluß- und AAS-Verfahren dargestellt.

2.4.10. Aufschlußverfahren

Die unter Punkt 2.4.9. vorbereiteten Pflanzenproben wurden in die Teflongefäße

eingewogen, mit 5 ml 65 %ige HNO3 (suprapur, der Fa. Merck) versetzt. Bei Boden-

proben wurden zusätzlich noch 1,5 ml 30%ige HCl (suprapur, der Fa. Merck)

zugegeben. Die Optimierung des Mikrowellen-Programmes (s. Tab. 3) erfolgte unter

Verwendung eines Obstbaumblatt-Standards (Orchard Leaves, Standard Reference

Material 1571). Durch den Nassaufschluß mit Salpetersäure wurden die schwer-

löslichen Stoffe durch Druck und Temperatur in säurelösliche Verbindungen überführt.

Die Säure der gelösten Proben wurden im Mikrowellen-Vakuum-Rotor MCR6 mit Hilfe

des Absorptionsmoduls FAM 40/Am3 (beides der Fa. MLS) abgedampft. Nach der

Abdampfung wurden die Proben in 5 ml 0,5 M 65 %ige HNO3 aufgenommen und in

Szintillationsgefäße (20 ml) aus Polyethylen überführt. Die Proben wurden bis zur

Messung im Gefrierschrank aufbewahrt.

Tab. 3 : Aufschluß- und Abdampfprogramme für die Pflanzen- und Bodenproben.

Aufschlußprogramm für Pflanzen Aufschlußprogramm für BodenStufe Zeitdauer [min] Leistung[W] Zeitdauer [min] Leistung[W]

1 3 250 5 2502 1 0 1 03 3 250 5 2504 3 400 4 4005 2 500 3 5006 1 600 3 6007 10 300 12 350

Ventilation 50 59Abdampfprogramm für Pflanzen Abdampfprogramm für Boden

Stufe Zeitdauer [min] Leistung[W] Zeitdauer [min] Leistung[W]1 27 250 30 250

Ventilation 10 10

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Material und Methoden 31

2.4.11. Bestimmung der Schwermetalle

Das Prinzip der Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) basiert auf der Messung einer

Absorption von optischer Strahlung durch Atome im Gaszustand (WELZ, 1983). Durch

stufenweise Anhebung der Temperatur werden die Prozesse Trocknung, thermische

Zersetzung der Matrix und thermische Dissoziation in freie Atome voneinander

getrennt. Während der Trocknung und der thermischen Zersetzung strömt inertes Gas

(Argon) durch das Graphitrohr, um Matrixbestandteile vor der Atomisierung abzu-

trennen (PERKIN-ELMER). Aus einer Stammlösung (Titrisol; Fa. Merck) wurden durch

Verdünnen geeignete Bezugslösungen in 0,5 M 65 %ige HNO3 hergestellt, die als

Eichreihe dienten. Zum Einstellen des Nullpunktes am Spektrometer wurde eine 0,5 M

65 %ige HNO3, in die auch die aufgeschlossenen Proben aufgenommen wurden,

verwendet.

2.4.11.1. Reproduzierbarkeit

Zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit des Mikrowellenverfahrens wurde mit Hilfe

des zertifizierten Referenz-Materials, dem Obstbaumblatt-Standard, (Orchard Leaves,

Standard Reference Material 1571) für alle Schwermetalle getestet. Die Wieder-

findungsrate der aufgeschlossenen Proben wird in Tabelle 4 zusammengestellt.

Tab. 4 : Wiederfindungsrate der Analyse (TG=Trockengewicht).

ElementZertifizierter Gehalt

in µg/g TGBerücksichtigte

ProbenFestgestellter Gehalt

in µg/g TGWiederfindungsrate

In %

Cu 12 ± 1 12 10,69 89,1Pb 45 ± 3 12 42,29 94,0Mn 91 ± 4 12 97,61 107,3Zn 25 ± 3 12 21,80 87,2Cd 0,11 ± 0,05 12 0,10 87,9

2.4.11.2. Pflanzenverfügbare Schwermetalle im Boden

Für eine Charakterisierung der ökologischen Wirksamkeit von Schwermetallen in

Böden ist eine Erfassung der pflanzenverfügbaren Fraktionen erforderlich (HORNBURG

& BRÜMMER, 1993). Die Pflanzen-Verfügbarkeit von Schwermetallen, insbesondere

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Material und Methoden 32

von Cd, Cu, Pb, Mn und Zn, läßt sich mit einer CaCl2-Extraktionslösung gut darstellen

(KUNTZE et al., 1988; KÖSTER & MERKEL, 1983). Zur Bestimmung der Schwermetalle

wurde 10 g luftgetrockneter Boden in säuregespülte 100 ml PE-Flaschen eingewogen

und mit 50 ml einer 0,1 M CaCl2-Lösung versetzt. Auf dem Schüttler wurde die

Suspension 2 Stunden durchmischt und über Faltenfilter (Schleicher & Schuell, 602 H

½) abfiltriert (der Vorlauf wurde verworfen). Dem Filtrat wurde 0,2 ml konz. HNO3

(65%) zugegeben und die Lösung kühl aufbewahrt. Die Bestimmung der Schwermetalle

erfolgte mittels Graphitrohr-AAS (PE Zeeman 3030, HGA 600, AS 60).

2.4.11.3. Schwermetall-Gesamtgehalte in Pflanzen und Böden

Neben der durch CaCl2-Lösung extrahierbaren Schwermetalle wurden die Schwer-

metallgesamtgehalte in den Pflanzen (Sproß und Wurzel) und den Böden untersucht.

Für die aufgeschlossenen Bodenproben wurde das gleiche Atomabsorptions-

spektroskopie-Programm verwendet wie für die Pflanzenproben. Ein Blindwert wurde

analog vorbereitet, der parallel zu jeder Analyse gemessen wurde. Die optimierten

Meßbedingungen von Cd, Pb, Mn, Cu und Zn für Sproß- und Wurzelproben sowie

Bodenproben sind in Tab. 23 und 24 im Anhang aufgeführt. Die Bestimmung der

Schwermetalle erfolgte mittels AAS.

2.4.12. Datenverarbeitung

Die Datenverarbeitung und Darstellung von Graphiken wurde mit dem Excel 5,0

Programm (Microsoft) angefertigt. Eine statistische Verarbeitung der gewonnenen

Daten von Sproß- und Wurzeltrockengewicht bei allen Untersuchungen erfolgte mit

dem Statistikprogramm UNISTAT (Version 5,0; 2000). Verteilungsunabhängige Tests

wurden zur Signifikanzbestimmung und Korrelationsanalyse herangezogen, da bei

biologischem Material nicht von einer Normalverteilung ausgegangen werden kann.

Zwei unabhängige Stichproben wurden mit dem “U-Test“ auf signifikante Unterschiede

überprüft. Als Signifikanzgrenze wurde die Irrtumswahrscheinlichkeit von p � 0,05 (�-

Wert) gewählt. Bei den meisten Grafiken wurde der Meßwertbereich (Range) mit

Median, Minimal- und Maximalwert dargestellt.

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Ergebnisse 33

3. Ergebnisse

3.1. Pflanzen und Pilze

3.1.1. Methodenentwicklung

3.1.1.1. Isolierung von Mykorrhizapilzen aus Fruchtkörpern und mykorrhiziertenWurzeln aus dem Freiland

Um Reinkulturen entsprechender Pilzarten für die Inokulierung zu gewinnen, wurden

Fruchtkörper und mykorrhizierte Wurzeln aus dem Freiland isoliert (s. Punkt 2.2.1.1.).

Nach mehreren Vorversuchen war es gelungen, entsprechende Methoden für die Gewin-

nung von Reinkulturen zu entwickeln. Während die Isolation von Pilzkulturen aus

Fruchtkörpern unproblematisch war (s. Abb. 7a), bedurfte die Isolation aus mykorrhi-

zierten Wurzeln eines sehr hohen methodischen Aufwandes. Problematisch war, dass die

Mykorrhizapilze in der Regel durch die hohen Konzentrationen des Sterilisationsmittels

(H2O2, 30%) abgetötet wurden. Bei einer zu niedrigen H2O2 Konzentration traten Probleme

mit Bakterien und Schimmelpilz-Verunreinigungen (z.B. Aspergillus und Penicillium) auf.

Aus diesem Grund wurden unterschiedliche Konzentrationen und unterschiedliche

Sterilisationszeiten für die Oberflächensterilisation der Mykorrhizapilze getestet, um ein

optimales Verhältnis zwischen beiden Faktoren zu erreichen. Das Ergebnis zeigt, dass die

optimale Konzentration von H2O2 zwischen 10% und 20% betrug und die Sterilisationszeit

zwischen 5-10 sec. lag. Da die Ausbeute an Reinkulturen (ca. 5-10%) sehr gering war,

wurden ca. 50-80 mykorrhizierte Wurzelabschnitte für eine erfolgreiche Isolierung

benötigt. Nach wenigen Tagen (ca. 3-5 Tage) konnte an der Wurzelspitze das erste

neugebildete Myzel beobachtet werden (s. Abb. 7b). Nach dem Auswachsen der Hyphen

(ca. 4 Wochen) konnten durch das Überimpfen auf neue MMN-Agarplatten Reinkulturen

angelegt werden. Durch die optimierte Isolierungsmethode der Oberflächensterilisation

konnten folgende Pilze aus Fruchtkörpern und mykorrhizierten Wurzeln isoliert werden.

Die Artbestimmung der Mykorrhizapilze erfolgte mit PCR und DNA-Sequenzierung, was

eine gesicherte Artzugehörigkeit ergab.

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Ergebnisse 34

a. Aus Fruchtkörpern: - Paxillus involutus (Batsch: Fr.) Fr.- Suillus luteus (L.: Fr.) Gray

b. Aus mykorrhizierten Wurzeln: - Rhizopogon roseolus (Fr.:Fr.) Th. Fr. (Syn.: Rhizopogon rubescens)

3.1.1.2. Identifizierung der isolierten Freilandmykorrhizen

Die Identifizierung der Mykorrhizapilze aus Wurzeln aus dem Freiland mit Hilfe

morphologischer Merkmale, wie z.B. Farbe, Form, Oberflächenstruktur und Struktur des

Hartigschen Netzes, ergab keine eindeutige Zuordnung der Gattung, bzw. Art. Ferner

konnten auch die Fruchtkörper nach der Bestimmungsliteratur zum Teil nicht eindeutig

bestimmt werden. Aus diesem Grund wurde eine Identifizierungsmethode mit Hilfe der

ITS-PCR (Primer ITS1 und ITS7) mit anschließender DNA-Sequenzbestimmung gewählt.

Die Abbildung 8 zeigt eine gelelektrophoretische Auftrennung von ITS-PCR-Fragmenten

von drei isolierten Freilandmykorrhizen. DNA aus Freilandmykorrhizapilzen wurde mittels

einer spezifischen ITS-PCR amplifiziert und anschließend mit bereits in der Genbank

(NCBI) publizierten Mykorrhiza-Sequenzen via Internet verglichen.

Abb. 7a-b: Makroskopische Aufnahme zur Gewinnung von Reinkulturen; a. aus Fruchtkörpern,15-20 Tage nach der Isolierung, ausgewachsenes Myzel (roter Pfeil), b. aus mykorrhiziertenFreilandwurzeln (roter Pfeil), 3-5 Tage nach der Isolation (96 x).

a

Ausgewachsenes Myzel

Aus FruchtkörperAus mykorrhizierter Wurzel

Ausgewachsenes Myzel

bAus mykorrhizierter Wurzel

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Ergebnisse 35

Dabei zeigte sich, dass die ITS-Region

(s. Abb. 6) der Organismen eine hohe

Variabilität aufweist, die zur Identifizierung

der Arten bzw. Gattungen herangezogen

werden konnte. Die Ergebnisse der

Sequenzanalyse sind in der Abbildung 9

dargestellt. In Tabelle 5 wurden die

wichtigsten Merkmale der identifizierten

Mykorrhizapilze aus dem Freiland zusam-

mengestellt.

Tab. 5 : Zusammenstellung der Merkmale isolierter Mykorrhizen aus dem Freiland.

Pax. involutus (Batsch exFr.) (Kahler Krempling)

R. roseolus (Fr.:Fr.) Th.Fr.(Rötlicher Wurzeltrüffel)Synonym: R. rubescens

S. luteus (L.: Fr.) Gray(Butter-Röhrling)

Gattung Paxillus Rhizopogon SuillusFamilie Paxillaceae Rhizopogonaceae, BoletaceaeKlasse Basidiomycetes Basidiomycetes BasidiomycetesIsolat aus Fruchtkörpern aus mykorrhizierten Wurzeln aus FruchtkörpernStandort Uelzen Uelzen BremenSymbiosepartner Kiefern und Fichten Kiefern und Fichten KiefernVorkommen im Nadel- und Laubwald,

Parkanlagenim Nadelwald unter Kiefernoder Fichten, auf Kalkböden

im Nadelwald unter Kiefernauf Sand- und Kalkböden

Abb. 8: Gelelektrophoretische Auftrennung vonITS-PCR-Fragmenten von drei isoliertenFreilandmykorrhizapilzen. HE-Marker (HindIIIund EcoRI), Paxillus involutus; Rhizopogonroseolus; Suillus luteus; K=Kontrolle.

HE-

Mar

ker

Pax.

invo

lutu

s

R. r

oseo

lus

S. lu

teus

Kon

trolle

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Ergebnisse 36

5.8S rDNAPax. involutus AGGATCATTATCGAAAAGCAATCCGGGGGG--GAGGC-GACC----GAGCR. roseolus AGGATCATTAACGAATATAATTCGGAGGGGTTGTAGCTGGCCGAGGAAACS. luteus ATX-TATCCGGCGAGGGGAAAGGCGGAGAGTTGTAGCTGGCCTCCA---- * * *** * * * * * ** * **

ITS1Pax. involutus GAAGTTTG-GTAGATCGTAGGGATTGTCG---CTGGCCTTTGGA---AACR. roseolus GAGGCATGTGCACGCTCTTCTGTTTTTCATAACTCACCTGTGCACCTAATS. luteus GGGGCATGTGCACGCTCTC-----TTCCGG-----ACCT-TTCGCC--GT * * ** * * * * * *** *

Pax. involutus GAAGGCATGTGCACGTTCCGAGT----TCTCCTTAGTCCTCCTTTGCCTTR. roseolus GTAGG-ATGCTCCTCTTTCGGGAGGGGGGACCTATGTCTTTGTATAACTCS. luteus AT-GG-GCGC-------------GGGGCGACCCGCGTCTTCATATACCTC ** * ** *** * * * **

Pax. involutus TCCTT-TGGAAAACCCT----TTCTTCACACCCGTGCACCCA----TTGTR. roseolus TTCGTGTAGAAAGTCTTAGAATGTTT-ACTATCAGAGAGTCGCGACTTCTS. luteus TTCGTGTAGAAAGXCTTTGAATGTTTTACCATCATCGAGTCGCGACTTCT * * * * **** * * * ** ** * * * ** *

Pax. involutus AGG---------TCTCCGCGAGGGGATCTAT----GTCTTCAC--ATAAAR. roseolus AGGAGACGCGAATCTTTGAGATAAAAGTTATTACAACTTTCAGCAATGGAS. luteus AGGAGACGCGATTCTTTGAGAAAAAAGTTATTACAACTTTCAGCAACGGA *** *** * ** * *** **** * *

Pax. involutus C------ACTA-CGTAT-GTCTAGGAATGTATCTAAAAGCGTCGGACGGCR. roseolus TCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAAGCGATATGTAATS. luteus TCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATCGCGATATGTAAT ** ** ** * * *** * * * ** ***

Pax. involutus TTGGCTT-CGTGCC--CGGTCGGCGACGGTAAA---GAAC-CATAATACAR. roseolus GTGAATTGCAGATCTACAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGS. luteus GXGAATTGCAGATCTACAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCG * ** * * * ** * * * **** ** * *

Pax. involutus ACTTTCAG-----CAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAG----AR. roseolus CTCCTCGGTGTTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCAGTAAATTCTCAS. luteus CTCCTCGGTGTTCCGAGGAGCATGCCTGT--------------------- ** * * * * * *

Pax. involutus ACGCAGC--GAATTG---CGATAAGTAATGTGAATTGCAGA--TTTTCAGR. roseolus ACCCCTCTTGATTTGTTTCGAGGGGGAGCTTGGATTGTGGGGGCTGCCGGS. luteus --------------------------------------------------

Pax. involutus TGA---------ATCATCGAATC--------TTTGAACGCACC---TTGCR. roseolus AGACTAGGACTCGTCCTTGACTCGGGCTCTCCTTAAATGCATCGGCTTGCS. luteus --------------------------------------------------

Pax. involutus GCTC--CTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTTA--ATR. roseolus GGTCGACTTTCGACTTTGCGCGACAAGGCTTTCGGCGTGATAATGATCGCS. luteus --------------------------------------------------

18S rDNAPax. involutus TCTCAACC--ATCCCTCGATTC---GTTTCGAGGGTTTGGCTTG--GATTR. roseolus CGTTCGCTGAAGCGCATGAATGAAGGTTCCGTGCCTCTAATTCGTCGACTS. luteus --------------------------------------------------

Pax. involutus TTGGGGG-CTGCCGGGCGACCCTAGGGTCTTC---GGCTCTC--CTTAAAR. roseolus TAGTATCTCTTCCGAGAGAAAACGTCTTCTTCATTGACTTTTGACCTCAAS. luteus --------------------------------------------------

Pax. involutus AGCAT-TAGCGATGGCGGCGCGATCTAACCCCC------R. roseolus ATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAS. luteus --------------------------------------A

Abb. 9 : DNA-Sequenz von Pax. involutus (572 bp, DNA-Sequenz 100%), R. roseolus (687 bp,DNA-Sequenz 99%) und S. luteus (347 bp, DNA-Sequenz 98%). ITS-Regionen zwischen der 5,8S-und 18S-rDNA der isolierten Freilandmykorrhizen. Sternchen (*) markieren die Überein-stimmungen in allen Sequenzen; bp=Basenpaare.

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Ergebnisse 37

3.1.1.3. Inokulationsversuch mit Flüssigkulturen

Es sollte eine Methode ausgearbeitet und erprobt werden, mit der eine Vielzahl von

Pflanzen inokuliert werden können. Das Ergebnis der Inokulierung mit Flüssigkulturen der

beiden Pflanzen P. thunbergii und P. densiflora zeigte eine unterschiedliche Wach-

stumsdynamik. Bereits 2-3 Wochen nach der Inokulation konnte bei den beiden Pflanzen-

gruppen eine erste Ausbildung von Mykorrhizen beobachtet werden. Nach einer Kulti-

vierungszeit von 17 Monaten (Anzuchtphase ca. 4 Monate), zeigten die beiden Pflanzen-

gruppen ein unterschiedliches Sproß- und Wurzelwachstum. In der Abbildung 10a und 10b

ist zu erkennen, dass die mykorrhizierten und unmykorrhizierten Pflanzen von P.

thunbergii ein deutlich erhöhtes Sproß- und Wurzeltrockengewicht aufwiesen als P.

densiflora.

i P

0

1

2

3

4

5

unmyko.Kontrolle

Pis. tinctorius R. roseolus0,0

0,5

1,0

1,5

2,0Sproß-TGWurzel-TGS/W-Verhältnis

S/W

-Ver

hältn

is

Sproß- und Wurzel-Trockengewicht und S/W-Verhältnis von P. thunbergii

Spro

ß- u

nd W

urze

l-Tro

cken

gew

icht

in g

Abb 11 S/W T k i h d S/W V häl

0

1

2

3

4

5

unmyko.Kontrolle

Pis. tinctorius R. roseolus0,0

0,5

1,0

1,5

2,0Sproß-TGWurzel-TGS/W-Verhältnis

Sproß- und Wurzel-Trockengewicht und S/W-Verhältnis von P. densiflora

S/W

-Ver

hältn

is

Spro

ß- u

nd W

urze

l-Tro

cken

gew

icht

in g

Abb. 10a-b: Vergleich der Sproß- und Wurzeltrockengewichte und des S/W-Verhältnisses von P.thunbergii (Abb. 10a) und P. densiflora (Abb. 10b) nach 17 Monaten Kultivierung; inokuliert wurdemit Flüssigkulturen von Pis. tinctorius und R. roseolus. Bodensubstrat aus Vermiculite undBiokompost (4:1, v/v). Die vertikalen Balken geben den Minimal- und Maximalwert(Meßwertbereich) an (Mittelwert aus n=16); (S/W=Sproß/Wurzel).

(a) (b)

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Ergebnisse 38

Aus der Abbildung 10a wird ersichtlich, dass die mykorrhizierten P. thunbergii Pflan-

zen ein höheres Sproß- und Wurzeltrockengewicht aufwiesen als die unmykorrhizierten

Kontrollpflanzen. Es zeigt sich auch, dass es zwischen beiden mykorrhizierten Pflanzen

einen Unterschied hinsichtlich des Sproßwachstums gab. Aus Abbildung 10a geht hervor,

dass das Sproß-Trockengewicht der mit R. roseolus inokulierten P. thunbergii fast zweimal

höher (0,3819 g) als bei den mit Pis. tinctorius inokulierten Pflanzen und dreimal höher

(0,1978 g) als bei den unmykorrhizierten Kontrollpflanzen (0,1117 g) war. Auffallend ist

hierbei, dass das Wurzeltrockengewicht der verschiedenen inokulierten Pflanzen gleich

hoch war. Das S/W-Verhältnis bei R. roseolus-Mykorrhizen war höher als 1 (1,40) und im

Vergleich zu Pis. tinctorius-Mykorrhizen (0,74) sowie den unmykorrhizierten

Kontrollpflanzen (0,70) deutlich höher. Die Mykorrhizierungsrate (hier nicht graphisch

dargestellt) der Mykobionten von R. roseolus betrug ca. 90 % und lag Pis. tinctorius

zwischen 5% und 50%.

Das Wurzelsystem von P. thunbergii war stark ineinander verflochten. Deshalb soll an

dieser Stelle auf das Verfahren der Wurzeltrockengewichtsbestimmung kurz hingewiesen

werden. Die ineinander verflochtenen Wurzeln in der Pflanzenschale konnten von den

einzelnen Pflanzen nicht getrennt werden. Daher wurde der Mittelwert des gesamten

Wurzeltrockengewichtes bestimmt (n=16) und in der Graphik wurden keine Minimal- und

Maximalwerte wiedergegeben.

Aus der Abbildung 10b ist zu erkennen, dass das Sproß- und Wurzeltrockengewicht von

P. densiflora im Vergleich zu P. thunbergii wesentlich niedriger war. Das Sproß- und

Wurzeltrockengewicht der inokulierten Pflanzen P. densiflora sowie P. thunbergii war

signifikant höher als das der unmykorrhizierten Kontrollpflanzen (p=0,001). Die Abbil-

dung 10b zeigt, dass das Sproß-Trockengewicht der beiden Mykobionten Pis. tinctorius

und R. roseolus fast identisch war. Auffallend ist dabei, dass das Wurzeltrockengewicht

der mit Pis. tinctorius inokulierten Pflanzen höher ausfiel als dass der mit R. roseolus

inokulierten Pflanzen. Das S/W-Verhältnis war sowohl bei den inokulierten Pflanzen als

auch bei den nicht inokulierten Kontrollpflanzen nahezu identisch.

Die Mykorrhizierungsrate (nicht graphisch dargestellt) der inokulierten Mykobionten

von Pis. tinctorius lag zwischen 5% und 20% und bei R. roseolus bei ca. 80 %. Das

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Ergebnisse 39

Wurzelsystem der Pflanzen P. densiflora war nicht wie bei P. thunbergii ineinander

verflochten und deshalb konnten für die einzelnen Pflanzen das Sproß- und Wurzel-

trockengewicht problemlos bestimmt werden (Abb. 11a-b). Durch die graphische

Darstellung vom Sproß- und Wurzeltrockengewicht und S/W-Verhältnis werden deutliche

Unterschiede sichtbar. Insbesondere zwischen P. thunbergii und P. densiflora mit unter-

schiedlichen Mykorrhizapilzen (Pis. tinctorius und R. roseolus) war ein deutlicher Unter-

schied hinsichtlich des Sproßwachstums erkennbar.

b-1b

a-1aPis. tinctorius

Abb. 11a-b: Makroskopische Aufnahme mykorrhizierter Wurzeln von P. densiflora inokuliert mitFlüssigkulturen von Pis. tinctorius (a. 96 x) und R. roseolus (b. 96 x).a-1. Vergrößerung (150 x) von a., dichotome Verzweigung der hellbraunen Mykorrhiza,Myzelstränge (roter Pfeil) wachsen auf die Wurzeln zu; b-1. Vergrößerung (150 x) von b.,dichotome Verzweigung der hellgelben Mykorrhiza, die Manteloberfläche ist mit dünnen undlangen Hyphen bedeckt.

R. roseolus

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Ergebnisse 40

3.1.1.4. Optimierung der Inokulationsmethode

Mit der “Petrischalen-Methode“ von WONG und FORTIN (1989) konnte keine aus-

reichende Mykorrhizierung bei den verwendeten Kiefernsämlingen erreicht werden.

Nach der Inokulierung von 2-3 Wochen bildeten die Pilze in den verwendeten

Rhizotronen kein ausreichendes Hyphenmyzel aus und es zeigte sich ferner kein

kontinuierliches Wachstum von Pilzhyphen. Nach der Inokulation mit Agarstückchen

auf Aktivkohlepapier wuchs das Pilzmyzel weitestgehend kreisförmig um die neu

gebildeten Kurzwurzeln, wobei das Pilzmyzel auch radial über das Aktivkohlepapier

verlief.

In der Abbildung 12 sind neu gebildete

und mykorrhizierte Kurzwurzeln deutlich zu

erkennen. Bereits nach 6-12 Tagen konnte

eine fast vollständige Mykorrhizierung (> 90

%) der Kurzwurzeln beobachtet werden.

Durch das Auflegen des Cellophans konnten

die Wurzeln mit dem Myzel in engen

Kontakt treten und eine vorzeitige

Austrocknung des Agarnährmediums wurde

verhindert. Die Wurzeln selbst konnten nicht

ins Agarnährmedium hinein wachsen, da

durch die Vernetzung des Myzels das

Eindringen der Wurzeln verhindert wurde.

Der zweite Schritt dieser Methode war eine

direkte Übertragung nach der fast

vollständigen Mykorrhizierung auf ver-

schiedene Bodensubstrate wie z.B. Wald-

boden, Sand und Bauschutt. Die mykorrhi-

zierten Pflanzen konnten in Waldboden und

Sandsubstraten problemlos weiter kultiviert werden, wohingegen bei den Pflanzen im

Bauschutt keine ausreichende Ausbildung von Kurzwurzeln und kein Zuwachs von

MykorrhizierteKurzwurzel

AgarNährmedium

Cellophan

Inokulum

Myzel

Abb. 12: Makroskopische Aufnahmeeines sterilen Rhizotronsystems: P.thunbergii inokuliert mit Pis. tinctorius.

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Ergebnisse 41

Pilzhyphen festzustellen war. Nach ca. 8 Monaten Kultivierungszeit konnte

insbesondere im Waldboden und in dem Sandsubstrat beobachtet werden, dass die

beiden Mykorrhizapilze ein starkes Wachstum aufwiesen, während die mykorrhizierten

Pflanzen auf Bauschutt und Bauschutt/Sand-Mischungen ein deutlich geringeres

Wachstum von Sproß und Wurzeln zeigten. Trotz der hohen Mykorrhizierungsrate, die

die Pflanzen nach der Reinkultur- inokulation aufwiesen, wiesen die auf Bauschutt

kultivierten Pflanzen bei Versuchsende eine geringe Biomasse auf.

Das Auswachsen der Pilzhyphen von den beiden Mykorrhizapilzen Pis. tinctorius

und R. roseolus wurde nach der Übertragung auf Bauschutt und Bauschutt/Sand-

Mischungen verlangsamt und eine neue Bildung der abziehenden Hyphen (Myzel-

stränge) war kaum zu beobachten. Die betroffenen Pflanzen zeigten eine äußere

Veränderung an den Nadelspitzen (braune Färbung) und verfärbten sich schließlich

dunkelbraun. Es läßt sich nur schwer beurteilen, ob es sich um einen mineralstoff-

bedingten Mangel, um Überschußsymptome oder um zu hohe Schwermetallgehalte wie

z.B. Cd, Cu und Zn handelt. Aus technischen und zeitlichen Gründen wurde diese

Methode nicht weiter verfolgt.

3.1.1.5. Wachstum der Pflanzen auf den eingesetzten Bodensubstraten mit Bio-

kompost als Zusatzstoff

Aus der Erkenntnis eigener bodenchemischer Untersuchungen heraus, konnte fest-

gestellt werden, dass Bauschutt (als technogenes Substrat) ein ungeeignetes Boden-

substrat für das Pflanzenwachstum und insbesondere für die Ausbildung der

Mykorrhiza ist. Zu den typischen Eigenschaften von Bauschutt gehört der hohe Nähr-

und Schadstoffgehalt MEUSER (1993, 1996), während das Sandsubstrat nur geringe

Nähr- und Schadstoffmengen enthält. Als Trägersubstanz für den Mykorrhizapilz und

als organische Nährstoffquelle wurde Biokompost den Bodensubstraten zugesetzt, um

bei Aufforstungsmaßnahmen - insbesondere an extremen Standorten wie z.B. Halden,

Schuttflächen und Erosionsstandorten - ein entsprechend vorteilhaftes Bodenverhältnis

für die Pflanzen und für die Mykorrhizapilze zu schaffen. In Voruntersuchungen wurde

festgestellt, dass sowohl die Pflanzen als auch die Mykorrhizapilze in einer

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Ergebnisse 42

Bodenmischung aus Sand, Bauschutt und Biokompost im Verhältnis von 4:2:1 (v/v) ein

gutes Wachstum aufwiesen. Wie in der Abbildung 13 zu erkennen ist, variiert die

Mykorrhizierungsrate bei verschiedenen Mykorrhizapilzen. Die makroskopisch

geschätzte Mykorrhizierungsrate von P. tinctorius lag in der Regel zwischen 20% und

70%, die von S. bovinus zwischen 30% und 60% und jene von R. roseolus zwischen

50% bis 80%.

Das Sproß- und Wurzeltrockengewicht und S/W-Verhältnis der Pflanzen ist in der

Abbildung 14 dargestellt. Daraus geht hervor, dass alle mykorrhizierten Pflanzen

gegenüber den unmykorrhizierten Pflanzen ein höheres Sproß- und Wurzel-Trocken-

gewicht aufwiesen. Sowohl Sproß- als auch Wurzeltrockengewicht der 4 Versuchs-

gruppen zeigen starke Schwankungen innerhalb der Einzelwerte. Trotzdem waren die

Unterschiede der Sproß- und Wurzeltrockengewichte von mykorrhizierten und

unmykorrhizierten Pflanzen signifikant (p= 0,0357). Die verschiedenen mykorrhizierten

Pflanzen zeigten keine signifikanten Unterschiede, nur das Sproß-Trockengewicht

nahm bei R. roseolus mykorrhizierten Pflanzen zu. Einen Einfluß der Mykorrhizierung

auf die Zunahme des Sproß- und Wurzeltrockengewichtes konnte bei allen

mykorrhizierten Pflanzen festgestellt werden.

Das S/W-Verhältnis des Trockengewichtes wird auf der Basis der Dividierung von

Sproß- durch Wurzeltrockenmasse gebildet. Das S/W-Verhältnis liegt bei allen

mykorrhizierten Pflanzen etwas niedriger als bei unmykorrhizierten Kontrollen (s. Abb.

14). Ein erniedrigtes S/W-Verhältnis bei mykorrhizierten Pflanzen kann durch eine

Reduktion des Wurzelwachstums oder durch ein gesteigertes Sproßwachstum

verursacht werden.

In den Abbildungen 15a-d ist eine makroskopische Aufnahme des Rhizotronsystems

der Pflanze P. thunbergii dargestellt. Dabei ist zu erkennen, dass die mykorrhizierten

Pflanzen ein deutlich erhöhtes Sproßwachstum gegenüber der Kontrollpflanze

aufweisen. In der Aufnahme des Rhizotrons (s. Abb. 15d) der mit R. roseolus

mykorrhizierten Pflanze sind die Mykorrhizen bzw. Pilzhyphen nicht deutlich zu

erkennen. Die Wurzeln hatten das Bodeninnere durchwachsen und auf der anderen Seite

des Rhizotrons konnten mykorrhizierte Wurzeln beobachtet werden.

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Ergebnisse 43

Abb. 15a-d: Makroskopischeb. Pis. tinctorius; c. S. bovinu(4:2:1, v/v), 14 Monate Kultiv

Abb. 13: Mykorrhizierungsrate der Pflanzen P.thunbergii mit verschiedenen MykorrhizapilzenPis. tinctorius, S. bovinus und R. roseolus aufausgewählten Bodensubstraten aus Sand,Bauschutt und Biokompost (4:2:1, v/v). 14Monate Kultivierungszeit (Mittelwert aus n=5).Die vertikalen Balken geben den Minimal- undMaximalwert (Meßwertbereich) an.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

unmyko.Kontrolle

Pis.tinctorius

S. bovinus R. roseolus0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Sproß-TGWurzel-TGS/W-Verhältnis

Sproß- und Wurzel-Trockengewicht und S/W-Verhältnis

Spro

ß- u

nd W

urze

l tro

cken

gew

icht

in g

S/W

-Ver

hältn

is

Abb. 14: Sproß- und Wurzel-Trockengewichtund S/W-Verhältnis von P. thunbergii,inokuliert mit Pis. tinctorius, S. bovinus und R.roseolus auf ausgewählten Bodensubstraten ausSand, Bauschutt und Biokompost (4:2:1, v/v).14 Monate Kultivierungszeit (Mittelwert ausn=5, unmyko. Kontrolle aus n=3).

