UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam (https://dare.uva.nl)

UvA-DARE (Digital Academic Repository)

Molecular and genetic basis of congenital conotruncal heart defects

Rana, M.S.

Publication date2014

Link to publication

Citation for published version (APA):Rana, M. S. (2014). Molecular and genetic basis of congenital conotruncal heart defects.

General rightsIt is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s)and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an opencontent license (like Creative Commons).

Disclaimer/Complaints regulationsIf you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, pleaselet the Library know, stating your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the materialinaccessible and/or remove it from the website. Please Ask the Library: https://uba.uva.nl/en/contact, or a letterto: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam, The Netherlands. Youwill be contacted as soon as possible.

Download date:31 May 2021

https://dare.uva.nl/personal/pure/en/publications/molecular-and-genetic-basis-of-congenital-conotruncal-heart-defects(53e1025c-8dcb-48f3-8e1e-d9ee29ce3dd2).html

  

Chapter 5  

 

 

Identification of a Tbx1/Tbx2/Tbx3 genetic pathway governing pharyngeal and  

arterial pole morphogenesis  

 

 

K. Mesbah*, M.S. Rana*, A. Francou, K. van Duijvenboden,  V.E. Papaioannou, A.F.M. Moorman,  

R.G. Kelly, V.M. Christoffels  

Human Molecular Genetics 2012 Mar 15;21(6):1217‐29 

 

*equal contribution 

   

118

Abstract 

The  22q11.2 deletion  syndrome  (22q11.2DS)  is  the most  common microdeletion disorder and  is  characterized  by  abnormal  development  of  the  pharyngeal  apparatus  and  heart. Cardiovascular malformations affecting  the outflow  tract  (OFT) are  frequently observed  in 22q11.2DS and are among the most commonly occuring heart defects. The gene encoding T‐box  transcription  factor 1  (Tbx1) has been  identified as a major  candidate  for 22q11.2DS. However, cardiovascular malformations are generally considered to have a multigenic basis and  single  gene  mutations  underlying  these  malformations  are  rare.  The  T‐box  family members  Tbx2  and  Tbx3  are  individually  required  in  regulating  aspects  of  OFT  and pharyngeal development. Here, using expression and 3D‐reconstruction analysis, we  show that Tbx1 and Tbx2/Tbx3 are largely uniquely expressed but overlap in the caudal pharyngeal mesoderm  during  OFT  development,  suggesting  potential  combinatorial  requirements. Cross‐regulation  between  Tbx1  and  Tbx2/Tbx3  was  analyzed  using  mouse  genetics  and revealed that Tbx1 deficiency affects Tbx2 and Tbx3 expression  in neural crest‐derived cells and pharyngeal mesoderm, whereas Tbx2 and Tbx3 function redundantly upstream of Tbx1 and Hh  ligand expression  in pharyngeal endoderm and BMP‐  and  FGF‐signaling  in  cardiac progenitors. Moreover, in vivo we show that loss of two of the three genes results in severe pharyngeal  hypoplasia  and  heart  tube  extension  defects.  These  findings  reveal  an indispensable T‐box gene network governing pharyngeal and OFT development and identify TBX2  and  TBX3  as potential modifier  genes of  the  cardiopharyngeal phenotypes  found  in TBX1 haploinsufficient 22q11.2DS patients. 

119

Introduction  

22q11.2  deletion  syndrome  (22q11.2DS)  comprises  DiGeorge  syndrome,  velocardiofacial syndrome  and  conotruncal  anomaly  face  syndrome  and  is  the most  common  interstitial microdeletion syndrome with an estimated prevalence of 1 per 4,000 live births1. 22q11.2DS patients exhibit a wide spectrum of developmental anomalies, including craniofacial defects, hypoplasia  of  the  thymus  and  parathyroid  glands  and  conotruncal  cardiovascular malformations  (CVMs).  CVMs  are  the  leading  cause  of  birth  defect‐related  death  in  the western world2, 3. Defects in the formation of the arterial pole of the heart, or outflow tract (OFT), account for up to 30% of CVMs. Formation of the OFT is a complex process, requiring spatial and temporal expression of genes  in multiple  interacting cell types. A population of mesodermal  progenitor  cells  called  the  second  heart  field  (SHF)  residing  in  splanchnic pharyngeal mesoderm  in  the dorsal wall of  the pericardial cavity  is progressively added  to the elongating arterial pole of the embryonic heart tube giving rise to the right ventricle and OFT 4. These SHF cells are closely associated with neural crest (NC)‐derived mesenchyme and pharyngeal endoderm, and complex autocrine and paracrine signaling events  regulate SHF development, including pro‐proliferative fibroblast growth factor (FGF) and Sonic hedgehog (Shh) signals and pro‐differentiation bone morphogenetic protein (BMP) signals5‐7. Direct or indirect perturbation of second heart field development leads to failure of correct alignment between the great arteries and ventricles during cardiac septation resulting  in conotruncal CVMs.  However,  the  mechanisms  coordinating  intercellular  signaling  events  during  SHF deployment remain insufficiently understood. 

While  single gene mutations or  chromosomal abnormalities  cause  certain CVMs or syndromes, the majority of CVMs appear to have a multifactorial basis. Despite this, little is known  about  the  networks  of  interacting  genes  that  control  cardiac  or  pharyngeal morphogenesis.  Several  scenarios  involving  interactions  of multiple  genes with major  or minor  effects  have  been  proposed  to  explain  the  complex  inheritance  and  variability  of CVMs8.  T‐box  transcription  factors  play  a  series  of  critical  roles  in  patterning  and morphogenesis of the vertebrate heart6, 9. TBX1 is a major candidate gene in the etiology of 22q11.2DS, contributing to a variable phenotypic spectrum including conotruncal congenital heart  defects10.  In mice,  haploinsufficiency  of  Tbx1  causes  fourth  pharyngeal  arch  artery (PAA)  defects,  whereas  Tbx1  null  mutants  display  most  of  the  severe  defects  found  in 22q11.2DS  patients,  including  common  arterial  trunk11‐13.  Tbx1  is  required  in  pharyngeal mesoderm  to  regulate proliferation  and  differentiation  of  SHF  progenitor  cells7, 14‐17.  This function is mediated in part by the regulation of FGF ligand expression and signal response18, 19.  Other  T‐box  proteins  known  to  impact  on  OFT  development  are  the  closely  related paralogs Tbx2 and Tbx3. Heterozygous mutations in TBX3 cause Ulnar‐Mammary syndrome, but usually do not  include heart defects20. Nevertheless, mouse  studies have  shown  that Tbx3  plays  important  roles  in  the  development  of  the  cardiac  conduction  system21. Moreover, whereas Tbx3 haploinsufficiency does not affect heart development, Tbx3 loss‐of‐function results in OFT alignment defects including double outlet right ventricle22, 23. The role of Tbx3  in OFT development appears  to be  indirect as Tbx3  is predominantly expressed  in cardiac NC cells and ventral pharyngeal endoderm, rather than pharyngeal mesoderm22, 23. The paralogous gene Tbx2 is expressed in pharyngeal mesoderm, including the SHF and OFT, and  in NC‐derived cells. Although Tbx2 haploinsufficient mice appear normal, a  fraction of Tbx2 null embryos develop OFT alignment defects24, 25. 

