Utilisation de la technique d'electrophorese dans la systematique des poissons*

J. Franssen' & G . Nibaruta 2Universite de Kinshasa (Zaire) : Laboratoire d'Hydrobiologie et de Pisci cultureAdresses actuelles : I Laboratoire d'Ethologie et Aquarium, Institut de Zoologie, Universite de Liege,

BelgiqueI Laboratoire de Morphologie, Systematique et Ecologie Animales, Institut de Zoologie,Universite de Liege, Belgique

Keywords: electrophoretic techniques, serum proteins, fishes, Africa

Abstract

Using agar gel electrophoresis, the number and relative mobility of seric protein fractions has beendetermined for twelve species of fishes belonging to the Elasmobranchii, Dipnoi and Actinopterygii .The study of relative mobilities has shown both similitudes and divergences between some of the

proteinograms . Immunoelectrophoretic cross tests using the twelve sera and five antisera have shown thatthese similitudes did not result from protein homology and thus agar gel electrophoresis could not be used todetermine phylogenetic relationships between the species considered .

Dans le but d'etablir une classification naturelledes animaux tenant compte des liens phylogeniques,les biologistes se sont penches sur 1'etude desproteines du sang ou de differents organes, plusparticulierement par electrophorese de zone en geld'agar, d'amidon, d'acrylamide ou d'acetate decellulose . Par 1'examen du nombre de fractionsproteiques separees dans l'echantillon, ainsi que parle calcul de leur mobilite relative, ils tenterentd'etablir des criteres systematiques nouveaux de-pendant de particularites biochimiques .

Chez les poissons, Kenneth & Engler (1957)constaterent que les sept especes d'Elasmobranchesetudiees possedaient un proteinogramme seriquespecifique permettant de les distinguer entre elles .

Drilhon et al. (1958) signalerent une absencefrequente des y-globulines dans les sera debeaucoup de Teleosteens, mais nota leur presenceconstante chez les Elasmobranches ; chez cesderniers it remarqua 1'absence d'albumine, com-pensee par un taux eleve en a-globuline . 11 signalaegalement que le sang des Elasmobranches estcaracterise par une dominance nette des globulinessur l'albumine .* Recherche subsidise par la cooperation universitaire belgo-zairoise .

Hydrobiologia 88, 289-293 (1982). 0018-8158/82/0883-0289/$01 .00.a Dr W. Junk Publishers, The Hague . Printed in the Netherlands .

Connel (1953) etudiant les extraits musculairesd'une vingtaine d'especes suggera que l'age desindividus studies avait une influence sur lesconcentrations relatives des constituants electro-phoretiques separes .

En accord avec Brand et al . (1951) et Zinsser &You-Chi Tang (1952) it admit que les mobilitesrelatives etaient influencees par Page des poissons .Paulus (1962) dans une etude taxonomique

des poissons d'eau douce tira quelques conclu-sions interessantes basees sur la mobilite relativedes proteines seriques (electrophorese en geld'agar), notamment sur les Protopteridae et lesPolypteridae .

Plus recemment encore, Rossi et al. (1976)caracteriserent aisement plusieurs especes par leurproteinogramme en gel d'acrylamide .

Toutes ces etudes ne permirent de tirer qu'un seultype de conclusions basees principalement sur desmesures de mobilite electrophoretique relative desfractions separees et accessoirement sur 1'evaluationde leurs concentrations relatives . Ces travaux nepermettaient cependant pas d'etablir si les proteinesappartenant a deux especes differentes et migrantavec des vitesses comparables en electrophoresepouvaient du point de vue biochimique etre

290

considerees comme homologues, heterologues ouanalogues. Et seules des considerations de ce typeauraient pudonner une ideedes liens phylogeniquesunissant les especes etudi&es .

Par contre, l'immuno-electrophorese combinantd'une part 1'electrophorese de zone et lesprecipitations selectives obtenues par reactionsentre antigenes et antiserum, constituait unetechnique d'approche parfaite pour aborder de telsproblemes .Nous avons, au cours de ce travail, applique

cette technique a 1'&tude des constituants pro-teiques du sang de poissons Selaciens, Dipneusteset Actinopterygiens pour lesquels nous avionsprepare des antisera specifiques ; nous desironsdeterminer dans quelle mesure des zones proteiquesmigrant a des vitesses similaires chez des especesdifferentes presentaient des similitudes biochimi-ques au niveau moleculaire .