34

46

68

0

20

40

60

80

100

Pis. tinctorius S. bovinus R. roseolus

Mykorrhizierungsrate

Myk

orrh

izie

rung

srat

e in

%

Mykorrhizapilz

a

b

Aufnahmen des Rhizotros; d. R. roseolus auf einemierungszeit.

c

nsystems von P. thunberg Gemisch aus Sand, Baus

d

ii: a. Kontrollpflanze;chutt und Biokompost

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Ergebnisse 44

3.1.1.6. Einfluß des pH-Wertes auf das Myzelwachstum

In diesem Experiment sollte das Wachstumsverhalten von den beiden Ekto-

mykorrhizapilzen Pis. tinctorius und R. roseolus in verschiedenen pH-Werten im

Flüssignährmedium untersucht werden. Durch Vorversuche wurde festgestellt, dass die

isolierten R. roseolus-Pilze aus Freilandwurzeln von Kiefern (P. sylvestris) auf

neutralem bis schwach alkalischem pH-Bereich ein gutes Myzelwachstum aufweisen.

Der Ektomykorrhizapilz Pis. tinctorius wurde für dieses vergleichende Experiment

deshalb ausgewählt, da er vorzugsweise im schwach sauren pH-Bereich vorkommt

(MARX, 1977).

In der Abbildung 16 ist zu erkennen, dass die beiden Pilze ein unterschiedliches

Myzelwachstum zeigten und unterschiedlich auf die verschiedenen pH-Werte

reagierten. Ferner zeigten beide Pilze sowohl bei sehr niedrigem pH-Wert (pH 2,0) als

auch bei sehr hohem pH-Wert (pH 9,0) ein geringes Wachstum. Die größte Myzel-

bildung (Trockengewicht) war jedoch bei einem pH von 6,0 bei R. roseolus erkennbar.

Im pH-Bereich von 6,0-7,0 zeigten beide Pilze ein optimales Myzelwachstum, wobei

keine eindeutig signifikanten Unterschiede zu den alkalischen pH-Werten auftraten.

Die Messung des pH-Wertes der Nährlösung nach Versuchsende zeigte eine starke

Absenkung des eingestellten pH-Wertes. Die Absenkung im neutralen und basischen

Bereich betrug bis zu 2,5 pH-Einheiten. Die Nährlösungen im sauren Bereich von pH

2,0-3,0 blieben dagegen relativ unverändert oder stiegen nur geringfügig an. Aus der

Abbildung 16 ist ersichtlich, dass hohe pH-Werte das Wachstum des Myzels negativ

beeinflussen. Der pH-Wert der Kontrolle zeigte eine ähnliche pH-Wert-Absenkung wie

die mit Pilz-Inokulum angesetzten Proben, aber die pH-Werte sind etwas höher als bei

den beiden Pilzproben.

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Ergebnisse 45

Abb. 16: Darstellung des Myzelwachstums (Trockengewicht in g) in Abhängigkeit vom pH-Wert(Versuchsbeginn) sowie der pH-Wert-Veränderung der Nährlösung (Versuchsende). Dieeingesetzten pH-Wert-Stufen beziehen sich auf den Versuchsbeginn, in der eingesetztenKurvengraphik sind die pH-Werte am Ende des Versuches wiedergegeben. Die vertikalen Balkengeben den Minimal- und Maximalwert (Meßwertbereich) an.

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

pH-2 pH-3 pH-4 pH-6 pH-7 pH-8 pH-90,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

TG von R. roseolus TG von P. tinctorius

pH-Wert von R. roseolus pH-Wert von P. tinctorius Kontrolle ohne Inokulum

pH-Wert bei Versuchsbeginn

Myzelwachstum in Abhängigkeit vom pH-Wert

pH-W

ert a

m V

ersu

chse

nde

Mittelwert aus n=3

Troc

keng

ewic

ht in

g

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Ergebnisse 46

3.2. Untersuchungen zu unterschiedlichen Bodensubstraten

3.2.1. Weitere Bodendaten

Anmerkungen:

Die wichtigsten Ergebnisse, mit deren Hilfe die bodenchemischen Zustände in verschie-denen Böden charakterisiert werden, erlauben einen Einblick in den Mineralstoffhaushalt deruntersuchten Pflanzen im Zusammenhang mit den eingesetzten Mykobionten und derchemischen Zusammensetzungen (Nähr- und Schadstoffkonzentrationen) der verwendetenBodensubstrate. In diesen Böden wurden die Pflanzen 12 Monate (4 Monate Anzucht und 8Monate Kultivierung) in Rhizotronen unter kontrollierten semisterilen Bedingungen kulti-viert. Der Stichprobenumfang ist der jeweiligen Grafik zu entnehmen.

3.2.1.1. pH-Wert des Bodens

Der pH-Wert von Ausgangsmaterial gibt Auskunft über den Zustand des Bodens

vor Beginn des Versuches. Am Versuchsende (nach 8 Monaten) wurden zudem die

pH-Werte der Böden bestimmt, um etwaige pH-Verschiebungen festzustellen. Aus den

Ergebnissen ist ersichtlich, dass die pH-Werte zwischen Waldboden und Bauschutt

recht unterschiedlich sind (s. Abb. 17). Der pH-Wert im Waldboden liegt zwischen

5,6 und 5,9 (CaCl2), im Sand bei 7,4 und im Bauschutt und in Bauschutt-Sand-

Gemischen von 8,3 bis 8,5. Mit Ausnahme des Waldbodens, konnte bei allen Böden

keine relevante pH-Wert-Verschiebung zwischen Versuchsbeginn und Versuchsende

festgestellt werden. Im Gegensatz dazu, war der pH-Wert des Waldbodens nach

Versuchsende um ca. 0,4 pH-Einheiten (bei CaCl2) angestiegen.

3.2.1.2. Elektrische Leitfähigkeit

Die elektrische Leitfähigkeit dient zur Abschätzung der chemischen Beschaffenheit

eines Bodens. Hohe Leitfähigkeiten über 700 µS/cm weisen auf eine vorhandene

Belastung hin. Wie in der Abbildung 18 zu erkennen ist, gibt es deutliche Unter-

schiede der elektrischen Leitfähigkeit in den verschiedenen Substraten Waldboden,

Sand und Bauschutt. Die hohe elektrische Leitfähigkeit im Bauschutt ist auf die hohe

Konzentration verschiedener Metallkationen zurückzuführen.

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Ergebnisse 47

Abb. 17 : pH-Werte der eingesetzten Bodensubstrate. Die vertikalen Balken geben den Minimal-und Maximalwert (Meßwertbereich) an (Wd= Waldboden; Sd= Sand; Bs= Bauschutt; Gm=Gemisch aus Bauschutt und Sand).

Abb. 18 : Elektrische Leitfähigkeit derBodensubstrate. Die vertikalen Balkengeben den Minimal- und Maximalwert(Meßwertbereich) an (Wd= Waldboden;Sd= Sand; Bs= Bauschutt; Gm= Gemischaus Bauschutt und Sand).

Elektrische Leitfähigkeit

0

300

600

900

1200

1500

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

µS/ c

m

Mittelwert aus n=7 Bodensubstrate

pH-W

erte

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

H2O CaCl2 H2O CaCl2 H2O CaCl2 H2O CaCl2 H2O CaCl2

VersuchsbeginnVersuchsende

Sd Gm-80/20% Gm-60/40%BodensubstrateMittelwert aus n=3

pH-W

erte

pH-Werte der Böden

BsWd

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Ergebnisse 48

3.2.1.3. CAL-lösliche Gehalte von P und K im Boden

Phosphat gehört neben Stickstoff und Kalium zu den Hauptnährstoffen für Pflanzen

und ist außerordentlich stabil und schwer pflanzenverfügbar. Zunächst wurde überprüft,

ob die Konzentration des CAL-löslichen Phosphat- und Kalium-Gehalts des Bodens durch

Autoklavieren (steril bzw. unsteril) verändert werden kann. In den Abbildungen 19 und 20

ist zu erkennen, dass die Konzentrationen der beiden Nährelemente durch die hohe Tem-

peratur (120°C) und den hohen Druck (1,2 bar) etwas gestiegen sind. Der Gehalt an

pflanzenverfügbarem Phosphat der hier untersuchten Böden ist je nach Bodentyp sehr

unterschiedlich. Der stark carbonathaltige technogene Bauschutt enthält die dreifache

Menge Phosphat (30,2 bzw. 26,7 mg/100g Boden) im Vergleich zum Waldboden (10,1

bzw. 7,9 mg/100g Boden) und eine dreißigfach höhere Menge Phosphat als der Sand (1,1

bzw. 0,9 mg/100g Boden). Die Abbildung 19 gibt die pflanzenverfügbaren Phosphat-

gehalte in den verschiedenen Bodensubstraten wieder. Kalium ist für die Pflanzen ein

essentielles Nährelement und ist als Co-Faktor an Enzymreaktionen beteiligt. Aus der

Abbildung 20 ist ersichtlich, dass der CAL-lösliche Kaliumgehalt im Bauschutt (23,3

mg/100g) im Vergleich zum Waldboden (4,2 mg/100g) und zum Sandsubstrat (0,4

mg/100g Boden) sehr hoch ist.

Abb. 19: Pflanzenverfügbare P-Gehalteim Boden. [mg P2O5/100g Boden].

Abb. 20: Pflanzenverfügbare K-Gehalteim Boden. [mg K2O/100g Boden].

0,7

7,6

0,8

22,5

5,9

19,9

0

10

20

30

40

Waldboden Sand Bauschutt

Bodensubstrate

mg/

100g

Bod

en

sterilunsteril

Mittelwert aus n=2

Phosphatgehalt Kaliumgehalt

0,7 0,4

23,3

4,4 4,2

22,4

0

10

20

30

40

Waldboden Sand Bauschutt

sterilunsteril

BodensubstrateMittelwert aus n=2

mg/

100g

Bod

en

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Ergebnisse 49

3.2.1.4. Corg- und Canorg-Gehalt im Boden

Der Gesamt-Kohlenstoffgehalt des Bodensubstrates wurde mit Hilfe des Leco-Gerätes

CNS-2000 quantitativ bestimmt. Der Anteil des anorganisch gebundenen Kohlenstoffs

(Canorg) wird vom Gesamtkohlenstoffgehalt (Ct) subtrahiert und erlaubt Aussagen über den

Corg-Gehalt. Der prozentuale Anteil des Canorg-Gehalts errechnet sich aus dem Anteil des

Kohlenstoffes von CaCO3 (s. Tab. 6). Dies entspricht dem Gewichtsanteil von Kohlenstoff

(8,33 Gew. %) im Molekül CaCO3 (Molgewicht von CaCO3=100,09g; CO2=44,01 g/mol;

C=12,01 g/mol). Aus der Abb. 21 ist zu ersehen, dass der Corg-Gehalt (=Gehalt an

organischem Kohlenstoff in %) des Waldbodens (10,38 Gew. %) fast 5-fach höher ausfällt

als der des Bauschutts (2,36 Gew. %). Der Bauschutt ist sehr heterogen zusammengesetzt,

hier finden sich verschiedene Baumaterialien wie Beton, Ziegel, Zement, Gips und

Aschen. Der Sand hingegen, weist nur einen sehr geringen Anteil an organischer Substanz

auf. Dagegen ist der Waldboden im Hinblick auf den relativ hohen organischen Gehalt

(8%-15%) als humusreich zu bezeichnen, während Bauschutt nur als schwach humos (1-

2%) einzustufen ist. Die Abbildung 22 zeigt einen geringen anorganischen Kohlenstoff-

gehalt (Canorg) im Waldboden (0,08%) und im Sandsubstrat (0,05%). Dagegen wurden im

Bauschutt und in den Bauschutt/Sand-Gemischen hohe Gehalte an anorganisch

gebundenem Kohlenstoff gemessen.

Abb. 21: Corg-Gehalt der Bodensubstrate. Dievertikalen Balken geben den Minimal- undMaximalwert (Meßwertbereich) an.(Wd=Waldboden; Sd=Sand; Bs=Bauschutt;Gm= Gemisch aus Bauschutt und Sand).

Abb. 22: Canorg-Gehalt der Bodensubstrate(Wd=Waldboden; Sd=Sand; Bs=Bauschutt;Gm= Gemisch aus Bauschutt und Sand).

Corg.-Gehalt im Boden

0,0

3,0

6,0

9,0

12,0

15,0

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

Bodensubstrate

Cor

g. -G

ehal

t in

%

Mittelwert aus n=5

Canorg.-Gehalt im Boden

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Wd Sd Bs Gm80/20%

Gm60/40%

Bodensubstrate

Can

org.

-Geh

alt i

n %

Mittelwert aus n=2

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Ergebnisse 50

3.2.1.5. Nt-Gehalt und C/N-Verhältnis im Boden

Bäume können Stickstoff in Form von NH4+ und NO3

- unter Abhängigkeit von

Temperatur, Feuchte und dem pH-Wert des Bodens aufnehmen, wobei zum Teil

symbiontische Assoziationen diese Ionen aus elementarem Stickstoff (Luftstickstoff)

direkt im Wurzelbereich fixieren können. Die organische Substanz (abgestorbene

pflanzliche und tierische Stoffe sowie organische Abbauprodukte) des Bodens besteht

im Mittel zu ca. 50% aus Kohlenstoff. Mit Hilfe des C-Gehaltes läßt sich das C/N-

Verhältnis errechnen. Das C/N-Verhältnis gibt u.a. Auskunft über die Intensität des

mikrobiellen Abbaus.

Aus der Abb. 23 ist zu erkennen, dass der Nt-Gehalt (Gesamt-Stickstoff-Gehalt) des

Waldbodens 7- bis 10-fach höher ausfällt als der im Bauschutt und in den

Bauschutt/Sand-Gemischen. Hingegen war im Sand kein Stickstoff festzustellen.

Die Relation zwischen dem C- und N-Gehalt erlaubt einen Rückschluss auf die

Eignung eines Bodens als Pflanzenwuchsort. Hohe C/N-Verhältnisse weit über 20:1

gelten als für das Pflanzenwachstum ungünstig. Wie aus der Abb. 24 zu ersehen ist,

fällt im Waldboden das C/N-Verhältnis mit 20:1 noch günstig aus. Hingegen fallen die

C/N-Verhältnisse von Bauschutt und den Bauschutt/Sand-Gemischen recht hoch aus

(Verhältnis > 30:1).

Waldboden Sand Bauschutt Gm-80/20% Gm-60/40%

Median 0,62 0,34 6,28 4,24 3,24Mittelwert 0,54 0,36 6,34 4,35 3,09Min 0,34 0,28 6,09 4,10 2,77Max 0,70 0,51 6,82 4,70 3,48SD 0,15 0,07 0,23 0,24 0,24

Tab. 6: Prozentuale Anteile der Calciumcarbonatgehalte (CaCO3) in verschiedenen Böden.SD=Standardabweichung [n=6]

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Ergebnisse 51

3.2.1.6. Pflanzenverfügbare Kationen im Boden

Die Kationengehalte, die mit Ammoniumlactatessigsäure (AL, bei pH 3,8)

extrahierbar sind, sind in der Abb. 25a bis 25d wiedergegeben. Wie aus der Abb. 25a

hervorgeht, sind deutlich variierende Kaliumgehalte in den verschiedenen Böden zu

erkennen. Der Anteil an pflanzenverfügbarem Kalium (K) im Waldboden ist im

Vergleich zu Bauschutt und den Bauschutt/Sand-Gemischen sehr niedrig. Der

Kaliumgehalt im Waldboden ist nach Versuchsende von 11,26 mg/100g Boden auf

6,40 mg/100g Boden fast um die Hälfte gesunken. Im Sand finden sich K-Gehalte zu

Versuchsbeginn von 0,85 mg/100g Boden und nach Versuchsende von 0,77 mg/100g

Boden. Der Bauschutt weist im Vergleich zu Sand und Waldboden einen sehr hohen

Kaliumgehalt von 41,76 mg/100g Boden zu Versuchsbeginn und nach Versuchsende

von 42,33 mg/100g Boden auf. Der Gehalt an Calcium (Ca) variiert stark in den

verschiedenen Bodensubstraten (Abb. 25b). Auffällig ist, dass Bauschutt im

Gegensatz zu Waldboden und Sand einen sehr hohen Calciumgehalt besitzt.

Abb. 24 : C/N-Verhältnisse der Bodensubstrate.Die vertikalen Balken geben den Minimal- undMaximalwert (Meßwertbereich) an.(Wd=Waldboden; Sd=Sand; Bs=Bauschutt;Gm= Gemisch aus Bauschutt und Sand).

Abb. 23 : Nt-Gehalt der Bodensubstrate. ImSand wurde kein Stickstoff nachgewiesen. Dievertikalen Balken geben den Minimal- undMaximalwert (Meßwertbereich) an.(Wd=Waldboden; Sd=Sand; Bs=Bauschutt;Gm= Gemisch aus Bauschutt und Sand).

Nt-Gehalt im Boden

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

Bodensubstrate

Nt-G

ehal

t in

Mittelwert aus n=5

C/N-Verhältnis

0

10

20

30

40

50

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

BodensubstrateV

erhä

ltnis

Mittelwert aus n=5

0,00

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Ergebnisse 52

Der pflanzenverfügbare Natriumgehalt (Na) im Waldboden ist nach Versuchsende

um mehr als das Dreifache von 3,42 mg auf 12,29 mg/100g Boden gestiegen (Abb.

25c). Geringe Natriumgehalte weist der Sand mit 0,4 mg (Versuchsbeginn) und 1,50

mg (Versuchsende) auf. Bauschutt und Bauschutt/Sand-Gemischen besitzen einen

relativ hohen Na-Gehalt. Wie in der Abbildung 25d zu erkennen ist, finden sich im

Waldboden deutlich höhere Magnesiumgehalte (Mg) als im Sand, im Bauschutt und

den Bauschutt/Sand-Gemischen. Nach Versuchsende ist der Magnesiumgehalt im

Waldboden leicht gestiegen.

Aufgrund des zuvor verwendeten sauren Extraktionsmittels Ammonium-

lactatessigsäure (AL, pH 3,8) wurden auch die Bodensubstrate durch das Perkola-

tionsverfahren (ULRICH, 1966; MEIWES et al., 1984) mit 0,5 M NH4Cl und Wasser

extrahiert. Die wasserextrahierbaren sowie die im NH4Cl- und in AL-Extrakt

gemessenen Kationenmengen gehen aus Tabelle 7 hervor. Dabei zeigt sich, dass der

durch AL-Lösung extrahierbare Calciumanteil von Bauschutt fast fünffach und von

Sand sechsfach höher liegt als der durch NH4Cl extrahierbare Gehalt. Bei stark kalk-

haltigen Proben wie z.B. in technogenen Substraten wie Bauschutt bewirkt das saure

Extraktionsmittel eine starke Lösung von Ca- und Mg-Carbonaten (SCHLICHTING,

1993). Im Gegensatz zum Ca sind die Na-Gehalte bei Sand und Bauschutt des NH4Cl-

Extraktes und der AL-Lösung nicht sehr unterschiedlich. Der Mg-Gehalt fällt

insbesondere im Bauschutt mit AL-Lösung vierfach höher aus als nach Extraktion mit

0,5 M NH4Cl. Insgesamt sind die wasserextrahierbaren Mengen an Kationen K, Ca

und Mg in allen Bodenproben im Vergleich zum NH4Cl- und Al-Extrakt deutlich

geringer.

Tab. 7: Vergleich zwischen den H2O und 0,5 M NH4Cl perkolierten Extrakten mit Ammonium-lactatessig-säure (AL)-Extrakt der pflanzenverfügbaren Kationen in Böden [mg/100gBoden]

Waldboden Sand Bauschutt

H2O NH4Cl AL H2O NH4Cl AL H2O NH4Cl ALKalium (K) 5,00 10,60 11,26 0,20 1,50 0,85 22,90 53,00 41,76

Calcium (Ca) 19,30 370,00 374,45 2,60 22,00 121,38 56,80 660,00 3490,00

Natrium (Na) 1,30 1,30 3,42 0,40 1,50 1,31 33,80 33,70 35,78

Magnesium (Mg) 5,20 61,00 72,16 0,10 2,00 2,96 3,90 16,00 66,43

Summe 30,80 442,90 461,29 3,30 27,00 126,50 117,40 762,70 3633,97

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Ergebnisse 53

3

N

N

N

K

0

10

20

30

40

50

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

Bodensubstrate

mg/

100g

Bod

en

VersuchsbeginnVersuchsende

Mittelwert aus n=2

Ca

0

1000

2000

3000

4000

5000

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

Bodensubstratem

g/10

0g B

oden

VersuchsbeginnVersuchsende

Mittelwert aus n=2

Na

0

10

20

30

40

50

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

Bodensubstrate

mg/

100g

Bod

en

VersuchsbeginnVersuchsende

Mittelwert aus n=2

Mg

0

20

40

60

80

100

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

Bodensubstrate

mg/

100g

Bod

en

VersuchsbeginnVersuchsende

Mittelwert aus n=2

(a) (b)

(c) (d)

Abb. 25a-d: Pflanzenverfügbare Kationen im Boden, gemessen wurde vor Versuchsbeginn undnach Versuchsende (Wd=Waldboden; Sd=Sand; Bs=Bauschutt; Gm= Gemisch aus Bauschuttund Sand).

.2.1.7. Anionengehalte im Boden

Die im Zuge der einzelnen Wasser-Extraktionen gewonnenen Mengen der Anionen

O3, Cl und SO4 gehen aus Abb. 26a-c hervor. Der Gehalt an pflanzenverfügbarem

itrat fällt in den verschiedenen Bodensubstraten unterschiedlich aus. Die Werte für

itrat im Waldboden und im Bauschutt liegen im Bereich von 5mg/100g Boden.

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Ergebnisse 54

Eine Ausnahme bildet Sand, dessen Nitratgehalt etwas höher liegt (7mg/100g

Boden). Die höchste Chloridkonzentration weist der Bauschutt mit 28,8 mg/100g

Boden auf. Die geringere Chloridkonzentration von Waldboden und Sandsubstrat

deutet auf einen unbelasteten Bodenzustand hin. Ferner zeigt die wasserextrahierbare

Sulfatmenge im Bauschutt die höchste Konzentration (604,99 mg/100g Boden). Diese

Konzentration liegt deutlich über den Werten des Waldbodens und Sand, deren

Sulfatgehalte 10,48 mg bzw. 33,78 mg/100g Boden betragen. Sulfat ist damit das

dominierende wasserlösliche Anion im Bauschutt.

NO3

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

Waldboden Sand Bauschutt

Bodensubstrate

mg/

100g

Bod

en

SO4

0

20

40

60

80

100

Waldboden Sand Bauschutt

Bodensubstrate

mg/

100g

Bod

en

Cl

0

10

20

30

40

50

Waldboden Sand Bauschutt

Bodensubstrate

mg/

100g

Bod

en

605

(a)

Abb. 26a-c: Anionengehalte in denBodensubstraten (Mittelwert aus n=2).(c)

(b)

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Ergebnisse 55

3.2.1.8. Schwermetallgesamtgehalte im Boden

Um die Bewertung des Bodens auf eine möglichst breite Basis stellen zu können,

wurden neben den pflanzenverfügbaren Schwermetallen (CaCl2-extrahierbare

Schwermetalle) die Schwermetallgesamtgehalte mittels Säureaufschluss (HNO3 und

HCl) verschiedener Böden untersucht. Die analytische Bestimmung der Elemente

Cadmium (Cd), Blei (Pb), Kupfer (Cu), Zink (Zn) und Mangan (Mn) erfolgte mit der

AAS (Messbedingungen siehe Tab. 24 im Anhang). Die Schwermetallgesamtgehalte

in den verschiedenen Böden gehen aus Abb. 27a-e hervor.

Mit Ausnahme der Pb- und Mn-Gehalte im Waldboden, zeigen sich ähnliche

Verhältnisse in Bezug auf den Schwermetallgesamtgehalt von Cd, Cu und Zn bei allen

untersuchten Bodensubstraten. Das heisst, dass die Bauschuttvarianten erhöhte

Schwermetallgesamtgehalte an Cd, Cu und Zn aufwiesen. Die Gesamtgehalte von

Cadmium (0,3 µg/g) im Waldboden liegen unter dem kritischen Gehalt von 1 µg/g

Boden (SCHEFFER & SCHACHTSCHABEL, 1992). Ebenfalls weisen die Cu- (6,6 µg/g

Boden) und Zn-Gesamtgehalte (4,4 µg/g Boden) im Waldboden einen niedrigen Wert

auf. Der Pb-Gesamtgehalt ( 48,9 µg/g Boden) im Waldboden ist als normal anzusehen,

da der Pb-Gehalt in unbelasteten Böden in der BRD meist zwischen 2-60 µg/g Boden

liegt (SCHEFFER & SCHACHTSCHABEL, 1992). Auffallend ist der hohe Anteil an

Mangan (48,9 µg/g Boden) im Waldboden im Vergleich zu den anderen Boden-

substraten. In der Regel ist der Schwermetallgesamtgehalt von Cd, Pb, Cu, Mn und Zn

im Sandsubstrat eher als sehr gering einzustufen.

Die Schwermetallgesamtgehalte an Cd, Pb, Cu und Zn mit Ausnahme Mn im

Bauschutt und in Bauschutt/Sand-Gemischen liegen deutlich höher als im

Sandsubstrat und im Waldboden. Der Gesamtgehalt an Cd, Pb, Cu und Zn in dem

überwiegend aus Ziegel, Mörtel und Beton bestehenden Bauschutt stimmt weitgehend

mit den Werten und Angaben von MEUSER (1996) überein (s. Tab. 15 im Anhang).

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Ergebnisse 56

Cd-Gesamtgehalt im Boden

0,0

4,2

2,1

0,90,3

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

µg/g Boden

BodensubstrateMittelwert aus n=2

Pb-Gesamtgehalt im Boden

1,9

48,9

70,3

67,0

43,5

0

20

40

60

80

100

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

µg/g Boden

BodensubstrateMittelwert aus n=2

Cu-Gesamtgehalt im Boden

6,60,9

48,8

18,713,7

0

20

40

60

80

100

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

µg/g Boden

BodensubstrateMittelwert aus n=2

Mn-Gesamtgehalt im Boden

337,6

248,5

83,3

192,6

157,0

0

100

200

300

400

500

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

µg/g Boden

BodensubstrateMittelwert aus n=2

Zn-Gesamtgehalt im Boden

4,4 2,0

48,1

26,4

18,2

0

20

40

60

80

100

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

µg/g Boden

BodensubstrateMittelwert aus n=2

Abb. 27a-e: Schwermetallgesamtgehalte vonCadmium (a), Blei (b), Kupfer (c), Mangan(d) und Zink (e) in verschiedenenBodensubstraten.Wd= Waldboden; Sd= Sand; Bs= Bauschutt;Gm= Gemisch aus Bauschutt und Sand.

(e)

(c) (d)

(a) (b)

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Ergebnisse 57

3.2.1.9. CaCl2-extrahierbare Schwermetallgehalte im Boden.

Um die ökologische Wirksamkeit von Schwermetallen im Boden beurteilen zu

können, wurden diese in 0,1 M CaCl2-extrahierbaren Fraktionen erfaßt. Diese mobilen

Anteile der Schwermetalle können als pflanzenverfügbare Fraktionen bezeichnet

werden (HORNBURG & BRÜMMER, 1993). In den folgenden Abbildungen 28a-e sind die

CaCl2-extrahierbaren Fraktionen der Elemente Cd, Pb, Cu, Mn und Zn wiedergegeben.

Die Cd- und Pb-Gehalte sind in allen Bodensubstraten - außer im Waldboden - sehr

ähnlich. Wie die in der Abbildung 28a und 28b dargestellten Ergebnisse zeigen, liegen die

Cd- und Pb-Gehalte im Waldboden (Median 0,015 µg/g bzw. 0,023µg/g Boden) höher

als im Sand, im Bauschutt und in den Bauschutt/Sand-Gemischen. Diese vergleichbar

hohen Cd- und Pb-Gehalte im Waldboden können auf den schwach sauren Charakter

des Bodens (pH-Wert 5,59 in CaCl2) zurückgeführt werden. Im Gegensatz zu Cd und

Pb weist der Kupfergehalt (Cu) im Waldboden (Median 0,026 µg/g Boden) und im

Sandsubstrat (Median 0,007 µg/g Boden) eine geringere Konzentration als im

Bauschutt und in den Bauschutt/Sand-Gemischen auf (Abb. 28c). Trotz des

alkalischen Bodencharakters finden sich im Bauschutt und in den Bauschutt/Sand-

Gemischen (pH 8,28 bis 8,32 in CaCl2) vergleichbar hohe Cu-Gehalte.

Im Waldboden ist der Mangangehalt im Vergleich zu den anderen Bodensubstraten

auffallend höher. Die Abbildung 28d zeigt, dass der Mn-Gehalt im Waldboden

(Median 104,500 µg/g Boden) deutlich höher ist als im Sand (Median 20,650 µg/g

Boden), im Bauschutt (Median 0,298 µg/g Boden) und in den Bauschutt/Sand-

Gemischen (Median 0,395 bzw. 0,461 µg/g Boden) ist. Dieser höhere Mangangehalt

ist durch den schwach sauren pH-Wert und den organischen Kohlenstoffgehalt des

Waldbodens bedingt. Zink (Zn) ist in Böden überwiegend an Silikate und Eisenoxide

gebunden und liegt zum größten Teil in organischer Bindung vor. Wie die Abb. 28e

zeigt, wurde das Zn durch die CaCl2-Extraktion nur in geringen Anteilen erfaßt. Der

CaCl2-extrahierbare Zn-Gehalt im Waldboden liegt etwa 2-fach höher als im Sand, im

Bauschutt und in den Bauschutt/Sand-Gemischen. Prozentuale Anteile der

pflanzenverfügbaren (CaCl2-Extraktion) Schwermetallgehalte in den verschiedenen

Böden sind in der Tabelle 8 dargestellt. Außer Pb und Cu, zeigen die Elemente Cd, Mn

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Ergebnisse 58

und Zn im Waldboden und im Sand im Vergleich zum Bauschutt und den

Bauschutt/Sand-Gemischen relativ hohe CaCl2-extrahierbare Gehalte. Die Elemente Pb

und Cu waren bei allen Böden nur zu einem sehr geringen Anteil mit CaCl2-

extrahierbar.

Tab. 8: Prozentuale Anteile der pflanzenverfügbaren Schwermetallgehalte (CaCl2-Extraktion)vom Gesamtgehalt (HNO3+HCl-Aufschluß) der Elemente in verschiedenen Böden [in %].

Waldboden Sand Bauschutt Gm-80/20% Gm-60/40%Cd 4,90 10,00 0,06 0,07 0,19Pb 0,05 0,22 0,01 0,01 0,01Cu 0,39 0,76 0,41 0,45 0,38Mn 30,95 24,80 0,12 0,22 0,21Zn 11,61 10,88 0,47 0,86 1,18

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Ergebnisse 59

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

µg/g Boden

Median aus n=3

(a)Cd-Gehalt

Bodensubstrate

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

µg/g Boden

Median aus n=3 Bodensubstrate

(b)Pb-Gehalt

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

µg/g Boden

Median aus n=3 Bodensubstrate

Cu-Gehalt (c)

104,5

0

10

20

30

40

50

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

µg/g Boden

Median aus n=3

Mn-Gehalt

Bodensubstrate

(d)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

µg/g Boden

Median aus n=3 Bodensubstrate

Zn-Gehalt (e) Abb. 28a-e: CaCl2-extrahierbareSchwermetallgehalte von Cadmium (a), Blei(b), Kupfer (c), Mangan (d) und Zink (e) inden untersuchten Böden. Die vertikalenBalken geben den Minimal- undMaximalwert (Meßwertbereich) an.Wd= Waldboden; Sd= Sand; Bs= Bauschutt;Gm= Gemisch aus Bauschutt und Sand.

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Ergebnisse 60

3.3. Untersuchungen der Pflanzen

Anmerkungen:

Die hier untersuchten Pflanzen wurden in autoklaviertem Sand/Perlite-Substraten (4:1) 12bis 14 Wochen vorkultiviert und ca. 3 Wochen nach der Inokulation in Rhizotrone mitunterschiedlichen Bodensubstraten übertragen. In der Regel wurden die Pflanzen über 8Monate in den Rhizotronen unter kontrollierten Bedingungen angezogen. Die Pflanzen wurdenzunächst für die chemische Analyse in zwei Teile getrennt: Sproß (zusammengesetzt ausNadeln und Stamm) und Wurzel. Der Stichprobenumfang ist aus der entsprechendenAbbildung der graphischen Darstellungen zu entnehmen. Die wichtigsten Ergebnisse dermorphometrischen und chemischen Pflanzenuntersuchungen sind im Folgenden dargestellt.

3.3.1. In-vitro Mykorrhizierungsverlauf

Der Verlauf der Mykorrhizierung des Wurzelsystems von P. thunbergii mit Pis.

tinctorius konnte in dem verwendeten Rhizotronsystem kontinuierlich beobachtet und

dokumentiert werden. Anhand der makroskopischen Untersuchung der Mykorrhizierung

sollte die Morphologie einzelner Wurzeln bei verschiedenen Mykorrhizierungsstadien

von der ersten Kontaktphase bis zur ausdifferenzierten Mykorrhiza verdeutlicht werden

(s. Abb. 29a-g).

