UPDATE MALATTIA CELIACA SIEROLOGIA DELLA MALATTIA CELIACA UNITA DI PATOLOGIA CLINICA AZIENDA OSPEDALI RIUNITI VILLA SOFIA-CERVELLO Direttore Dott: Tomaso

UPDATE MALATTIA CELIACA SIEROLOGIA DELLA MALATTIA CELIACA UNITA DI PATOLOGIA CLINICA AZIENDA OSPEDALI RIUNITI VILLA SOFIA-CERVELLO Direttore Dott: Tomaso Stampone

Negli anni passati questa malattia veniva sospettata solo nei bambini che non crescevano. Negli ultimi anni, lepidemia della celiachia ha assunto dimensioni inaspettate a livello globale, ed in molti paesi occidentali da malattia rara divenuta una condizione molto diffusa, con un elevato impatto sociale essendo una malattia che dura tutta la vita se non si inizia una dieta priva di glutine.

Recentemente si visto che la M.C. in realt molto diffusa e subdola e pu comparire in un periodo qualsiasi della vita con sintomi molto sfumati Nellet adulta caratterizzata dalla presenza di una combinazione variabile di manifestazioni cliniche associate o no ai sintomi gastro-intestinali Oggi si pu affermare che i celiaci con il classico quadro di malassorbimento intestinale, caratterizzato da diarrea e perdita di peso, sono sempre pi rari ad osservarsi, mentre predominano altri sintomi la stipsi ostinata, i dolori addominali, lanemia sideropenica e losteoporosi.

E una malattia cronica sistemica immunomediata indotta dallingestione di glutine che, in soggetti geneticamente suscettibili, determina un processo infiammatorio che porta a lesioni della mucosa dellintestino tenue con conseguente malassorbimento e manifestazioni extraintestinali extraintestinali

Malattia celiaca Glutine ingerito Genetica HLA II DQ2/DQ8 Antigliadina ( Ag esogeno ) Anti transglutaminasi ( Ag endogeno) Anti endomisio ( Ag endogeno ) Fattori di rischio (Sesso allattamento infezioni altro )

sistema nervoso cuore cute e cavit orale fegato sistema emopoiteco tiroide osso sistema riproduttivo femminile e maschile Organo bersaglio intestino tenue

La celiachia una malattia per cui l'ingestione di glutine (in particolare della proteina gliadina) determina un aumento della permeabilit epiteliale e contemporaneamente unattivazione della transglutaminasi tissutale che ha un ruolo importante nellinnescare il disordine immunologico attraverso la deamidazione della gliadina che viene trasformata in peptidi ricchi di acido glutammico ad alta affinit per la tasca recettoriale HLA DQ2/DQ8 situate sulla superficie delle APC. Questi peptidi vengono processati dalle APC ed esposti sulla loro superficie stimolano i linfociti T CD4+ ( che una volta attivati iniziano a produrre citochine ) e i linfociti B ( produzione di anticorpi AGA, anti-tTG ed EMA )

MARCATORI SIEROLOGICI A partire dagli anni 80,grazie alla individuazione della patogenesi e la comparsa dei primi marcatori sierologici, il laboratorio diventato componente fondamentale del percorso diagnostico della malattia celiaca Si tratta di analisi di laboratorio che prevedono un normale prelievo di sangue e che non richiedono alcuna specifica preparazione.

G li anticorpi appartengono alla classe IgA ed IgG, ma in generale solamente gli anticorpi di classe IgA possono essere considerati marker altamente sensibili e specifici per lintolleranza al glutine. Limpiego dei marker di classe IgG e spesso fuorviante a causa dellelevata percentuale di falsi positivi ed il loro uso dovrebbe essere limitato ai pazienti con deficit di IgA., condizione strettamente associata alla celiachia. IgA che corrispondono al 20% delle immunoglobuline circolanti (immunit locale)

IgA. 70-370 mg/dl (normal range) IgM.. 60-260 mg/dl IgG 700-1600 mg/dl Si osservano, molto spesso deficit parziali, ossia casi in cui la produzione anticorpale esiste, ma in quantit insufficiente per let. IgA n.d. (alla nascita) 8-74( 3 mesi) 10-85 (1 anno) 60-270 (2-10 anni) IgA DEFICIENCY