120

Here we show that Tbx2 and Tbx3 are required redundantly during OFT development to  attenuate  Tbx1  expression  in  the  ventral  foregut,  but  also  depend  on  Tbx1  for  their correct distribution  in pharyngeal mesoderm, endoderm and NC cells. Furthermore,  loss of function of Tbx1 and either Tbx2 or Tbx3 also causes severe defects during OFT and foregut development,  suggesting  that  these  three  genes  (Tbx1/Tbx2/Tbx3)  comprise  a  crucial regulatory network  controlling  the  topography of  intercellular  signaling during pharyngeal and  OFT  development.  When  disrupted,  this  network  fails  to  properly  orchestrate morphogenesis  of  the  pharyngeal  apparatus  and  cardiovascular  system.  Our  results underscore  the  clinical  relevance  of  this  Tbx1/Tbx2/Tbx3  network  which  potentially contributes to the phenotypic variation of congenital cardiopharyngeal malformations in the 22q11.2DS patient population. 

 

Materials and Methods  

 Transgenic mice 

Tbx1tm1Pa (synonym: Tbx1‐; 11‐13), Tbx1tm1Bld (synonyms: Tbx1LacZ , Tbx1‐ 12), Tbx2Δ2 (synonym: Tbx2‐ 48), Tbx3tm1Pa (synonym: Tbx3‐ 49) and Tbx3tm1.1(cre)Vmc (synonyms: Tbx3Cre, Tbx3‐ 50) mice have been described previously. Homozygosity for above‐mentioned alleles is also indicated as  ‐/‐. All  strains were maintained on mixed  or  outbred  (Bl6/CD1  or  FVB/N)  backgrounds. Embryos were staged considering noon of the day of the copulation plug as embryonic day (E) 0.5. Embryos were  isolated  in  ice‐cold 1x Phosphate‐buffered  saline  (PBS),  fixed  in 4% paraformaldehyde in PBS for 1‐4 hours, examined and processed for in situ hybridization or immunohistochemistry. Genomic DNA obtained  from yolk sac or tail biopsies was used  for genotyping by PCR, using primers described in the above references. 

 Immunohistochemistry  

Embryos  were  collected  and  whole  embryos  or  trunk  regions  were  fixed  in  4% paraformaldehyde, dehydrated and embedded in paraffin prior to sectioning at 7‐12 μm for immunohistochemistry  (IHC),  in  situ  hybridization  (ISH)  and  haemotoxylin  and  eosin  (HE) staining.  IHC  was  performed  on  hydrated  sections  treated  for  15  min  with  antigen unmasking solution (Vector) or pressure‐cooked for 4 min in Antigen unmasking solution (H‐3300,  Vector  Laboratories).  The  sections  were  processed  according  to  the  TSA tetramethylrhodamine  system  protocol  (NEL702001KT,  Perkin  Elmer  LAS).  Primary antibodies were  incubated overnight. Primary antibody concentrations were: Tbx1  (1/100, Zymed), Tbx3 (1/200, Santa Cruz Biotechnology), Islet‐1 (clone 40.2D6 : 1/100, DSHB), AP‐2α (1/50,  clone  3B5  DSHB),  phospho‐ERK  (1/100,  phospho‐p44/42  MAPK  (Thr202/Tyr204) (20G11)  Cell  Signaling)  phospho‐SMAD  (1/100,  Phospho‐Smad1  (Ser463/465)/  Smad5 (Ser463/465)/ Smad8 (Ser426/428), 9511, Cell Signaling). Secondary antibody concentrations were: anti‐species Alexa 488  (1/500,  Jackson), Alexa 680  (1:250, Molecular Probes), Alexa 647  (1:250,  Molecular  Probes),  Alexa  568  (1:250,  Molecular  Probes)  and  Cy3  (1/500, Jackson).  Sections  were  counterstained  with  Hoechst,  Sytox  Green  nucleic  acid  stain 

121

(1:30,000; Molecular Probes) or Dapi  (1:40,000; Molecular Probes) and observed using an ApoTome microscope (Zeiss). 

In situ hybridization 

Nonradioactive  ISH on sections was performed as described  51 using mRNA probes  for  the detection  of  Tbx2  52,  lacZ,  Tbx3,  Tbx1,  Fgf8, Bmp4,  Isl1, Mlc2a  and  Shh  23.  Sections were counterstained with Nuclear Fast Red. For whole‐mount in situ hybridization embryos were fixed in 4% paraformaldehyde and processed as described 27. 

 Ink injection 

Visualization  of  pharyngeal  arch  artery  formation  at  E10.5  by  ink  injection  into  the embryonic ventricle was carried out as described 53. 

 3D‐reconstruction of gene expression patterns and morphology 

Image acquisition of serial sections stained by ISH or IHC, and processing for subsequent 3D reconstructions  was  performed  using  a  previously  described  method  using  Amira  5.2 software  54. The mRNA expression patterns were  independently confirmed  in at  least  two additional embryos. 

 

Results 

 Three‐dimensional analysis of Tbx1, Tbx2 and Tbx3 transcript distribution in the cardiopharyngeal region 

In  order  to  understand  the  multigenic  cause  of  cardiopharyngeal  defects  observed  in 22q11.2DS, we first explored whether Tbx1, Tbx2 and Tbx3 could be expected to function co‐operatively  during  arterial  pole  development.  This  was  achieved  by  examining  their expression  patterns  relative  to  each  other  by  in  situ  hybridization  (Figure  1A‐C)  and fluorescent immunohistochemistry (Figure 1D‐F) in wildtype embryonic day (E) 8.5 and E9.5 embryos,  stages at which SHF cells are added  to  the elongating heart  tube. To  facilitate a more  accurate  identification  of  unique  and  overlapping  expression  sites  in  the cardiopharyngeal  region,  we  generated  3D‐reconstructions  of  transcript  distributions  for these  three  genes  (Figure 1G‐L;  Supplementary Material,  Figure  S1;  Supplemental 3D‐PDF file). At E8.5 and E9.5, Tbx1  is expressed  in  lateral pharyngeal endoderm  (arrows  in Figure 1A, arrowhead in 1F) and surrounding mesoderm, in the SHF and in surface ectoderm (Figure 1D‐F). In pharyngeal endoderm, Tbx3 primarily accumulates ventrally (Figure 1C, arrowhead; 1D‐F), overlapping with Tbx2 in the endoderm underlying the aortic sac (Figure 1K, L, arrow). Tbx2 and Tbx3 are also co‐expressed in NC‐derived mesenchyme (Figure 1B, C, black arrow; 1I,  arrow)  and  the  dorsal  and  lateral  pericardial wall  at  E9.5  (Figure  1B, C,  green  arrow). Overlap  between  Tbx1  and  Tbx2  was  observed  in  mesoderm  lateral  to  and  underlying ventral pharyngeal endoderm (Figure 1A, B, arrowhead), including SHF cells. A small patch of 