Etwa 2-3 Tage nach der Inokulation mit Agarstückchen konnte ein erneutes

Auswachsen der Hyphen des Inokulums beobachtet werden. 3-5 Tage nach der Inoku-

lation orientieren sich die Hyphen gezielt in Richtung der Wurzel und traten in direkten

Kontakt zur Pflanze (Abb. 29a-b). Nach 6-9 Tagen zeigen die Hyphen ein verstärktes

Auswachsen und wuchsen zwischen die Wurzelhaare (Abb. 29c). 9-14 Tage nach der

Inokulation beginnen sich feine Hyphenmäntel im Bereich der Wurzelspitzen zu bilden

und leiten damit den Übergang zur etablierten Mykorrhiza ein. Bei der beginnenden

Mantelbildung ist die Ausbildung der für Ektomykorrhizen typischen keuligen

Wurzelspitze erkennbar. Die Hyphen und einzelne Myzelstränge zeigen eine

dunkelbraune Färbung (Abb. 29d). Diese Alterungserscheinung der Mykorrhiza ist im

reifen ausdifferenzierten Zustand an der Färbung des Pilzmantels zu erkennen (Abb.

29e).

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Ergebnisse 61

Obwohl die Wurzel durch die Spitze des Hyphenmantels erneut austreibt, wurde sie

als Besonderheit nicht mehr mykorrhiziert (Abb. 29f). 20-25 Tage nach der Inokulation

bilden sich Mykorrhizanester und die mykorrhizierten Kurzwurzeln sind teilweise

dichotom verzweigt (Abb. 29g). Die Mykorrhizierung erfolgte nur bei frisch aus-

getriebenen Kurzwurzeln und hier in jüngeren Bereichen, die als “Mycorrhizal Infection

Zone“ (MIZ) bezeichnet werden (MARKS & FOSTER, 1973). In den älteren Bereichen der

Wurzel war keine Mykorrhizierung erkennbar, da die Wurzel hier Rindenzellen mit

suberinisierten Zellwänden als Abschlußgewebe aufweist. Die jungen Wurzeln, die vom

Pilz infiziert wurden, bilden im Beisein des Pilzes keine Wurzelhaare mehr. Eine

Mykorrhiza konnte sich nur an wachsenden Wurzelspitzen etablieren.

Durch die hier verwendete Inokulationsmethode kommt es zu einer schnellen

Infektion der dem Inokulat benachbarten Feinwurzeln. Dagegen wurden die weiter

entfernt gelegenen Feinwurzeln erst später infiziert, so dass der Inokulationszeitpunkt

keine genauen Rückschlüsse auf das tatsächliche Alter der Mykorrhizen zuläßt.

Innerhalb eines Rhizotrons fanden sich jedoch verschiedene Altersstadien von

Mykorrhizen. Aus diesem Grund wurde der Mykorrhizierungsverlauf in regelmäßigen

zeitlichen Abständen untersucht. Die weitere anatomische Entwicklung und Aus-

differenzierung der etablierten Mykorrhiza, vor allem die Merkmale Myzelstränge,

Hyphenmantel und Hartigsches Netz sollen durch die lichtmikroskopische Beobachtung

genau beschrieben werden.

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Ergebnisse 62

Abb. 29a-g: Darstellung des(a) 3 Tage nach der Inokulaweißer Pfeil= Hyphen (50 Pfeil= zusammengelagerte EBeginnende Mantelbildung Ummantelung durch die Hynach der Inokulation, fortge(weißer Pfeil) verbinden dieeiner Kurzwurzelspitze ohnVerzweigungen sind zu erke

a

Mykorrhizierungsverlaufes votion. Auswachsende Hyphen ox); (b) 5 Tage nach Inokulatiinzelhyphen (Hyphenstränge)

der Seitenwurzel (50 x); (d) 9-phen, Kurzwurzel wird von Hschrittene Mykorrhizierung. D Mykorrhiza mit dem Bodense Hyphenmantel (32 x); (g) Bnnen (weißer Pfeil) (12 x), rot

e

b

n P. thunbergii mit Pis. tinctorientieren sich in Richtung deon. Kurzwurzel mit Wurzelh (50 x); (c) 6-9 Tage nach de14 Tage nach der Inokulation.yphen umsponnen (50 x); (eie abziehenden Hyphen und

ubstrat (50 x); (f) Erneuerungsildung von Mykorrhizanesterer Pfeil= Inokulat.

c

d

f

rius.r Kurzwurzel,aaren; weißerr Inokulation. Zunehmende) 15-19 TageMyzelsträngewachstum an

n. Dichotome

g

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Ergebnisse 63

3.3.2. Morphologische und anatomische Charakterisierung der Mykorrhizen

Zur morphologischen und anatomischen Charakterisierung der Kiefernmykorrhizen

sollen durch lichtmikroskopische (LM) und rasterelektronenmikroskopische (REM)

Aufnahmen die verschiedenen Entwicklungsstadien der Mykorrhizierung zwischen den

Symbiosepartnern P. densiflora und P. thunbergii mit S. bovinus beschrieben werden.

Alle ektotrophen Mykorrhizen zeichnen sich durch zwei typische strukturelle Merkmale

aus: der die Wurzel umhüllende Hyphenmantel und das Hartigsche Netz, das im

Bereich der primären Rinde durch das Eindringen des Pilzes zwischen die Zellwände

ausgebildet wird. Durch das dichte Hyphengeflecht entsteht eine optimale

Ummantelung der Rindenzelle, was für den Stoffaustausch von großer Bedeutung ist.

Der Zentralzylinder und die ihn umgebende Endodermis werden nicht von Hyphen

besiedelt.

Die Tangentialschnitte durch den Hyphenmantel einer etablierten Mykorrhiza weisen

im äußeren Bereich ein lockeres plectenchymatisches Hyphengeflecht auf (Abb. 30a).

In der Abbildung 30b sind die puzzleartig strukturierten Hyphen mit Septen und nicht

septierten Verzweigungen im Übergangsbereich zur Tanninschicht erkennbar. Der

Aufbau des Hartigschen Netzes aus verzweigten Hyphenkomplexen zeigt sich im

tangentialen Längsschnitt, in der Aufsicht auf einzelne Rindenzellen (Abb. 30c). In der

Abbildung 30c ist der Übergang von der Tanninschicht zum Hartigschen Netz mit

angeschnittenen Rindenzellen zu erkennen. Etwa 3 Wochen nach der Mantelbildung

liegt die mykorrhizierte Wurzel in ihrer ausdifferenzierten Form vor. Die Abbildung

30c zeigt eine metakutinisierte Wurzel, die durch eine Ruheperiode der Mykorrhiza

zustande kommt.

Durch die lichtmikroskopische Prüfung mit Hilfe von Quer- und Längsschnitten der

Feinwurzeln unterschiedlicher Differenzierung konnten die Entwicklung sowie

morphologische Veränderungen der Mykorrhiza auf den verschiedenen Bodensubstraten

untersucht und miteinander verglichen werden (s. Abb. 31a-c und 32a-c). Es waren

deutliche Unterschiede in der Ausgestaltung der Mykorrhiza zwischen P. thnubergii

und S. bovinus auf den unterschiedlichen Bodensubstraten zu erkennen. Anhand der

Detailaufnahmen der Wurzelquerschnitte (Abb. 31a-1 bis 31c-1) lässt sich der

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Ergebnisse 64

Etablierungsvorgang einer Mykorrhiza ableiten. Dabei wird deutlich, dass der

Hyphenmantel der Mykorrhiza von P. thunbergii mit S. bovinus auf Waldboden (Abb.

31a-1) relativ dick ausgebildet wurde im Vergleich zu den mykorrhizierten Wurzeln auf

Sandsubstrat. Die Hyphen der Mykorrhiza auf Waldboden bilden im äußeren Bereich

des Mantels ein lockeres plectenchymatisches Geflecht im Vergleich zu Sand (Abb.

31b-1) und Bauschutt. Auffallend dabei ist, dass die Struktur des Hartigschen Netzes

der Mykorrhiza bei allen untersuchten Böden eine spezifische Ausbildung mit

charakteristischen Unterschieden zeigt. Zum Beispiel reicht das Hartigsche Netz der auf

Bauschutt (Abb. 31c-1) kultivierten Pflanzen deutlich in die primäre Rindenzellen

hinein. Hier sind noch suberinisierte Endodermiszellen (sEn) deutlich sichtbar.

Die Abbildungen 32a-c und die Detailaufnahme (Abb. 32a-1 - 32c-1) zeigen in den

Wurzellängsschnitten ein bereits fortgeschrittenes Übergangsstadium zur Ausgestaltung

einer Mykorrhiza. Anhand solcher Wurzellängsschnitte und der Detailaufnahmen lassen

sich weitergehende strukturelle Unterschiede in der Ausgestaltung der Mykorrhizen, die

besonders den Hyphenmantel und das Hartigsche Netz betreffen, auf den verschiedenen

Böden (Waldboden, Sand und Bauschutt) ausmachen.

Die Abbildungen 33a-b zeigen die Wurzelquerschnitte einer unmykorrhizierten

Kurzwurzel ohne und mit Wurzelhaaren. Bei den Rhizotronkulturen treten dichotome

Verzweigungen der unmykorrhizierten Kurzwurzeln im Gegensatz zu mykorrhizierten

Kurzwurzeln nur sehr selten auf (eigene Beobachtung). Die älteren Kurzwurzeln weisen

eine suberinisierte Wurzelendodermis (Abb. 33b, En) auf. Die unmykorrhizierten

Kurzwurzeln zeigen schnell Seneszenzerscheinungen.

Durch rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen konnte die Oberflächen-

struktur der Mykorrhiza dargestellt werden (Abb. 34a-b und 35a-f). In der Abbildung

35a, b und c ist in der Aufsicht der lockere und netzartige Aufbau des äußeren

Hyphenmantels (a), und der Aufbau der Hyphenstränge (b) und die Schnallenbildung

(Abb. 35c und 35d) zu erkennen. Weitere detaillierte Beschreibungen zu den einzelnen

Fotos sind direkt den Bildunterschriften der entsprechenden Abbildungen zu

entnehmen.

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Ergebnisse 65

Abb. 30a-d : a. TangentiplectenchymaSepten und VÜbergang zuHyphenmantDetails a-c (4

c

a

Lichtmikroskopische Darstellung deralschnitt durch den Hyphenmantisch (250 x). b. Innerer kompakteerzweigungen (Schwarze Pfeile) (4

r Zone des Hartigschen Netzes (HNel (Hm) mit Hartigschem Netz (HN) 00 x).

Ri

HN

b

P. densiflortel einer r Hyphenm00 x). c. Di) (400 x). deiner Mykor

(a)

d

a und S. bovinus-Mykorrhiza;etablierten Mykorrhiza. Äußerer Bereich=

antel mit ungeordneter Hyphenorientierung mite angeschnittenen Rindenzellen (Ri) zeigen den. Detail eines Querschnittes von a.; kompakterrhiza, (a), (b) und (c) am Rand= Zuordnung der

(b)

HN

Hm (c)

Ri

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Ergebnisse 66

Abb. 31a-c: Lichtmikroskopische Darstellunthunbergii/S. bovinus-Mykorrhiza aus verscPflanzen sind ca. 9 Monate alt.a. Querschnitt durch eine ausdifferenzieaufgebauter Mantel. Der Hyphenmantel (Hm)(Schwarzer Pfeil) (312 x). a-1. Detail aus a. (5b. Querschnitt durch eine ausdifferenziWurzelrinde (Ri). Das Hartigsche Netz is(500 x).c. Querschnitt durch eine ausdifferenziertdem relativ kompakten Hyphenmantel (Hausgebildet. Die Endodermis ist kollabiert

Sand

Bauschutt

Waldboden a a-1

c

b

a

c-1

b-1

HNHm

ZzRi

En

HmHN

Ri

En

g von Querschnitten durch eine primär ausdifferenzierte P.hiedenen Böden (Waldboden, Sand und Bauschutt). Die

rte Mykorrhiza auf Waldboden. Pseudoparenchymatisch ist locker ausgebildet. Die Endodermis ist hier nicht kollabiert00 x).

erte Mykorrhiza auf Sand. Starke Vakuolisierung dert etwas lockerer strukturiert (312 x). b-1. Detail aus b.

e Mykorrhiza auf Bauschutt. Die Feinwurzeln sind vonm) umgeben. Das Hartigsche Netz ist hier sehr intensiv (schwarzer Pfeil) (200 x). c-1. Detail aus c. (500 x).

Zz

sEnHN

Hm

Ri

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Ergebnisse 67

Waldboden

Abb.thunsind a. Ldichox). ab. Lädünnausdc. Läerschausg

a

c

b

Z

Bauschutt

Sand

ZzEn

Am

WhWh

sEn

Zz

HN

Hm

Xy

1

b 1

sEn

Hm

HNRi

Ri

zAm

HmZz HN

32a-c: Lichtmikroskopische Darstellung von Längsbergii/S. bovinus Mykorrhiza auf verschiedenen Bödenca. 9 Monate alt.ängsschnitt einer auf Waldboden kultivierten austom verzweigt. Wurzelhaare (Wh) sind vorhanden. D-1. Detail aus a. Die Endodermis (En) mit suberinisiertngsschnitt einer auf Sand kultivierten ausdifferenzieren Hyphenmantel (Hm) umschlossen. Im Zentralzyifferenziert (125x). b-1. Detail aus b. (312 x).ngsschnitt einer auf Bauschutt kultivierten ausdiffereneint kompakter als auf Sandsubstrat und Waldboden. S

ebildet (125 x). c-1. Detail aus c. (312 x).

Zz

En HN

Hm

Am

a-1

c-

-

schnitten durch eine primär ausdifferenzierte P. (Waldboden, Sand und Bauschutt). Die Pflanzen

differenzierten Ektomykorrhiza. Die Wurzel ister Hyphenmantel (Hm) ist hier relativ dünn (125

en Zellwänden (sEn/schwarzer Pfeil) (312 x).ten Ektomykorrhiza. Die Wurzel wird von einemlinder (Zz) sind Leitelemente des Xylems (Xy)

zierten Ektomykorrhiza. Der Hyphenmantel (Hm)ubapikal hat sich eine Metacutis (schwarze Pfeile)

HN

sEn

Zz

Hm

Ri

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Ergebnisse 68

Abb. 33a-b: Lichtmikroskopische Aufnahmen von Querschnitten durch die unmykorrhizierteKurzwurzel von P. thunbergii auf Bauschutt. a. Querschnitt einer jungen Kurzwurzel ohneWurzelhaare. Rhizodermis (Rhi) aufgequollen durch Präparation, Endodermis (En) ist als Grenzeder primären Wurzelrinde zum Zentralzylinder (Zz) zu erkennen (200 x). b. Basal ausgeführterQuerschnitt einer alten Kurzwurzel. Die Wurzelhaare (Wh) sind sichtbar. Die Endodermis ist hiernicht kollabiert (En, schwarzer Pfeil). Die Wurzeloberfläche ist rauh und verhärtet. Die äußerenRindenzellen (Ri) sind kollabiert (200 x).

Abb. 3a. Detazwische

Zz

En

Wh

b

Ri

a

En

Zz

Ri

Rhi

a

4a-b: Rasterelektronenmikroskopische Darstelluil Wurzelquerschnitt (130 x). b. Detail aus a. Dn den Zellwänden beobachtet werden (weißer P

b

ng der P. densiflora/S. bovinus Mykorrhiza;ie interzelluläre Ausdehnung des Pilzes kannfeil, 1000 x).

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Ergebnisse 69

Abb. 35aDichotomAufsicht (11000 x)

e

a

-f: Rasterelektronenmikroskopische Darstel verzweigte Ektomykorrhiza (89 x). b. Myzeauf den Hyphenmantel der Mykorrhiza (430. e. Wurzeloberfläche mit Wurzelhaaren (1000

b

c

d

f

lung der P. densiflora/S. bovinus Mykorrhiza; a.lstränge mit parallel verlaufenden Hyphen (890 x). c.0 x). d. Detail aus c. Stärker vergrößerte Schnalle x). f. Beginnende Seitenwurzelbildung (550 x).

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Ergebnisse 70

3.3.3. Sproß- und Wurzelentwicklung

In diesem Kapitel soll der Effekt des inokulierten Mykorrhizapilzes Pis. tinctorius

auf die Mykorrhizierung und die Entwicklung der Wirtspflanze (P. thunbergii) in

Verbindung mit den eingesetzten Bodensubstraten zusammenfassend beschrieben

werden. Die hier untersuchten Pflanzen P. thunbergii mit Pis. tinctorius wurden in den

Rhizotronen auf den unterschiedlichen Bodensubstraten wie Waldboden, Sand,

Bauschutt und Bauschutt/Sand-Gemischen angezogen. Nach 12 Monaten wurde die

Sproß- und Wurzelentwicklung sowie der Vitalitätszustand mykorrhizierter und

unmykorrhizierter Pflanzen makroskopisch untersucht. Neben der Beobachtung des in-

vitro Mykorrhizierungsverlaufes (s. Punkt 3.3.1) stellt die vergleichende Untersuchung

von Sproß- und Wurzelwachstum einen wichtigen Faktor für die Beurteilung der in-

vitro Mykorrhizierung dar (Abb. 36a).

In der Abbildung 36a ist der Einfluß auf das Sproß- und Wurzelwachstum sowie die

unterschiedliche Ausbildung und Entwicklung der Mykorrhizen in den verschiedenen

Bodensubstraten zu erkennen. Bei der Entwicklung der Wurzeln auf der Waldboden-

kontrolle konnte beobachtet werden, dass die im Waldboden wachsenden Pilzmyzelien

mit zunehmender Mykorrhizierung des Wurzelsystems dichter und weiträumiger

verbreitet sind. Die abziehenden Hyphen treten oft miteinander in Kontakt und auf

diese Weise verbinden sie die Seitenwurzeln. Bei der weiteren Entwicklung der

etablierten Mykorrhiza entstehen immer wieder neu abziehende Hyphen. Die

Mykorrhizbildung in der Waldbodenkontrolle verlief ohne Unterbrechung und die

Kurzwurzeln wurden fast vollständig mykorrhiziert (Quote > 85%). In der Abbildung

36a ist zu erkennen, dass das Sproß- und Wurzelwachstum der mit Pis. tinctorius

mykorrhizierten Pflanzen auf Waldboden stark angestiegen ist.

Dagegen läßt sich bei den Pflanzen auf Sand, Bauschutt und Bauschutt/Sand-

Gemischen ein deutlich reduziertes Sproß- und Wurzelwachstum erkennen (Abb. 36a).

Die Entwicklung des Sproß- und Wurzelwachstums auf Sandsubstrat ist vergleichs-

weise stärker reduziert als bei den Pflanzen auf Waldboden, Bauschutt und den

Bauschutt/Sand-Gemischen. Der Mangel an notwendigen Nährstoffen (z.B. K, Ca, P

und N) im Sandsubstrat äußerte sich insbesondere in einem reduzierten Sproß-

wachstum.

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Ergebnisse 71

Im Gegensatz dazu wurde das Wurzelwachstum gefördert, um in dem nährstoff-

armen Substrat die aufnehmende Oberfläche zu vergrößern. Beim Vergleich fällt auf,

dass die mykorrhizierten Pflanzen im Gegensatz zu den unmykorrhizierten Pflanzen im

Sand ein erkennbar abweichendes Sproß- und Wurzelwachstum zeigen, welches einen

deutlichen Einfluß des Mykobionten erkennen lässt. Insgesamt weisen die Pflanzen auf

Sandsubstrat trotz der Mykorrhizierung ein stark reduziertes Sproß- und Wurzel-

wachstum auf.

Trotz der ungünstigen Bodenverhältnisse im Bauschutt und in den Bauschutt/Sand-

Gemischen (s. Abb. 36a), die relativ hohe Nähr- und Schadstoffkonzentrationen

aufweisen, gelang es das Pflanzenwachstum durch die optimierten Mykorrhizierungs-

methoden und die positive Entwicklung der Mykorrhizapilze in den Rhizotronen zu

verbessern. Dies wird dadurch deutlich, dass die mykorrhizierten Pflanzen auf

Bauschutt und Bauschutt/Sand-Gemischen ein höheres Sproß- und Wurzelwachstum

aufweisen als die unmykorrhizierten Pflanzen auf denselben Bodensubstraten.

Insgesamt gesehen ist das Sproß- und Wurzelwachstum der mykorrhizierten Pflanzen

auf Bauschutt und Bauschutt/Sand-Gemischen stärker ausgeprägt als bei den

unmykorrhizierten Pflanzen. Eine Mykorrhizierung wirkt sich auf das Sproß- und

Wurzelwachstum der Kiefernsämlinge insbesondere auf den Bauschutt/Sand-

Gemischen sehr positiv aus.

In Abbildung 36b ist erkennbar, dass das Wurzelwachstum der unmykorrhizierten

Pflanzen auf Waldboden sich nicht von dem der mykorrhizierten Pflanzen unter-

scheidet. Abbildung 36b verdeutlicht die Hemmung des Sproß- und Wurzelwachstums

der unmykorrhizierten Pflanzen auf Sand, Bauschutt und den Bauschutt/Sand-

Gemischen im Vergleich zu den mykorrhizierten Pflanzen. Bei den unmykorrhizierten

Pflanzen ist das Wurzelwachstum im Bauschutt und den Bauschutt/Sand-Gemischen

deutlich gehemmt. Auffälliges Symptom dieser unmykorrhizierten Pflanzen ist die erst

gelbliche, später braune Verfärbung der Nadelspitzen (s. Abb. 36b, weißer Pfeil).

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Ergebnisse 72

Wd Sd Bs Gm-80/20% Gm-60/40%

aM

ykor

rhiz

iert

e Pf

lanz

en

Wd Sd Bs Gm-80/20% Gm-60/40%

Unm

ykor

rhiz

iert

e Pf

lanz

en

b

Abb. 36a-b: Makroskopische Aufnahmen der Sproß- und Wurzelentwicklungmykorrhizierter und unmykorrhizierter Pflanzen auf verschiedenen Böden.a. 12 Monate alte P. thunbergii mykorrhiziert mit Pis. tinctorius. b.Unmykorrhizierte P. thunbergii. Die Nadelspitzen (Bauschutt und Gm-80/20%) zeigen eine braune Verfärbung (weißer Pfeil); Wd=Waldboden;Sd=Sand; Bs=Bauschutt; Gm= Gemisch aus Bauschutt und Sand (v/v).

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Ergebnisse 73

Insbesondere wurde die

unmykorhizierten Pflanzen

dungen 37a-37c weisen ein

Feinwurzelsystems der Kief

Wurzeln im Waldboden ze

während die Feinwurzeln au

und deutliche Einschnürunge

Charakteristisch ist ferne

wachstum) von Kurzwurzeln

(1986) beobachtete ein ähnli

der Fichte im Freiland. Ein

Stillstand gekommenes Wach

In der Abb. 38 wird die

beginn und Versuchsende vo

zierter Pflanzen auf verschi

Frischgewicht wurde zu Be

(nach ca. 9 Monaten) bestimm

Abb. 37a-c: Chunterschiedlichen BIn b. und c. sind ein (schwarzer Pfeil). Wd

Wd

a

charakteristische Entw

der jeweiligen Bodens

e typische Wurzelentw

er (P. thunbergii) auf

igten eine mehr oder

f Sand und Bauschutt

n (schwarzer Pfeil) aufw

r die wiederholte Bild

auf Sand und Bauschutt

ches Erneuerungswachst

Grund hierfür ist, dass

stum ein erneuter begren

Frischgewichtsdifferenz

n Sproß und Wurzel) m

edenen Bodensubstraten

ginn des Versuches und

t.

arakteristische Feinwurodensubstraten kultiviertenreduziertes Längenwachstum

=Waldboden; Sd=Sand; Bs=B

Sd

b

icklung der Feinwu

ubstrate untersucht.

icklung des unmyk

verschiedenen Böde

weniger normale E

ein reduziertes Länge

iesen.

ung (schubweises Er

(Abb. 38 b und 38c).

um bei mykorrhiziert

auf ein verlangsamte

zter Wachstumsschub

(=Differenz zwischen

ykorrhizierter und u

im Vergleich darge

nach Abschluß des

zel-Morphologie der unmykorrhizierten Pfla und Einschnürungen erkeauschutt.

Bs

c

rzeln von

Die Abbil-

orrhizierten

n auf. Die

ntwicklung,

nwachstum

neuerungs-

BLASCHKE

en Wurzeln

s oder zum

erfolgt.

Versuchs-

nmykorrhi-

stellt. Das

Versuches

aufnzen.nnbar

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Ergebnisse 74

Es zeigt sich, dass die Frischgewichtszunahme der mykorrhizierten Pflanzen bei

allen Ansätzen stärker ausgeprägt ist als bei unmykorrhizierten Pflanzen. Diese

Frischgewichtszunahme bei mykorrhizierten Pflanzen weist darauf hin, dass der

Mykorrhizapilz Pis. tinctorius einen Beitrag zum Sproß- und Wurzelwachstum leistete.

3.3.4. Sproß- und Wurzel-Trockengewicht und Sproß/Wurzel-Verhältnis

Das Sproß- und Wurzel-Trockengewicht der Pflanzen, die auf verschiedenen Boden-

substraten kultiviert (12 Monaten) wurden, ist in den Abbildungen 39a-b dargestellt.

Abbildungen 39a verdeutlicht die Differenz des Sproß-Trockengewichtes zwischen den

mit Pis. tinctorius mykorrhizierten und den unmykorrhizierten Pflanzen. Die Zunahme

des Sproß-Trockengewichtes der mykorrhizierten Pflanzen gegenüber den unmykorrhi-

zierten Pflanzen, weist auf ein erhöhtes Wachstum dieser Pflanzen in den verschiedenen

Böden hin. Dies wird insbesondere bei den mykorrhizierten Pflanzen auf Waldboden

(als Kontrollansatz) deutlich. Es war ein signifikanter Unterschied (p � 0,05) (s. Tab. 20

u. 21 im Anhang) im Vergleich zu den unmykorrhizierten Pflanzen auszumachen. Die in

Sand kultivierten Pflanzen zeigen dagegen ein geringeres Sproß-Trockengewicht,

sowohl bei den mykorrhizierten als auch bei den unmykorrhizierten Pflanzen. Diese

Abb. 38: Frischgewichtsdifferenz zwischen Versuchsbeginn und Versuchsende mykorrhizierterund unmykorrhizierter Pflanzen auf verschiedenen Bodensubstraten. Die vertikalen Balkengeben den Minimal- und Maximalwert (Meßwertbereich) an; (Gm= Gemisch aus Bauschutt undSand).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Waldboden Sand Bauschutt Gm-80/20 % Gm-60/40 %

myko. Pflanzenunmyko. Pflanzen

Bodensubstrate

Fris

chge

wic

htsd

iffer

enz

[in

g]

Frischgewichtsdifferenz zwischenVersuchsbeginn und Versuchsende

Mittelwert aus n=5

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Ergebnisse 75

Tendenz war auch bei den Pflanzen in den Bauschutt und Bauschutt/Sand-Gemischen

deutlich erkennbar. Hingegen konnten beim Sproß-Trockengewicht zwischen den

verschiedenen Bauschutt-Varianten keine eindeutigen Unterschiede festgestellt werden.

Auch das Wurzel-Trockengewicht zeigt im Vergleich der verschiedenen Boden-

substrate ähnliche Tendenzen (s. Abb. 39b). Unabhängig vom Bodensubstrat ist das

Wurzel-Trockengewicht bei mykorrhizierten Pflanzen höher als bei den unmykorrhi-

zierten Pflanzen. Außer im Waldboden haben die Pflanzen im Sand, im Bauschutt und

den Bauschutt/Sand-Gemischen ein vergleichbar geringes Wurzel-Trockengewicht.

Interessanterweise haben die Pflanzen im Sand ein höheres Wurzel- als Sproß-

Trockengewicht; dies gilt sowohl für die mykorrhizierten als auch für die unmykorrhi-

zierten Pflanzen. Bei allen anderen Substraten ist das Sproß-Trockengewicht höher als

das Wurzel-Trockengewicht sowohl bei den mykorrhizierten als auch bei den

unmykorrhizierten Pflanzen. Ein Einfluß der Mykorrhizierung auf die Zunahme des

Sproß-Trockengewichtes konnte bei allen Bodensubstraten festgestellt werden.

Alle mykorrhizierten Pflanzen weisen gegenüber den unmykorrhizierten Pflanzen

etwas höhere Sproß/Wurzel-Verhältnisse (S/W-Verhältnis) auf (s. Abb. 39c). Das liegt

daran, dass mykorrhizierte Pflanzen eine geringere Wurzelmasse ausbilden als die

unmykorrhizierten Pflanzen. Auffällig ist ein sehr niedriges S/W-Verhältnis (< 1) der

Pflanzen, die im Sand kultiviert wurden. Das heisst, wie oben schon angesprochen,

dass hier das Wurzelwachstum stärker als das Sproß-Wachstum gefördert wird. Dieser

Effekt lässt sich gut durch die niedrige Nährstoffkonzentration im Sand und den

Versuch der Pflanze, dies durch eine vermehrte Wurzelbildung auszugleichen,

erklären. Ein erhöhtes S/W-Verhältnis (> 1) des Trockengewichtes kann durch eine

Reduzierung des Wurzelwachstums oder durch ein gesteigertes Sproß-Wachstum

verursacht werden. Mit Ausnahme des Sandsubstrates zeigen die S/W-Verhältnisse der

Pflanzen im Waldboden und im Bauschutt und den Bauschutt/Sand-Gemischen eine

ähnliche Entwicklung.

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Ergebnisse 76

0

100

200

300

400

500

myko. PflanzenSproß-TrockengewichtTr

ocke

ngew

icht

in m

g

Mittelwert au

0

100

200

300

400

500

Troc

keng

ewic

ht in

mg

Mittelwe

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Spro

ß/W

urze

l-Ver

hältn

is

Mittelwert a

(

Abb. 39a-c: V(TrockengewicMinimal- undGm=Gemisch

(a)

Wd Sd Bs Gm-80/20% Gm-60/40%

Bodensubstrate

unmyko. Pflanzen

s n=5

Wd Sd Bs Gm-80/20% Gm-60/40%

Bodensubstrate

myko. Pflanzenunmyko. Pflanzen

Wurzel-Trockengewicht

rt aus n=5

Wd Sd Bs Gm-80/20% Gm-60/40%

myko. Pflanzenunmyko. Pflanzen

Bodensubstrateus n=5

Sproß/Wurzel-Verhältnis(b)bc)

(b)

ergleich der Sproß- und Wurzel-Trockengewichte sowie des Sproß/Wurzel-Verhältnissesht) mykorrhizierter und unmykorrhizierter Pflanzen; die vertikalen Balken geben den Maximalwert (Meßwertbereich) an; (Wd=Waldboden; Sd=Sand; Bs=Bauschutt;

aus Bauschutt und Sand).

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Ergebnisse 77

3.3.5. Makroskopische Bewertung der Mykorrhizierungsrate

In der Abbildung 40 ist die Mykorrhizierungsrate der mit Pis. tinctorius inokulierten

P. thunbergii Pflanzen, die nach Abschluß des Versuches (nach 12 Monaten) makros-

kopisch ermittelt wurde, dargestellt. Die Mykorrhizierungsrate der einzelnen Ansätze

wurde durch eine prozentuale Abschätzung der mykorrhizierten Wurzelfraktionen (im

Verhältnis zur Gesamtwurzel) ermittelt. Die in Waldboden kultivierten Kiefern zeigten

eine deutlich erhöhte Mykorrhizierungsrate (88 %) gegenüber den anderen Ansätzen

wie Sand, Bauschutt und den Bauschutt/Sand-Gemischen. Im Sand wiesen die

inokulierten Pflanzen die niedrigste Mykorrhizierungsrate (ca. 18 %) auf.

Die Mykorrhizierungsraten der Pflanzen im Bauschutt (24 %) und in den

Bauschutt/Sand-Gemischen (28 % bzw. 34 %) unterschieden sich nicht deutlich.

Trotzdem ist die Mykorrhizierungsrate der Pflanzen in Bauschutt/Sand-Gemischen

(Gm-80/20% und Gm-60/40%) etwas höher (um etwa 4% bzw.10%) als die der

Pflanzen im reinen Bauschutt.

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

12

34

0

20

40

60

80

100

Myk

orrh

izie

rung

sgra

d in

%

Bodensubstrate

Ans

ätze

Abb. 40: Makroskopische Auswertung der Mykorrhizierungsrate von P. thunbergii mit Pis. tinctoriusder einzelnen Ansätze (1-4) in % (Wd=Waldboden; Sd=Sand; Bs=Bauschutt; Gm=Gemisch ausBauschutt und Sand).