OSTEICHTYES

- ACTINOPTERYGI

Polypterus palmas

Heterotis niloticus

Mormyrops lineatus

Citharinus gibbosus

Auchenoglanis punctatus

Clarias angolensis

Synoaontis notatus

Tilapia spp

Ophiocephalus obscurus

- DIPNEUSTI

Protopterus aethiopicus 0

CHONDRICHTYES

Squalus spp

Raja spp

O

O0o00 0 O

a a 0000

0 O 0 0

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Materiel et methodes

Les electrophoreses et immuno-electrophoresessont realises en gel d'agar suivant la technique deWieme, a pH 8,6, tampon de barbital sodique deforce ionique &gale a 50 moles par metre cube . Lesmobilites &lectrophor&tiques relatives (m r ) desdifferences fractions ont &t& evaluees en comparantleur mobilit& a celle de deux substances de reference(serum albumine bovine: mr = 100 et macrodex : mr= 0), a temperature de 15 'C; les prelevements desang ont ete effectues sur des poissons vivants, surles lieux de peche, et ramen&s au laboratoire dansune boite frigorifique.

Les antisera ont et& obtenus a partir de lapinsimmunises par des injections sous-cutanees d'unesolution d'antigene additionn& d'adjuvant completde Freund. Nous avons prepare des antiseraspecifiques aux antigenes s&riques des poissons

lb

000 El

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O O 0110

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100mr

Fig. 1 . (a) Proteinogrammes des douze especes de poissons reconstues a partir des calculs des mobilites relatives de chaque fractionprotbique identifiee apres electrophorese en gel d'agar. (b) Integration au niveau des electrophoreses de zone, des resultats obtenus par desimmunoelectrophoreses revelees par des antisera anti-Raja (les fractions ayant reagi sont en noir.)

suivants : Synodontis notatus, Tilapia sp ., Protop-terus aethiopicus, Squalis spp . e t Raja spp.

Resultats

Electrophoreses de zone

Nous avons consign dans la figure la la repre-sentation graphique des proteinogrammes obtenuschez les douze especes de poissons etudies .

Tous ces proteinogrammes sont caracteristiquesdes especes etudiees . Les Synodontis, Ophiocep-halus, Tilapia et Citharinus possedent des fractionsde mobilite elevees et vraisemblablement corre-spondant a des prealbumines. Les_ fractionsalbuminiques semblent absentes des sera desDipneustes et d'un Selacien (Squalus) . L'Heterotis,le Protopterus et le Squalus presentent une fractionde mobilite negative. De plus, tous ces poissonspresentent dans leur proteinogramme des fractionsde mobilite pratiquement identique d'une espece al'autre .

OSTEICHTYES

- ACTINOPTERYGI

Polypterus palmas

Heterotis niloticus

Mormyrops lineatus

Citharinus gibbosus

Auchenoglani punctatus

Clarias angolensis

Synodontis notatus

Tilapia spp

Ophiocephalus obscurus

- DIPNEUSTI

Protopterus aethiopicus ∎

CHONDRICHTYES

Squalus spp

Raja spp

0

0000_ 0 0o a El II000 = O ∎D 00 00000 0

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I I

III

I I

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0 0 0 0: ::I o

Immuno-electrophorese

Les figures 1 b, 2 et 3 reprennent les resultats desdifferentes immunoelectrophoreses effectuees avecdu serum de chaque espece et revelees par les 5antisera en notre possession .

Nous y relevons que :les anti-Tilapia ne reagissent pas avec lesantigenes seriques des Ophiocephalus et desProtopterusles anti-Protopterus ne reagissent pas avec lesantigenes seriques des Auchenoglanis, Tilapia etOphiocephalusles anti-Synodontis ne reagissent pas avec lesantigenes seriques des Polypterus, Tilapia,Ophiocephalus et Protopterus .les anti-Squalus ne reagissent pas avec lesantigenes seriques des Polypterus, Citharinus,Auchenoglanis, Synodontis et Tilapiales anti-Raja ne reagissent pas avec les antigenesseriques des Polypterus, Citharinus, Aucheno-glanis, Tilapia, Ophiocephalus et Protopterus .

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2b

00000 0 00 0 0uu000 0 0 ∎0 00 El 000000 0 0 00000 0 ∎EDE0O 0 000 00 0 0 0

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29 1

mr

mrFig . 2. (a) Integration, au niveau des electrophoreses de zone des resultats obtenus par des immunoelectrophoreses revelees par desantisera anti-Protopterus. (Les fractions ayant rCagi sont en noir .) (b) Integration, au niveau des electrophoreses de zone, des resultatsobtenus par des immunoelectrophoreses revelees par des antisera anti-Squalus . (Les fractions ayant reagi sont en noir .)