122

overlapping  Tbx1  and  Tbx3  expression  was  also  observed  in  the  dorsal  pericardial  wall (Supplementary Material, Figure S2; Supplemental 3D‐PDF file). Unlike Tbx1 and Tbx3, Tbx2 is robustly expressed in the myocardial wall of the developing OFT at E9.5 (Figure 1G, I). Tbx2 and  Tbx3  are  co‐expressed  in  distal  OFT mesenchyme  at  this  stage  (Figure  1B,  C,  K).  In summary, Tbx2 and Tbx3 are extensively co‐expressed, whereas Tbx1 demonstrates a more distinct pattern in pharyngeal mesoderm and endoderm (Figure 1J). 

 

Figure  1.  Unique  and  overlapping expression  patterns  of  Tbx1,  Tbx2  and Tbx3. In situ hybridization at E9.5 showing Tbx1  (A),  Tbx2  (B)  and  Tbx3  (C) mRNA  in pharyngeal  endoderm  (A,  arrows;  C, arrowhead),  neural  crest‐derived mesenchyme  (B,  C,  black  arrow)  and pharyngeal mesoderm  (A, B,  arrowheads; B, C, green arrows). At E8.5 (D, E) and E9.5 (F), Tbx1 protein (red) was found in lateral pharyngeal endoderm (L‐end, arrowhead), pharyngeal mesoderm  (mes)  and  surface ectoderm (se) and Tbx3 protein (green)  in ventral pharyngeal endoderm  (V‐end) and neural crest‐derived mesenchyme (arrow). Three‐dimensional  reconstructions showing  unique  and  overlapping  (black arrow)  sites  of  expression  of  Tbx1/Tbx3 (G),  Tbx1/Tbx2  (H)  and  Tbx2/Tbx3  (I).  (J) Summary of expression  sites of Tbx1–2–3 at E8.5–9.5. Note that ventral endodermal Tbx2  expression  is  restricted  to  where endoderm  underlies  the  aortic  sac.  Cross sections  (K)  of  corresponding  three‐dimensional models  (G, H,  I, dashed  line). Note  the overlap between Tbx2 and Tbx3 in  ventral  endoderm  (L,  arrow).  avc, atrioventricular  canal;  dpw,  dorsal pericardial  wall;  la,  left  atrium;  lv,  left ventricle;  oft,  outflow  tract;  ov,  otic vesicle;  pa1,  2,  1st  and  2nd  pharyngeal arch; ph, pharynx; pp1–3, first, second and third pharyngeal pouches; ra, right atrium; rv, right ventricle. Scale bar  in  (A) and  (D) is 100 mm and in (E) and (F) is 50 µm. 

 Loss of Tbx1 affects Tbx2 and Tbx3 expression in the caudal pharynx  SHF signaling pathways are affected  in Tbx1 null mutant embryos resulting  in hypoplasia of the distal OFT at midgestation26. To determine whether this OFT phenotype coincides with altered expression of Tbx2 and Tbx3, we examined the expression patterns of all three genes by  in  situ hybridization on whole embryos and  transverse  sections  in wildtype and Tbx1‐/‐ embryos. The  level of Tbx2 expression was reduced  in the pharyngeal region  in E9.5 Tbx1‐/‐ 

123

embryos  (Figure  2C,  D)  compared  to  controls  (Figure  2A,  B).  In  contrast,  the  expression domain  of  Tbx2  was  expanded  in  the  first  arch  of  Tbx1  null  embryos  (Figure  2C, arrowhead)27. Tbx2 was downregulated in the dorsal pericardial wall (Figure 2F, red surface), and the area of co‐expression with Tbx1 in the SHF was thus greatly reduced in size (purple surface  in Figure 2F). Similarly, accumulation of Tbx3 transcripts was reduced  in the caudal pharyngeal  region  including  the dorsal pericardial wall  (Figure  2I, bracket;  Supplementary Material, Figure S2B, D), and expanded in the first arch of Tbx1‐/‐ embryos at E9.5 (Figure 2I, arrow). 

Previous  work  has  documented  reduced  NC‐derived  cell  numbers  in  the  caudal pharyngeal region of Tbx1 null mutants, showing that Tbx1‐responsive Gbx2 signaling from pharyngeal ectoderm  is  required  for proper guidance of  the adjacently  located NC cells  to the  caudal  pharynx, where  Tbx2  and  Tbx3  are  co‐expressed  28, 29. We  thus  analyzed  and quantified  the  number  of NC‐derived  cells  in wildtype  and  Tbx1  null mutant  embryos  by labeling NC‐derived cells with an Ap2α antibody, and found a 50% reduction in the number of Ap2α‐positive NC‐derived cells and, among  the  remaining cells, a 20%  reduction of  the fraction  of  Tbx3‐positive  cells  compared  to  the wildtype  situation  (n=3  embryos  of  each genotype; Figure 2H,  J, K). Hence  loss of Tbx3 expression  in Tbx1‐/‐ embryos  reflects both reduced  numbers  of  crest‐derived  cells  and  a  reduction  of  Tbx2‐  and  Tbx3‐positive  crest cells.  In wildtype embryos, Tbx2 and Tbx3 overlap  in ventral pharyngeal endoderm.  In  the hypoplastic  foregut  of  Tbx1‐/‐  embryos, we  observed  that  ventral  expression  of  Tbx2 was decreased (Figure 2M, arrow), whereas Tbx3 expression was maintained (Figure 2O). Thus, Tbx1‐deficiency  affects  Tbx2  and  Tbx3  expression  in  mesodermal,  NC‐derived  and endodermal cells in the caudal pharynx, supporting a requirement for Tbx1 upstream of Tbx2 and Tbx3 during OFT development. 