Tissue transglutaminase antibody (IgA-IgG) Endomysial antibody (IgA-IgG) Antibodies against deamidated gliadin (IgA-IgG) SEROLOGICAL TESTS

Sono i primi anticorpi messi in evidenza nei soggetti con CD: sono Ab diretti contro un Ag esogeno, la alfa gliadina da glutine di grano. Nel siero dei soggetti con CD si trovano Ab AGA isotipi IgA e IgG. La determinazione delle IgA utile nella diagnosi delle malattia in fase attiva e nel monitoraggio del comportamento alimentare dopo prescrizione della dieta priva di glutine. ANTICORPI ANTIGLIADINA- AGA ANTICORPI ANTIGLIADINA- AGA ANTIGLIADINA AGA IgA IgG (1967- 1970) (Dike 1950) ELISA Un tempo esame di elezione per la diagnosi di celiachia risultano positivi anche in altre patologie BASSA SENSIBILITA 70-90% E SPECIFICITA 82-92%

Valori di riferimento Unit Negativo 30 METODICA ELISA

Limiti della metodica legati alla scarsa specificit (rischio di falsi positivi)

LA TRANSGLUTAMINASI TISSUTALE (tTG) Caratteristiche: Enzima ubiquitario Ca++dip. Amino--glutamil-transferasi Peso molecolare: 78,24 k Catena aminoacidica: 689 aa Assenza di ponti di-solfuro Esistono diverse forme isoenzimatiche: Transglutaminasi 2 presente a livello della lamina propria dellintestino tenue nei celiaci ANTITRANSGLUTAMINASI tTG IgA/ IgG (1997 W. Dieterick) E stata identificata come l'antigene pi importante nella malattia celiaca. Gli anticorpi IgA anti-tTG sono dei marcatori sierologici altamente specifici per la malattia celiaca. Gli anticorpi IgG anti-tTG sono meno specifici, ma sono comunque un valido marker nei pazienti con deficit di IgA. METODICA : ELISA automatica risultati affidabili precisi quantitativi Valori di riferimento: Unit Negativo 30

T RANSGLUTAMINASITISSUTALE FONTI DI ANTIGENE Fonti naturali Tecniche ricombinanti Purificato da fegato Procarioti(E. Coli) di guinea pig Baculovirus / cellule eucariote di insetto Estratto da eritrociti umani 293-EBNA cellule renali embrionali

I baculovirus sono una famiglia di virus in grado di infettare una grande variet di artropodi ed in particolar modo le larve di Spodoptera frugiperda (Sf9) assumono unimportanza fondamentale nella pratica di laboratorio cos come nellindustria, in quanto attraverso opportune modificazioni genetiche del loro genoma (baculovirus ricombinante) possibile impiegarli come vettori di espressione per la produzione su larga scala di proteine ricombinanti. Coltura di cellule d'insetto Spodoptera frugiperda (Sf9) infettate con baculovirus ricombinante a 48 ore dall'infezione

Figura 1 Profilo elettroforetico della tTG ottenuto con diverse tecnologie di produzione (Gel- filtrazione con 0.3 mg/ml di preparato proteico). La transglutaminasi ottenuta con la tecnologia DNA ricombinante eucariota Baculovirus/cellule di insetto presenta un profilo elettroforetico tipico di una proteina omogenea, in forma integra e priva di contaminazioni. La proteina ottenuta con le altre tecnologie di produzione presentano invece limiti o di integrit e/o di purezza.