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Ergebnisse 78

3.3.6. Chemische Untersuchungen der Pflanzen

3.3.6.1. Kationengesamtgehalte in Sproß und Wurzel mykorrhizierter Pflanzen

Neben dem pflanzenverfügbaren Kationengehalt in Böden wurden die Kationen-

gesamtgehalte im Sproß und in der Wurzel mykorrhizierter Pflanzen (P. thunbergii/Pis.

tinctorius) nach Mikrowellenaufschluß mit Hilfe der AAS ermittelt. Bei allen Böden

außer dem Waldboden ist eine erhöhte K-Konzentration im Sproß im Vergleich zur

Wurzel auffällig (s. Abb. 41a). Obwohl der pflanzenverfügbare K-Gehalt im Bauschutt

und in den Bauschutt/Sand-Gemischen (42-23 mg/100g Boden) viel höher ist als im

Waldboden (11,3 mg/100g Boden), wurde im Sproß ein ähnlicher Kaliumgehalt

festgestellt. Dies kann vor allem auf die hohe Beweglichkeit der K-Ionen in den

Pflanzen und auf die selektive Aufnahme durch die Wurzel zurückgeführt werden. Im

Gegensatz dazu ist bei den auf Waldboden kultivierten Pflanzen eine erhöhte K-

Anreicherung in der Wurzel - im Vergleich zum K-Gehalt des Sprosses - zu

beobachten. Dies ist vermutlich auf den Effekt einer engeren Assoziation mit einem

Mykorrhizapilz zurückzuführen.

Wie die Abbildung 41b zeigt, weisen die Wurzeln in allen Böden einen erhöhten Ca-

Gesamtgehalt (Ca) auf. Dabei ist auffällig, dass die Wurzeln im Bauschutt und in den

Bauschutt/Sand-Gemischen deutlich erhöhte Ca-Konzentrationen zeigen. Dieser hohe

Ca-Gesamtgehalt in den Wurzeln kann auf die Kalkablagerungen auf der Wurzel-

oberfläche zurückgeführt werden, da der inhomogene Bauschutt aus verschiedenen

einzelnen Komponenten wie z.B. Zementmörtel, Gips, Beton und Bausand usw. besteht.

Dagegen zeigt der Sproß fast gleichmäßige Ca-Gehalte bei allen Böden. Obwohl die

pflanzenverfügbaren Ca-Gehalte (s. Tab. 9 und Abb. 41b) im Bauschutt und in den

Bauschutt/Sand-Gemischen verhältnismäßig hoch sind, wurden von den Pflanzen

Calcium aus dem Boden nicht in verstärktem Maße aufgenommen.

Natrium (Na) ist für die meisten Pflanzenarten kein essentieller Nährstoff und wird

nur in geringen Mengen benötigt. Der Na-Gesamtgehalt der Wurzeln im Bauschutt und

den Bauschutt/Sand-Gemischen liegt wesentlich höher als in den oberirdischen Sproß-

organen. Im Waldboden ist der Na-Gehalt im Sproß höher als in der Wurzel. Dagegen

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Ergebnisse 79

zeigen die Wurzeln im Bauschutt und in den Bauschutt/Sand-Gemischen höhere Na-

Gehalte. Insgesamt sind die Na-Gehalte sowohl im Sproß als auch in der Wurzeln bei

allen Bodensubstraten als relativ niedrig zu bewerten (Abb. 41c). Normalerweise

werden Mg-Ionen von den Pflanzen in geringeren Mengen aufgenommen als K- oder

Ca-Ionen. In der Abbildung 41d ist ersichtlich, dass die Mg-Ionen durch Sproß und

Wurzeln bei allen Böden in fast gleichen Mengen aufgenommen wurden, obwohl der

pflanzenverfügbare Mg-Gehalt in den Böden sehr unterschiedlich war (s. Tab. 9, Abb.

41d). Trotz der hohen pflanzenverfügbaren Mg-Ionen im Waldboden, im Bauschutt und

den Bauschutt/Sand-Gemischen wurden Mg-Ionen in sehr geringem Umfang von den

Pflanzen aufgenommen.

In der Tabelle 9 sind die Kationengesamtgehalte in Sproß und Wurzel (HNO3-

Aufschluß) und die pflanzenverfügbaren Kationen im Boden (AL-Extraktion) gegen-

übergestellt. Auffallend ist dabei, dass die Gehalte insbesondere an Ca und Mg bei

allen Ansätzen trotz der hohen pflanzenverfügbaren Gehalte im Boden keine erhöhte

Konzentration in Sproß und Wurzel aufweisen.

Tab. 9: Gegenüberstellung der pflanzenverfügbaren Kationen im Boden (AL-Extraktion in mg/100gBoden) mit den Kationengesamtgehalten im Sproß und Wurzel (HNO3-Aufschluß in mg/g TG).Sp=Sproß, Wu=Wurzel

Waldboden Sand Bauschutt Gm-80/20% Gm-60/40%Boden(AL)

Sp Wu Boden(AL)

Sp Wu Boden(AL)

Sp Wu Boden(AL)

Sp Wu Boden(AL)

Sp Wu

K 11,26 8,67 10,49 0,85 4,81 3,67 41,76 9,51 5,44 33,48 10,28 5,73 23,06 11,01 8,37

Ca 374 5,56 10,28 121 10,07 13,10 3490 10,83 24,41 2724 12,38 29,10 1760 11,81 24,58

Na 3,42 4,26 2,35 1,50 4,02 4,13 35,78 2,61 5,21 27,14 0,88 3,68 19,25 0,77 1,93

Mg 61,00 1,98 1,91 2,00 2,23 1,49 66,43 2,26 2,02 53,24 2,16 2,22 37,66 2,53 1,91

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Ergebnisse 80

Abb. 41a-d: Kationengesamtgehalte im Sproß und Wurzel der mit Pis. tinctorius mykorrhiziertenP. thunbergii-Sämlingen. Die vertikalen Balken geben den Minimal- und Maximalwert(Meßwertbereich) an (Wd=Waldboden; Sd=Sand; Bs=Bauschutt; Gm= Gemisch aus Bauschuttund Sand).

Mg

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

Wd Sd Bs Gm80/20%

Gm60/40%

Bodensubstrate

mg/

g T

G

SproßWurzel

K

0

5

10

15

20

Wd Sd Bs Gm80/20%

Gm60/40%

Bodensubstrate

mg/

g T

G

SproßWurzel

Ca

0

10

20

30

40

Wd Sd Bs Gm80/20%

Gm60/40%

Bodensubstratem

g/ g

TG

SproßWurzel

Na

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

Wd Sd Bs Gm80/20%

Gm60/40%

Bodensubstrate

mg/

g T

G

SproßWurzel

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Ergebnisse 81

3.3.6.2. EDXS-Messungen zur Lokalisation verschiedener Elemente in der Wurzel

Mit Hilfe der röntgenmikroanalytischen Untersuchungen konnte die Lokalisation

einiger Elemente wie z.B. K, Ca, Na, S und P in einzelnen Geweben des mykorrhi-

zierten Wurzelquerschnittes von P. thunbergii mit Pis. tinctorius auf Bauschutt

dargestellt werden. Dabei wurde die Elementverteilung im Querschnitt der mykorrhi-

zierten Wurzeln im Apoplasten, im Symplasten und in den Vakuolen untersucht. Die

Ergebnisse dieser EDXS-Untersuchungen sind wie folgt dargestellt (s. Abb. 42a bis

42e).

Die Elemente Kalium (K) und Calcium (Ca) zeigen innerhalb der mykorrhizierten

Kurzwurzeln eine charakteristische Lokalisation. Wie in der Abbildung 42a zu

erkennen ist, weist Kalium ein vergleichsweise hohes P/B-Verhältnis im Wurzel-

querschnitt auf. Das Element Kalium zeigt insbesondere in der Zellwand und im Cyto-

plasma der Wurzelrinde ein sehr hohes P/B-Verhältnis (ca. 4-5 P/B). Auffallend hierbei

ist, dass die P/B-Verhältnisse eine von außen nach innen zunehmende Tendenz zeigen.

Aus Abbildung 42b geht hervor, dass das Element Calcium in den Kurzwurzeln ein

relativ hohes P/B-Verhältnis (ca. 4 P/B) aufweist.

Das Element Natrium (Na) war in den verschiedenen Wurzelbereichen, außer in den

Vakuolen der Wurzelrinde, mit relativ hohen P/B-Verhältnissen detektierbar (Abb.

42c). In der Vakuole der Wurzelrindenzellen tritt es dagegen nur in geringen Mengen

auf (0,32 P/B). Der Na-Gehalt im Wurzelquerschnitt ist vergleichsweise hoch. Durch

die Mykorrhizierung mit Pis. tinctorius auf Bauschutt konnte eine relativ hohe

Aufnahme von Natrium in das Cytoplasma und in die Vakuole des Hyphenmantels

nachgewiesen werden (ca. 1,75 P/B). Die Schwefelverteilung (S) ist über die

verschiedenen Kompartimente des Wurzelquerschnittes mit Ausnahme der Wurzel-

rindenzellen relativ gleichmäßig (um 1 P/B, s. Abb. 42d). In der Vakuole der Wurzel-

rindenzellen ist Schwefel fast nicht detektierbar (0,13 P/B).

In der Abbildung 42e ist zu erkennen, dass Phosphor (P) eine sehr differenzierte

Verteilung aufweist. Deutliche Maxima findet man in der Vakuole des Hyphenmantels

(der Wert liegt bei 4,5 P/B), weniger P findet sich in der Vakuole der Wurzelrinden-

zellen (0,5 P/B).

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Ergebnisse 82

Kalium

0

1

2

3

4

5

6

7

HM

P/B Calcium7

P/B Natrium7

P/B

0

1

2

3

4

5

6

7

HM

P/B

)

(a

Legende:

M- HM-C HM-V WR-ZW

WR-C

WR-V

Wurzelbereich

0

1

2

3

4

5

6

HM-M

HM-C

HM-V WR-ZW

WR-C

WR-V

Wurzelbereich

0

1

2

3

4

5

6

HM-M

HM-C HM-V WR-ZW

WR-C

WR-V

Wurzelbereich

Schwefel

M- HM-C HM-V WR-ZW

WR-C

WR-V

Wurzelbereich

Phosphor

0

1

2

3

4

5

6

7

H

P/B Abb. 42a-e: P/B-Verhältnisse)

HM-M=HyphenmHM-C= HyphenmHM-V=Hyphenm

(e

(d)

(b)

M-M

HM-C HM-V WR-ZW

WR-C

WR-V

Wurzelbereich

im versder mykPflavertMin(Meaus

antel Matrix WR-ZW=Wurzelriantel Cytoplasma WR-C=Wurzelrinantel Vakuole WR-V=Wurzelrin

(c)

Hyphenmantel undchiedener Wurzelbereiche

mit Pis. tinctoriusorrhizierten P. thunbergiinze auf Bauschutt. Dieikalen Balken geben denimal- und Maximalwertßwertbereich) an (Mediann=3).

nde Zellwandde Cytoplasmade Vakuole

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Ergebnisse 83

3.3.6.3. Schwermetallgesamtgehalte in Sproß und Wurzeln mykorrhizierterund unmykorrhizierter Pflanzen

In den folgenden Abbildungen 43a bis 43e sind die Cadmium- (Cd), Blei- (Pb),

Kupfer- (Cu), Mangan- (Mn) und Zink- (Zn)-Gehalte in Sproß und Wurzel mykorrhi-

zierter und unmykorrhizierter Pflanzen dargestellt, um den Einfluß des Mykorrhi-

zierung auf den möglichen Transfer der Schwermetalle vom Boden in die Pflanze und

die Akkumulation durch die Mykorrhizapilze zu erfassen. Eine Gegenüberstellung mit

dem pflanzenverfügbaren Schwermetallgehalt ist der Tabelle 10 zu entnehmen.

In den Abbildungen 43a und 43a-1 sind die Cadmium-Gehalte (Cd) wiedergegeben.

Bei allen Bodensubstraten weisen die Wurzeln einen viel höheren Cd-Gehalt als der

Sproß auf. Auffällig ist ferner, dass die Wurzeln mykorrhizierter und unmykorrhizierter

Pflanzen auf Waldboden deutlich höhere Cd-Gehalte als die auf Sand, Bauschutt und

auf den Bauschutt/Sand-Gemischen aufweisen. Vergleicht man die Cd-Konzentration

im Sproß und der Wurzel mykorrhizierter und unmykorrhizierter Pflanzen ist zu

erkennen, dass die Mykorrhizierung einen Einfluß auf den Transfer von

Schwermetallen in die Pflanze hat.

Die Blei-Gehalte (Pb) im Sproß und in den Wurzeln verhalten sich bei allen Boden-

substraten außer dem Waldboden ähnlich wie die Cd-Gehalte (Abb. 43b und 43b-1).

Auffallend ist hierbei, dass der Pb-Gehalt in den Wurzeln auf Waldboden viel geringer

ist als bei den Bauschutt und den Bauschutt/Sand-Gemischen. Der Pb-Gehalt in den

Wurzeln mykorrhizierter und unmykorrhizierter Pflanzen liegt viel höher als der Pb-

Gehalt im Sproß (Ausnahme: Sand). Es zeigte sich weiter, dass eine deutlich erhöhte

Pb-Aufnahme in die Wurzeln mykorrhizierter Pflanzen zu beobachten ist. Insbesondere

ist der Pb-Gehalt in den Wurzeln von mykorrhizierten und unmykorrhizierten Pflanzen

auf Bauschutt (100%) und den Bauschutt/Sand-Gemischen (Gm-80/20% und Gm-

60/40%) signifikant unterschiedlich (p=0,0495). Die Pb-Gehalte in den Wurzeln der auf

Sand kultivierten Pflanzen weisen ähnlich hohe Gehalte wie im Sproß auf.

Die Abbildungen 43c und 43c-1 zeigen, dass die aufgenommenen Kupfer-Gehalte

(Cu) im Sproß und in den Wurzeln sehr unterschiedlich ausfallen. Im Vergleich zu

unmykorrhizierten Pflanzen finden sich im Sproß mykorrhizierter Pflanzen bei allen

Bodensubstraten mit Ausnahme des Waldbodens geringere Cu-Konzentrationen.

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Ergebnisse 84

Die Wurzeln der mykorrhizierten Pflanzen zeigen bei allen Bodensubstraten deutlich

höhere Cu-Gehalte im Vergleich zu den unmykorrhizierten Pflanzen. Eine denkbare

Erklärung hierfür wäre, dass das Cu in der Pflanze selbst nicht leicht beweglich ist. Im

Vergleich zwischen mykorrhizierten und unmykorrhizierten Pflanzen sind ferner

Unterschiede beim Waldboden und den beiden Bauschutt/Sand-Gemischen zu

beobachten. Der Cu-Gehalt in den Wurzeln von mykorrhizierten und unmykorrhizierten

Pflanzen auf Bauschutt (100%) und den Bauschutt/Sand-Gemischen (Gm-80/20% und

Gm-60/40%) unterscheiden sich signifikant voneinander (p=0,0495). Obwohl der Cu-

Gesamtgehalt im Boden relativ hoch ist (s. Abb. 27c), zeigen die CaCl2-extrahierbaren

Cu-Fraktionen der eingesetzten Bodensubstrate (s. Abb. 28c) eine deutlich niedrigere

Konzentration (Waldboden 0,026; Sand 0,007 und Bauschutt 0,201 µg/g Boden). Dies

gilt für alle Bodensubstrate. Die Löslichkeit von Cu im Boden ist bei neutralen und

hohen pH-Werten (>7,0) sehr gering (HERMS & BRÜMMER, 1980).

Die Mangan-Gehalte (Mn) im Sproß der auf Waldboden kultivierten mykorrhizierten

und unmykorrhizierten Pflanzen sind deutlich niedriger als in den Wurzeln (Abb. 43d

und 43d-1). Auffällig ist dabei, dass die Mn-Gehalte sowohl im Sproß als auch in der

Wurzel unmykorrhizierter Pflanzen deutlich höher sind als in den mykorrhizierten

Pflanzen (mit Ausnahme der auf Sand kultivierten Pflanzen). Auf Sandsubstrat ist der

Mn-Gehalt im Sproß mykorrhizierter Pflanzen im Gegensatz zu Waldboden etwas

höher als im Sproß unmykorrhizierter Pflanzen (signifikanter Unterschied).

Die Wurzeln der im Sand kultivierten mykorrhizierten und unmykorrhizierten

Pflanzen enthalten nur relative geringe Mn-Mengen. Es zeigen sich weitere interessante

Befunde: bezüglich der Schwermetallaufnahme zeigen die Pflanzen im nährstoffreichen

Waldboden gegenüber den Pflanzen im nährstoffarmen Sand ein entgegengesetztes

Aufnahmeverhalten. Die Mn-Gehalte in Bauschutt und in den Bauschutt/Sand-

Gemischen zeigen keine großen Unterschiede zwischen Sproß und Wurzel

mykorrhizierter und unmykorrhizierter Pflanzen. Die Mn-Aufnahme der Pflanze kann

durch die hohen Mg- und Ca-Konzentrationen in Pflanzen und einen alkalischen pH-

Wert im Boden von Bauschutt und Bauschutt/Sand-Gemischen behindert sein.

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Ergebnisse 85

Der erhöhte Zink-Gehalt (Zn) in den Wurzeln mykorrhizierter und unmykorrhizierter

Pflanzen ist ähnlich den Cu-Gehalten. Das heisst, dass der Zn-Gehalt in den Wurzeln

bei allen Böden höher als im Sproß ist. Der Zn-Gehalt in den Wurzeln mykorrhizierter

Pflanzen ist bei allen Bodensubstraten außer im Sand höher als in den

unmykorrhizierten Pflanzen. Für das Substratgemisch (Gm-80/20%) konnte ein signi-

fikanter Unterschied zwischen mykorrhizierten und unmykorrhizierten Pflanzen

lediglich für die Wurzeln festgestellt werden.

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Ergebnisse 86

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

Bodensubstrate

µg/gTG

myko. Pflanzenunmyko. Pflanzen

Median aus n=3

Cd (Sproß)

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

Bodensubstrate

µg/gTG

myk.-Pflanzenunmyk.-Pflanzen

Pb (Wurzel)

Median aus n=3

0

100

200

300

400

500

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

Bodensubstrate

µg/gTG

myk.-Pflanzenunmyk.-Pflanzen

Cu (Wurzel)

Median aus n=3

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

Bodensubstrate

µg/gTG

myko. Pflanzenunmyko. Pflanzen

Median aus n=3

Cd (Wurzel)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

Bodensubstrate

µg/gTG

myk.-Pflanzenunmyk.-Pflanzen

Median aus n=3

Pb (Sproß)

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

Bodensubstrate

µg/gTG

myk.-Pflanzenunmyk.-Pflanzen

Median aus n=3

Cu (Sproß)

Abb. 43a-c: Cadmium-, Blei- und Kupfergehalte in Sproß und Wurzel (Abb. 43a-1-43c-1) dermykorrhizierten und unmykorrhizierten Pflanzen. Die vertikalen Balken geben den Minimal-und Maximalwert (Meßwertbereich) an (Wd= Waldboden; Sd= Sand; Bs= Bauschutt; Gm=Gemisch aus Bauschutt und Sand).

(a) (a-1)

(b) (b-1)

(c)(c-1)

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Ergebnisse 87

0

500

1000

1500

2000

2500

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

Bodensubstrate

µg/gTG

myk.-Pflanzenunmyk.-Pflanzen

Mn (Sproß)

Median aus n=3

0

500

1000

1500

2000

2500

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

Bodensubstrate

µg/gTG

myk.-Pflanzenunmyk.-Pflanzen

Mn (Wurzel)

Median aus n=3

0

50

100

150

200

250

300

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

Bodensubstrate

µg/gTG

myk.-Pflanzenunmyk.-Pflanzen

Zn (Sproß)

Median aus n=3

0

50

100

150

200

250

300

Wd Sd Bs Gm-80/20%

Gm-60/40%

Bodensubstrate

µg/gTG

myk.-Pflanzenunmyk.-Pflanzen

Zn (Wurzel)

Median aus n=3

(d)

(e)

(d-1)

(e-1)

Abb. 43d-e: Mangan- und Zinkgehalte im Sproß und Wurzel (Abb. 43d-1-43e-1) der mykorrhiziertenund unmykorrhizierten Pflanzen. Die vertikalen Balken geben den Minimal- und Maximalwert(Meßwertbereich) an (Wd= Waldboden; Sd= Sand; Bs= Bauschutt; Gm= Gemisch aus Bauschuttund Sand).

Tab. 10: Gegenüberstellung der pflanzenverfügbaren Schwermetalle in verschiedenen Böden (CaCl2-Extraktion, µg/100g Boden) und dem Schwermetallgesamtgehalt (HNO3-Aufschluß) im Sproß (Sp)und in der Wurzel (Wu) von mykorrhizierten Pflanzen (in µg/g Trockengewicht).

Waldboden Sand Bauschutt Gm-80/20% Gm-60/40%Boden Pflanzen Boden Pflanzen Boden Pflanzen Boden Pflanzen Boden PflanzenCaCl2 Sp Wu CaCl2 Sp Wu CaCl2 Sp Wu CaCl2 Sp Wu CaCl2 Sp Wu

Cd 0,0258 0,058 0,353 0,0016 0,056 0,167 0,0021 0,026 0,261 0,0019 0,014 0,206 0,0016 0,019 0,160

Pb 0,0253 0,197 12,930 0,0041 0,284 2,377 0,0084 0,438 40,158 0,0067 0,333 32,365 0,0061 0,361 30,202

Cu 0,0255 3,080 46,65 0,0070 6,263 89,18 0,2000 4,995 310,02 0,0830 5,642 262,37 0,0523 5,422 242,01

Mn 104,50 894,05 1332,6 20,650 1045,9 231,995 0,2975 92,931 98,714 0,4300 101,83 125,18 0,3325 123,32 133,59

Zn 0,5100 47,502 63,020 0,2175 25,865 41,603 0,2275 27,583 173,01 0,2350 24,178 100,67 0,2150 26,345 97,643

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Diskussion 88

4. Diskussion

Nachfolgend soll auf die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchungen zur

Verbesserung von Wiederaufforstungsmaßnahmen von extremen Standorten

eingegangen werden. Bei der mykorrhizabasierten Wiederaufforstung von Problem-

standorten wie Halden, Schuttflächen und Erosionsstandorten kommt unter anderem der

Auswahl der Pflanzen, der Optimierung der Bodenbedingungen und insbesondere dem

Screening geeigneter Mykorrhizapilze für die Inokulation eine besondere Bedeutung zu.

In diesem Zusammenhang wird im nachfolgenden Abschnitt die Entwicklung der

Isolationsmethoden, die Optimierung der in-vitro Mykorrhizierung in unterschiedlichen

Bodensubstraten und die Auswirkungen der Nähr- und Schadstoffe auf das Pflanzen-

wachstum wie auch der Mykobionten diskutiert. Die anatomische Ausbildung der

mykorrhizierten Kiefernwurzeln wird in die Diskussion eingebunden. Anschließend

wird die Entwicklung eines möglichen Modellsystems für Aufforstungsmaßnahmen von

extremen Standorten erörtert.

4.1. Selektion der Mykorrhizapilze und die Isolierung aus Fruchtkörpern undmykorrhizierten Wurzeln aus dem Freiland

Die Selektion geeigneter Mykorrhizapilze und die Entwicklung einer effektiven In-

okulationsmethode war ein wichtiger Faktor bei der vorliegenden Arbeit. Die erste

Voraussetzung war zunächst einen geeigneten Standort auszuwählen, wo der Boden-pH

im neutralen bis schwach alkalischen Bereich angesiedelt ist, um entsprechende

Mykorrhizapilze zu selektieren, da die für die Untersuchung verwendeten Boden-

substrate wie Bauschutt und Sand relativ hohe pH-Werte zwischen 7 und 8 aufwiesen.

Zur Gewinnung von Inokulationsmaterial war es notwendig, eine reproduzierbare und

schonende Methode zur Oberflächensterilisation von mykorrhizierten Wurzeln zu

entwickeln, wobei auf Ergebnisse von MOLINA und PALMER (1982) aufgebaut wurde,

um Reinkulturen entsprechender Pilzarten zu erhalten. Die Gewinnung von Rein-

kulturen aus Fruchtkörpern ist eine weniger arbeitsintensive Methode im Vergleich zur

Isolierung aus mykorrhizierten Wurzeln und es treten seltener Kontaminationen des

Inokulats auf.

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Diskussion 89

Die dabei erzielten Ausbeuten sind erfolgsversprechend, da aus dem Fruchtkörper

relativ steriles Gewebematerial entnommen werden kann. Dies ist insbesondere von der

Festigkeit des Fruchtkörpers abhängig, worauf auch MOLINA und PALMER (1982)

hinweisen. Es ist notwendig neu gebildetes Pilzmyzel in kurzer Folge auf frische Agar-

Platten zu überimpfen und in den folgenden Tagen die Agar-Platten zu kontrollieren,

um Kontaminationen durch Schimmelpilze zu vermeiden.

Im Gegensatz zur Isolation aus Fruchtkörpern fallen die Erfolge bei der Isolation von

mykorrhizierten Wurzeln von Pilz zu Pilz sehr unterschiedlich aus und liegen nur

zwischen 5-20%. Die Methode der direkten Myzelisolierung aus mykorrhizierten

Wurzeln findet insofern stärkere Beachtung, da auf diese Weise gewonnenes Myzel mit

Sicherheit von dem Pilz stammt, mit dem die ausgewählte Pflanze eine Mykorrhiza

ausgebildet hat (HOCK et al., 1984; HEINONEN-TANSKI & HOLOPAINEN, 1991).

Bei der Oberflächensterilisation mykorrhizierter Wurzeln spielen zwei wichtige

Faktoren eine entscheidende Rolle:

� die Konzentration des Hydrogenperoxids (MOLINA & PALMER, 1982) und

� die Sterilisationszeit (HEINONEN-TANSKI & HOLOPAINEN, 1991).

Die Hinweise aus der Literatur weisen auf unterschiedliche Konzentrationen des

Sterilisationslösung (z.B. Hydrogenperoxid, H2O2) und verschiedene Sterilisations-

zeiten (ZAK & BRYAN, 1963; ZAK & MARX, 1964; ZAK, 1973; MOLINA & PALMER,

1982) hin. MOLINA und PALMER (1982) sterilisierte die Oberfläche von mykorrhizierten

Wurzeln erfolgreich mit Hydrogenperoxid (30%igem H2O2, 5-20 sec.). Dabei ist die

Sterilisationszeit abhängig von der Dicke und Struktur des Pilzmantels sowie der

Morphologie der einzelnen Mykorrhizatypen. Desweiteren wurde z.B. von CHU-CHOU

(1979) und ZAK (1973) eine Methode zur Oberflächesterilisation von mykorrhizierten

Wurzeln z.B. mit Calciumhypochlorit (0,7 %) beschrieben.

Wie die in Abschnitt 3.1.1.1. dargestellten Ergebnisse zeigen, ist die Gefahr der

Kontamination bei der Gewinnung von Reinkulturen relativ groß, da die Oberflächen-

sterilisation zwar kontaminierende Mikroorganismen abtötet, die symbiotischen Pilze

jedoch nicht schädigen soll. Bei zu langer Sterilisationszeit (über 30 sec.) insbesondere

bei hohen Hydrogenperoxidkonzentrationen (über 25%) sterben die Pilzhyphen

mykorrhizierter Wurzeln schnell ab.

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Diskussion 90

Aus den Ergebnissen läßt sich folgern, dass z.B. für den Mykorrhizapilz R. roseolus

die reproduzierbar beste Konzentration für das Hydrogenperoxid zwischen 10%-15%

und die optimale Sterilisationszeit bei 10-20 sec. liegt. Der hier gefundene optimale

Konzentrationsbereich und die geeignete Sterilisationszeit entsprechen den Angaben

von HEINONEN-TANSKI & HOLOPAINEN (1991). Allerdings ist kritisch anzumerken, dass

trotz optimierter Methode der Oberflächensterilisation von mykorrhizierten Wurzeln

immer wieder unerwartete Kontaminationen durch Schimmelpilze und Bakterien

vorkommen können. In diesem Fall sollten die kontaminierten Proben so früh wie

möglich vorsichtig von den Agar-Platten entfernt und das neu gebildete Pilzmyzel

weiter auf frische Agar-Platten überimpft werden. Dies führt meist dann doch noch zu

einer kontaminationsfreien und sicheren Reinkulturgewinnung der Mykorrhizapilze.

4.2. Identifizierung der Mykorrhizapilze anhand von mykorrhiziertenWurzeln bzw. Fruchtkörpern

Viele Autoren versuchten, auf der Basis morphologischer Merkmale der unter-

schiedlichen Mykorrhizatypen ein Klassifikationsschema herzustellen. Bei diesem

Klassifikationsschema handelt es sich um leicht erkennbare morphologische Merkmale

wie Farbe, Struktur des Hyphenmantels, Existenz von Rhizomorphen und Cystidien.

AGERER (1995) versuchte charakteristische Merkmale von bestimmten Mykorrhizen

durch makroskopische und mikroskopische Methoden zu identifizieren. Bei der Analyse

von Pseudotsuga menziesii Ektomykorrhizen zeigte bereits ZAK (1973), dass der

morphologische Charakter wie z.B. die Farbe ein wichtiges Identifikations-merkmal

darstellt.

AGERER (1987) legte eine Sammlung ausführlicher Beschreibungen verschiedener

Ektomykorrhizatypen an. Mit Hilfe des Identifikationskataloges von AGERER &

RAMBOLD (1996) wurde versucht, verschiedene Pilze durch morphologische und

mikroskopische Merkmale zu identifizieren (s. Software Programm DEEMY; A

DELTA-based system of characterization and Determination of Ectomycorrhizae,

RAMBOLD & AGERER, 1997). Trotz der ausführlichen Beschreibungen der Charak-

teristika der verschiedenen Ektomykorrhizen durch AGERER und RAMBOLD (1996),

lassen sich diese anhand morphologischer Merkmale der mykorrhizierten Wurzeln nicht

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Diskussion 91

leicht und auch nicht eindeutig identifizieren. Hier bieten molekularbiologische

Bestimmungsverfahren ein Verbesserungspotential, um die Gattung oder die Art der mit

der Wurzel assoziierten Pilze zu identifizieren (REDECKER, 2000, arbuskulare

Mykorrhiza; PRITSCH et al., 1997, 2000, ektotrophe Mykorrhiza).

Die Methode der ITS-PCR ermöglicht die spezifische Vervielfältigung eines

variablen Bereiches der ribosomalen Gene, der jedoch innerhalb einer biologischen Art

konstant bleibt. Die Sequenzierung des ITS-Bereiches und der Vergleich der Sequenz

mit den Einträgen in der Datenbank des NCBI (National Center for Bioinformaties in

Maryland/USA) liefert bereits sehr zuverlässige Ergebnisse, da dort mehrere tausend

ribosomale Gensequenzen von Pilzen hinterlegt sind, was auch im Zusammenhang mit

dieser Arbeit genutzt wurde. Bei zu geringer Übereinstimmung mit den Referenzdaten

ist jedoch weiterhin eine Bestimmung nach morphologischen Kriterien unumgänglich.

4.3. In-vitro Inokulation

4.3.1. Entwicklung der in-vitro Inokulationsmethode (Petrischalen- und Nylon-Mesh-Methode)

Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war es, Mykorrhizapilze auszuwählen, deren

Einsatz das Baumwachstum auf extremen Standorten verbessert oder oft auch erst

ermöglicht. Hierfür war die Entwicklung einer Inokulationsmethode notwendig, um die

gewünschte Mykorrhizierung der Feinwurzeln der eingesetzten Kiefernsämlinge zu

gewährleisten. Dafür mußte ein System ausgewählt werden, das sowohl eine

kontinuierliche Beobachtung der mykorrhizierten Wurzeln als auch eine zuverlässige

Mykorrhizierung gewährleistet. Hierbei spielen ferner die Auswahl der entsprechenden

Ektomykorrhizapilzspezies und die Art des Inokulums eine wichtige Rolle (MARX &

KENNEY, 1982; MOLINA et al., 1999). Die von KOTTKE et al. (1987) und WONG &

FORTIN (1989) vorgeschlagene Petrischalen-Methode wurde für die Inokulierung von

Kiefernsämlingen angewendet. Die Anwendung dieser effektiven Petrischalen-Methode

zeigte mehrere Vorteile aber auch einige Nachteile.

Die Vorteile bestanden darin, dass während der Kultivierung kontinuierlich der

Entwicklungsverlauf, Mykorrhizierungsgrad und die Wachstumsgeschwindigkeit des

Wurzelsystems beobachtet werden konnten. Es war weiterhin gewährleistet, dass trotz

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Diskussion 92

der semisterilen Bedingungen keine Fremdinfektionen der Wurzeln auftrat. Dieses

System ist sowohl für Nadelbaumarten als auch für Laubbäume sehr gut geeignet, um

steril bzw. semisteril zu inokulieren (DUDDRIDGE, 1986; WONG & FORTIN 1989)). Diese

Petrischalen-Methode erwies sich auch für diese Arbeit als ein ideales System und

wurde daher für die Vorinokulation eingesetzt.

Ein Nachteil dieser Rhizotronsysteme war, dass die mykorrhizierten Wurzeln nach

der Kultivierungszeit am Rhizotron und am Kohlepapier anhafteten und die

Wurzelspitzen ins Innere des Kohlepapiers hinein gewachsen waren. Hierdurch wurde

eine unversehrte Entfernung der Wurzeln vom Kohlepapier erschwert. Ein Vorschlag

für experimentelle Untersuchungen wäre, die Wurzeln zusammen mit dem Kohlepapier

auf das Bodensubstrat zu übertragen und später (nach einer Woche) das Kohlepapier

mit Hilfe einer Pinzette vorsichtig zu entfernen. Es gibt eine Reihe von verschiedenen

Inokulationsmethoden (Petrischalen-Methode) zur sterilen bzw. semisterilen Inokul-

ation von Pflanzen, mit deren Hilfe eine erfolgreiche Mykorrhizierung erzielt werden

kann (s. Tab. 11).