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OSTEICHTYES- ACTINOPTERYGI

Polypterus pal-

Heterotis niloticus 0

0 IN I I =Mormyrops lineatus

Citharinus gibbosus

Auchenoglanis punctatus

Clarias angolensis

Synodontis notatus

Tilapia spp

Ophiocephalus obscurus

- DIPNEDSTI

Protopterus aethiopicus O

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Squalus spp

0Raja app

0 1~ o ∎ ~-o 00 ∎ -~1]100

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00 00000

i I ∎ I I

0 C7 I=D

De plus les reactions antigenes-antisera obtenuesentre des poissons appartenant a des familiesdifferentes sont generalement cantonnees au niveaudes memes fractions, de Mr voisine de 50 . Quelquesreactions ont parfois lieu au niveau des albumines(mr de 70 a 85) . Aucune reaction n'a jamais eteremarquee au niveau des fractions lentes .

Interpretation

La comparaison des electrophoreses de zoneobtenues par 1'etude des proteines seriques dequelques poissons peut nous pousser a emettrel'hypothese que les fractions de m r identiques ontune composition chimique comparable .

Si cette hypothese s'averait exacte, lors desreactions immunologiques croisees explicitees plushaut, nous aurions dit obtenir a leur endroit desreactions positives . Le fait d'obtenir des reactionsnegatives indique clairement que ces fractions

1I I

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MrFig. 3. (a) Integration, au niveau des electrophoreses de zone des resultats obtenus par des immunoelectrophoreses revelees'par desantisera anti-Tilapia . (Les fractions ayant reagi sont en noir .) (b) Integration, au niveau des electrophoreses de zone, des resultatsobtenus par des immunoelectrophoreses revelees par des antisera anti-Svnodontis . (Les fractions ayant reagi sont en noir .)

minant antigenique commun et sont donc de com-position chimique totalement differente .

Conclusions et discussions

I

proteiques de mr identiques Wont aucun

deter-1

I

I

Les resultats presentes au cours de cette premiereetude demontrent avec beaucoup de precisions quela comparaison des electrophoreses de zone ne peutapporter que bien peu de renseignements taxo-nomiques de niveau evolutif.

Les electrophoreses de zone ne revelent que desdifferences ou ressemblances au niveau du nombrede fractions separees et de leur mobilite relative ; cesresultats ne peuvent titre utilises que comme criterespermettant de delimiter des especes entre elles, plusparticulierement la ou les caracteres morpho-logiques traditionnels manquent de precision .

Les resultats des tests croises (antigenes d'uneespece, antiserum caracteristique d'une autreespece) demontrent avec nettete que les fractions de

meme mobilite electrophoretique relative ne sontque rarement homologues .

Resume

Par electrophorese en gel d'agar nous avonsdetermine le nombre de fractions proteiquesseriques et leur mobilite relative chez douze especesde poissons appartenant aux trois sous-classessuivantes: Selaciens, Dipneustes et Actinoptery-giens .

La comparaison des mobilites relatives des dif-ferentes fractions nous a permis d'observer desressemblances et des dissemblances entre les pro-teinogrammes obtenus pour chaque Poisson .

Pour verifier si ces differences et ressemblancesimpliquaient l'homologie, l'heterologie ou 1'analo-gie proteique, nous avons effectue par immuno-electrophorese des tests croises en utilisant lesdouze types de sera contre les cinq types d'antiseraspecifiques en notre possession .

Les resultats obtenus Wont montre que peud'affinite entre les differentes especes etudiees .

References

Brandt, L. W ., Clegg, R. C . & Andrews, A . C ., 1951. The effectof age and degree of maturity on the serum protein ofchicken . J . biol. Chem. 191 : 105 .

Connell, J . J ., 1953 . Electrophoretic analysis of ionic strengthextracts of several species offish. Biochem. J . 55 : 376-380 .

Drilhon, A . J ., Fine, J . M. & Dauoules, F., 1958 . Etudeselect rophoretiques de quelques constituants seriques despoissons . A . Inst . Ocean . 35 : 141-148 .

Kenneth, R . & Engler, R . L ., 1957 . Phylogenesis of plasmaproteins and plasma cells . 1 . Starch gel zone electrophoresisof sera from marine invertebrates and fishes . Biol . Bull. 113 :362-363 .

Paulus, J ., 1962 . Nature et importance taxonomique des frac-tions proteiques du serum de poissons d'eau douce . Thesis,Univ. Lovanium de Kinshasa .

Rossi, A ., Damiani, P . & Donati, E ., 1976 . Characterization ofthe principal fish species of Trasimeno lakes, by protein-electrophoresis patterns . Riv . Idrobiol . 12: 3-20 .

Repu le 30juillet 1980 .

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