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Utilisation et validation des méthodes PCR en temps réel pour la détection des agents pathogènes dans les aliments

Sarah Denayer, Laurence Delbrassinne, Katelijne Dierick et Nadine BotteldoornWIV-ISP, rue Juliette Wytsmans 14, 1050 Bruxelles

Alors que la détection des agents pathogènes d’origine alimentaire dans un laboratoire de routine est encore principalement basée sur des méthodes microbiologiques conventionnelles, on observe une forte progression des méthodes de détection moléculaire. La détection et l’isolement de bactéries pathogènes à partir de denrées alimentaires à l’aide des méthodes classiques requièrent plusieurs étapes, ce qui nécessite souvent beaucoup de main-d’œuvre et un délai d’analyse assez long (5-14 jours). Bien que ces techniques soient incontournables au sein d’un laboratoire de microbiologie alimentaire, les techniques moléculaires offrent une solution à ces inconvé-nients. Le screening d’échantillons enrichis au moyen de la PCR en temps réel permet en effet de libérer rapide-ment les échantillons négatifs (≤ 24h), ce qui constitue un aspect important pour le fabriquant.

Introduction des techniques moléculaires dans le laboratoire

Pour mettre en application des méthodes moléculaires – parmi lesquelles la PCR en temps réel –au sein d’un laboratoire, un certain nombre de mesures de précaution doivent être prises. L’Organisation internationale de normalisation (ISO) a rassemblé dans plusieurs normes ISO les différentes exigences applicables au laboratoire et les exigences générales pour l’analyse des denrées alimentaires au moyen de méthodes basées sur la PCR (ISO 22174:2005, ISO 20837:2006, ISO 20838:2006, ISO 22118:2011 et ISO 22119:2010).

Tableau 1: Directives ISO pour les méthodes basées sur la PCR

ISO Titre

Microbiologie des aliments – Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche de micro-organismes pathogènes dans les aliments -

22174:2005 Exigences générales et définitions

20837:2006 Exigences relatives à la préparation des échantillons pour la détection qualitative

20838:2006 Exigences relatives à l’amplification et à la détection pour les méthodes qualitatives

22118:2011 Caractéristiques de performance des méthodes de détection moléculaire

22119:2010 PCR en temps réel – Exigences générales et définitions

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Validation des méthodes PCR en temps réel : approche modulaire Une première norme ISO basée sur un screening initial de l’échantillon par PCR en temps réel pour la détec-tion spécifique d’agents pathogènes dans les aliments a été publiée en novembre 2012, à savoir la norme ISO 13136:2012 pour la détection des E. coli pathogènes. Suivra probablement bientôt la méthode de référence ISO pour la détection du Norovirus et de l’Hépatite A dans les aliments, qui est simplement basée sur la détection par PCR en temps réel. Le Comité européen de Normalisation (CEN) soutient également le développement de méthodes standardisées pour la détection entre autres de Vibrio parahaemolyticus et V. vulnificus, Clostridium botu-

linum, Yersinia enterocolitica et Y. pseudotuberculosis suivant la même méthodologie. Ces méthodes sont composées de deux grandes étapes, à savoir la détection de l’agent pathogène par PCR en temps réel et – en cas de résultat positif du point de vue des critères fixés – l’isolement subséquent du germe. Cela signifie que lorsqu’on souhaite introduire de telles méthodes au sein du laboratoire sous une accréditation (ISO 17025), une validation modulaire est requise pour ces deux étapes (Figure 1). Cela implique que la sélectivité, la limite de détection, la répétabilité et la reproductibilité de la méthode doivent être démontrées tant pour le screening que pour l’étape d’isolement. La participation à un test interlaboratoire est également requise afin de déterminer la justesse de la méthode.

Figure 1: Reproduction schématique de l’approche modulaire en microbiologie alimentaire (basée sur Kagkli et al., 2011)

Module A: Prise d’essai de la matrice alimentaire p.ex. légumes, produits laitiers, viande, …

Module B: Pré-enrichissement/enrichissement (sélectif ou non)

Module C: Extraction d’ADN (méthode développée au laboratoire, kit, …)

Module D: PCR en temps réel

Module E: Confirmation, isolement (étalement, sérotypage,…)

OUI

OUI

OUI

OUI

NON

NON

NON

NON

Les critères fixés sont respectés Actions correctives

Les critères fixés sont respectés

Les critères fixés sont respectés

Les critères fixés sont respectés

Actions correctives

Actions correctives

Actions correctives

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Stratégie de validation en fonction de la méthode

Pour la détection d’un agent pathogène par PCR en temps réel (technique de screening), le laboratoire peut choisir d’utiliser soit les réactifs décrits dans la directive ISO (p.ex. ISO13136:2012 VTEC), soit des kits commerciaux alternatifs ou encore une méthode qu’il aura lui-même développée.