Tab. 11: Zusammenstellung verschiedener Inokulationsmethoden (Petrischalen basiert) zursterilen bzw. semisterilen Inokulation von Pflanzen.

Methode Autor SubstratePetrischalen Methode

″Duddridge, 1986Kottke et al., 1987

Torf und VermikulitePerlite und Kohlepapier

Divided-Petri-Plate Methode Brownlee et al., 1983 Torf und VermikuliteSandwich Methode Chilvers et al., 1986 Agar NährmediumNylon-Mesh Methode Wong & Fortin, 1989 Agar Nährmedium

In der vorliegenden Arbeit wurde die von WONG und FORTIN (1989) entwickelte

Nylon-Mesh-Methode zur Mykorrhizierung der Kiefernsämlinge intensiv und mit einer

Reihe von Modifizierungen erprobt. Anstelle des Nylon-Netzes wurde steriles

Cellophane verwendet, das durchsichtig ist und leicht auf der Oberfläche des Agar-

Nährmediums anhaftet. Ein Problem, das bei Anwendung dieser Methode besonders

zum Tragen kommt, ist allerdings, dass unter nicht vollständig sterilen Bedingungen

Fremdorganismen stark aufwuchsen und die Mykorrhizierung zurückdrängten.

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Diskussion 93

Obwohl durch diese Methode eine relativ hohe Mykorrhizierungsrate (auf Agarnähr-

medium) erreicht wurde, war sie im Vergleich zur Petrischalen Methode arbeitsintensiv

und zeitaufwendig, da der gesamte Arbeitsvorgang unter sterilen Bedingungen durch-

geführt werden mußte. Aus diesem Grunde wurde die Petrischalen-Methode für die

weiteren Untersuchungen eingesetzt.

4.3.2. Inokulationsversuche mit Flüssigkulturen und entsprechende Vorbe-handlung der verwendeten Bodensubstrate (Vermiculit und Biokompost)

In der vorliegenden Arbeit wurde für die erfolgreiche Infektion und Mykorrhizierung

der Versuchspflanzen P. thunbergii und P. densiflora in nicht sterilisierten Boden-

substraten (Gemisch aus Vermiculit und Biokompost, 4:1 v/v) vegetatives Myzel aus

Flüssigkulturen von Pis. tinctorius und R. roseolus verwendet. Diese Methode bietet

bei der praktischen Anwendung den Vorteil, in einem großen System eine Vielzahl von

Pflanzen gleichzeitig inokulieren zu können.

Wie die Ergebnisse deutlich zeigen (s. Abschnitt 3.1.1.3), waren sowohl die

Kultivierung der ausgewählten Mykorrhizapilze Pis. tinctorius und R. roseolus im

Flüssigmedium als auch deren Inokulation mit den Pflanzen P. thunbergii und P.

densiflora erfolgreich. Auffallend ist, dass das Sproß/Wurzel-Verhältnis der mit R.

roseolus mykorrhizierten P. thunbergii Pflanzen höher (zugunsten des Sprosses

verschoben) ist als das der mit Pis. tinctorius mykorrhizierten Pflanzen insbesondere

im Vergleich zu nicht mykorrhizierten Pflanzen. Dieser Effekt auf das Sproß/Wurzel-

Verhältnis wurde mehrfach beschrieben, siehe, HARLEY & SMITH (1983).

Obwohl der Mykorrhizapilz Pis. tinctorius mit vielen Nadelgehölzen (z.B. Kiefer,

Fichte und Lärche) und Laubbäumen (z.B. Eiche, Buche und Eucalyptus) eine

Mykorrhiza ausbilden und eine Vielzahl von Lebensräumen (z.B. Waldgebiete mit

unterschiedlichen Böden, Garten und Ackerböden) besiedeln kann (MARX, 1977;

MALLOCH & KUJA, 1979; MEYER, 1987), zeigten die inokulierten P. thunbergii

Pflanzen mit dem von uns eingesetzten Stamm Pis. tinctorius unter den gegebenen

Kulturbedingungen eine im Vergleich zu R. roseolus geringe Mykorrhizierungsrate. So

war auch verständlicherweise ein niedriges Sproßtrockengewicht zu beobachten.

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Diskussion 94

R. roseolus wurde für die Inokulationsversuche aus frisch geernteten mykorrhizierten

Kiefernwurzeln (P. sylvestris) aus dem Freiland isoliert. Neben der möglicherweise

verbesserten Anpassung dieses Pilzes an die Versuchsgegebenheiten deutete das rasche

Wachstum des Pilzes und der gute Mykorrhizierungsverlauf auch auf einen sehr aktiven

physiologischen Zustand bei der beginnenden Mykorrhizierung hin (MOLINA & TRAPPE,

1994). Gute Wachstumsleistungen, die sich aus unterschiedlichen physiologischen

Aktivitäten ergeben, sind eine wichtige Voraussetzung bei der Auswahl von geeigneten

Mykorrhizapilzen für eine Aufforstung extremer Standorte (MEYER, 1987).

PARLADÉ et al., (1996) versuchten bei verschiedenen Pflanzen (Bodensubstrat;

Gemisch aus Vermiculit und Torf) die Mykorrhizierungsrate mit Isolaten aus dem

Freiland zu bestimmen (s. Tab. 12). Dabei konnte festgestellt werden, dass die

Mykorrhizierungsrate eine starke Abhängigkeit sowohl von der Pflanzenart als auch

dem eingesetzten Mykorrhizapilz zeigte.

Tab. 12: Mykorrhizierungsrate von verschiedenen Pflanzen mit unterschiedlichenMykobionten. Der Boden-pH bezieht sich auf die Fundstandorte der jeweiligen Pilze. C. sat=Castanea sativa; Q. sub= Quercus suber; P. syl= Pinus sylvestris; P. men= Pseudotsugamenziesii; P. nig= Pinus nigra; P. pin= Pinus pinaster; P. abi= Picea abies; P. con= Pinuscontorta; P. pon= Pinus ponderosa; P. rad= Pinus radiata.

Ausgangs- MykorrhizierungsrateMykorrhizapilze pflanzen

BodenpH P. men P. nig P. pin P. abi P. con P. pon P. rad

Paxillus involutus C. sat 4,7 3 nb 3 2 2 3 2Pisolithus tinctorius Q. sub 4,7 3 3 4 4 3 1 3Rhizopogon roseolus P. syl 7,2 1 1 3 nm nb nm 1Suillus bovinus C. sat 4,7 2 1 3 nb nb 2 1

* Mykorrhizierungsrate 1=1-25%, 2=26-50%, 3=51-75%, 4=100%, (nm= nicht mykorrhiziert, nb=nicht bestimmt), Quelle: PARLADÉ et al. (1996), anteilig geändert.

Das in der hier vorgelegten Arbeit verwendete Bodensubstrat, ein Gemisch aus

Vermiculit und Biokompost (4:1 v/v) wurde weder autoklaviert noch mit chemischen

Mitteln wie z.B. Methylbromide sterilisiert. Es wurde bei Raumtemperatur mehrere

Tage an der Luft getrocknet. Dieser einfache Trocknungsprozess hatte den Vorteil, dass

das Bodensubstrat keine Infektion durch Schimmelpilze aufwies. Es ist anzunehmen,

dass die Aktivität pathogener Pilze durch die Lufttrocknung gehemmt wurde.

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Diskussion 95

Dagegen zeigte die Sterilisation (Autoklavieren) einen negativen Effekt. Dabei

wurden die Molekülstrukturen von organischen Bestandteilen des Substrates zerstört

und vorhandene Nährstoffe in einen instabilen Zustand überführt und damit die

Infektionsgefahr durch Fremdorganismen (z.B. Schimmelpilze) erhöht, wobei die

Verdichtung des Bodens durch Autoklavieren verbessert werden konnte (SKINNER &

BOWEN, 1974). SOULAS et al., (1997) haben in anderem Zusammenhang verschiedene

Bodensterilisationsmethoden miteinander verglichen z.B. Sterilisation mit Sonnenlicht

(Solarization) und Sterilisation durch Dampf wie chemische Behandlung. Dabei

konnten sie feststellen, dass sich die Bodensterilisation mit Sonnenlicht sehr effektive

Ergebnisse lieferte und für eine anschließende gezielte Mykorrhizierung gut einsetzbar

ist. Weiterhin fällt nach Untersuchungen von PARLADÉ et al. (1999) das Wurzel-

wachstum nach einer chemischen Bodensubstrat-Sterilisation und die Mykorrhi-

zierungsrate im Vergleich zur Autoklavierung deutlich niedriger aus, so dass diese, im

Vergleich der unterschiedlichen Sterilisationsmethoden, am schlechtesten abschneidet.

Es ist zu vermuten, dass die Aktivität der in den eingesetzten Bodensubstraten

vorhandenen Mikroorganismen nach der Lufttrocknung nicht so stark gehemmt wurde,

aber diese auch einen guten Schutz vor Fremdinfektionen lieferte, daher wurde sie auch

für die in Verbindung mit dieser Arbeit durchgeführten Experimente eingesetzt.

4.3.3. Mykorrhizierungsfähigkeit

Angelegte Reinkulturen von Mykorrhizapilzen werden in der Regel über längere Zeit

auf Agarnährmedium kultiviert. Es ist zu beobachten, dass nach langen Kulturzeiten die

Fähigkeit zur Bildung von Mykorrhizen nachläßt. Um eine verbesserte Mykorrhi-

zierungsfähigkeit mit ausgewählten Pilzen zu erreichen, muß entweder auf Inokulum

aus frisch isolierten Pilzen zurückgegriffen werden oder, gerade wenn diese

Möglichkeit nicht besteht, muß über Pflanzenpassagen versucht werden, die Mykorrhi-

zierungsfähigkeit der vorhandenen Kulturen zu verbessern. In Verbindung mit den hier

durchgeführten Untersuchungen wie z.B. der Bestimmung der Mykorrhizierungsrate

konnte bei Einsatz der verwendeten Isolate von Pis. tinctorius eine Verminderung der

Mykorrhizierung beobachtet werden.

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Diskussion 96

TRAPPE (1977) hat in seinem Bericht über dieses Phänomen geschrieben, dass die

Hälfte der untersuchten Isolate von Pis. tinctorius die Mykorrhizierungsfähigkeit nach

3 Jahren Kultivierung auf Agarnährmedium verloren hatten. Eine Ursache hierfür

könnte eine Veränderung in der Aktivität der Enzymsysteme sein (TRAPPE, 1977). Aus

eigenen Beobachtungen geht hervor, dass P. thunbergii mit dem frisch isolierten

Mykorrhizapilz R. roseolus häufiger und besser eine Symbiose bildet, als mit dem seit

langem in Kultur befindlichen Mykorrhizapilz Pis. tinctorius.

4.3.4. Einfluß des pH-Wertes auf das Wachstumsverhalten der Pilzkultur

In einer ergänzenden Untersuchung wurde der Einfluß des pH-Wertes auf das

Myzelwachstum in MMN-Flüssigkulturen untersucht. Dabei sollte im Besonderen der

optimale pH-Bereich ermittelt werden, bei dem das Pilzmyzel das beste Wachstum

zeigt, um daraus Schlussfolgerungen für die Einsatzmöglichkeiten zu ziehen. Bei den

beiden eingesetzten Pilzen war dies der pH-Bereich von 6. Jedoch zeigten die

Pilzkulturen auch in extremen pH-Bereichen (pH 2 bis 4 und pH 8 bis 9) ein noch

erkennbares Wachstum (s. Abb. 16), wenn auch mit graduellen Unterschieden. MOLINA

et al. (1999) berichtete, dass der von Rhizopogon tolerierte pH-Bereich im Kultur-

medium zwischen 3,5 bis 6,8 lag. R. roseolus wurde in Spanien sogar bei Boden pH-

Werten von 7,2 gefunden (PARLADÉ et al., 1996). Pis. tinctorius wächst ebenfalls im

neutralen bis schwach alkalischen Bodenmilieu (MARX & KENNEY, 1982), so dass die

beiden eingesetzten Pilzarten bezogen auf die Rahmenbedingungen der Versuche als

gut geeignet eingestuft werden können.

HUNG und TRAPPE (1983) berichten, dass einzelne Mykorrhizapilze und von diesen

auch verschiedenen Isolate unterschiedlich auf pH-Werte reagieren. Insbesondere Pis.

tinctorius und R. roseolus wurden von diesen Arbeiten als Pilze ausgewiesen, die in

neutralen bis schwach alkalischen Kulturmedien besser wuchsen als in sauren, was sich

durch die hier durchgeführten Experimente bestätigte. In diesem Zusammenhang ist

jedoch zu berücksichtigen, dass insbesondere ektotrophe Mykorrhizapilze die Fähigkeit

haben, Nährstoffe in besonderem Maße zu mobilisieren (GEORGE & MARSCHNER,

1996), was u. a. mit einer intensiven Protonenabgabe zusammenhängt, die an eine hohe

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Diskussion 97

Atmungsintensität gekoppelt ist (HOCK et al., 1984). Dies kann im Umfeld der Hyphen,

in der sogenannten Mykorrhizosphäre, zu deutlich niedrigeren pH-Werten führen als im

gesamt gemessenen Bodensubstrat. Die beobachteten pH-Wert-Verschiebungen führten

zum Aufbau des erforderlichen elektrochemischen Potentials für die Ionenaufnahme in

die Pilzzelle (HOCK et al., 1984). Bei Experimenten in Nährlösung führte die

Protonenabgabe wie auch die Aufnahme pH-beeinflussender Ionen zu deutlich

meßbaren pH-Veränderung in der Nährlösung. Bezogen auf das Geschehen in der

Mykorrhizosphäre verdeutlicht dies, dass der pH-Toleranzbereich der Pilze weiter zu

fassen ist, als aus den Experimenten mit Nährlösungen zu ersehen ist.

4.3.5. In-vitro Mykorrhizierungsverlauf

Im Folgenden soll der zeitliche Verlauf und die Ausbildung der in-vitro Mykorrhi-

zierung auf der Ebene der einzelnen Wurzeln anhand makroskopischer Aufnahmen

diskutiert werden (s. Abb. 29a-29g). In den vorliegenden Untersuchungen konnten die

morphologischen Veränderungen bei der in künstlichen Systemen synthetisierten

Mykorrhizabildung über den gesamten Zeitraum gezeigt werden. Das Rhizotronsystem

von KOTTKE et al. (1987) und WONG & FORTIN (1989) für die in-vitro Mykorrhizierung

(Petrischalen-Methode) war das, für die hier durchgeführten Versuche, geeignetste

Verfahren für die direkte, kontinuierliche Beobachtung des Wurzelwachstums, wobei

auch Entwicklungsabläufe und Wachstumsgeschwindigkeiten der untersuchten P.

thunbergii/ Pis. tinctorius-Mykorrhiza registriert werden konnten.

Es ist kaum möglich, die Entwicklung des Mykorrhizierungsablaufes in allen Ein-

zelheiten zu verfolgen (BEHRMANN, 1995). Deshalb müssen die einzelnen Ent-

wicklungsstadien im in-vitro System exemplarisch durch die Beobachtung und

Dokumentation verschiedener individueller Wurzeln verfolgt werden. Die angegebenen

Zeiträume der verschiedenen Entwicklungsstadien haben keine Allgemeingültigkeit, da

innerhalb eines Rhizotrons nebeneinander verschiedene Entwicklungsstadien der

Kurzwurzelentwicklung und der Mykorrhizierung zu beobachten sind (BLASCHKE,

1986). Die Zeitangaben von der Inokulation bis zur beobachteten Entwicklung der

Mykorrhiza schwanken in der Literatur von wenigen Tagen bis zu mehreren Wochen

(VAARIO et al., 1999; WONG & FORTIN, 1989; TAM, 1994).

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Diskussion 98

Die hier vorgelegten Ergebnisse der Entwicklung des Mykorrhizierungsverlaufes von

P. thunbergii mit Pis. tinctorius beziehen sich auf einen Zeitraum von ca. 20-25 Tagen

nach der Inokulation (s. Abb. 29a-29g).

Die erste Voraussetzung für eine erfolgreiche Mykorrhizierung ist das Auswachsen

von Pilzhyphen aus dem Inokulum und die Kontaktaufnahme (Abb. 29a-29b) zwischen

Pilz und Wurzel (PETERSON & FARQUHAR, 1994, BONFANTE et al., 1998). Ein ziel-

gerichtetes Hyphenwachstum dürfte von der Stimulanz durch Wurzelexsudate abhängig

sein, die aus für den Pilz essentiellen Kohlenhydraten, Aminosäuren, organischen

Säuren und anderen Substanzen bestehen und einen chemotaxischen Reiz auf den Pilz

ausüben (KOTTKE & OBERWINKLER, 1986). Es ist noch nicht bestätigt, welche

Substanzen und in welcher Weise die wachstumsstimulierende Wirkung auf die

Pilzhyphen ausüben (PETERSON & FARQUHAR, 1994).

Die hier vorgelegten Ergebnisse zeigen (Abb. 29c), dass zwischen Wurzel und Pilz

normalerweise ein lockeres Hyphenwachstum stattfand, das nur an wachsenden

Wurzelspitzen zu einer Mykorrhiza führte. Die Entwicklung eines oberflächlichen

Hyphenwachstums zu einem vollständigen Hyphenmantel und einer etablierten

Mykorrhiza beginnt im apikalen Bereich der Kurzwurzel (Abb. 29d). Die Bildung von

Myzelsträngen bei Pis. tinctorius wurde besonders deutlich (s. Abb. 29e). Pis.

tinctorius bildet zahlreiche Rhizomorphen aus, die beim Wasser- und Nährstoff-

transport für die Pflanzen eine große Rolle spielen (DUDDRIDGE et al., 1980) und zur

Ausbreitung des Pilzes im Substrat wesentlich beitragen.

Die Wiederaufnahme des Wurzellängenwachstums (s. Abb. 29f) nach einer

Ruhephase führte zu einem Durchwachsen des Mykorrhizamantels einer älteren

Kurzwurzelspitze wie dies auch von BLASCHKE (1986) beobachtet wurde. In der Regel

ist dabei die Wurzelspitze nicht mykorrhiziert und durch ihre abgerundete Form

gekennzeichnet (WILSON & HARLEY, 1983). Beim Erneuerungswachstum und

Regeneration aus einer älteren Kurzwurzelspitze fehlt der Hyphenmantel (BLASCHKE,

1986). Obwohl dichotome Verzweigungen auch vereinzelt in unmykorrhizierten

Wurzelsystemen auftraten, wurden sie besonders häufig an mykorrhizierten

Kurzwurzeln (s. Abb. 29g) beobachtet (speziell bei der Ausbildung von Mykorrhiza-

Clustern) (TAM, 1994). Bei der Ektomykorrhiza variieren die Art der Wurzel-

verzweigung, die Ausbildung des Hartigschen Netzes sowie die Mantelstärke, -struktur

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Diskussion 99

und -farbe stark in Abhängigkeit von den Umweltbedingungen, der Pilzart und dem

Entwicklungsstadium (MOLINA & TRAPPE, 1994).

4.4. Chemische Charakterisierung der Bodensubstrate und der Pflanzen

4.4.1. Bodenchemische Kennwerte

Die im Labor gewonnenen chemischen Daten der Bodensubstrate werden hier

besprochen. Vor allem soll diskutiert werden, welche Zusammenhänge und Aus-

wirkungen von Bodenchemismen bezogen auf mykorrhizierte wie unmykorrhizierte

Pflanzen unter Kulturbedingungen bestehen.

Der pH-Wert eines Bodens ist einer der wichtigsten und am häufigsten verfügbaren

Kenngrößen. Er beeinflusst die Gehalte an austauschbaren und damit potenziell

pflanzenverfügbaren Nährstoffen aber insbesondere auch der Schwermetalle (HERMS &

BRÜMMER, 1980). Mit steigendem pH-Wert (Alkalisierung) werden die Mikronährstoffe

wie Mn, Cu, Zn, und B weniger pflanzenverfügbar. Bei niedrigem pH-Wert

(Versauerung) wird die Löslichkeit der Schwermetalle wie z.B. Pb und Zn, aber auch

Al, die an organischen Materialien und Tonmineralien gebunden sind, erhöht

(SCHEFFER & SCHACHT- SCHABEL, 1992).

Aus den in Abb. 17 dargestellten Ergebnissen geht hervor, dass die pH-Werte des

eingesetzten Waldbodens im schwach bis mittel sauren Bereich lagen. Auffallend war,

dass die zu Versuchsende gemessenen pH-Werte der Waldbodenexperimente einen pH-

Wert von 6,0 (CaCl2) aufwiesen und somit um ca. 0,4 pH-Einheiten höher als zu

Versuchsbeginn lagen. Dies kann wohl vor allem auf das Gießen mit Leitungswasser,

das einen schwach bis mäßig alkalischen pH-Wert (7,5-7,8) hat und den damit

verbundenen Ioneneintrag zurückzuführen sein. Im Vergleich zum Waldboden liegen

die pH-Werte von Sand, Bauschutt und Bauschutt/Sand-Gemischen im schwach bis

mäßig alkalischen Bereich. Die relativ hohen pH-Werte insbesondere von Bauschutt

und Bauschutt/Sand-Gemischen, sind vergleichbar mit den durch MEUSER (1993, 1996)

in Bauschutt (Gemenge aus Ziegel, Mörtel und Beton), sowie BLUME (1992) und

HILLER (1996) in Bauschutt/Sand-Gemischen ermittelten Daten (pH 7-8). Der pH-Wert

des Bodens spielt vor allem auch für Zustandekommen von Ektomykorrhizen eine

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Diskussion 100

wichtige Rolle. Eine Bildung von Mykorrhizen ist vor allem in schwach bis mäßig

saurem Milieu häufig zu beobachten (MARX et al., 1991), obwohl einzelne Pilzspecies

sowohl in Kalk- als auch in sauren Böden vorkommen wie z.B. S. bovinus und Pis.

tinctorius (MARX & ZAK, 1965; HUNG & TRAPPE, 1983). Trotz des für die ausge-

wählten Mykorrhizapilze ungünstigen pH-Wert Bereiches in den Versuchsböden konnte

in allen Versuchsansätzen, zwar abhängig von der eingesetzten Pilzspecies, eine

Mykorrhizierung nachgewiesen werden, wobei in den einzelnen Versuchsansätzen

erstaunlicherweise nur geringe Unterschiede im Mykorrhizierungsgrad erkennbar

waren. Die hier vorgelegten Ergebnisse weisen darauf hin, dass durch den Einsatz von

ausgewählten Pflanzen und geeigneten Mykorrhiza-Symbiosepartnern, die an den pH-

Wert Bereich (> 7) der Böden angepasst sind, Wiederaufforstungsmaßnahmen an

extremen Standorten ermöglicht bzw. verbessert werden können. Das beinhaltet, dass

insbesondere Mykorrhizapilze von schwach alkalischen Standorten isoliert und durch

optimierte Inokulationsmethoden zum Einsatz gebracht werden müssen.

Phosphat als wichtiges Makronährelement liegt in vielen Böden in organischer Form

vor und ist so für die Pflanze nicht direkt verfügbar. Extrazellulare Phosphatasen, die

insbesondere von Mykorrhizapilzen (ALVAREZ, 2001) aber auch Wurzeln abgegeben

werden, ermöglichen die Freisetzung von Phosphat, so dass dieses über den Pilz aber

auch über die Wurzeln direkt aufgenommen werden kann (MENGEL, 1991). Es hat sich

gezeigt, dass Mikroorganismen (z.B. Pilze und Bakterien), die sich in unmittelbarer

Wurzelnähe, der Rhizosphäre, befinden, bei der Phosphorversorgung der Pflanze von

entscheidender Bedeutung sind (GISI, 1990). Wie effektiv und langanhaltend

Mykorrhziapilze zur Phosphatversorgung der Wirtzpflanzen beitragen kann, wurde in

jüngster Zeit von ALVAREZ (2001) aufgezeigt. Bezogen auf die in dieser Untersuchung

eingesetzten Bodenvarianten ist bezüglich ihrer Phosphatgehaltes folgendes anzu-

merken.

Die Ergebnisse der CAL-Extraktionen der Bauschuttvarianten zeigen große Mengen

an pflanzenverfügbaren P-Verbindungen (22,5 mg P2O5/100g Boden). Dagegen ist der

Phosphatgehalt des Waldbodens mit 7,6 mg P2O5/100g als durchschnittlich anzusehen

(s. Abb. 19). In Mineralböden für Acker- und Grünlandbewirtschaftung (Richtwerte für

Weser-Ems, Gehaltsklasse B) können Phosphatgehalte von 7-15 mg P2O5/100g Boden

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Diskussion 101

für eine Pflanzenversorgung als ausreichend angesehen werden (FINCK, 1989). Der hohe

pflanzenverfügbare Phosphatgehalt im Bauschutt ist vorwiegend auf technogene

Substrate wie z.B. Aschen (pH-Wert > 7) zurückzuführen, die generell einen hohen

Phosphatgehalt aufweisen (HILLER, 1995). Die Löslichkeit des Phosphats im Boden ist

vor allem vom pH-Wert und den austauschbaren Kationen abhängig. Dabei verhält sich

Phosphat in Teilen ähnlich wie Mikronährstoffe, da die Konzentration von Phosphat in

der Bodenlösung bei pH-Werten über 6 abnimmt (JUNGK & CLAASSEN, 1989; SCHEFFER

& SCHACHTSCHABEL, 1992; ZORN & KRAUSE, 1999).

Trotz der hohen pH-Werte in den Bauschuttvarianten, wurden relativ hohe Gehalte

an verfügbarem Phosphat in diesen Substraten nachgewiesen. Da Mykorrhizapilze nur

bei niedrigem Phosphatangebot einen positiven Einfluss auf die Phosphatversorgung

der Pflanzen ausüben, kann in diesem Fall davon ausgegangen werden, dass die

Mykorrhiza keinen Einfluss darauf hat und vielleicht sogar eine Wachstumsreduktion

der Pflanzen nach sich ziehen kann, die dann bei optimaler Nährstoffversorgung der

Pflanzen auf die Kohlenhydrat-Ansprüche der Mykobionten zurückzuführen ist (PENG

et al., 1993). In den Bauschuttvarianten wurden bei ausreichendem P-Angebot

allgemein niedrigere Mykorrhizierungsraten festgestellt. Eine eventuell antagonistische

Wirkung zwischen den beiden Symbionten wäre demzufolge herabgesetzt, so dass die

Pflanzen nicht beeinträchtigt werden.

Kalium (K) als essentielles Nährelement ist für die Pflanzen von wesentlicher

Bedeutung für die Aufrechterhaltung und Regulation des Wasserhaushaltes, für den

Stofftransport und ist weiterhin als Co-Faktor an Enzymreaktionen beteiligt. Aus der

Abbildung 20 ist ersichtlich, dass der CAL-lösliche K-Gehalt im Bauschutt im

Vergleich zum Waldboden (4,4 mg K2O/100g Boden) und Sand (0,7 mg K2O /100g

Boden) sehr hoch ist (23,3 mg K2O/100g Boden). Dies ist ebenfalls auf die hohen

Anteile von technogenen Substraten (z.B. Aschen) zurückzuführen (HILLER, 1995). In

Ackerböden (humusreicher Sand) werden allgemein K-Gehalte von 7-12 mg K2O/100g

(Richtwerte der LUFA Oldenburg, Gehaltsklasse B) als normal angesehen (FINCK,

1989). Der hohe K-Gehalt im Bauschutt kann möglicherweise eine antagonistische

Wechselwirkung in Bezug auf andere Nährstoffe (z.B. Mg) bewirken und die Verfüg-

barkeit für Magnesium und andere Nährelemente herabsetzen (MENGEL, 1991).

Entsprechende Tendenzen bezüglich des Magnesiumgehaltes konnten in den Bauschutt-

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Diskussion 102

varianten festgestellt werden. Das aufgrund einer erniedrigten Bioverfügbarkeit für

Nährstoffe das Wachstum der Pflanzen vermindert werden kann, zeigten Vergleiche mit

dem Waldboden. So waren in der Waldbodenvariante im Vergleich zu den Bauschutt-

varianten die Biomassezuwächse an den Pflanzen deutlich höher.

Bauschutt und Bauschutt/Sand-Gemischen weisen weiterhin hohe Kohlenstoffgehalte

auf, da diese zu einem großen Teil aus carbonathaltigem bzw. alkalisierendem,

technogenem Ausgangssubstrat aufgebaut sind. Anorganischer Kohlenstoff (Canorg-

Gehalt) ist im Waldboden und im Sand nur in sehr geringer Menge nachweisbar (s.

Abb. 22), während Bauschutt und Bauschutt/Sand-Gemische einen relativ hohen

anorganischen Kohlenstoffgehalt aufweisen. Im Waldboden und Sandsubstrat sind nur

niedrigere Calciumcarbonatgehalte (CaCO3) nachgewiesen worden, im Gegensatz zum

Bauschutt, der 6- bis 11-fach höhere Canorg-Gehalte aufweist. Diese sind für den hohen

pH-Wert und die hohe pH-Pufferkapazität im Bauschutt verantwortlich (s. Tab. 6).

Es konnte festgestellt werden, dass die vom Elementaranalysator (CNS-2000, Fa.

LECO) abgeleiteten Ct-Gehalte im Bauschutt durch teilweise miterfasste Holz- und

Kohleanteile besonders hoch ausgefallen sind, was für technogene Substrate typisch ist,

da sie oft fossile organische Substanzen wie Kohle, Koks und Holzkohle enthalten

(HILLER, 1996). Die im Waldboden bestimmten Corg-Gehalte (9,91 %) entsprechen

nahezu den von NEITE (1989) ermittelten Werten für Buchenwald (9,4 %) und geben

zum überwiegenden Anteil auf totes biologisch abbaubares Pflanzenmaterial zurück. In

diesen biologischen Recycling-Prozess sind die Mykorrhizapilze in besonderem Masse

einbezogen und versorgen darüber auch ihre Wirtzpflanzen mit Nährstoffen.

So ist auch bekannt, dass Stickstoff (N) in Böden zu über 95 % nicht pflanzen-

verfügbar in organischen Verbindungen vorliegt. Pflanzen können Stickstoff nur in

Form von anorganischen Verbindungen aufnehmen, d.h. es muss vorher eine N-

Mineralisierung durch mikrobielle Umwandlung stattfinden. Dabei wird N-Minerali-

sierung durch verschiedene Faktoren wie z.B. Wassergehalt, Temperatur, C/N-

Verhältnis und pH-Wert im Boden beeinflußt.

Das Verhältnis des organischen Kohlenstoff-Gehaltes zum Gesamtstickstoff-Gehalt

(C/N-Verhältnis) ist eine wichtige Potenziel-Kenngröße für die mikrobielle Aktivität

im Boden. C/N-Verhältnisse von 10-20 werden in Bezug auf eine ausreichende

Freisetzung von org. gebundenem Stickstoff als durchschnittlich angesehen (SCHEFFER

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Diskussion 103

& SCHACHTSCHABEL, 1992). Die hier festgestellten C/N-Verhältnisse von 20 bei

Waldboden entsprechen somit einer ausreichenden Versorgung. Dagegen weisen die

C/N-Verhältnisse im Bauschutt und den Bauschutt/Sand-Gemischen aufgrund der

niedrigen Corg-und N-Gehalte ein ökologisch ungünstiges Verhältnis auf, was zu einem

geringen Pflanzenwachstum und niedriger bodenbiologischer Aktivität führt.

Dabei ist in besonderen Masse zu berücksichtigen, dass die fossilen organischen

bzw. pyrolytisierten C-Verbindungen das C/N-Verhältnis bezogen auf die Erfassung der

mikrobiologischen Abbaupotenzials in Abhängigkeit von deren Anteil verschieden und

zudem auch durch deren geringen N-Gehalt schwer werten lassen (s. Abb. 23). Deshalb

kann das C/N-Verhältnis (s. Abb. 24) für die verwendeten Substrate zur Beurteilung der

mikrobiellen Aktivität nur bedingt herangezogen werden. Die ermittelten C/N-

Verhältnisse im Bauschutt und den Bauschutt/Sand-Gemischen entsprechen den von

BLUME (1992) dokumentierten Werten von 20 bis 39. Die gefundenen Mykorrhi-

zierungsraten in den Bauschuttvarianten liegen bei 24-34% und sind damit eher im

schwach mykorrhizierten Bereich anzusiedeln.

In der Regel entwickelt sich eine Mykorrhiza optimal bei einem Mangel an

pflanzenverfügbaren Stickstoff- und Phosphatgehalten im Boden. Liegt allerdings ein

zu großer Stickstoffmangel vor, wird auch die Mykorrhizabildung gehemmt. Steht

dagegen Stickstoff in Form von Ammonium- wie organischen Verbindungen in

genügender Menge, auch bei gleichzeitigem Phosphatmangel, zur Verfügung, so kann

die Mykorrhiza gut ausgebildet werden. Jedoch bei ausreichendem Phosphatangebot,

unabhängig vom Stickstoffgehalt, wird die Bildung der Mykorrhiza eingeschränkt

(MEYER, 1962). Bei der Ausbildung der Mykorrhiza stellt das Phosphatangebot den

limitierenden Faktor dar. So kann bezogen auf die Deutung der erhaltenen Ergebnisse

festgestellt werden, dass der niedrige Mykorrhizierungsgrad auf die für die Ernährung

von Pflanzen als ausreichend anzusehenden Phosphatgehalte (22,5 mg/100g Boden)

zurückgeführt werden kann.