Anticorpi Anti-Endomisio su esofago distale di scimmia MONKEY EOSOPHAGUS ENDOMYSIAL Detection of endomysial antibodies

ANTIENDOMISIO EMA IFA (1983 Chorzelski) Sono autoanticorpi diretti verso lendomisio della muscolatura liscia dellintestino. Il test degli anticorpi anti-endomisio, effettuato con la metodica dellimmunofluorescenza indiretta che utilizza come substrato antigenico lesofago distale di scimmia o il cordone ombelicale umano e che rende visibile la reazione ANTIGENE-ANTICORPO marcando con la fluorescina o la rodamina. Al microscopio la positivit degli EMA appre come una intensa fluorescenza a nido dape Viene attualmente utilizzato dalla maggior parte dei laboratori come test di conferma per i casi positivi per gli anti-tTG ANTICORPI ANTI ENDOMISIO EMA

EMA Elementi critici della procedura Interpretazione soggettiva Utilizzo di substrati ottenuti da due particolari linee cellulari Metodica semiquantitativa

ANTI-tTG EMA

DGP-AGA Sono un nuovo interessante marcatore, avente una specificit talmente elevata (99%) un Valore Predittivo Positivo molto elevato da raggiungere quella degli EmA IgA e quella degli anti-tTG IgA I DGP-AGA, inoltre, si sono rivelati anche ottimi marcatori immunologici per individuare celiaci al di sotto dei due anni di et infatti sono rilevabili ancora prima rispetto alle IgA tTG. Deamidated gliadin peptide

C CH 2 C H O NH 2 H 2 N COOH Gln C CH 2 C H O O - H 2 N COOH Glu Le cariche negative introdotte da questo processo di deamidazione aumentano laffinit dei peptidi con la molecola DQ2. Lenzima transglutaminasi tissutale (tTG) a livello della mucosa intestinale attraverso un processo di deaminazione converte la glutammina ad acido glutammico. * Range di normalit

Lanticorpo di classe IgG (IgG DGP) la vera novit In aggiunta alle tTG aumenta la nostra capacit diagnostica IgG DGP: Pu essere impiegato nei deficit di IgA sia nei bambini che negli adulti unico esame utile da richiedere Pu essere impiegato nei bambini al di sotto dei due anni di et come test aggiuntivo Il test Gliadina Deamidata IgG consente il recupero significativo dei cosiddetti falsi positivi IgG DGP un marcatore pi tempestivo della aderenza alla dieta aglutinata in quanto gli anti tTg e gli EMA si negativizzano in ritardo

IgA DGP IgA - tTG

Sono anche disponibili test rapidi, eseguiti su goccia di sangue, per la ricerca degli anti-tTG. Laccuratezza diagnostica dei test rapidi indubbiamente inferiore a quella dei marker sierologici tradizionali, per cui il risultato di questi test dovrebbe essere sempre controllato con la ricerca degli anti-tTG in ELISA. Si tratta di un test qualitativo (anticorpi s - anticorpi no )

ALGORITMO DIAGNOSTICO Quali anticorpi devono essere utilizzati nello screening della celiachia?

Unaltra importante pietra miliare nella storia della celiachia!

CONGRESSO ESPGHAN 2011: 25-27 maggio 2011, Sorrento Da diversi anni un gruppo dellESPGHAN sta lavorando alla formulazione di pi attuali criteri diagnostici, la cui validazione clinica dovrebbe concludersi a breve con la pubblicazione delle nuove linee guida. In accordo a tali criteri, la diagnosi di celiachia dovr realizzarsi attraverso lintegrazione di dati clinici, sierologici, genetici, istologici, definire nuovi percorsi diagnostici pi appropriati e richieste di esami pi mirate In presenza del sospetto clinico di celiachia (soggetto con manifestazioni tipiche ed atipiche), si proceder al dosaggio delle IgA totali e alla ricerca degli anticorpi anti- transglutaminasi. Sulla base del valore delle transglutaminasi, possibile distinguere 3 scenari clinici

SCENARIO CLINICO 1: in caso di forte positivit degli anti-transglutaminasi (valori superiori a 10 volte i valori massimi di riferimento) in soggetti sintomatici, per confermare la diagnosi di celiachia sar sufficiente riscontrare gli anti-endomisio e, mediante il test di tipizzazione genetica, un HLA compatibile (DQ2 o DQ8); in caso di negativit degli anti-endomisio e del test genetico, si dovr riconsiderare la diagnosi; in caso di discordanza tra il risultato degli anti-endomisio e del test genetico, la biopsia intestinale sar comunque necessaria.

SCENARIO CLINICO 2: in caso di anti-transglutaminasi presenti a basso titolo (

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