1 Réactifs tels que décrits dans la méthode ISO

Le laboratoire peut choisir d’utiliser les amorces et la sonde spécifiées dans la directive ISO. Il peut commander lui-même les amorces et la sonde auprès d’un fournisseur de son choix ou utiliser un kit commercial qui comporte les mêmes amorces et sonde que celles spécifiées dans la directive ISO. Dans les deux cas, la limite de détection visée est définie dans la directive ISO ou dans le manuel du kit commercial utilisé, et le laboratoire doit prouver que cette limite est atteinte. Par ailleurs, les autres paramètres de validation, tels que décrits plus haut, doivent également être déterminés.

2 Méthodes alternatives : kits commerciaux

Le laboratoire peut également opter pour des kits commerciaux basés sur la détection par PCR en temps réel d’un agent pathogène au lieu de la méthode ISO microbiologique classique (p.ex. Listeria et Salmonella). Pour les direc-tives ISO basées sur la PCR en temps réel, des kits commerciaux peuvent aussi être utilisés qui n’emploient pas les réactifs tels que décrits dans celles-ci. On parle dans ce cas d’une méthode alternative. L’Agence fédérale pour la Sécurité de la Chaîne alimentaire (AFSCA) autorise l’utilisation de telles méthodes dans le cadre du programme officiel de contrôle, à condition qu’elles soient reprises dans la liste des méthodes microbiologiques reconnues, qui est disponible sur le site internet de l’AFSCA (http://www.favv.be/laboratoria/erkendelaboratoria/dienstno-tas/_documents/2012-04-12_Lijst-microbio-methoden_v12.pdf ). La condition pour figurer dans cette liste est une validation ISO 16140 du kit par rapport à la méthode de référence (normes ISO) pour l’agent pathogène concerné. Cette liste est mise à jour chaque année.

La validation se définit comme la confirmation qu’une méthode satisfait aux exigences fixées, ce pour un usage visé spécifique, il faut dès lors tenir compte du champ d’application du kit commercial. Un protocole peut en effet différer suivant la matrice à analyser (échantillon humain, eau, aliment, prélèvement issu de l’environnement). Dans ce cas, le kit a fait l’objet d’une validation ISO 16140 par le fournisseur pour une matrice spécifique suivant la procédure publiée. Le laboratoire peut utiliser le dossier de validation du fournisseur pour démontrer la sélectivité (inclusivité/exclusivité) du kit commercial mais il doit également vérifier s’il atteint la limite de détection spéci-fiée. L’introduction de contrôles d’extraction pour le suivi de l’extraction de l’ADN et de contrôles internes pour la vérification de l’absence d’inhibition et d’une amplification correcte sont indispensables aux méthodes de PCR en temps réel. Même si les kits commerciaux comportent souvent un contrôle interne, un contrôle d’extraction n’est pas toujours prévu. Enfin, le laboratoire doit définir dans le dossier de validation les autres paramètres de valida-tion tels que la répétabilité, la reproductibilité et la justesse, ce aussi bien pour la partie screening que pour les étapes ultérieures d’isolement du germe.

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3 Méthode développée par le laboratoire

Si le laboratoire souhaite mettre au point sa propre méthode de PCR en temps réel pour la détection d’un germe et la soumettre à l’accréditation, c’est uniquement possible si la méthode est validée au sein du laboratoire selon la norme ISO 16140 ‘in house method’.

Conclusion

L’introduction de méthodes de détection moléculaire dans le laboratoire de microbiologie implique donc davan-tage qu’une validation classique et peut également nécessiter une adaptation de l’infrastructure. Les méthodes de détection moléculaire ont comme avantage une libération rapide des échantillons conformes (dans les 24h). L’isolement d’un germe reste toutefois indispensable pour confirmer la présence d’un agent pathogène dans la matrice analysée et pour la détermination ultérieure de sa virulence.

Références :- ISO 16140:2003 - Microbiologie des aliments – Protocole pour la validation des méthodes alternatives - ISO 17025:2005 - Exigences générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnages et d’essais- ISO 22174:2005 - Microbiologie des aliments – Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche

de micro-organismes pathogènes dans les aliments – Exigences générales et définitions- ISO 20837:2006 - Microbiologie des aliments – Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection

des micro-organismes pathogènes dans les aliments – Exigences relatives à la préparation des échantillons pour la détection qualitative

- ISO 20838:2006 - Microbiologie des aliments – Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection des micro-organismes pathogènes dans les aliments – Exigences relatives à l’amplification et à la détection pour les méthodes qualitatives

- ISO 22118:2011 - Microbiologie des aliments – Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection et la quantification des micro-organismes pathogènes dans les aliments - Caractéristiques de performance

- ISO 22119:2010 - Microbiologie des aliments – Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en temps réel pour la détection des micro-organismes pathogènes dans les aliments – Exigences générales et définitions

- Kagkli, D-M., Weber, T.P., Van den Bulcke, M., Folloni, S., Tozzoli, R., Morabito, S., Ermolli, M., Gribaldo, L. & Van den Eede, G. (2011). Application of the modular approach to an In-House validation study of Real-Time PCR methods for the detection and serogroup determination of verocytotoxigenic Escherichia coli. Appl Env Microbiol 77 (19), 6954-6963

Sarah.Denayer@wiv-isp.be