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Diskussion 104

4.4.2. Pflanzenverfügbare Nährstoffmengen im Boden

In der vorliegenden Arbeit wurde die pflanzenverfügbaren Nährstoffmengen von K+,

Ca2+, Na+ und Mg2+ in verschiedenen Böden untersucht. Gegenüber der Gesamtmenge

ist die Menge der in der Bodenlösung vorkommenden bzw. extrahierbaren Ionen

normalerweise äußerst gering (GISI, 1990). Für die Beurteilung des Nährstoffpotenzials

eines Bodens ist jedoch der pflanzenverfügbare Ionenanteil sehr wichtig (MENGEL,

1991), da die Bestimmung des Gesamtgehaltes nur bedingt den pflanzenphysiologisch

relevanten Elementgehalt wiedergibt. Die Nährstoffaufnahme ist nicht nur vom

Nährstoffstatus im Boden, sondern auch vom artspezifischen Aufnahmevermögen der

einzelnen Pflanzen wie auch der Mykorrhizapilzpartener abhängig (LYR et al., 1992).

Die Pflanze kann das Bodenmilieu aktiv beeinflussen, sie gibt z.B. H+-Ionen und

Chelatoren ab, um Nährstoffe, insbesondere Kalium, Calcium, Magnesium und

Phosphat aufnehmen zu können, oder sie bedient sich der Mykorrhiza, bei der die

Pilzpartner in der Lage sind, für die Pflanze nicht erreichbare Nährstoffe verfügbar zu

machen (GEORGE & MARSCHNER, 1996).

Die Ergebnisse der pflanzenverfügbaren Nährstoffmengen von K+, Ca2+, Na+ und

Mg2+ in den untersuchten Böden und insbesondere in den Bauschutt und in der

Bauschutt/Sand-Gemischen deuten darauf hin, dass diese Substrate im Gegensatz zum

Waldboden für das Pflanzenwachstum nur bedingt geeignete bodenchemische

Eigenschaften besitzen (s. Abb. 25a-25d). Mit Ausnahme von Magnesium (Mg) weisen

Bauschutt und die Bauschutt/Sand-Gemische im Vergleich zum Waldboden die 4-

fachen Kalium-, die 10-fachen Calcium- und die 10-fachen Natrium-Gehalte auf. Diese

sehr hohen Gehalte an austauschbaren Kationen insbesondere Calcium und Natrium

(Wasserextrakt) im Bauschutt können auf die technogenen Ausgangssubstrate wie z.B.

Ziegel, Mörtel und Beton zurückgeführt werden und stehen in Übereinstimmung mit

den Ergebnissen von HILLER (1996).

Während der hohe K- und Ca-Gehalt in sehr heterogenen Bauschuttgemengen wohl

keine schädigende Wirkung auf das Wachstum der Pflanzen und des eingesetzten

Mikroorganismen hat, könnte insbesondere der hohe Na-Gehalt (Salzeffekt) einen

negativen Effekt auf das Wachstum von Pflanzen und auch des Mykorrhizapilzes

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Diskussion 105

ausüben. Extrem hohe Salzkonzentrationen im Boden wirken auf Mikroorganismen

insbesondere auf die Mykorrhizapilze schädlich und führen zur Reduktion des

Pilzwachstums (REDDELL, 1986; DIXON et al.,1993), obwohl Mykorrhizapilze wie z.B.

Pis. tinctorius bei hohen Salzkonzentrationen durchaus wachsen können (NAGARAJAN

& NATARAJAN, 1999). Daher ist es wichtig bei Wiederaufforstungs- und insbesondere

Rekultivierungsmaßnahmen mit Bäumen Pilze je nach Bodengegebenheiten (z.B.

bezogen auf Salztoleranz hin) zu selektieren und so Inokula zu entwickeln, die ein

Pflanzen- und insbesondere Baumwachstum auf z.B. auch salzbelasteten Standorten

(z.B. Küstenregionen) ermöglichen und gewährleisten (PERRY et al., 1987).

Wie in der Tabelle 7 zu erkennen ist, sind insbesondere hinsichtlich der Calcium-

Konzentrationen im Bauschutt große Unterschiede zwischen der Extraktion mit H2O

und NH4Cl sowie dem Schüttel-Extrakt mit Ammoniumlaktatessigsäure festzustellen.

Dies zeigt auf, dass die Freisetzung der Kationen im Boden nicht unwesentlich von der

Extraktionsmethode und dem Extraktionsmittel abhängig ist (MEIWES et al., 1984), was

die Beurteilung der Pflanzenverfügbarkeit schwierig macht. Im Gegensatz zu den

vorliegenden Ergebnissen konnte PRENZEL (1982) aus einem Waldboden eine größere

Menge Kationen mit Wasser als mit NH4Cl extrahieren, was eventuell auch auf die Art

der Durchführung (Perkolationsverfahren) zurückzuführen ist. Insbesondere ist zu

berücksichtigen, dass die Wurzeln wie auch die aufnehmenden Pilze durch Abgabe von

Protonen, organischen Säuren sowie Enzymen die Ionenverfügbarkeit in der

Rhizosphäre in erheblichem Maße beeinflussen können. Aus diesem Grund ist die

Aussagekraft der verschiedenen Extraktionsverfahren gerade im Zusammenhang mit

besonderen Gegebenheiten kritisch zu betrachten.

4.4.3. Kationengesamtgehalte in Sproß und Wurzel mykorrhizierter Pflanzen

Zur Untersuchung des Mineralstoffhaushaltes der Pflanzen wurden die

Gesamtgehalte der Nährelemente von Sproß und Wurzeln mykorrhizierter Pflanzen

herangezogen. Die Mineralsalze werden von der Wurzel aus der Bodenlösung in Form

von Kationen oder Anionen aufgenommen. Es wird angenommen, dass die Wurzeln

über die Abscheidung von H+ bzw. OH– (oder HCO3– ) im Überschuss aufgenommenen

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Diskussion 106

Kationen bzw. Anionen ausgleichen (MENGEL & STEFFENS, 1982), wobei Überschuß

bedeutet, dass die Summe aller aufgenommenen Kationen die Summe aller

aufgenommenen Anionen übersteigt (Kationenüberschuß) bzw. umgekehrt (Anionen-

überschuß), was ganz wesentlich dann auch wieder den pH-Wert insbesondere im

Rhizosphärenbereich beeinflusst.

Die vorliegenden Ergebnisse zeigen (s. Tab. 9 und Abb. 41a), dass Kalium (K+) im

Sproß bei allen Bodenvarianten - mit Ausnahme des Waldbodens - in höherer

Konzentration als in den Wurzeln angereichert ist. Diese relativ hohen K-Gehalte im

Sproß - insbesondere auf Bauschutt und den Bauschutt/Sand-Gemischen - könnten auf

einen erhöhten Bedarf an diesen Ionen in den photosynthetisch aktiven Teilen der

Pflanze (Förderung der Wasseraufnahme von Wurzeln durch eine aktive Beteiligung an

der Öffnung und dem Schließen der Stomata) zurückgeführt werden (SIEGHARDT, 1987;

MENGEL, 1991). Weiterhin könnte dies eine Folge des hohen Salzgehaltes im Bauschutt

sein. Nach Untersuchungen von CLARKSON und HANSON (1980) wird Kalium von den

Pflanzen im höchsten Ausmaß aufgenommen und dient den Zellen auch zur Einstellung

des osmotischen Werte. Nach Angabe von MENGEL (1991) kann K-Mangel im Boden

(z.B. in Sand) auf verschiedenen Ebenen die Photosynthese und den Wasserhaushalt

von Pflanzen beeinträchtigen. Es ist anzunehmen, dass die hier untersuchten Pflanzen

im Sandsubstrat unzureichend mit Kalium versorgt waren, worauf auch die ermittelten

Gehalte hindeuten (Sproß 4,81 mg/g TG und Wurzel 3,66 mg/g TG). Auf einen K-

Mangel weisen auch das verringerte Sproßwachstum und die Aufhellung der Nadeln hin

(s. Abb. 36b). Bei grünen Pflanzen ist ein K-Gehalt unter 15 mg/g TG als Mangel-

zustand zu werten. Kaliumkonzentrationen von 20-60 mg/g TG sind hinsichtlich der

Nährstoffversorgung als ausreichend zu bezeichnen (BERGMANN, 1993). K-Mangel

steht des weiteren im Zusammenhang mit einem gestörtem Wasserhaushalt (GEORGE &

MARSCHNER, 1996).

Es ist bekannt, dass mykorrhizierte Pflanzen besser wachsen als unmykorrhizierte,

was besonders auf eine bessere Nährstoffversorgung zurückzuführen ist, obwohl dies

noch kontrovers diskutiert wird. ELTROP (1993) untersuchte in diesem Zusammenhang

die Nährstoffgehalte der Nadeln unmykorrhizierter und mykorrhizierter Fichten in

verschiedenen Böden, wie z.B. auf Torfsubstrat und im Sand mit Durchflußnährlösung.

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Diskussion 107

So zeigten die Experimente, dass die mit Pax. involutus mykorrhizierten Fichten in

Torfsubstrat besser gewachsen (Trockengewicht) waren und höhere K-Konzentrationen

in den Nadeln aufwiesen als die unmykorrhizierten Pflanzen. Ein weiteres Ergebnis von

ELTROP (1993) war, dass sich die Mykorrhizierungsrate der mit Pax. involutus

mykorrhizierten Pflanzen mit steigendem Nährstoffangebot verringerte.

Im Vergleich zu den anderen Kationen ist der Calciumgehalt (Ca2+) der Böden im

allgemeinen relativ hoch. Calcium ist ein essentieller Nährstoff, der vor allem für die

Zellwandbildung bei der Neubildung und dem Wachstum von Geweben, wie auch den

Wurzelspitzen, wichtig ist (TÜRK et al., 1993). Aus den vorgelegten Analysedaten von

Sproß und Wurzeln geht hervor, dass die Calciumkonzentration in den Wurzeln

insbesondere im Bauschutt und den Bauschutt/Sand-Gemischen gegenüber den Pflanzen

in Waldboden deutlich erhöht ist (s. Abb. 41b u. Tab. 9). Trotz der hier gemessenen

hohen pflanzenverfügbaren Ca-Gehalte im Boden (s. Abb. 25b u. Tab. 7) sind in den

Pflanzen verhältnismäßig geringe Calciummengen meßbar. Dieses Ergebnis stimmt mit

den Aussagen von MENGEL (1991) überein, der die geringe Aufnahme von Ca auf die

Schwerlöslichkeit des Calciums im Boden zurückführt. Weiterhin ist die geringe Ca-

Aufnahme in die Pflanzen (z.B. Mais- und Bohnenkeimpflanzen) auch dadurch

begründet, dass Calcium fast nur über die Wurzelspitzen aufgenommen werden kann

(MARSCHNER & RICHTER, 1974; TÜRK et al., 1993), da es nahezu ausschließlich über

den apoplastischen Weg vor der Ausdifferenzierung der Endodermis in den

Zentralzylinder gelangt. Dieser apoplastische Transportweg über die Wurzelspitzen hat

besonders für Ca2+, in geringerem Maße auch für Mg2+ Bedeutung (CLARKSON &

HANSON, 1980; HÄUSSLING et al., 1988).

Natrium (Na+) ist für die meisten Pflanzen kein essentieller Nährstoff, sondern wirkt

in hohen Konzentrationen sogar phytotoxisch, da es das Wasserpotenzial des Bodens

herabsetzt und somit zu einer Verringerung der Aufnahme und des Transportes von

Wasser in den Pflanzen führt (WAISEL, 1991; MENGEL, 1991). Wie die Ergebnisse

zeigen, weisen die Pflanzen trotz der hohen pflanzenverfügbaren Na-Konzentration im

Boden - insbesondere im Bauschutt und den Bauschutt/Sand-Gemischen (s. Abb. 41c u.

Tab. 7) - keine erhöhte Na-Aufnahme im Vergleich zum Waldboden und zum Sand auf,

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Diskussion 108

was auf einen intakten Ionenaufnahme- bzw. auch –ausschlußmechnismus unter den

besonderen Gegebenheiten des Bauschuttes schließen lässt. Nach WAISEL (1991)

verursacht ein verringerter K-Gehalt im Boden eine Kompensationsreaktion der

Wurzel, die durch eine verstärkte Aufnahme von Natrium gekennzeichnet sein kann,

was in gutem Einklang mit den ermittelten Werten des Sandsubstrates ist (s. Abb. 41a).

Im Gegensatz zum Bauschutt und zu den Bauschutt/Sand-Gemischen wird Natrium im

Waldboden im oberirdischen Teil der Pflanzen (Sproß) stärker konzentriert als in der

Wurzel. Es ist daher zu vermuten, dass durch den Mykorrhizapilz die passive Na-

Aufnahme der Wurzel nicht inhibiert wird, sondern möglicherweise eine Na-Aufnahme

in der Pflanze begünstigt wird.

Magnesium (Mg2+) wird von den Pflanzen in geringeren Mengen als Ca2+ oder K+

aufgenommen (MENGEL, 1991). Die funktionelle Bedeutung des Magnesiums liegt vor

allem im Enzymhaushalt und bei der Proteinsynthese, sowie in der Regulation der

osmotischen Verhältnisse als Gegenion in den Vakuolen (CLARKSON & HANSON, 1980).

Wie die Abb. 41d zeigt, liegt eine gleichmäßige Mg-Konzentration sowohl im Sproß als

auch in den Wurzeln bei allen Böden vor. Dies weist darauf hin, dass genügend

pflanzenverfügbares Magnesium in allen Bodensubstraten (s. Abb. 25d u. Tab. 7) mit

Ausnahme des Sandes vorhanden war. In meiner Arbeit wurden unmykorrhizierte

Pflanzen bezüglich ihrer Nährstoffversorgung nicht untersucht, aber der positive Effekt

der Mykorrhizapilze für das Pflanzenwachstum wurde von anderen Autoren dargestellt

(z.B. ELTROP & MARSCHNER, 1996). Untersuchungen von ELTROP und MARSCHNER

(1996) im Zusammenhang mit der Ionenkonzentration in Nadeln von Fichten (Picea

abies (L.) Karst) und der Effekt einer Mykorrhizierung ergab, dass die mit Pis.

tinctorius mykorrhizierten Fichten (22 Wochen alt, im Sand mit Durchflußnährlösung)

in Nadeln eine höhere Mg-Konzentration als die unmykorrhizierten Fichten aufwiesen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse bezogen auf die

Nährstoffversorgung mit K, Ca, Na und Mg für die Pflanzen im Bauschutt keine große

Unter- bzw. Überversorgung zeigen. Auffällig sind die extrem niedrigen Gehalte an

Stickstoff und biologisch verwertbaren organischen Stoffen im Bauschutt, so dass bei

der Bepflanzung solcher Substrate eine ergänzende Düngung anzuraten ist. Auf Grund

des hohen Phosphatgehaltes sowie des alkalischen Bodenmilieus wurden nur geringe

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Diskussion 109

Mykorrhizierungsraten erzielt, so dass bei den gegebenen ungünstigen Versorgungs-

bedingungen allein die ausgewählten Mykorrhizapilze (Pis. tinctorius) das Pflanzen-

wachstum nur bedingt fördern konnten. Als Hauptursachen für das schwache

Pflanzenwachstum im Bauschutt und den Bauschutt/Sand-Gemischen kann u. a. das

Fehlen von Stickstoff und die hohen Na-Gehalte dieser Substrate angesehen werden.

Um diesem Problem zu begegnen, ist es erforderlich entsprechende Zusatzstoffe wie

z.B. Biokompost, aber auch gezielt ausgewählte Düngestoffe dem Boden zuzusetzen.

4.4.4. EDXS-Messungen zur Lokalisation verschiedener Elemente in der Wurzeln

Die Darstellung der Elementverteilung in pflanzlichen Geweben auf subzellulärer

Ebene wird durch die energiedispersive Röntgenmikroanalyse (EDXS) ermöglicht

(PLATTNER & ZINGSHEIM, 1987; BÜCKING, 1995; BÜCKING & HEYSER 1999). Um

detailliertere Aussagen zum Aufnahme- und Einlagerungsverhalten der auf dem

Bauschutt (100%) kultivierten Pflanzen machen zu können, wurden neben den

Gesamtgehalten der Nährelemente in Sproß und Wurzeln auch EDXS-Analysen zur

Darstellung der Verteilung verschiedener Elemente (K, Ca, Na, S und P) in den

verschiedenen Gewebebereichen mykorrhizierter Kurzwurzeln von Kiefern (P.

thunbergii/Pis. tinctorius) herangezogen.

Wegen der vergleichsweise sehr geringen P/B-Verhältnisse einiger Elemente, wie

z.B. bei Magnesium und den Schwermetallen, sind die Ergebnisse jedoch schwierig zu

bewerten. Die gemessenen Werte lagen nur geringfügig über der Nachweisgrenze.

Weiter hin ist die Elementdetektion auf subzellulärer Ebene bei der Röntgen-

mikroanalyse stark abhängig vom Präparationsverfahren. Das heisst, dass das

ausgewählte Einbettungsverfahren eine gute Strukturerhaltung sowie geringe Element-

verluste und -verlagerungen gewährleisten muß. Bei meinen Untersuchungen wurde die

von BÜCKING und HEYSER (1999) optimierte Methode - Cryofixierung, Tiefsttem-

peratur-Gefriertrocknung und Druckeinbettung - angewendet. Wie die Ergebnisse der

Röntgenmikroanalyse der mykorrhizierten Kurzwurzeln (Pis. tinctorius) von Bauschutt

zeigen, weisen die Elemente - K, Ca und Na - im Wurzelquerschnitt hohe P/B-

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Diskussion 110

Verhältnisse auf (Abb. 42a-42c). Die hohen P/B-Verhältnisse verdeutlichen, dass diese

diffusiblen Elemente in den Zellkompartimenten angereichert wurden.

Kalium (K) ist, wie bereits erwähnt, ein wichtiges Kation in den Zellen und kann

daher in hohen Konzentrationen nachgewiesen werden. In den Kiefernwurzeln wurde

Kalium hauptsächlich in der Zellwand und im Cytoplasma der Wurzelrinde mit hohen

P/B-Verhältnissen detektiert. Hierbei konnte eine charakteristische Verteilung (Abb.

42a) beobachtet werden, und zwar steigt der K-Gehalt von außen nach innen in der

Wurzelrinde kontinuierlich an. Der gemessene Anstieg der Kalium-Konzentration in

den Zellkompartimenten der Wurzelrinde wurde auch von BÜCKING (1995) bei

mykorrhizierten und unmykorrhizierten Wurzeln der Kiefer (P. sylvestris) beobachtet.

DONNER (1987) konnte bei der Fichte ebenfalls hohe P/B-Verhältnisse im Cytoplasma

und in den Vakuolen der Wurzelrinde nachweisen. KUHN et al. (1992), die die

Verteilung der Elemente K, Ca, Na und Mg in mykorrhizierten Fichtenwurzeln

untersuchten, fanden ebenfalls einen Anstieg der Kaliumgehalte in den Zellwänden von

der Wurzelrinde bis hin zum primären Xylem.

Calcium (Ca) ist insbesondere in den pflanzlichen Zellwänden der mykorrhizierten

Kiefernwurzel zu finden. Das Element Calcium reichert sich hautsächlich im

Matrixmaterial und im Cytoplasma der Zellen des Hyphenmantels an (Abb. 42b) und

zeigte im Gegensatz zu Kalium einen von außen nach innen sinkenden Gradienten.

KUHN et al. (1992) konnten mit Hilfe von Mikrosonden-Analysen (LAMMA-Technik)

bei mykorrhizierten Fichtenkurzwurzeln ebenfalls einen von außen nach innen

abfallenden Gradienten nachweisen. Allerdings war Ca-Konzentration des Cytoplasmas

der Wurzelrinde von Kiefern (P. thunbergii/Pis. tinctorius) derart gering, dass dieses

Element unter der röntgenmikroanalytisch erfassbaren Nachweisgrenze lag.

Die Anreicherung von Natrium (Na) in Kurzwurzeln gilt als ein Maß für eine erhöhte

Bodensalinität. In diesem Zusammenhang wurden sowohl der Boden als auch die

Pflanzen untersucht. Sowohl pflanzenverfügbares Natrium im Boden (s. Abb. 25c) als

auch der Natriumgesamtgehalt in den auf Bauschutt kultivierten Pflanzen weisen (s.

Abb. 41c) - insbesondere in der Wurzel - relativ hohe Konzentrationen auf. Dies deutet

darauf hin, dass die Pflanzen zur Aufrechterhaltung ihrer osmotischen Balance

geradezu gezwungen sind, vermehrt Ionen, so auch Natrium, aufzunehmen und diese in

den Zellen anreichern. In der vorliegenden Untersuchung (s. Abb. 42c) waren erhöhte

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Diskussion 111

Einlagerungen von Natrium im Cytoplasma und in der Vakuole der Zellen des

Hyphenmantels zu beobachten. Die Untersuchungen von BÜCKING und HEYSER (2000b)

mit P. sylvestris, in denen zwar die Aufnahme von Phosphat jedoch in Verbindung mit

unterschiedlichen Kationen in der angebotenen Nährlösung untersucht wurden, zeigten

ebenfalls bei hohen Na-Gehalt in der Angebotslösung eine erhöhte Einlagerung von

Natrium im Cytoplasma des Hyphenmantels von Pax. involutus. Es ist daher zu

vermuten, dass der Mykorrhizapilz durchaus durch seine Einlagerungskapazität einen

Einfluss auf die Natriumaufnahme hat, jedoch bei reichlichem Angebot die

Weiterverlagerung von Natrium in das pflanzliche Gewebe nicht wesentlich reduziert.

Die Schwefel (S)-Verteilung im Hyphenmantel und im pflanzlichen Gewebe - außer

in den Vakuolen der Wurzelrinde - ist nahezu gleichmäßig. Die geringe Akkumulation

von Schwefel im Hyphenmantel deutet auf eine uneingeschränkte Weitergabe des

Sulfats zum pflanzlichen Gewebe hin. Übereinstimmend stellte WINN-BÖRNER (1991)

fest, dass die Mykorrhizierung die Schwefelakkumulation wenig beeinflußt. Da

Schwefel im Boden mobil ist, nehmen auch unmykorrhizierte Wurzeln ausreichende

Schwefel-Mengen auf.

Die Akkumulation von Phosphor (P) in den Vakuolen des Hyphenmantels ist relativ

hoch (ca. 4,5 P/B). Im Gegensatz dazu zeigt die Kompartimentierung von Phosphor in

der Wurzelrinde keine Akkumulation in bestimmten Gewebebereichen (s. Abb. 42e).

WINN-BÖRNER (1991) und BÜCKING (1995) fanden in ihren Untersuchungen an

mykorrhizierten Feinwurzeln der Buche bzw. der Kiefer ebenfalls keine deutlichen

Akkumulationen in pflanzlichen Geweben. Die hier in den Vakuolen des Hyphen-

mantels detektierten hohen P/B-Verhältnisse sind auf Polyphosphate in den Vakuolen

zurückzuführen. Das Vorkommen von Polyphosphatgranula im Pilzpartner wurde bei

vielen Mykorrhiza-Typen (z.B. S. bovinus, Pax. involutus und Pis. tinctorius) nach-

gewiesen (ASHFORD et al., 1986; BÜCKING & HEYSER, 1999, 2000a).

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Diskussion 112

4.4.5. Schwermetallgehalte im Boden (Gesamt- und pflanzenverfügbareGehalte)

Die Schwermetallgesamtgehalte im Boden allein geben nur einen geringen Hinweis

auf die Mobilität der Schadstoffe, deshalb wurden anschließend die pflanzen-

verfügbaren Schwermetallgehalte im Boden mit einer CaCl2-Extraktionslösung

ermittelt. In diesem Kapitel soll auf den Gesamtgehalt und den pflanzenverfügbaren

Schwermetallgehalt verschiedener Böden vergleichend eingegangen werden.

Wie die in Abbildung 27a-e (Schwermetallgesamtgehalte) dargestellten Ergebnisse

verdeutlichen, treten mit Ausnahme von Mangan (Mn) die Gesamtgehalte von Cd, Pb,

Cu und Zn bei allen Böden in ähnlichen Größenverhältnissen auf. Aus der Literatur ist

bekannt, dass in überwiegend aus Ziegel, Mörtel und Beton bestehenden Bauschutt-

gemengen generell erhöhte Schadstoffkonzentrationen festgestellt werden können

(MEUSER, 1996; HILLER, 1995). Die hier im Bauschutt (100%) gemessenen Gesamt-

gehalte von Cd, Pb, Cu und Zn liegen in vergleichbaren Konzentrationsbereichen. Nach

Angaben von MEUSER (1996) betrugen die Schwermetallgesamtgehalte von Bauschutt

(Gemenge aus Ziegel, Mörtel und Beton) für Cd 0,7-5,9mg/kg, für Pb 37-480mg/kg, für

Cu 24-67mg/kg und für Zn 248-1570mg/kg.

Im Gegensatz zum Schwermetallgesamtgehalt im Boden liegen die mit CaCl2

extrahierten pflanzenverfügbaren Schwermetallionen in den eingesetzten Boden-

substraten - mit Ausnahme des Mangans (Mn) im Waldboden - in sehr niedrigen

Konzentrationen vor (s. Abb. 28a-e). Trotz der hohen Schwermetallgesamtgehalte des

Bauschutts wurden mit CaCl2 nur sehr geringe Mengen Schwermetalle extrahiert (s.

Tab. 8). Obwohl der pH-Wert (s. Abb. 17) der untersuchten Böden unterschiedlich ist,

wurden insbesondere nur geringe pflanzenverfügbare Pb- und Cu-Gehalte festgestellt.

Die Löslichkeit von Schwermetallen wird durch verschiedene Bodeneigenschaften

beeinflußt, wie z.B. dem pH-Wert (HERMS & BRÜMMER, 1980; HORNBURG &

BRÜMMER, 1993; HORNBURG et al., 1995; KÖSTER & MERKEL, 1983). Die Bedeutung

des pH-Wertes ist bei manchen Elementen dominierend (WELP et al., 1999). Aber auch

die Redoxbedingungen (HERMS & BRÜMMER, 1979; WALLNÖFER & ENGELHARDT,

1995) sowie verschiedene stoffliche Komponenten, wie Fe- und Mn-Oxide und

Humussubstanzen in den Böden, beeinflussen die Löslichkeit.

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Diskussion 113

Nach den Untersuchungen von HERMS und BRÜMMER (1984) ist die Löslichkeit und

Bindung der Schwermetalle im wesentlichen von Ad- und Desorptionsprozesse sowie

von Komplexierungsvorgängen organischer und anorganischer Komplexbildner

abhängig. Die vergleichsweise hohen Cd-, Pb-, Mn- und Zn-Gehalte im Waldboden

können im Vergleich zu Sand und Bauschutt auf den schwach sauren pH-Wert (5,59 in

CaCl2) des Waldbodens zurückgeführt werden (NEITE, 1989), denn mit steigendem pH-

Wert nimmt die Konzentration der mit CaCl2-extrahierbaren Schwermetalle in der

Bodenlösung ab (HERMS & BRÜMMER, 1980, 1984). Die Zunahme des Cu-Gehaltes im

Bauschutt und in den Bauschutt/Sand-Gemischen kann auf das heterogene Gemenge aus

Ziegel, Mörtel und Kalk im Bauschutt zurückgeführt werden (BLUME & RUNGE, 1978;

NEITE, 1989). Wegen der hohen Gesamtgehalte von Spurenelementen wie z.B. Cu, Mn

und Zn in Böden dürfte trotz hoher pH-Werte kein Mangel an verfügbaren

Spurenelementen bestehen. Andererseits könnte es unter besonderen Gegebenheiten zu

einer toxischen Wirkung hoher Gehalte von Cu und Zn kommen (BLUME & RUNGE,

1978).

4.4.6. Schwermetallaufnahme und –verteilung in der Pflanzen

Die Pflanzen benötigen für ihr Wachstum essentielle Spurenelemente wie z.B. Mn,

Zn, Cu, Br und Mo (ZIEGLER, 1995). Die Spurenelemente werden dann toxisch, wenn

bestimmte Konzentrationen überschritten werden (RENGEL, 1999). Viele Mykorrhiza-

pilze vermögen die Wurzeln vor einer toxischen Einwirkung der Elemente zu schützen,

indem sie die Elemente wie z.B. Schwermetalle in ihren Hyphen zurückhalten bzw.

akkumulieren (HAGEMEYER & BRECKLE 1996; BARGAGLI, 1998; HAGEMEYER, 1999).

Im folgenden Teil werden die Ergebnisse der untersuchten Schwermetalle diskutiert.

Cadmium (Cd) ist ein toxisches Element und über die Wirkungsweise wie auch

Grenzwerte des Cadmiums ist noch wenig bekannt. Nach Angaben von HAGEMEYER

(1999) liegt die Cd-Konzentration in Pflanzen normalerweise zwischen 0,05-0,2 ppm,

kann aber in kontaminierten Böden viel höher liegen. Aus den vorliegenden

Ergebnissen folgt, dass die Cd-Konzentrationen in den Wurzeln mykorrhizierter und

unmykorrhizierter Pflanzen der Waldbodenansätze etwas höher als in den anderen

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Diskussion 114

Ansätzen sind (Sand und Bauschutt), da vor allem aufgrund der pH-Bedingungen der

pflanzenverfügbare Anteil in der Bodenlösung des Waldbodens höher ist als im Sand

und im Bauschutt. Dies deutet auf eine leichte Aufnahme des Cadmiums aus dem

Boden hin und auf eine relativ hohe Pflanzenverfügbarkeit. In die gleiche Richtung

weisen die Ergebnisse von WALLNÖFER & ENGELHARDT (1995), die herausfanden, dass

die Cd-Konzentrationen in den Pflanzen bei hohen Cd-Gehalten im Boden stark

ansteigen. KAHLE (1988) stellte in seinen Untersuchungen mit Buchenkeimlingen

(Fagus sylvatica) eine hohe Mobilität des Cadmiums fest.

Die Cd-Gehalte der Wurzeln mykorrhizierter und unmykorrhizierter Pflanzen von

Bauschutt und Bauschutt/Sand-Gemischen weisen einen niedrigeren Cd-Gehalt als die

Wurzeln des Waldbodens auf. Es ist zu berücksichtigen, dass, insbesondere bei hohen

pH-Werten, die Cd-Verbindungen schwer löslich sind oder im Boden in schwer lösliche

Verbindungen überführt werden. Die Aufnahme und Akkumulation von Cd in die

Wurzeln ist von verschiedenen Parametern abhängig, wie z.B. Schwermetallgehalt im

Boden, Boden-pH, von der Mobilität und vom Entwicklungszustand der Pflanzen

(HAGEMEYER & BRECKLE, 1996). BERTELS (1989) fand heraus, dass das Wurzel-

Trockengewicht von Fagus sylvatica-Keimlingen mit steigender Cd-Konzentration in

der Wurzel abnimmt. Von COLPAERT und VAN ASSCHE (1993) konnte festgestellt

werden, dass die Cd-Konzentration im Sproß mykorrhizierter P. sylvestris Sämlinge

nach Cd-Angebot sehr viel niedriger war als in den Wurzeln. Durch eine Mykorrhi-

zierung mit verschiedenen Pilzen (u.a. Thelephora terrestris, Laccaria laccata und S.

bovinus) wurde der Sproß-Gehalt signifikant reduziert gegenüber den unmykorrhi-

zierten Kontrollen.

Wie in dieser Untersuchung gezeigt wurde, besitzen sowohl mykorrhizierte als auch

unmykorrhizierte Kiefernwurzeln eine Kapazität zur Zurückhaltung und Akkumulation

von verschiedenen Schwermetallen, insbesondere Blei (Pb) und Kupfer (Cu). In der

Abb. 43b-1 und 43c-1 ist zu erkennen, dass die Schwermetalle Pb und Cu in den

Wurzeln der mykorrhizierten Pflanzen im Bauschutt und den Bauschutt/Sand-

Gemischen im Vergleich zu den unmykorrhizierten Wurzeln verstärkt angereichert

wurden. Da jedoch in den oberirdischen Teilen keine erhöhten Werte zu finden waren,

lässt sich daraus ableiten, dass Mykorrhizapilze gewissermaßen eine Filterfunktion

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Diskussion 115

ausüben (ZIEGLER, 1995). Die Pflanzen regulieren mit der Wurzel die Spurenelement-

konzentrationen in den oberirdischen Organen (Sproß) und versuchen dort sowohl

Mangel- als auch toxische Konzentrationen zu verhindern (HAGEMEYER, 1999).

Die vorliegenden Ergebnisse (s. Abb. 43b und 43c) zeigen, dass bei niedrigen CaCl2-

extrahierbaren Pb- und Cu-Konzentrationen im Boden (s. Abb. 28b und 28c) nur

geringe Mengen dieser Schwermetalle aus den Wurzeln in den Sproß transportiert

werden. Die Translokation von Pb und Cu in die oberirdischen Pflanzenorgane ist bei

allen Bodenansätzen sowohl bei mykorrhizierten als auch bei den unmykorrhizierten

Pflanzen sehr gering. Insbesondere ist bei den Bauschuttansätzen die Konzentration von

beiden Schwermetallen in den Wurzeln der unmykorrhizierten Pflanzen deutlich

niedriger als bei den mykorrhizierten Pflanzen (s. Abb. 43b und c). Auch dieses

Ergebnis deutet auf die Akkumulation der Schwermetalle durch die ausgewählten

Mykorrhizapilze hin. Selektive Barrieren bestehen in der Pflanze auch für Blei. Zum

Beispiel reichern Fichten in der Wurzel-Trockenmasse bis zu 5800 ppm Pb an, während

die Nadeln nur 15-26 ppm Pb enthalten (KELLER & ZUBER, 1970). Dieser verminderte

Schwermetalltransport bzw. -verlagerung von der Wurzel zum Sproß kann auf die

physiologischen Gegebenheiten bei den Transportprozessen zurückgeführt werden

(HAGEMEYER, 1999).