 

Compound  Tbx2‐Tbx3‐deficiency  affects  endodermal  Tbx1  expression  and  key  signaling molecules in the SHF 

We next assessed whether Tbx1 expression  is affected  in  the absence of paralogs Tbx2 or Tbx3  by  analyzing  E9.5  Tbx2‐/‐  and  Tbx3‐/‐ mouse  embryos  using  in  situ  hybridization  on transverse sections. The overall expression pattern of Tbx1 was found to be normal in both Tbx2  and Tbx3 null mutants  (Figure 3, Tbx1). Because Tbx2  and Tbx3  are  co‐expressed  in multiple regions and share common targets in the heart, they could function redundantly to regulate  Tbx1  and OFT development  9. We  thus  generated mice double heterozygous  for Tbx2 and Tbx3 null alleles. Only a  few  such mice were obtained because  this genotype  is afflicted  with  severe  craniofacial  defects  30.  Tbx2;Tbx3  double  heterozygous  mice  were interbred  to  obtain  Tbx2‐/‐;Tbx3‐/‐  embryos  (Table  1).  Tbx2‐/‐;Tbx3‐/‐  embryos  could  be recovered  up  to  E9.5  (n=11/150)  at  mendelian  ratios  and  displayed  impaired  overall embryonic growth, pericardial edema and hypoplasia of the OFT and right ventricle (Figure 3D;  Supplementary  Material,  Figure  S3C,  D).  Tbx1  expression  is  restricted  to  lateral pharyngeal  endoderm  in wildtype,  Tbx2‐/‐  and  Tbx3‐/‐  embryos.  In  Tbx2‐/‐;Tbx3‐/‐  embryos, Tbx1 was upregulated in the subdomain of the ventral endoderm that normally co‐expresses Tbx2  and  Tbx3  (Figure  3,  Tbx1,  arrowhead;  Supplementary Material,  Figure  S3L,  arrow; Figure 1L, arrow). In contrast, Tbx1 expression was unchanged in pharyngeal mesoderm and in  lateral  pharyngeal  endoderm  that  do  not  co‐express  these  factors.  This  observation 

124

suggests  functional redundancy of Tbx2 and Tbx3  in the suppression of Tbx1 expression  in ventral pharyngeal endoderm.  

 Figure 2. Tbx2 and Tbx3 are affected by  loss of Tbx1. Tbx2 and Tbx3 expression  is broader  in  the  first arch (arrowhead in C and I) and reduced in the caudal pharynx (brackets in C and I; arrows in D and J) of E9.5 Tbx1 null embryos. Three‐dimensional reconstructions of  the dorsal pericardial wall showed a smaller overlapping region of Tbx1/Tbx2 (compare purple region in E with F) and reduced detection of Tbx2 mRNA (D, arrowheads, blue region absent in F) in the dorsal pericardial wall of Tbx1‐/‐ embryos. Immunofluorescence and histograms (K)  showing  a  reduction  in  Tbx3‐positive mesenchymal  cells  (J,  white  arrows),  Ap2a‐positive  neural  crest‐derived  cells  (K)  and  Tbx3‐positive/Ap2a‐positive  cells  (compare  yellow  staining  in  H  with  J;  K)  in  Tbx1‐/‐ 

embryos.  3D‐reconstructions  reveal  loss  of  Tbx2  expression  in  ventral  pharyngeal  endoderm  (M,  arrow), whereas expression of Tbx3  is maintained  in pharyngeal endoderm of Tbx1‐/‐ embryos (O, yellow). Ca, caudal; Cr,  cranial; D,  dorsal;  dpw,  dorsal  pericardial wall;  L,  left  lateral;  la,  left  atrium;  lv,  left  ventricle;  pa1,  first pharyngeal arch; ph, pharynx; pp1–3; first, second and third pharyngeal pouch; R, right lateral; ra, right atrium; V, ventral. Scale bar is 100 µm.    

125

The  LIM  homeodomain  transcription  factor  Isl1  is  expressed  in  undifferentiated cardiac  progenitors  in  the  SHF  and  in  the  distal  OFT.  In  Tbx2‐/‐;Tbx3‐/‐  embryos,  Isl1 transcripts could  still be detected  in SHF cells and  the  shortened OFT,  suggesting  that  the deployment  of  SHF  cells  is  compromised  downstream  of  Isl1  expression  (Supplementary Material,  Figure  S3D,  arrow). We  therefore  examined  the  expression  patterns  of  known regulators of SHF development. Shh has been implicated in proliferation and deployment of cardiac  progenitor  cells  and  in  signaling  events  required  for  cardiac NC  survival  from  an expression  site  in  ventral  pharyngeal  endoderm  31. Moreover,  Shh  has  been  reported  to regulate Tbx1 in pharyngeal endoderm and arches 32, 33. Shh expression in ventral pharyngeal endoderm was  decreased,  concomitant with  the  increased  expression  of  Tbx1,  in  Tbx2‐/‐

;Tbx3‐/‐ embryos, but not in Tbx2 or Tbx3 single mutants (Figure 3, Shh, arrowhead). 

We  subsequently  investigated  FGF  signaling,  also  known  to  play  a  critical  role  in regulating SHF progenitor cell proliferation  in pharyngeal mesoderm distal to the OFT. Fgf8 appears  to be  the major FGF  ligand driving heart  tube elongation and Fgf8 and Tbx1 have been linked genetically during vascular morphogenesis and to the etiology of 22q11.2DS 6,18, 34,35.  At  E9.5  Fgf8  is  co‐expressed  with  Tbx1  in  lateral  pharyngeal  endoderm,  overlying surface ectoderm and, at low level, in pharyngeal mesoderm lateral to the pharynx including SHF progenitor cells 15, 36, 37. We found elevated Fgf8 transcript accumulation in the SHF and OFT of  compound Tbx2‐/‐;Tbx3‐/‐ embryos  (Figure 3,  Fgf8,  red arrowheads,  Supplementary Material, Figure S3K, arrowhead).  

BMP  signaling  induces  cardiac  differentiation  and  antagonizes  FGF  signaling proximally to the OFT during heart tube extension 7. We therefore included Bmp4, known to be a crucial BMP ligand during OFT development, in our expression pattern analyses 38. We observed a decrease in Bmp4 transcript levels in ventral pharyngeal endoderm, where Tbx2 and Tbx3 are normally co‐expressed, as well as  in pharyngeal mesoderm  including the SHF and distal OFT of Tbx2‐/‐;Tbx3‐/‐ embryos  (Figure 3, Bmp4, arrowheads). Bmp4 and Nkx2‐5 expression  in  the  dorsal  pericardial  wall  has  been  reported  to  depend  on  GATA  family member Gata6, where  it  is required for proper maturation of cardiomyocyte precursors 39. In Tbx2‐/‐;Tbx3‐/‐ embryos,  in  situ hybridization  revealed a decrease  in Gata6 expression  in the dorsal pericardial wall, presumably affecting BMP‐signaling in the SHF (data not shown). Albeit  slightly  less  severe, a  shortened OFT, hypoplastic  right ventricle and modulations  in FGF  and BMP  ligand  and  Shh expression were  also observed  in  Tbx2‐/‐;Tbx3+/‐  and  Tbx2+/‐

;Tbx3‐/‐  compound  mutants  (Figure  3E,  I;  n=21  and  n=15,  respectively,  Table  1;  n=3  as examined by in situ hybridization). However, endodermal expression of Tbx1 was unaffected in  these compound mutant embryos  (Figure 3E, Tbx1). These  results  indicate gene dosage effects and functional redundancy between Tbx2 and Tbx3, as a single allele of either gene is insufficient to activate normal FGF and BMP and Hh signaling pathways, yet  is sufficient to repress Tbx1 in ventral endoderm. 