Die Speicherung bzw. Akkumulation der Elemente in den Wurzeln wird mit der

Synthese von komplexierenden Peptiden (Phytochelatinen) und schwermetall-

bindenden Proteinen (Metallothioneine) in Verbindung gebracht (ZIEGLER, 1995). Bei

den Metallothioneinen handelt es sich um cysteinreiche Proteine, die frei von

aromatischen Aminosäuren sind und deren Synthese in den Pflanzen durch Schwer-

metalle ausgelöst wird. Bei Schwermetallbelastung wird in der Pflanze die Bildung von

Phytochelatinen induziert, die von GEKELER et al. (1989) in vielen Pflanzen nach-

gewiesen werden konnten.

So stellten die in Tabelle 13 genannten Autoren bei hohen Schwermetallgehalten in

den untersuchten Böden übereinstimmend fest, dass die mykorrhizierten Pflanzen ein

höheres Wachstum als die unmykorrhizierten Pflanzen aufwiesen, und dass die

Schwermetallkonzentrationen in den Nadeln bzw. Blättern der mykorrhizierten

Pflanzen niedriger lagen als in den unmykorrhizierten Pflanzen.

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Diskussion 116

Tab. 13: Schwermetalltoleranz von verschiedenen Ektomykorrhizen mit unterschiedlichenWirtspflanzen, modifiziert nach HÜTTERMANN et al. (1999).

Metalle Kein Effekt(hohe Empfindlichkeit)

Zunahme derToleranz

Wirtspflanzen Autoren

Cd Scleroderma citrinum Suillus bovinus P2 Pinus sylvestris Colpaert & Van Assche (1993)Laccaria laccata Paxillus involutus 533 Picea abies Jentschke et al. (1998)Suillus bovinus NP1

Pb Pisolithus ticntoriusPaxillus involutus Cou

Paxillus involutus 533Laccaria laccata

Picea abies Marschner (1994, Marschner etal. 1996, 1999)

Amanita muscariaZn Thelephora terrestris Paxillus involutus Pinus sylvestris Colpaert & Van Assche (1992)

Paxillus involutus Betula Brown & Wilkins (1985)Amanita muscaria

Dies ist auch aus Untersuchungen von BROWN und WILKINS (1985) und DENNY &

WILKINS (1987a-1987d) abzuleiten, die Resistenz von Betula spp. gegenüber einer Zn-

Belastung untersucht haben. Die Birkensämlinge (Betula spp.), die mit Amanita

muscaria und Pax. involutus mykorrhiziert wurden, wiesen eine verstärkte Zn-

Resistenz auf. Ferner konnten die Autoren feststellen, dass die Erhöhung des

Pflanzenwachstums durch die Zurückhaltung bzw. Akkumulation von Zink in den

Hyphen stimuliert wurde. All diese Untersuchungen belegen, dass die Mykorrhizapilze

zu einer verminderten Schwermetallaufnahme in die Pflanze und damit der

Schwermetallgehalte im Sproß beitragen.

Dies wird auch aus der hier vorgelegten Untersuchungen deutlich. Wie die

Abbildung 43e-1 zeigt, war der Zn-Gehalt in der Wurzel - insbesondere in den

Bauschuttansätzen - viel höher als im Sproß. Die vergleichsweise höhere Zn-

Konzentration in mykorrhizierten Wurzeln ist vermutlich auf den Effekt der

vorhaltenden Akkumulation im Pilz zurückzuführen. Hinsichtlich des Zinks im Sproß

(Nadel und Stamm) lag der Zn-Gehalt in allen Ansätzen im Bereich von ca. 24-48 µg/g

Trockengewicht (s. Tab. 10). Nach Angaben von BERGMANN (1993) ist die Zn-

Konzentration in ein bis zweijährigen Kiefernadeln mit ca. 20-70 ppm

Zn/Trockengewicht als ausreichend für ein normales Wachstum anzusehen. Eine

Verringerung des schädigenden Schwermetalleinflusses auf das Sproß- und

Wurzelwachstum bei erfolgter Mykorrhizierung wird von mehreren Autoren bestätigt

(BROWN & WILKINS, 1985; JONES & HUTCHINSON 1986; COLPAERT et al., 1992a).

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Diskussion 117

Beispielsweise kamen COLPAERT et al. (1999a) zu dem Ergebnis, dass die Zn-Konzen-

trationen in den Nadeln von P. sylvestris, die mit den Mykorrhizapilzen Pax. involutus

und Suillus sp. mykorrhiziert wurden, niedriger waren als in unmykorrhizierten

Pflanzen.

Ein wichtiges Ergebnis meiner Untersuchungen war, dass die mit Pis. tinctorius

geimpften Kiefernsämlinge von P. thunbergii insbesondere im Bauschutt und den

Bauschutt/Sand-Gemischen weniger Cd, Pb, Cu im Sproß aufwiesen als die

unmykorrhizierten Pflanzen. Wobei zunächst einmal verblüfft, dass die in

mykorrhizierten Wurzeln gefundenen Pb-, Cu- und Zn-Gehalte deutlich höher lagen als

in unmykorrhizierten. Da jedoch eine Anreicherung in pilzlichen Gewebe und nicht in

den Wurzelrindenzellen selbst bzw. der Pflanze erfolgte, zeigt dieses Ergebnis die

Fähigkeit des ausgewählten Mykorrhizapilzes Pis. tinctorius auf. Dabei ist zu

bedenken, dass einerseits der Mykorrhizapilz Schwermetalle speichern bzw.

akkumulieren kann und andererseits der Schwermetalltransport von der Wurzel zum

Sproß vermindert wird (HAGEMEYER & BRECKLE, 1996).

4.5. Pflanzenwachstum auf den Bodensubstraten mit Biokompost als Zusatzstoff

Für eine Wiederaufforstung belasteter Standorte, auf denen Pflanzenwachstum

lediglich in sehr eingeschränkter Form möglich ist, sind vielfältige Vorbereitungen

notwendig. Insbesondere der Optimierung des Bodensubstrats für das Pflanzen-

wachstum kommt hierbei eine entscheidende Bedeutung zu, wie auch der Pflanzen-

auswahl und Vorbehandlung, hier im speziellen einer angepassten Mykorrhizierung.

Besonders bei Steppen- und Ackeraufforstungen ist die Bodenoptimierung durch

Zugabe von organischem Material (z.B. Biokompost) und weiteren Zuschlagstoffen

(z.B. Nährstoff armen Waldboden) für Wiederaufforstungsmaßnahmen sehr wichtig

(LYR et al., 1992; HELM & CARLING, 1993). Gleiches trifft natürlich auf Halden und

aufgeschüttete Bereiche zu.

Um Bodensubstrate für das Pflanzenwachstum und die Etablierung von

Mykorrhizapilzen optimieren zu können, wurde in dieser Arbeit Biokompost aus

Grünabfällen (nach DIN 18915) als Zusatzstoff und zusätzlicher Nährstofflieferant

eingesetzt. Der für diese Untersuchung verwendete Biokompost hatte einen pH-Wert

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Diskussion 118

von ca. 7 und der Gehalt an organischer Substanz lag bei über 20% des

Trockengewichtes (Inhaltstoffe von Biokompost s. Tab. 16 im Anhang).

Ein wichtiges Ergebnis meiner Untersuchungen ist, dass in dem Mischsubstrat aus

Sand, Bauschutt und Biokompost im Verhältnis von 4:2:1 (v/v) die Pflanzen und

Mykorrhizapilze ein deutlich verbessertes Wachstum aufweisen (s. Abb. 15a-15d). Der

optimale Biokompostanteil beträgt ca. 15%, d. h. eine optimale fördernde Wirkung

durch Biokompost ist durch relativ geringe Beigaben zu erreichen; höhere Zugaben

zeigen geringe Wirkungen und können sich sogar negativ auswirken. GARCIA et al.

(2000) versuchten im Freiland durch Zugabe von organischem Material und auch durch

Inokulation mit Mykorrhizapilzen (Pis. tinctorius mit Pinus halepensis) die Auf-

forstungsbedingungen in Spanien zu verbessern. Diese Untersuchungen geben einen

Hinweis auf die Wichtigkeit und praktische Bedeutung für mögliche Aufforstungs-

maßnahmen z.B. in semiariden Gebieten.

In einem Aufforstungsexperiment von QUEREJETA et al. (1998) konnte durch Zugabe

von Waldboden und von organischem Material ein positiver Effekt auf das

Pflanzenwachstum festgestellt werden. Das Experiment wurde mit Inokulaten des

Mykorrhizapilzes Pis. tinctorius und Pinus halepensis als Wirtspflanzen auf Gemischen

mit definierten Mengen Waldboden und organischem Material - z.B. Hausmüll (urban

solid refuse) - durchgeführt. Die Autoren konnten dabei zeigen, dass die Zugabe

organischen Materials keinen negativen Einfluß auf die Mykorrhizierung hatte. Die

Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Zugabe von Biokompost einen

positiven Einfluß auf das Wachstum von Pflanzen hatte, die mit ausgewählten

Ektomykorrhizapilzen inokuliert waren. Insbesondere weisen die mit R. roseolus

(frisches Freilandisolat) inokulierten Pflanzen ein erhöhtes Sproß-Trockengewicht und

eine höhere Mykorrhizierungsrate als die mit Pis. tinctorius und S. bovinus

mykorrhizierten Pflanzen auf. Dies kann zum einen auf die Zugabe von Biokompost

zum Bodensubstrat sowie zum anderen auf die relativ gute Mykorrhizierungsfähigkeit

des frisch aus dem Freiland isolierten Mykorrhizapilzes zurückgeführt werden und als

Grundlage für weitere Untersuchungen dienen.

Für die Optimierung des Bodensubstrates müssen aber auch die bodenphysikalischen

Faktoren in besonderen Masse berücksichtigt werden, da die Ektomykorrhiza für ihre

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Diskussion 119

hohen Stoffwechselaktivitäten mehr Sauerstoff benötigen als unmykorrhizierte

Feinwurzeln. Die Limitierung der Sauerstoffversorgung z.B. durch Bodenverdichtung

und Staunässe kann die Symbiose stark beeinträchtigen, da die Mykorrhizapilze aerob

sind (SLANKIS, 1974). Es wurden daher die bodenphysikalischen Eigenschaften wie

Konsistenz des Bodensubstrates insbesondere von Bauschutt berücksichtigt. Eigene

Voruntersuchungen ergaben, dass Bauschutt viele feinkörnige Bestandteile aus

Baumaterialen wie z.B. Isoliermaterial aus feinen Glasfasern enthält, welche zu einer

leichten Verdichtung des Bodens, ungünstiger Porenverteilung und schlechten

Wasserhaltefähigkeit führen. SKINNER und BOWEN (1974) konnten nachweisen, dass die

Mykorrhiza mit steigender Bodendichte die Fähigkeit verliert, Rhizomorphen zu bilden.

Außerdem weist ein dichter Boden oft Probleme mit der Nährstoffverteilung auf, was

im Besonderem eine schlechte Erreichbarkeit zur Folge hat (AGERER et al., 1986). Auch

in diesem Zusammenhang führt die Zugabe z.B. von Kompost zu deutlichen

Verbesserungen.

4.6. Anatomische Charakterisierung der Mykorrhiza

In diesem Kapitel soll zunächst auf die Ergebnisse zur Anatomie der untersuchten

Ektomykorrhiza eingegangen werden. Nachfolgend sollen mögliche Zusammenhänge

zwischen den anatomischen Gegebenheiten der Mykorrhizapilze und verschiedenen

Bodensubstraten erörtert werden. Die anatomische Charakterisierung der Mykorrhiza-

pilze erfolgte insbesondere durch licht- und rasterelektronenmikroskopische

Untersuchungen. Für ektotrophe Mykorrhizen ist die Ausbildung eines Hyphenmantels

und eines Hartigschen Netzes charakteristisch (AGERER et al., 1986; AGERER, 1987,

1991). Die Ausgestaltung des Hyphenmantels und des Hartigschen Netzes variiert je

nach Pilzart sehr stark. Beispielsweise zeichnet sich der Hyphenmantel von Suillus

bovinus durch eine mehrschichtige plektenchymatische Hyphenanordnung aus.

Während im äußeren Bereich des Hyphenmantels ein relativ lockeres Hyphengeflecht

vorherrscht, ist im inneren Bereich eine eher kompakte, plektenchymatische

Organisation der Hyphen zu erkennen. Bei der ektotrophen Mykorrhiza spielen neben

der Dichte des Hyphenmantels auch die Eindringtiefe des Hartigschen Netzes eine

große Rolle (AGERER et al., 1986). In diesem Zusammenhang soll der Einfluß

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Diskussion 120

verschiedener Bodengegebenheiten auf die Morphologie des Hyphenmantels und des

Hartigschen Netzes diskutiert werden. Die lichtmikroskopischen Aufnahmen der

Abbildungen 31a-31c (Querschnitt) und der Abbildungen 32a-32c (Längsschnitt)

zeigen, dass die Entwicklung der mykorrhizierten Kurzwurzeln auf verschiedenen

Böden (Waldboden, Sand und Bauschutt) erkennbare morphologische Unterschiede

aufweist. Dabei ist zu erkennen, dass mit S. bovinus mykorrhizierte Wurzeln im

Waldboden gegenüber entsprechenden Mykorrhizen im Sand einen etwas dickeren

Hyphenmantel und ein dichteres Hartigsches Netz ausbilden.

BERGEMANN (1955) erzielte mit Koniferen auf Waldboden und auf Sand ein

vergleichbares Ergebnis. Die mykorrhizierten Pflanzen bildeten in diesen

Untersuchungen auf nährstoffarmen Sand einen relativ dünnen Hyphenmantel aus, der

oft sogar vollständig fehlt. Das Hartigsche Netz erstreckte sich in solchen Wurzeln

meistens bis zur Endodermis. Dagegen zeichneten sich die Mykorrhizen auf Waldboden

durch einen relativ dicken Hyphenmantel aus und das englumige Hartigsche Netz drang

nur selten weiter als 2-3 Rindenschichten vor. In meinem Versuch zeigten die

mykorrhizierten Wurzeln im Bauschutt einen noch deutlicheren Unterschied bei der

Bildung von Hyphenmantel und Hartigsches Netz zu den Wurzeln im Waldboden und

im Sand. Dabei konnte beobachtet werden, dass die Wurzeln im Bauschutt einen dicken

Hyphenmantel ausbilden und das Hartigsche Netz fast bis zur Endodermis

eingedrungen ist (Abb. 31c).

Auch BERGEMANN (1955) untersuchte den Einfluss verschiedener Bodentypen

(Waldboden, Ackerboden und Sand) auf die Ausbildung von Mykorrhizen bei

verschiedenen Koniferen. Auch er konnte eine ganz unterschiedliche Ausgestaltung der

Mykorrhizen in Abhängigkeit von den Bodensubstraten feststellen, wobei anzumerken

ist, dass weniger das Bodensubstrat an sich als viel mehr unterschiedliche Nährstoff-

konzentrationen, Feuchtigkeitsgehalte und pH-Werte sich in den Boden in diesen

morphologischen Unterschieden manifestieren. Durch die unterschiedlichen

Bodenbedingungen kann wahrscheinlich das Gleichgewicht in der Symbiose besonders

auf Bauschutt gestört worden sein. In wieweit und in welche Weise diese Phänomene

von oben genannten Faktoren verursacht werden, konnten an hand der hier

durchgeführten Experimente nicht abgeleitet werden. Bei unmykorrhizierten und älteren

Wurzeln (s. Abb. 33b) insbesondere aber auch bei schlechten Nährstoffversorgungs-

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Diskussion 121

gegebenheiten kommt es zu verstärkten Einlagerung von Gerbstoffen in die

Zellschichten der Wurzelrinde und auch zu einer Imprägnierung der Zellwände des

Rindengewebes mit Tanninen (BEYELER, 1993). Dadurch wird die Bildung der

Mykorrhiza stark eingeschränkt, was auch BERGEMANN (1955) bereits angesprochen

hat.

4.7. Sproß- und Wurzelentwicklung auf den verschiedenen Böden

In diesem Kapitel soll der Einfluß der Mykorrhizierung insbesondere im Hinblick

auf die Auswirkungen von verschiedenen Böden auf das Pflanzenwachstum diskutiert

werden. Hierfür wurden neben makroskopischen Beobachtungen von Sproß und Wurzel

auch die Frischgewichtsdifferenz zwischen Versuchsbeginn und -ende und Sproß- und

Wurzel-Trockengewicht sowie die Mykorrhizierungsrate bestimmt. Dabei wiesen die

mykorrhizierten Pflanzen bei allen Böden ein höheres Sproß- und Wurzelwachstum als

die unmykorrhizierten Pflanzen auf (s. Abb. 36a). Bei unmykorrhizierten Pflanzen

besonders in der Bauschuttvariante sind chlorotische Veränderungen in Form gelbroter

bzw. dunkelbrauner Verfärbungen der Nadelspitzen wie in Folge von Nährstoffmangel

bzw. auch/und Schadstoffüberschuß beschrieben, deutlich zu erkennen (s. Abb. 36b,

weißer Pfeil).

Wie die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, haben die Mykorrhizapilze (Pis.

tinctorius) und die Bodeneigenschaften einen erkennbaren Effekt auf das Sproß- und

Wurzelwachstum von P. thunbergii (s. Abb. 36a und 36b). Da die Mykorrhizierung

wesentlich in die Nährstoffversorgung und Streßresistenz der Bäume eingreift (BERRY

& MARX, 1976; HARLEY, 1989), ist die Kenntnis des Mykorrhizazustandes der

Rhizotronkulturen eine wichtige Voraussetzung für die Interpretation der vorliegenden

Ergebnisse, denn durch den Ernährungszustand der Pflanzen wie auch den Grad der

Mykorrhizierung der Wurzeln wird das Sproß- und Wurzelwachstum stark beeinflusst

(SMITH & READ, 1997). Die Verminderung der Wurzelmasse bei unmykorrhizierten

Pflanzen deutet einerseits auf ernährungsbedingte Störungen in Folge des

unterschiedlichen bodenchemischen Zustands und der damit verbundenen Beein-

flussung der Wurzelentwicklung, andererseits auf eine verminderte Assimilat-

produktion hin (HARLEY, 1989).

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Diskussion 122

Betrachtet man die auf Waldboden kultivierten Pflanzen, so sind sowohl hinsichtlich

der Frischgewichtsdifferenz als auch des Sproß- und Wurzel-Trockengewichtes sowie

des Sproß/Wurzel-Verhältnisses (Trockengewicht) deutliche Unterschiede zwischen

mykorrhizierten und unmykorrhizierten Pflanzen zu erkennen. Dabei ist kein

Nährstoffmangel- oder Überschuß-Symptom entlang der in diesem Boden gemessenen

Werte zu beobachten. Auffallend ist weiterhin, dass sowohl die mykorrhizierten als

auch die unmykorrhizierten Pflanzen auf Waldboden ein deutlich höheres Sproß- und

Wurzelwachstum aufwiesen als die Pflanzen auf Sand, Bauschutt und dem

Bauschutt/Sand-Gemischen. Dies läßt bereits erkennen, dass der positive Einfluß der

bodenchemischen Zusammensetzung und der Effekt der nahezu vollständigen

Mykorrhizierung (Mykorrhizierungsrate 88%) im Waldboden relativ groß war.

Die Pflanzen auf Sand, die nach den bodenchemischen Untersuchungen keine

ausreichende und ausgeglichene Versorgung mit Nährstoffen aufwiesen, zeigten sowohl

im mykorrhizierten als auch im unmykorrhizierten Zustand ein deutlich inhibiertes

Sproß- und Wurzelwachstum, wobei die mykorrhizierten Pflanzen eindeutig leichte

Vorteile aufwiesen. Die Mykorrhizierung mit Pis. tinctorius führte zu einem, im

Vergleich zu den unmykorrhizierten Pflanzen, erhöhten Sproß- und Wurzel-Frisch-

bzw. Trockengewicht (s. Abb. 38 bzw. 39a und 39b).

Im Bauschutt und den Bauschutt/Sand-Gemischen haben sowohl die mykorrhizierten

als auch die unmykorrhizierten Pflanzen ein erhöhtes Sproß-Trockengewicht gegenüber

den in reinem Sand kultivierten Kiefern. Es ist zu vermuten, dass dieser Effekt

möglicherweise auf die höheren, wenn auch nicht ausgeglichenen Nährstoffgehalte des

Bausschutts bzw. der Bauschutt/Sand-Gemische zurückgeht.

Nach Angabe von HILLER (1995) in Übereinstimmung mit den vorliegenden boden-

chemischen Untersuchungen besitzen Bauschuttgemenge sehr hohe Schadstoffgehalte.

Aufgrund der hohen Schadstoffbelastung des Bauschuttes kann von einer veränderten

Nährstoff- und Wasseraufnahme ausgegangen werden. Die hier festgestellten Zunahmen

des Frischgewichtes und des Sproß-Trockengewichtes der mykorrhizierten Pflanzen in

den Bauschuttvarianten können eindeutig auf einen positiven Einfluß des ausgewählten

Mykorrhizapilzes Pis. tinctorius zurückgeführt werden und bestätigen, welche eine

Bedeutung geeigneten Mykorrhizapilzen bei der Aufforstung von Standorten mit

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Diskussion 123

extremen Bodenverhältnissen zukommt. Gerade die Auswahl geeigneter symbiotischer

Pilze spielt eine besondere Rolle.

So beobachteten LEE und KOO (1983) eine höhere Mykorrhizierungsrate (80-95%)

und ein stärkeres Sproß-Wachstum bei den mit Pis. tinctorius inokulierten P. densiflora

und P. thunbergii gegenüber den mit Thelephora terrestris mykorrhizierten Pflanzen

wie auch den Kontrollpflanzen im Kulturboden (Gemisch aus Vermiculit und

Torfmoos). Dieser positive Effekt einer Mykorrhizierung auf das Sproß- und

Wurzelwachstum von Kiefern mit Pis. tinctorius im Kulturboden wurde ebenfalls von

MARX und BRYAN (1975) beobachtet, die das Pflanzenwachstum in Verbindung mit der

Entwicklung der Mykorrhiza untersuchten. Ebenso fanden COLPAERT et al. (1992b) eine

Steigerung des Sproß/Wurzel-Verhältnisses bei mykorrhizierten Pinus sylvestris

Keimlingen. Auch in den hier vorgelegten Untersuchungen zeigten die mykorrhizierten

Pflanzen in den Bauschuttvarianten ein etwas höheres Sproß/Wurzel-Verhältnis als die

unmykorrhizierten Pflanzen..

Die Untersuchungen von TRAPPE (1977) über den Effekt der Inokulation zeigen je

nach Pflanzenart und Mykorrhizapilz unterschiedliche Ergebnisse hinsichtlich des

Sproß- und Wurzel-Trockengewichtes sowie des Sproß/Wurzel-Verhältnisses. Insbe-

sondere wiesen die Hemlocksämlinge (Tsuga heterophylla) in Torf und Vermiculit mit

allen eingesetzten Mykorrhizapilzen eine deutlich erhöhte Zunahme des Sproß- und

Wurzel-Trockengewichts gegenüber den unmykorrhizierten Kontrollpflanzen auf

(TRAPPE, 1977). Auffallend dabei ist, dass die insbesondere mit Pis. tinctorius

inokulierten Pinus ponderosa Pflanzen ein reduziertes Sproß/Wurzel-Verhältnis

gegenüber den, mit den anderen Mykorrhizapilzen (Hebeloma crustuliniforme,

Laccaria laccata und Thelephora terrestris), inokulierten Pflanzen aufwiesen, was

wiederum die Wichtigkeit einer guten Vorauswahl unterstreicht.

Im allgemeinen deutet das verringerte Sproß/Wurzel-Verhältnis auf eine mangelhafte

Wasser- und Nährstoffversorgung der Pflanzen hin, d.h., die Ursachen für ein

verringertes oberirdisches Sproßtrockengewicht liegen ganz wesentlich in der

Funktionstüchtigkeit (Vitalität) des Wurzelsystems, wobei zu berücksichtigen ist, dass

bezogen auf die Mykorrhizierung verschiedene symbiotische Pilze in unterschiedlicher

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Diskussion 124

Weise zur Nährstoffversorgung der Wirtspflanze beitragen und sich auch ergänzen.

Auch dies sollte bei Wiederaufforstungsmaßnahme berücksichtigt werden.

Um eine verbesserte Mykorrhizierung und somit ein verbessertes Pflanzenwachstum

auf extremen Standorten (z.B. Halden und Schuttflächen) zu erzielen, könnte einerseits

der Einsatz von Zusatzstoffen wie z.B. Biokompost vorteilhaft sein. Desweiteren

könnte wie angesprochen der gleichzeitige Einsatz von mehreren geeigneten

Mykorrhizapilzen im Rahmen einer Mischinokulation von großem Vorteil sein. So

konnten z.B. PARLADÉ und ALVAREZ (1993), dass gleichzeitige Inokulationsangebot von

Pisolithus arhizus und Rhizopogon subareolatus beziehungsweise Pisoliths arhizus und

Rhizopogon roseolus eine erfolgreiche Wiederaufforstung unterstützte, da in der Regel

ja auch die meisten höheren Pflanzen wie z.B. Kiefern, Fichte und Buche an

unterschiedlichen Standorten mit mehreren Mykorrhizapilzen gleichzeitig eine

Symbiose eingehen. In jüngster Zeit wurden durch Mischinokulationen sowohl durch

vegetative (z.B. mit Hebeloma crustuliniforme, Laccaria laccata und Pis. tinctorius)

als auch durch Sporen-Inokulation (z.B. mit R. roseolus, Rhizopogon luteolus und Pis.

tinctorius) mit Pinus pinea L. bei Wiederaufforstungen in mediterranen Regionen

(Spanien) erfolgversprechende Ergebnisse erzielt (RINCÓN et al., 2001)

4.8. Schlußfolgerungen

Die Wiederaufforstung extremer Standorte wie z.B. von Halden, Schuttflächen und

Erosionsstandorte ist mit großen Problemen verbunden, da in der Regel an diesen

extremen Standorten zum eine Mangel bzw. eine Unausgewogenheit an Nährstoffen

und Wasser herrscht, während zum anderen toxische Metallionen (Schwermetalle) und

andere Giftstoffe in hohen Konzentrationen vorliegen können. Daher sind Pflanzen an

solchen Standorten auf eine Mykorrhizierung in besonderem Masse angewiesen.

Geeignete Pilzpartner sind aber gerade an solchen Standorten kaum zu finden. Insofern

können Wiederaufforstungsmaßnahmen an diesen Standorten nur unterstützt werden,

wenn an die Standortgegebenheiten angepaßte und von den Pflanzen als Symbiose-

partner bevorzugte Mykorrhizapilze eingesetzt werden. Das Pflanzenwachstum wird

jedoch nur dann gefördert, wenn die Pflanzenwurzeln mit inokulierten Mykorrhiza-

pilzen eine Symbiose eingehen. Aus diesem Grund müssen geeignete Inokulate und

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Diskussion 125

Inokulationstechniken eingesetzt werden. Da in der Symbiose insbesondere durch das

weitflächige Auswachsen der feinen Hyphen eine bessere Nährstoffaufnahme und

Wasserresorption gegeben ist, hat dieser fördernde Einfluß der Mykorrhiza besonders

auf nährstoffarmen Standorten eine große Bedeutung.

Ziel dieser Arbeit war es, für einen Haldenstandort geeignete Pflanzen auszuwählen

an Bodengegebenheiten wie auch für diese Pflanzen geeignete Mykorrhizapilze zu

isolieren und erfolgreiche Inokulationstechniken zu entwickeln, um dadurch Wege für

erfolgreiche Wiederaufforstungsmaßnahmen an extremen Standorten aufzuzeigen. Dies

beinhaltete als weitere wichtige Faktoren die Optimierung der Inokulationsmethoden

(z.B. Petrischalen-Methode), die Verbesserung der Bodenbedingungen (Zugabe von

Biokompost) und die nach Standortgegebenheiten gezielte Auswahl von Mykorrhiza-

pilzen.

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen:

� Die Isolation (mit optimierter Methode) von Pilzen aus Fruchtkörpern wie auch

mykorrhizierten Wurzeln von entsprechenden Standorten ist notwendig, um

geeignete Mykorrhizapilz zu selektieren und als Reinkultur für die Inokulation zu

gewinnen. In meiner Arbeit erwies sich beispielsweise der Mykorrhizapilz R.

roseolus als ein optimaler Symbiosepartner für die Kiefer (P. thunbergii) bezogen

auf neutrale bis schwachalkalische Bodengegebenheiten.

� Die beschriebene molekularbiologische Identifikationsmethode (ITS-PCR mit

anschließender DNA-Sequenzbestimmung) ermöglicht sowohl die Bestimmung der

isolierten Reinkulturen wie auch der Pilzpartner mykorrhizierter Wurzeln aus dem

Freiland.

� Zur Beobachtung und Optimierung der Inokulation von Sämlingen ist die

Petrischalen-Methode ein ideales System, das eine einfache Inokulation ermöglicht,

wobei der Mykorrhizierungsverlauf zwischen Pilz und Feinwurzeln zu jeder Zeit

beobachtet werden kann.

� Die Verwendung von Zusatzstoffen wie z.B. Biokompost und der Einsatz von

ausgewählten Mykorrhizapilzen kann bei richtiger Auswahl einen positiven Effekt

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Diskussion 126

auf das Wachstum mykorrhizierter Pflanzen insbesondere auf extremen Standorten

ausüben bzw. deren Wachstum erst ermöglichen.

� Flüssigkulturen mit Pilzinokulum bieten den Vorteil, dass eine größere Zahl von

Pflanzen gleichzeitig beimpft werden können. Durch diese Methode lassen sich

deutlich erhöhte Mykorrhizerungsraten erzielen.

� Das Bodensubstrat (verschiedenartige Bodenzusammensetzung) hat in Verbindung

mit unterschiedlichen Nähr- und Schadstoffkonzentrationen Auswirkungen auf die

Morphologie der Wurzel, deren Struktur, die Ausgestaltung des Hyphenmantels und

des Hartigschen Netzes.

� Die in dieser Arbeit vorliegenden Nähr- und Schadstoffuntersuchungen von

Pflanzen und Boden lassen auf einen positiven Effekt der Mykorrhiza bezüglich der

Pflanzenetablierung wie auch des Wachstums schließen. Daraus lässt sich ableiten,

dass der eingesetzte Mykorrhizapilz (Pis. tinctorius) die Nährstoffversorgung der

Pflanzen verbessert, was die vorgelegten Analysen aufzeigen. Desweiteren bewirkt

die Akkumulation von toxischen Stoffen (z.B. Schwermetalle) durch die Mykorrhi-

zapilze eine verringerte Belastung der Wirtspflanzen.

Die beschriebenen positiven Effekte der Symbiose zwischen spezifischen

Mykorrhizapilzen (z.B. Pis. tinctorius und R. roseolus) und ausgewählten Pflanzen (P.

thunbergii) bestätigen, dass durch den Einsatz von speziell ausgewählten Symbiose-

partnern Wiederaufforstungsmaßnahmen extremer Standorte insbesondere durch

optimierte Inokulationsmaßnahmen deutlich verbessert werden können. Da sich die im

Rahmen meiner Arbeit gewonnenen Erkenntnisse ausschließlich auf Rhizotronkulturen

beziehen, muss die praxisbezogene Anwendung dieser Resultate bei Wiederauf-

forstungsmaßnahmen von extremen Standorten noch angepaßt werden.

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Zusammenfassung 127

5. Zusammenfassung und Summary

5.1. Zusammenfassung

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein Modellsystem zur Verbesserung von Wiederauf-

forstungsmaßnahmen für extreme Standorte zu entwickeln. Als extreme Standorte wurden hier

insbesondere Halden, Schuttflächen und Erosionsstandorte Südkoreas berücksichtigt. Als Pflanzen

wurden in Korea heimische Kiefernarten (P. thunbergii und P. densiflora) ausgewählt, und als

Mykobionten die Mykorrhizapilze Pis. tinctorius und S. bovinus sowie ein R. roseolus-Isolat aus

dem Freiland eingesetzt. Als Bodensubstrate dienten hauptsächlich Waldboden, Sand und

Bauschutt. Biokompost wurde als Zusatzstoff für die Bodensubstrate verwendet. In der

vorliegenden Arbeit wurde ein besonderer Schwerpunkt auf die Wahl der geeigneten Symbiose-

partner gelegt.