Taken together, our findings indicate that endodermal Tbx1 and the abovementioned signaling molecules  are potential downstream effectors of  the  redundant  actions of  Tbx2 and Tbx3, impacting on both pharyngeal and OFT development.  

   

126

 

Figure 3. Morphological, Tbx1 expression and  signaling  component analysis  in Tbx2;Tbx3  compound mutant embryos. Severe hypoplasia of  the outflow  tract and  right ventricle, ectopic distribution of Tbx1 mRNA and decreased expression of Bmp4 and Shh  in  the  ventral endoderm  (black arrowheads) were observed  in E9.5 Tbx2‐/‐;Tbx3‐/‐  embryos  compared  with  wild‐type,  Tbx2‐/‐  and  Tbx3‐/‐  embryos  (A–D).  Elevated  Fgf8  and decreased Bmp4 expression was observed in splanchnic mesoderm (red arrowheads). Tbx2+/‐;Tbx3‐/‐ and Tbx2‐/‐

;Tbx3+/‐ embryos display similar aberrations in transcript levels of Shh, Fgf8 and Bmp4, but no ventral expansion of endodermal Tbx1 (E). Composite Tbx2;Tbx3 mutant embryos with pharyngeal arch, OFT and RV hypoplasia (G–I). Morphology  and  three‐dimensional  reconstruction  of  the  pharyngeal  endoderm  showing  patterning defects  of  interpouch  endoderm  in  Tbx2‐/‐;Tbx3‐/‐  embryos  (G′,  red  arrow)  and  hypoplasia  of  the  first  and second pharyngeal pouches (G′‐I′). dpw, dorsal pericardial wall; lv, left ventricle; pa1–3, first, second and third pharyngeal  arch; oft, outflow  tract; ph, pharynx; pp1–3;  first,  second  and  third pharyngeal pouch;  ra,  right atrium; rv, right ventricle. Scale bar in (A) is 100 µm.   Pharyngeal segmentation defects in Tbx2‐/‐;Tbx3‐/‐ embryos In  vertebrates,  the  pharyngeal  apparatus  is  a  transient  structure  and  contributes  to  the thymus,  thyroid  and  parathyroid,  structures  frequently  affected  in  22q11.2DS.  Upon macroscopic examination of Tbx2‐/‐;Tbx3‐/‐, Tbx2‐/‐;Tbx3+/‐ and Tbx2+/‐;Tbx3‐/‐ mutants at E9.5, 

127

the  pharyngeal  region  was  observed  to  be  severely  affected  (Table  1)  revealing  an underdeveloped  first  pharyngeal  arch,  while  the  more  caudal  arches  were  hypoplastic compared  to wildtype controls  (Figure 3G‐I). The  foregut of E9.5 control embryos  showed three pharyngeal pouches and  two  interpouch regions  (Figure 3F, F’, pp1‐3). Tbx2‐/‐;Tbx3‐/‐ embryos displayed some pharyngeal expansion, as the foregut did not acquire the tube‐like shape observed  in Tbx1‐/‐ embryos  (compare Figure 3G’ with 2M, O). However,  interpouch endoderm could not be distinguished (Figure 3G, red arrow). Pharyngeal segmentation was also, albeit less severely, affected in embryos lacking three of the four alleles (Tbx2+/‐;Tbx3‐/‐ and Tbx2‐/‐;Tbx3+/‐),  indicating  that a developmental delay  is not  the primary cause of  this phenotype  (Figure  3H,  I).  Unfortunately,  all  compound  Tbx2;Tbx3  mutants  die  by  mid‐gestation, making  it  impossible to study the development and differentiation of pharyngeal precursors of  the  (para)thyroid and  thymus. Nevertheless, our  results  indicate  that proper segmentation of the pharyngeal region requires all four alleles of Tbx2 and Tbx3, suggesting roles during development of the pharyngeal apparatus and possibly its derivatives. 

 

Severe arterial pole defects and altered FGF‐ and BMP‐signaling in Tbx1‐/‐;Tbx2‐/‐ and Tbx1‐/‐;Tbx3‐/‐ embryos  Since Tbx1 is required for correct pharyngeal expression of Tbx2 and Tbx3, which in turn are redundantly  required  to  attenuate  expression  of  Tbx1  in  the  ventral  endoderm,  we hypothesized  that  these  three  genes  could  constitute  a  regulatory  T‐box  network.  We therefore  investigated  the combinatorial  in vivo  requirements  for Tbx1 and either Tbx2 or Tbx3 by interbreeding Tbx1;Tbx2 or Tbx1;Tbx3 double heterozygous mice and analyzing the respective  compound  mutant  embryos.  Tbx1+/‐;Tbx2+/‐  and  Tbx1+/‐;Tbx3+/‐  mice  were obtained at  the expected mendelian  ratio and are viable and  fertile. As Tbx3‐deficiency  is reported to delay aortic arch artery formation 23, we investigated whether heterozygosity for Tbx3  influences  the  incidence  or  severity  of  pharyngeal  arch  artery  defects  in  Tbx1+/‐ 

embryos.  We  did  not  find  significant  changes  at  either  E10.5  or  E15.5  (Supplementary Material, Figure S4D). Analysis of E9.5 and E10.5 embryos obtained by interbreeding Tbx1+/‐

;Tbx2+/‐ or Tbx1+/‐;Tbx3+/‐ mice  revealed  that Tbx1‐/‐;Tbx2‐/‐ embryos were not  recovered at the expected mendelian  ratio  (n=4/134, expected n=8.4/134),  in  contrast  to Tbx1‐/‐;Tbx3‐/‐ embryos (12/156). Importantly, 4/4 of Tbx1‐/‐;Tbx2‐/‐ embryos and 9/12 (75%) of Tbx1‐/‐;Tbx3‐/‐  embryos  displayed  impaired  overall  embryonic  growth  with  development  apparently blocked  at  E8.5  (Figure  4D,  J).  These  embryos  all  exhibited  pericardial  edema.  Severe hypoplasia of the pharyngeal region was also observed, including underdevelopment of the first arch (Figure 4D, J), which forms relatively normally in Tbx1‐/‐ embryos 11. Expansion and segmentation  of  the  pharyngeal  endoderm was mildly  affected  in  Tbx1+/‐;Tbx2‐/‐  embryos compared to wildtype and Tbx1‐/‐ embryos (Supplementary Material, Figure S5C). We could not  perform  transcript  detection  or  immunohistochemical  analyses  on  Tbx1‐/‐;Tbx2‐/‐ 

embryos, since 3 out of 4 embryos were necrotic and thus unfit for molecular analysis. We compared  cardiac  morphology  between  E9.5  wildtype  and  Tbx1‐/‐;Tbx2‐/‐  embryos  using histological and 3D analyses and found a severely shortened OFT connected to an embryonic ventricle, whereas morphological signs of a developing  right ventricle were  lacking  (Figure 4D,  F,  n=3).  Moreover,  the  OFT  lumen  of  the  mutant  heart  was  extremely  narrow  or completely obstructed by myocardium. 

128

 Figure  4.  Heart  tube elongation  is  severely compromised  by  loss  of Tbx1  and  either  Tbx2  or Tbx3. Right  lateral views at E9.5  showing  pharyngeal and  cardiac  hypoplasia  in Tbx1‐/‐;Tbx2‐/‐  (D) and Tbx1‐/‐;Tbx3‐/‐  embryos  (J).  3D reconstruction  of  a  Tbx1‐/‐

;Tbx2‐/‐  heart  revealing  a shortened  outflow  tract with a constricted lumen (F, arrowhead).  Transverse sections  showing pharyngeal  hypoplasia  (ph) and  a  persistent  dorsal mesocardium  in  Tbx1‐/‐

;Tbx3‐/‐ embryos (N, arrow). Milder  pharyngeal hypoplasia  is  observed  in Tbx1‐/‐  embryos  (L).  In  situ hybidization  showing reduced  Tbx5‐negative right  ventricular  and  OFT myocardium in Tbx1‐/‐;Tbx3‐/‐  embryos  (R).  lv,  left ventricle;  la,  left  atrium, pa1,  1st  pharyngeal  arch; oft,  outflow  tract;  ph, pharynx;  ra,  right  atrium; rv, right ventricle. Scale bar is 100 μm. 

  

As we could not  isolate a sufficient number of Tbx1‐/‐;Tbx2‐/‐ embryos, we examined transverse  sections  of  Tbx1‐/‐;Tbx3‐/‐  embryos,  and  found  that  pharyngeal  endoderm was severely  reduced,  and  that  the  dorsal mesocardium  failed  to  close  under  the  hypoplastic pharynx  (Figure  4N,  arrow).  Gene  expression  analysis  revealed  that  Tbx1‐/‐;Tbx3‐/‐  hearts were almost entirely positive  for Tbx5  transcripts, normally  restricted  to  the  left ventricle and  inflow regions of the heart  (Figure 4O‐R).  In addition, very  few  Isl1‐positive cells were observed at the arterial pole compared to the situation  in Tbx1‐/‐ or the majority of Tbx3‐/‐ hearts (Supplementary Material, Figure S6A‐D). The observation that Tbx2 and Tbx3 are co‐operatively  required  for  Hh,  FGF  and  BMP  ligand  expression,  key  regulators  of  cardiac progenitor  cell proliferation  and differentiation,  led us  to  investigate  the  extent  to which these  signaling  pathways  were  altered  in  Tbx1‐/‐;Tbx3‐/‐  embryos  compared  to  wildtype, Tbx1‐/‐ and Tbx3‐/‐ embryos. Using in situ hybridization on transverse sections, Shh expression was found to be expressed at a lower level in ventral pharyngeal endoderm of Tbx1‐/‐;Tbx3‐/‐ (Figure  5C)  compared  to  Tbx1‐/‐  (Figure  5B)  and  Tbx3‐/‐  embryos  (Figure  3,  Shh).  Fgf8 expression  was  reduced  in  lateral  pharyngeal  endoderm  of  Tbx1‐/‐  embryos  at  E9.5,  as 

129

previously  documented  (Figure  5E,  arrow)  28.  In  contrast,  in  Tbx1‐/‐;Tbx3‐/‐  compound mutants,  Fgf8  transcript  accumulation  was  elevated  in  the  SHF  and  OFT  (Figure  5F, arrowhead). Consistent with elevated ventral and  loss of  lateral Fgf8 expression,  increased p‐ERK was observed  in pharyngeal mesoderm underlying the pharynx and  in the distal OFT of  Tbx1‐/‐;Tbx3‐/‐  embryos  (Figure  5M,  white  arrow),  compared  to  wildtype  and  Tbx1‐/‐ embryos (Figure 5K, L). Bmp4 expression was unchanged in Tbx1‐/‐ embryos (compare Figure 5G with  5H), but decreased  transcript  levels were observed  in  the distal OFT  and  SHF of Tbx1‐/‐;Tbx3‐/‐  embryos  (Figure  5I).  Consistent  with  altered  Bmp4  expression,  reduced  P‐Smad  labeling was  observed  in  the  distal OFT  of  Tbx1‐/‐;Tbx3‐/‐  (Figure  5Q, white  arrow) compared to wildtype and Tbx1‐/‐ embryos (Figure 5O, P).  

 

Figure 5. Altered signaling pathway components in Tbx1;Tbx3 composite mutant embryos. In situ hybridization showing that endodermal Shh expression was reduced in E9.5 Tbx1‐/‐;Tbx3‐/‐ compared to wildtype and Tbx1‐/‐ 

embryos (A‐C, arrowhead). Fgf8 expression was reduced  in  lateral endoderm of Tbx1‐/‐ (E, black arrows) and Tbx1‐/‐;Tbx3‐/‐  (F,  black  arrows)  embryos  and  elevated  in  ventral  pharyngeal  mesoderm  of  Tbx1‐/‐;Tbx3‐/‐ 

embryos (F, arrowhead). Bmp4 transcript detection was decreased  in the distal OFT (I, arrowhead) of Tbx1‐/‐

;Tbx3‐/‐ embryos. Immunofluorescence of wildtype P‐Erk (J) and P‐Smad (N) staining with higher magnifications in wildtype (K, O), Tbx1‐/‐ (L, P) and Tbx1‐/‐;Tbx3‐/‐ embryos (M, Q) of the boxed regions  in J and N. P‐Erk was increased  (M, white  arrow)  and P‐Smad was  reduced  (Q, white  arrow)  compared  to  the  situation  in  atrial endocardium  (Q,  yellow  arrow)  in  the  distal  OFT  of  Tbx1‐/‐;Tbx3‐/‐  embryos.  ph,  pharynx;  l‐end,  lateral pharyngeal endoderm;  lv,  left  ventricle; oft, outflow  tract;  v‐end,  ventral pharyngeal endoderm;  se,  surface ectoderm. Scale bar in Panels A, J, N is 100 μm and in Panels K‐M, O‐Q 25 μm. 

130

It has been  shown  that Tbx1 deficiency affects proliferation and differentiation of  cardiac progenitor  cells  17.  Our  results  demonstrate  that  combinatorial  loss  of  regulators  of proliferation  and  differentiation  of  cardiac  precursors  in  Tbx1‐/‐;Tbx2‐/‐  and  Tbx1‐/‐;Tbx3‐/‐ embryos  results  in a  severe  failure of heart  tube elongation. These changes are  similar  to those  observed  in  Tbx2‐/‐;Tbx3‐/‐  embryos.  Together  these  data  uncover  impaired intercellular  signaling  in  cardiac  precursors  and  surrounding  tissues  in  composite Tbx1/Tbx2/Tbx3  mutant  embryos  during  OFT  formation  and  pharyngeal  development, structures contributing to the pathogenesis of 22q11.2DS.  