Die Arbeit beinhaltet:

- Entwicklung und Optimierung einer Isolationsmethode zur Gewinnung von geeignetenReinkulturen aus Fruchtkörpern und mykorrhizierten Wurzeln aus dem Freiland,

- Identifizierung von isolierten Freiland-Mykorrhizen mit Hilfe einer molekularbiologischenIdentifikationsmethode (ITS-PCR),

- Methodenentwicklung zur in-vitro Mykorrhizierung und Optimierung des Inokulations-verfahrens mit der “Nylon-mesh-Methode“ und der “Petrischalen-Methode“,

- Erprobung einer Inokulationsmethode mit Flüssigkulturen mit dem Ziel, eine Vielzahl vonPflanzen zu inokulieren,

- Optimierungsversuche mit verschiedenen Bodensubstraten (Gemisch aus Sand, Bauschuttund Biokompost) und Inokulation mit unterschiedlichen Mykorrhizapilzen (Pis. tinctorius,S. bovinus und R. roseolus),

- Licht- und rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen zur Entwicklung der Symbiosesowie zur Anatomie und Morphologie der mykorrhizierten Baumwurzeln undDokumentation des Mykorrhizierungsverlaufes,

- Bestimmung der verschiedenen Bodenparameter und atomabsorptionsspektrometrischeAnalysen (AAS) zum Nähr- und Schadstoffgehalt (Schwermetalle) der unterschiedlichenBodensubstrate und verschiedener Pflanzenorgane (Sproß und Wurzel) der mykorrhiziertenund unmykorrhizierten Kiefernsämlinge.

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Zusammenfassung 128

Ein wichtiger Bestandteil der Arbeit war die Optimierung einer Isolationsmethode für

Mykorrhizapilze aus dem Freiland, deren pH-Optimum im neutralen bis schwach alkalischen

Bereich liegt. Im Rahmen dieser Versuche gelang es Reinkulturen aus Fruchtkörpern und aus

mykorrhizierten Wurzeln aus dem Freiland durch eine optimierte Isolationsmethode zu

gewinnen. Für die Mykorrhizierungsversuche in verschiedenen Bodensubstraten wurde

insbesondere der aus Freilandwurzeln (P. sylvestris) isolierte Mykorrhizapilz R. roseolus

herangezogen, da er ein gutes Wachstum auf MMN-Nährmedium und eine rasche Mykorrhi-

zierung der Wirtspflanzen zeigte.

Mit Hilfe einer molekularbiologischen Identifikationsmethode (ITS-PCR) konnten sowohl

aus Fruchtkörpern (Pax. involutus und Suillus luteus) als auch direkt von mykorrhizierten

Wurzeln (R. roseolus) isolierte Reinkulturen in ihrer Identität bestätigt werden.

Um eine gute Mykorrhizierungsrate zu erzielen, wurden die isolierten Freilandkulturen mit

verschiedenen Inokulationsmethoden wie z. B. der “Nylon-mesh-Methode“ und der

“Petrischalen-Methode“ erprobt. Mit der “Nylon-mesh-Methode“ konnte zwar eine schnelle

und hohe Mykorrhizierung erreicht werden, aber diese Methode zeigte im Gegensatz zur

“Petrischalen-Methode“ in den weiteren Versuchen keine großen Unterschiede bezüglich der

gewählten Bodensubstrate und Symbiosepartner.

In einem ausgesuchten Modellsystem wurden die Pflanzen (P. thunbergii und P.

densiflora) mit Flüssigkulturen von Pis. tinctorius und R. roseolus (aus dem Freiland isoliert)

erfolgreich inokuliert, um zu überprüfen, mit welchen Baumarten und welchen Mykorrhiza-

pilzen ein optimales Pflanzenwachstum und eine gute Mykorrhizierung erreicht werden kann.

Ein wichtiges Ergebnis war, dass die mit R. roseolus inokulierten P. thunbergii ein deutlich

erhöhtes Sproß- und Wurzelwachstum und eine verbesserte Mykorrhizierung im Vergleich zu

P. densiflora zeigten.

Der aus dem Freiland isolierte Mykorrhizapilz R. roseolus zeigte auf Sand/Bauschutt/Bio-

kompost Gemischen eine vergleichsweise hohe Mykorrhizierungsrate im Vergleich zu den

Mykorrhizapilzen Pis. tinctorius und S. bovinus. Alle mykorrhizierten Pflanzen wiesen

gegenüber den unmykorrhizierten Ansätzen ein deutlich erhöhtes Sproß- und Wurzel-

wachstum auf. Dies kann auf die verbesserten Bodenbedingungen durch den Einsatz von

Zusatzstoffen wie Biokompost zurückgeführt werden.

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Zusammenfassung 129

Die Entwicklung der Symbiose anhand morphologischer und anatomischer Unterschiede

der mykorrhizierten und unmykorrhizierten Pflanzen (P. thunbergii/Pis. tinctorius) wurden

dargestellt und bezüglich ihrer Entwicklung für die Vergleichbarkeit von Waldboden, Sand

und Bauschutt diskutiert. Bezüglich der Entwicklung der Wurzeln und der Etablierung der

Mykorrhizapilze in Waldboden, Sand und Bauschutt wurden vor allem morphologische

Unterschiede hinsichtlich der Bildung des Hyphenmantels und des Hartigschen Netzes in den

Wurzelzellen festgestellt.

Um die Auswirkung von Bodenparametern auf die Entwicklung der Mykorrhiza und auf

das Pflanzenwachstum beurteilen zu können, wurden verschiedene Bodenparameter bestimmt

sowie eine Nähr- und Schadstoffanalyse (z. B. Schwermetalle) im Sproß und Wurzeln

mykorrhizierter und unmykorrhizierter Pflanzen (P. thunbergii/Pis. tinctorius) durchgeführt.

Auf allen Substraten, die unterschiedliche Nähr- und Schadstoffgehalte zeigten, war ein unter-

schiedliches Wachstum der Kiefernsämlinge zu beobachten. Auffällig war dabei ein stark

reduziertes Sproßwachstum der in Sand kultivierten Sämlinge, das auf die geringen

Nährstoffgehalte zurückzuführen ist. Aber auch im Bauschutt bzw. den Bauschutt/Sand-

Gemischen war trotz des hohen Nähr- und Schadstoffgehaltes (Schwermetalle) gegenüber der

Waldbodenkontrolle ein deutlich reduziertes Sproß- und Wurzelwachstum zu verzeichnen.

Eine detailliertere Beurteilung des Sproß- und Wurzelwachstums anhand der Trocken-

gewichte zeigte, dass die mykorrhizierten Pflanzen insbesondere auf Bauschutt und den

Bauschutt/Sand-Gemischen durch ein höheres Sproß- und Wurzeltrockengewicht gegenüber

den unmykorrhizierten Pflanzen auffielen.

Das entwickelte Modellsystem hat sich zur Bearbeitung der aufgeführten Fragestellungen

bewährt. Es ist hierbei auch der Effekt der Mykorrhizierung in den Versuchsansätzen zur

Inokulation sowie die optimale Kombination zwischen den Symbiosepartnern erkennbar. In

der Mehrzahl meiner Untersuchungen spiegelt sich der förderliche Einfluss der geeigneten

Mykorrhizapilze für das Baumwachstum in den Versuchsergebnissen wieder. Eine ziel-

gerichtete und optimierte Auswahl von Mykorrhizapilzen könnte zu einem verbesserten

Wachstum von Gehölzen auf extremen Standorten führen.

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Zusammenfassung 130

5.2. Summary

The aim of the present investigation was the development of a model system for an

improvement of a reforestation of extreme sites. As extreme locations here in particular, waste

dumps, rubble and eroded locations in South Korea were considered. Two domestic Pinus

species (P. thunbergii and P. densiflora) of South Korea and as mycobionts Pis. tinctorius and

S. bovinus and a field isolate of R. roseolus were selected. As soil substrates mainly forest

soil, sand, and rubble were tested. Additionally, compost was used as an additive to improve

the used soil substrates. In the present work a special emphasis was placed on the choice of

efficient symbiotic partners.

This work contains:

- development and optimization of an method to isolate and to produce suitable axenic

cultures from fruit bodies and mycorrhizal roots from the field,

- identification of field mycorrhizas by a molecular technique (ITS-PCR),

- development of an in-vitro method to establish mycorrhizas by different inoculation

techniques e. g. the "nylon mesh " and the "petri dish method",

- tests for an efficient inoculation technique with liquid cultures, in order to achieve a high

number of inoculated plants,

- test of the effect of different soil substrates (mixture on sand, rubble and compost) on

growth and mycorrhizal colonization of different mycorrhizal tree seedlings (Pis.

tinctorius, S. bovinus and R. roseolus),

- light and scanning electron microscopical investigations of the development of the

symbiosis, anatomy and morphology of mycorrhizal tree roots and documentation of the

mycorrhizal formation process,

- determination of different soil parameters, e. g. nutrient and toxic element concentrations

(heavy metals) by atomic absorption-spectroscopy (AAS) of the different soil substrates

and the different plant organs (shoot and root) of mycorrhizal and non-mycorrhizal pine

seedlings.

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Zusammenfassung 131

An important component of this work was the optimization of methods to isolate

mycorrhizal fungi from the field, whose pH optimum ranges from neutral to slightly alkaline.

The extraction of axenic cultures from fruit bodies and mycorrhizal roots from the field by use

of the optimized isolation technique were successful. For the mycorrhiza inoculation in

different soil substrates, especially a field isolate of the mycorrhizal fungus R. roseolus was

used, since it showed a good growth on MMN medium and a rapid colonization of the plants

studied.

By a molecular biological based identification method (ITS-PCR), the fungal species

isolated from fruit bodies (Pax. involutus and Suillus luteus) and directly from mycorrhizal

roots (R. roseolus) was identified.

In order to obtain a good mycorrhizal colonization, different inoculation methods, e. g. the

"nylon mesh method" and "petri dish method” were tested". With the "nylon mesh method" a

rapid and effective mycorrhiza colonization was achieved, but this method differed not from

the "petri dish method" used in further attempts with respect to the selected soil substrates and

symbiotic partners.

In a model system, the plants (P. thunbergii and P. densiflora) were successfully inoculated

with liquid cultures of Pis. tinctorius and R. roseolus, in order to examine which tree species

can good be colonized and show an optimal plant growth under the experimental conditions.

The results showed that P. thunbergii plants inoculated with R. roseolus showed a higher

shoot and root growth and a better mycorrhizal colonization than P. densiflora.

With the mycorrhizal fungus R. roseolus, a better mycorrhizal colonization rate in the

sand/rubble/compost mixture could be obtained than with the mycorrhizal fungi Pis. tinctorius

and S. bovinus. Mycorrhizal plants showed generally a better shoot and root growth than non-

mycorrhizal control plants.

The development of the symbiosis based on morphological and anatomical differences of

mycorrhizal and non-mycorrhizal roots (P. thunbergii/Pis. tinctorius) were presented and their

development on the different soil substrates, forest soil, sand and rubble, is discussed.

Concerning the development of the roots and the establishment of the mycorrhizal fungi

within roots in forest soil, sand and building debris, morphological differences of the

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Zusammenfassung 132

formation of the hyphal sheath and the Hartig net within the mycorrhizal root cortex were

determined.

In order to be able to determine the effect of soil parameters on the development of the

mycorrhiza and on plant growth, different soil parameters as well as nutrient and toxic

element (e.g. heavy metals) concentrations in shoots and roots of mycorrhizal and

nonmycorrhizal plants (P. thunbergii/Pis. tinctorius) were determined. The growth of the pine

seedlings differed dependent on the soil substrate. There was a remarkably reduced shoot

growth of the seedlings cultured in sand, which is obviously due to the low nutrient contents

of this substrate. However, also in rubble and rubble/sand mixtures, which contained high

levels of nutrients and toxic elements (heavy metals), a clearly reduced shoot and root growth

was observed compared to the control grown on forest soil. Especially on rubble and

rubble/sand mixtures mycorrhizal plants showed remarkably higher shoot and root dry

weights than the nonmycorrhizal plants.

The developed model system was useful for the answering of different questions. The

effect of the mycorrhizal formation on the inoculation attempts, and the optimal combination

of various symbiotic partners are also detected here. In the majority of the investigations, the

positive effect of efficient mycorrhizal fungi for the tree growth was obvious. A purposeful

and optimized selection of mycorrhizal fungi could lead to an improved plant growth on

extreme sites.

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Anhang 146

7. Anhang

7.1. Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen

7.1.1. Abbildungsverzeichnis

Abb. Titel Seite

1. Vereinfachtes Schema der Transportprozesse in einem mykorrhizierten Wurzelsystem ....... 5

2. Vereinfachte schematische Darstellung der Stofftransportprozesse .....................................7

3. Darstellung der Rhizotrontechnik..................................................................................................... 16

4. Schematische Darstellung eines sterilen Rhizotronsystems ............................................................. 18

5a-c Mykorrhizierung des Wurzelsystems von P. thunbergii .................................................................. 20

6. Schematische Darstellung der ribosomalen Transkriptionseinheit und der ITS-Region.................. 21

7a-b Makroskopische Aufnahme zur Gewinnung von Reinkulturen ....................................................... 34

8. Gelelektrophoretische Auftrennung von ITS-PCR-Fragmente von drei isolierten

Freilandmykorrhizapilzen................................................................................................................. 36

9. DNA-Sequenz................................................................................................................................... 36

10a-b Vergleich der Sroß- und Wurzeltrockengewichte und des S/W-Verhältnis von P. thunbergii ........ 37

11a-b Makroskopische Aufnahme mykorrhizierter Wurzeln von P. densiflora ........................................ 39

12. Makroskopische Aufnahme eines sterilen Rhizotronsystems .......................................................... 40

13. Mykorrhizierungsrate der Pflanzen P. thunbergii mit verschiedenen Mykorrhizapilzen................. 43

14. Sproß- und Wurzel-Trockengewicht und S/W-Verhältnis von P. thunbergii .................................. 43

15a-d Makroskopische Aufnahmen des Rhizotronsystems von P. thunbergii ........................................... 43

16. Darstellung des Myzelwachstums (Trockengewicht in g) in Abhängigkeit vom pH-Wert.............. 45

17. pH-Werte der eingesetzten Bodensubstrate...................................................................................... 47

18. Elektrische Leitfähigkeit der Bodensubstrate................................................................................... 47

19. Pflanzenverfügbare P-Gehalte im Boden. ........................................................................................ 48

20. Pflanzenverfügbare K-Gehalte im Boden......................................................................................... 48

21. Corg.-Gehalt der Bodensubstrate ....................................................................................................... 49

22. Canorg.-Gehalt der Bodensubstrate .................................................................................................... 49

23. Nt-Gehalt der Bodensubstrate Die vertikalen ................................................................................... 51

24. C/N-Verhältnisse der Bodensubstrate .............................................................................................. 51

25a-d Pflanzenverfügbare Kationen im Boden........................................................................................... 53

26a-c Anionengehalte in den Bodensubstraten .......................................................................................... 54

27a-e Schwermetallgesamtgehalte von Cadmium (a), Blei (b), Kupfer (c), Mangan (d) und Zink (e)

in verschiedenen Bodensubstraten ................................................................................................... 56

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Anhang 147

28a-e CaCl2-extrahierbare Schwermetallgehalte von Cadmium (a), Blei (b), Kupfer (c), Mangan (d)

und Zink (e) in den untersuchten Böden .......................................................................................... 59

29a-g Darstellung des Mykorrhizierungsverlaufes von P. thunbergii mit Pis. tinctorius .......................... 62

30a-d Lichtmikroskopische Darstellung der P. densiflora und S. bovinus-Mykorrhiza............................. 65

31a-c Lichtmikroskopische Darstellung von Querschnitten durch eine primär ausdifferenzierte

P. thunbergii/S. bovinus-Mykorrhiza aus verschiedenen Böden...................................................... 66

32a-c Lichtmikroskopische Darstellung von Längsschnitten durch eine primär ausdifferenzierte

P. thunbergii/S. bovinus Mykorrhiza auf verschiedenen Böden ...................................................... 67

33a-b Lichtmikroskopische Aufnahmen von Querschnitten durch die unmykorrhizierte Kurzwurzel

von P. thunbergii auf Bauschutt ....................................................................................................... 68

34a-b Rasterelektronenmikroskopische Darstellung der P. densiflora/S. bovinus Mykorrhiza ................. 68

35a-f Rasterelektronenmikroskopische Darstellung der P. densiflora/S. bovinus Mykorrhiza ................. 69

36a-b Makroskopische Aufnahmen der Sproß- und Wurzelentwicklung mykorrhizierter und

unmykorrhizierter Pflanzen auf verschiedenen Böden..................................................................... 72

37a-c Charakteristische Feinwurzel-Morphologie ..................................................................................... 73

38. Frischgewichtsdifferenz zwischen Versuchsbeginn und Versuchsende mykorrhizierten und

unmykorrhizierten Pflanzen auf verschiedenen Bodensubstraten.................................................... 74

39a-c Vergleich der Sproß- und Wurzel-Trockengewichte sowie des Sproß/Wurzel-Verhältnises

(Trockengewicht) mykorrhizierter und unmykorrhizierter Pflanzen ............................................... 76

40. Makroskopische Auswertung der Mykorrhizierungsrate von P. thunbergii mit Pis. tinctorius...............77

41a-d Kationengesamtgehalte im Sproß und Wurzel mykorrhizierter P. thunbergii .................................. 80

42a-e P/B-Verhältnisse im Hyphenmantel und verschiedener Wurzelbereich der mit Pis. tinctorius

mykorrhizierten P. thunbergii Pflanze auf Bauschutt. ..................................................................... 82

43a-c Cadmium-, Blei- und Kupfergehalte in Sproß und Wurzel (Abb. 43a-1-43c-1) der

mykorrhizierten und unmykorrhizierten Pflanzen............................................................................ 86

43d-e Mangan- und Zinkgehalte in Sproß und Wurzel (Abb. 43d-1-43e-1) der mykorrhizierten und

unmykorrhizierten Pflanzen ............................................................................................................. 87

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Anhang 148

7.1.2. Tabellenverzeichnis

Tab. Titel Seite

1. Trocknungsverlauf der Gefriertrocknung .............................................................................. 23

2. Geräteparameter der röntgenmikroanalytischen Untersuchungen ............................................... 25

3. Aufschluß- und Abdampfprogramme für die Pflanzen- und Bodenproben...................................30

4. Wiederfindungsrate der Analyse (TG=Trockengewicht) ............................................................. 31

5. Zusammenstellung der Merkmale isolierter Mykorrhizen aus dem Freiland.............................. 35

6. Prozentuale Anteile der Calciumcarbonatgehalte (CaCO3) in verschiedenen Böden ...................... 50

7. Vergleich zwischen den H2O und 0,5 M NH4Cl perkolierten Extrakten mit

Ammoniumlactatessigsäure ............................................................................................................ 52

8. Prozentuale Anteile der pflanzenverfügbaren Schwermetallgehalte (CaCl2-Extraktion)................58

9. Gegenüberstellung der pflanzenverfügbaren Kationen im Boden.................................................... 79

10. Gegenüberstellung der pflanzenverfügbaren Schwermetalle in verschiedenen Böden.................... 87

11. Zusammenstellung verschiedener Inokulationsmethoden........................................................ 92

12. Mykorrhizierungsrate von verschiedenen Pflanzen mit unterschiedlichen Mykobionten .... 94

13. Schwermetall-Toleranz von verschiedenen Ektomykorrhizen..........................................116

14. Nährstoffzusammensetzung des Bodens von Stadt Uelzen............................................................ 149

15. Schadstoffgehalte technogener Substrate ................................................................................. 149

16. Inhaltsstoffe von Biokompost aus Grünabfällen (nach DIN 18915) .............................................. 150

17. Zusammensetzung des verwendeten MMN-Nährmediums............................................................ 150

18. Zusammensetzung des Nährmediums (modifiziert nach INGESTAD, 1960)............................ 150

19. Grenz- und Richtwerte für Schadstoffe in Klärschlammen und Böden ......................................... 151

20. Sproß-Trockengewicht der mykorrhizierten und unmykorrhizierten Pflanzen .................151

20a Ermittelte Signifikanz von Sproß-Trockengewicht der myk. Pflanzen .....................................151

20b Ermittelte Signifikanz von Sproß-Trockengewicht der unmyk. Pflanzen..................................151

20c Ermittelte Signifikanz der myk.- und unmyk.-Pflanzen .........................................................151

21. Wurzel-Trockengewicht der mykorrhizierten und unmykorrhizierten Pflanzen. .............152

21a Ermittelte Signifikanz von Wurzel-Trockengewicht der myk. Pflanzen ...................................152

21b Ermittelte Signifikanz von Wurzel-Trockengewicht der unmyk. Pflanzen................................152

21c Ermittelte Signifikanz von myk.- und unmyk. Pflanzen ........................................................152

22. Zusammenstellung der Merkmale von beiden ausgewählten Gehölzen Südkoreas ...........152

23. Meßbedingungen für Zink und andere Kationen im Boden und Pflanzen (Flammen-AAS).........153

24. Meßbedingungen für die Elemente Cd, Pb, Mn und Cu (Graphitrohr-AAS) ..............................154

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Anhang 149

7.2. Werteanhang

Tab. 14: Nährstoffzusammensetzung des Waldbodens bei Uelzen (BRD)

Bodentiefe [cm] pH-H2O pH-KCl CaO[mg]

K2O[mg]

MgO[mg]

P2O5

[mg]Glüh-verlust

40-50 7,8 7,6 342,9 3,7 2,7 4,7 2,68105-115 7,5 7,5 394,8 3,9 2,3 3,6 3,54

Quelle: Aus Stadtforstamt Uelzen (1986)

Tab. 15: Schadstoffgehalte technogener Substrate. Bereiche (min-max) und arithmetischeMittelwerte (x) der Gehalte von Metallen für die Hauptkomponenten-gruppe, Bauschutt,Kohle, Koks, Sand [mg/kg].

Substrate CaCO3

(Gew.%)pH

CaCl2

Cd Zn Cu Pb

Bauschutt (Gemenge aus min-maxZiegel, Mörtel, Beton ) (n=16) x

-7-8

0,7-5,91,5

248-1570610

24-6740

37-480168

Ziegel (Monosubstrat) (n=5) min-max x

0 6-7 0,5-1,81,0

(127)-

(9)-

40-11364

Mörtel (Monosubstrat) (n=3) min-max x

> 10 7-8 n.n.-0,2 < 0,1

--

--

13-4231

Straßenaufbruch (n=17) min-max x

0-3 1,0-1,21,1

(287)-

(22)-

81-9486

Steinkohle (n=6) min-max x

0 7-8 5-3219

96-303200

11-4327

22-310110

Koks (n=2) min-max X

0 2-3 29-48 22-25 13-33

Sand (geogen) (n=8) min-max X

- n.n.-0,20,1

18-2523

3-105

n.n.-96

n.n = nicht nachweisbar, () = Einzelwerte, - = keine Daten vorhanden.Königwasseraufschluß nach DIN 38414-T7. Bestimmung mit Atomabsorptionsspektrometrie(Flammen-/ Graphitrohrtechnik). Quelle: Meuser (1996)

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Anhang 150

Tab. 16: Inhaltsstoffe von Biokompost aus Grünabfällen (nach DIN 18915)

Inhaltsstoffe Konzentration Inhaltsstoffe KonzentrationpH-Wert ca. 7 Gesamtstickstoff(N 0,6 – 0,8 %/ TSSalzgehalt 1,5 – 3,5 g/ l Gesamtphosphor 0,3 – 0,6 %/ TSWassergehalt < 35 % Gesamtkalium 0,6 – 1,9 %/ TSRohdichte 550 – 650 g/l FS Gesamtmagnesium 0,3 – 0,6 %/ TSOrganische Substanz > 20 %/ TS Gesamtkalzium 1,0 – 3,0 %/ TS

Verfügbare Gehalte:Stickstoff (N) 300 – 500 mg/ l Kalium (K2O) 1000 – 2500 mg/Phosphor (P2O5) 600 – 1000 mg/ l Magnesium (Mg) 200 – 300 mg/ l

Diese Angaben stammen aus der Hersteller von Kompostierungsanlage in Bremen.

Tab. 17: Zusammensetzung des verwendeten MMN-Nährmediums

CaCl2 50 mg/l FeCl3 mod. Fe-EDTA 22 mg/lNaCl 25 mg/l Thiamin-HCl 0,1 mg/lKH2 PO4 500 mg/l d-Glucose 10 g/l(NH4)2HPO4 250 mg/l Malzextrakt (mod.) 5 g/lMgSO4, 7H2O 150 mg/l Agar Agar (nur bei Festkulturen) 20 g/l

Tab. 18: Zusammensetzung des Nährmediums (modifiziert nach Ingestad, 1960).

Komponenten mg/l mM/lNH4NO3 143,0 1.785KH2PO4 88,0 0.646KCl 46,0 0.624CaCl2,6H2O 219,0 1.000MgSO4,7H2O 154,0 0.630FeCl3,6H2O mod. Fe-EDTA 5,0 0.017MnCl2,4H2O 0,6 3 x 10-3

H3BO3 1,0 0.015ZnCl2, mod. Zn-EDTA 0,040 0,3 x 10-3

CuCl2, 2H2O 0,050 0,3 x 10-3

Na2MoO4, 2H2O 7 x 10-3 0,03 x 10-3

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Anhang 151

Tab. 19: Grenz- und Richtwerte für Schadstoffe in Klärschlämmen und Böden sowie normaleGehalte in Pflanzen und Böden (Tr.S.= Trockensubstanz)

Grenz- und Richtwerte Normale GehalteElement Klärschlamm

(mg/kg Tr.S.)Böden

(mg/kg Tr.S.)Pflanzen

(mg/kg Tr.S.)Böden

(mg/kg Tr.S.)Cd Cadmium 20 3 0,05 - 0,4 < 0,5Zn Zink 3000 300 10 - 100 10- 80Cu Kupfer 1200 100 3 - 30 4 - 40Pb Blei 1200 100 0,1 - 6 2 - 60

Quelle : Lehrbuch der Bodenkunde, Scheffer/ Schachtschabel (1992)

Tab. 20: Sproß-Trockengewichte der mykorrhizierten und unmykorrhizierten Pflanzen.

Tab. 20a: Ermittelte Signifikanz von Sproß-Trockengewichten der myk. Pflanzen

Tab. 20b: Ermittelte Signifikanz von Sproß-Trockengewichten der unmyk. Pflanzen

Tab. 20c: Ermittelte Signifikanz der myk.- und unmyk.-Pflanzen

S*= p= 0,056, ns = keine signifikanten Unterschiede, s= signifikante Unterschiede

Waldboden Sand Bauschutt Gm-80/20% Gm-60/40%Waldboden s s s sSand s s sBauschutt ns nsGm-80/20% nsGm-60/40%

Waldboden sand Bauschutt Gm-80/20% Gm-60/40%Waldboden s s s sSand s s s *Bauschutt ns nsGm-80/20% nsGm-60/40%

Waldboden Sand Bauschutt Gm-80/20% Gm-60/40%Waldboden s * s s s sSand s s ns ns nsBauschutt s s s ns sGm-80/20% s s s s nsGm-60/40% s s s ns s

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Anhang 152

Tab. 21: Wurzel-Trockengewicht der mykorrhizierten und unmykorrhizierten Pflanzen.

Tab. 21a: Ermittelte Signifikanz von Wurzel-Trockengewicht der myk. Pflanzen

Tab. 21b: Ermittelte Signifikanz von Wurzel-Trockengewicht der unmyk. Pflanzen

Tab. 21c: Ermittelte Signifikanz von myk.- und unmyk. Pflanzen

S*= p= 0,056, ns = keine signifikanten Unterschiede, s= signifikante Unterschiede

Tab. 22: Zusammenstellung der Merkmale von beiden ausgewählten Gehölzen Südkoreas

Merkmale Pinus thunbergii Parl.(Japanische Schwarz-Kiefer)

Pinus densiflora Sieb. & Zucc.(Japanische Rot-Kiefer)

Baum 30-40 m hoch 20-30 m hochRinde Grau bis bräunlich, rissig Rötlich, dünn abschuppendKnospe Eiförmig bis länglich, spitz, nichtverharzt,

hell bis fast weißEi-länglich, spitz, rotbraun, harzig

Nadeln Zu 2, 6-12 cm lang, dunkelgrün, scharfzugespitzt, fein gesägt, 3 jahre bleibend

Zu 2, 6-12 cm lang, fein zugespitzt,gesägt, an den Trieben stehend

Zapfen 4-6 cm, ei-kegelförmig 3-5 cm, kurz gestielt, ei-kegelförmigVorkommen Süd-Korea und Japan, in Küstennähe

(Schutz gegen Wind), in nährstoffarmenSandböden, in Europa schwer zu kultivieren

Korea, Japan und China,in sauren Böden,in Europa schwer zu kultivieren

Verwendung Als Bauholz gut geeignet Nutzung der gärtnerrischen Formen

Unterscheidung Durch fast weißen Knospen Durch Zapfen

Waldboden Sand Bauschutt Gm-80/20% Gm-60/40%Waldboden s s s sSand ns ns nsBauschutt ns nsGm-80/20% nsGm-60/40%

Waldboden Sand Bauschutt Gm-80/20% Gm-60/40%Waldboden s s s sSand ns ns nsBauschutt ns nsGm-80/20% nsGm-60/40%

Waldboden Sand Bauschutt Gm-80/20% Gm-60/40%Waldboden ns s s s sSand s s * s * ns nsBauschutt s s * s * ns nsGm-80/20% s ns ns ns nsGm-60/40% s s s ns s

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Anhang 153

Tab. 23 : Meßbedingungen für Zink und andere Kationen im Boden und Pflanzen (Flammen-AAS).

Parameter Zn Ca K Mg Na

AAS-Gerätetyp Perkin Elmer 2380 Philips PU 9100 Philips PU 9100 Philips PU 9100 Philips PU 9100Wellenlänge[nm] 213,9 422,7 766,5 285,2 589,0Spaltbreite [nm] 0,7 0,5 0,5 0,5 0,5Lichtquelle (Typ) HKL (PE) max 15 mA HKL 10 mA HKL 10 mA HKL 10 mA HKL 10 mABrennerkopf 1-Schlitz /Mischflügel 10 cm / Mischflügel 10 cm / Mischflügel 10 cm / Mischflügel 10 cm / MischflügelGasströmung [ml/min] 20/50(C2H2/ Luft ) 20/50(C2H2/ Luft ) 20/50(C2H2/ Luft ) 20/50(C2H2/ Luft ) 20/50(C2H2/ Luft )Probeneingabe Automatisch AS 3 (PE) manuell manuell manuell manuellSignalverarbeitung Peak Höhe Peak Höhe Peak Höhe Peak Höhe Peak HöheStörungen - Phasenstörungen - Phasenstörungen -Probenvolumen[ml/min] 7 7 7 7 7Meßzeit [s] 3,0 1,0 1,0 1,0 1,0Parallelmessungen 3 3 3 3 3Probenzusätze : - 0,4 %ige LaCl2-Lösung - 0,4 %ige LaCl2-Lösung -Eichung :Art der Eichung Linear Linear Linear Linear LinearProben: Pflanzen Böden Pflanzen Böden Pflanzen Böden Pflanzen Böden Pflanzen BödenStandards [mg/l] : 0,50 0,10 5,00 5,00 1,00 2,50 1,00 1,00 0,50 5,00

1,00 0,25 10,00 10,00 5,00 5,00 5,00 5,00 1,00 7,50 1,50 0,50 50,00 10,00 7,50 10,00 2,50 10,00 2,00 100,00 10,00 20,00 20,00 2,50 200,00 20,00

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Anhang 154

Tab. 24 : Meßbedingungen für die Elemente Cd, Pb, Mn und Cu (Graphitrohr-AAS)

Parameter Cd Pb Mn Cu

AAS-Gerätetyp Perkin Elmer Zeeman 3030 Perkin Elmer Zeeman 3030 Perkin Elmer Zeeman 3030 Perkin Elmer Zeeman 3030Wellenlänge[nm] 228,8 283,3 279,5 324,8Spaltbreite [nm] 0,7 0,7 0,2 0,7Lichtquelle (Typ) HKL (PE) max 6 mA HKL (PE) max 10 mA HKL (PE) max. 20 mA HKL (PE) max. 15 mARohrtyp Phyrorohr Normalrohr Phyrorohr PhyrorohrUntergrundkompensation ja ja ja jaSchutzgas Argon 4,8 Argon 4,8 Argon 4,8 Argon 4,8Probeneingabe Automatisch AS 60 (PE) Automatisch AS 60 (PE) Automatisch AS 60 (PE) Automatisch AS 60 (PE)Matrixmodifikation - 5 µl : * Mg(NO3) 2 + Pd - -Probenvolumen[µl] 20 20 20 20Technik ZAA ZAA ZAA ZAASignalverarbeitung Peak Fläche 0,02 Peak Höhe 0,02 Peak Höhe 0,02 Peak HöheMeßzeit [s] 4,0 4,0 3,0 6,0Parallelmessungen 2 2 2 2Eichung :Art der Eichung Linear Linear Linear LinearStandards [µg/l] : 0,25 5,0 1,25 5,0

0,50 10,0 2,50 10,01,00 20,0 5,00 20,0

Temperaturprogramm des Graphitofens:Programmschritt: 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6Temperatur [°C] 240 600 2000 2650 40 90 130 850 1800 2650 40 90 130 1000 1900 2650 40 90 130 900 2000 2650 40

Aufheizzeit [s] 25 15 0 1 1 20 20 10 0 1 1 20 20 10 0 1 1 20 20 10 0 1 2

Haltezeit [s] 15 10 4 2 2 20 15 10 4 3 2 20 15 10 3 2 2 20 15 15 4 2 3

Meßbefehl: ● ● ● ●

Gasstrom [ml/min] 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300* Matrixmodifikation : 0,6 g / l Mg(NO3) 2 + 1 g / l Pd (1:1 gemischt)

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EErrkklläärruunngg

Hiermit erkläre ich, daß ich die Arbeit ohne unerlaubte fremde Hilfe angefertigt habe,keine anderen als die von mir angegebenen Quellen undHilfsmittel verwendet habe und die den benutzten Werkenwörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlichgemacht habe.

Bremen 2002