Discussion 

 

Tbx1,  Tbx2,  and  Tbx3  constitute  a  T‐box  regulatory  network  that  controls  OFT  and pharyngeal development 

Variability  in  clinical  features  between  22q11.2DS  patients  suggests  that  disruptions  of multiple  genes  or  pathways  are  likely  to  contribute  to  the  cardiopharyngeal  phenotypes found in 22q11.2DS. The 22q11.2DS gene Tbx1 is an important regulator of pharyngeal and OFT development, as Tbx1 deficiency affects SHF proliferation and differentiation leading to hypoplasia of the distal OFT and a common ventricular outlet, as well as patterning defects of the pharyngeal apparatus 11‐13. As T‐box factors comprise a family of related proteins that recognize a similar DNA binding site and interact with the common co‐factors 40, mutations in other T‐box factor genes may contribute to phenotypic variability. Loss of function mouse models of  two other T‐box  transcription  factors, Tbx2 and Tbx3,  revealed  important  roles during  arterial  pole  development.  Tbx2  and  Tbx3  are  closely  related  transcriptional repressors  and  are  required  for  proper  deployment  of  SHF  cells  and  ventriculoarterial alignment  22‐24, 41.  Tbx2  and  Tbx3  are  thus  excellent  candidate  modifier  genes  of  the cardiopharyngeal phenotypes resulting from Tbx1 disruption. 

Our study indicates that Tbx1, Tbx2, and Tbx3 constitute a T‐box regulatory network that controls OFT and pharyngeal development. Firstly, Tbx1 is required for the expression of Tbx2 and Tbx3  in pharyngeal and NC‐derived mesenchyme. As Tbx1  is not expressed  in NC cells the effect on Tbx2 and Tbx3 in this cell type is likely to be indirect, mediated by altered intercellular  signaling between Tbx1 expressing mesoderm or pharyngeal epithelia and NC cells.  Tbx2  and  Tbx3  are  also  potential  direct  targets  of  Tbx1,  as  these  genes  are  co‐expressed  in  pharyngeal  mesoderm,  including  SHF  cells  in  the  dorsal  pericardial  wall. Ongoing analysis of Tbx2 and Tbx3 cis‐regulatory elements will provide insight into the Tbx1 dependent signaling pathways, and potential direct role of Tbx1 in pharyngeal mesoderm, in the transcriptional regulation of these genes. 

Secondly,  we  demonstrate  that  Tbx2  and  Tbx3  are  co‐expressed  in  multiple  cell populations  and  that  loss  of  function  of  both  Tbx2  and  Tbx3  causes  overall  growth impairment, disturbed patterning of endodermal pouches  (Figure 3) and hypoplasia of  the OFT  and  right  ventricle  suggesting  defective  SHF  deployment.  Tbx2  and  Tbx3  overlap  in function  to pattern pharyngeal endoderm,  since  Tbx1 expression was observed  in  ventral pharyngeal endoderm of Tbx2‐/‐;Tbx3‐/‐ embryos. This  localized up‐regulation of Tbx1  in the 

131

ventral endoderm of Tbx2;Tbx3 compound mutants, coinciding with the site where Tbx2 and Tbx3 are normally co‐expressed, suggests that Tbx2 and Tbx3 directly suppress Tbx1  in this domain  of  the  foregut. However,  putative  T‐box  binding  sites  regulating  Tbx1  expression have not yet been identified. In addition, downregulation of Shh expression was observed in ventral  pharyngeal  endoderm  where  Tbx2  and  Tbx3  are  co‐expressed.  Hh‐signaling  is required during SHF proliferation and migration and, together with downregulation of Bmp4 and upregulation of Fgf8 in the SHF and distal outflow tract, potentially underlies perturbed SHF deployment in Tbx2;Tbx3 compound mutants.   

Thirdly,  we  provide  evidence  for  the  functional  importance  of  a  cross‐regulating Tbx1/Tbx2/Tbx3 network, as embryos lacking Tbx1/Tbx2 or Tbx1/Tbx3 present similar severe pharyngeal and heart tube elongation phenotypes, suggesting overlapping roles for Tbx2 and Tbx3 in conferring network robustness. This phenotype is characterized by a C‐looped heart tube that fails to close dorsally, cardiac dilation and OFT obstruction and pericardial edema, associated with reduced addition of SHF derived progenitor cells to the arterial pole of the heart  as  revealed  by  Tbx5  and  Isl1  expression.  This  severe  phenotype  is  associated with overall growth  impairment and developmental delay, potentially resulting from the cardiac defects.  These  results  demonstrate  that  the  Tbx1/Tbx2/Tbx3  network  identified  here  is robust, requiring loss of function of two of the three components for network collapse and a severe phenotype to emerge. Tbx1 and Tbx2 are co‐localized in a broader domain of the SHF than  Tbx1  and  Tbx3  potentially  explaining  the  low  numbers  of  Tbx1‐/‐;Tbx2‐/‐  embryos recovered at E9.5. Moreover, downregulation of Tbx2 and Tbx3 in Tbx1‐deficient endoderm and splanchnic mesoderm could further disrupt SHF development in Tbx1‐/‐;Tbx2‐/‐ and Tbx1‐/‐;Tbx3‐/‐ embryos.   

 

Disruption of SHF signaling in compound T‐box factor mutants  

Recent  work  has  defined  the  importance  of  intercellular  signals  in  controlling  SHF deployment during heart tube elongation, including FGF, BMP, Shh, Notch, retinoic acid and Wnt signaling pathways 5, 6. In particular, the balance between FGF signaling, predominant in the  lateral  pharynx  where  it  promotes  progenitor  cell  proliferation,  and  BMP  signaling, predominant  in  the  ventral  pharynx  and  distal  OFT  where  it  drives  myocardial differentiation, has emerged as a central axis controlling progressive addition of SHF cells to the OFT. Antagonism between  these signaling pathways has been dissected  revealing  that BMP  signaling downregulates  FGF  signaling  through BMP  target  genes  in NC  cells  7, 42.  In addition,  BMP  regulates  microRNA  function  to  silence  the  SHF  progenitor  cell  genetic program 43. We have investigated the expression of Fgf8 and Bmp4, thought to be the major ligands mediating  this signal exchange during OFT morphogenesis  in  the mouse, and p‐Erk and  P‐Smad,  intracellular  readouts  of  FGF  and  BMP  signaling,  in  embryos  lacking combinations of Tbx1/Tbx2/Tbx3. Our results reveal that in compound mutant embryos, but not in single mutant embryos, combinatorial defects are observed such that proximal to the elongating heart tube FGF signaling is elevated and BMP signaling downregulated (Figure 6). The topography of signaling events  in the caudal pharynx of compound mutant embryos  is thus altered and is likely to contribute significantly to generating the observed phenotypes.  

132

Alterations  in  FGF  and BMP  signaling pathways  in  Tbx2‐/‐;Tbx3+/‐  and  Tbx2+/‐;Tbx3‐/‐ embryos  indicate that more than one functional allele of either Tbx2 or Tbx3  is required to correctly  regulate  these  signaling  pathway  components.  The  elevated  Fgf8  expression  in pharyngeal  mesoderm  of  Tbx1/Tbx2/Tbx3  compound  mutants  potentially  results  from disrupted  BMP  signaling  and  decreased  antagonism  between  these  pathways  (Figure  6). BMP  signaling  is  likely  to  be  tightly  regulated  during  normal  OFT  development,  because expanded  BMP  signaling  in  Nkx2.5  mutant  embryos  also  leads  to  failure  of  heart  tube extension 38. 

  A  small  percentage  of  Tbx3‐/‐  embryos  display  a  severe  phenotype  on  a  mixed Bl6/CD1  genetic  background  (Table  1)23,  affecting  endodermal  Hh‐signaling  and  the expression  of  Bmp4  and  Fgf8  in  the  SHF  and  distal  OFT,  similar  to  that  the  expression changes observed  in  Tbx2‐/‐;Tbx3‐/‐,  Tbx2+/‐;Tbx3‐/‐  and  Tbx2‐/‐;Tbx3+/‐  embryos on  a  FVB/N background. Tbx1/Tbx2/Tbx3  is  thus  likely  to be part of a  larger network comprising other genetic  factors  that  differ  between  different  genetic  backgrounds.  Furthermore, downregulation  of  the  BMP  target  genes Msx1  and Msx2  is  observed  in  the  pharyngeal region  of  severely  affected  Tbx3 mutant  embryos,  supporting  a  role  for  this  gene  in  the regulation  of  BMP  signaling  during  pharyngeal  development  (Supplementary  Material, Figure S6F, H).  

 

Figure 6. Altered FGF and BMP signaling in Tbx1/Tbx2/Tbx3  composite  mutant embryos.  Cartoons  showing  the distribution  of  Tbx1,  Tbx2  and  Tbx3  and the topography of BMP and FGF signaling in pharyngeal mesenchyme (comprised of mesodermal  cells,  dark  grey,  and  neural crest‐derived cells,  light grey), pharyngeal endoderm, dorsal pericardial wall and the outflow  tract  of wildtype  (A),  Tbx1‐/‐  (C) and compound mutant embryos (D, E). (B) Schematic summary of FGF‐BMP signaling axis  regulation  by  Tbx1  and  by  the redundant  action  of  Tbx2/Tbx3  during pharyngeal  and  arterial  pole morphogenesis. Red  arrow  in C,  reduced expression of Tbx2 and Tbx3; green arrow in D, elevated expression of Tbx1. See text for details. 

 

TBX2 and TBX3 are candidate modifier genes of the cardiopharyngeal phenotypes in TBX1 haploinsufficient 22q11.2DS patients 

Tbx1  regulates proliferation and differentiation of  cardiac progenitor  cells  in  the SHF, and our data demonstrate  that Tbx2/Tbx3  function  redundantly  to assist  in coordinating  these crucial  developmental  processes. While  the  detailed mechanisms  linking  Tbx1/Tbx2/Tbx3 function to the regulation of this signaling axis remain to be dissected, our study has shown that  in  the absence of  two components  the Tbx1/Tbx2/Tbx3  regulatory network collapses, 

133

severely compromising crucial intercellular Hh, BMP and FGF signaling events during arterial pole morphogenesis (Figure 6). Interestingly, recent work has shown that DNA variations in TBX1 are unable to fully explain the variable cardiovascular phenotypes in 22q11DS patients, highlighting the importance of genetic modifiers of the 22q11DS phenotype 44. Using mouse models, genetic interactions have already been identified between Tbx1 and the genes Crkl, Fgf8, Pitx2, Gbx2, Chd7, Six1/Eya1 and Hes1 29, 45‐47. Here, we show that Tbx2 and Tbx3 can be  added  to  this  list.  Our  findings  provide  new  insights  into  the mechanisms  by  which polygenic  mutations  compromise  the  robustness  of  cardiac  morphogenesis  and  lead  to CVMs. In conclusion, this work highlights the central roles of Tbx1/Tbx2/Tbx3 in conotruncal morphogenesis and  identifies TBX2 and TBX3 as potential candidate modifier genes of  the cardiopharyngeal phenotypes in TBX1 haploinsufficient 22q11.2DS patients. 

 Acknowledgements We thank Jaco Hagoort for his help preparing the interactive 3D‐PDF file and Edouard Saint‐Michel and Laure Lo‐Ré for technical assistance. 

 FUNDING This work was  supported  by  the  European  Commission  under  the  FP7  Integrated  Project CardioGeNet (HEALTH‐2007‐B‐223463), the Netherlands Organization for Scientific Research (Vidi grant 864.05.006 to V.M.C. and Mosaic grant 017.004.040 to M.S.R.) and the Fondation pour la Récherche Médicale and Agence National pour la Recherche (to R.G.K.). 

 

Table  1.  Phenotypic  severity  of  embryos  resulting  from  Tbx2+/‐;Tbx3+/‐,  Tbx1+/‐;Tbx2+/‐    or  Tbx1+/‐;Tbx3+/‐ 

intercrosses. 

      Phenotypic severity c

Genotype  N (obs) a  N (exp) b 1 2 3 4 5 

Tbx2+/+;Tbx3+/+  10 9.4  10 0 0 0 0 

Tbx2+/‐;Tbx3+/+  20 18.8  20 0 0 0 0 

Tbx2‐/‐;Tbx3+/+  7 9.4  6 0 1 0 0 

Tbx2+/+;Tbx3+/‐  20 18.8  20 0 0 0 0 

Tbx2+/‐;Tbx3+/‐  34 37.5  34 0 0 0 0 

Tbx2‐/‐;Tbx3+/‐  21 18.8  0 0 0 19 2 

Tbx2+/+;Tbx3‐/‐  12 9.4  10 0 2 0 0 

Tbx2+/‐;Tbx3‐/‐  15 18.8  0 0 0 10 5 

Tbx2‐/‐;Tbx3‐/‐  11 9.4  0 0 0 0 11 

Total  150    100 0 3 27 20 

       

134

Tbx1+/+;Tbx2+/+  10 8.4  10 0 0 0 0 

Tbx1+/‐;Tbx2+/+  24 17  24 0 0 0 0 

Tbx1‐/‐;Tbx2+/+  7 8.4  0 7 0 0 0 

Tbx1+/+;Tbx2+/‐  16 17  16 0 0 0 0 

Tbx1+/‐;Tbx2+/‐  36 34  36 0 0 0 0 

Tbx1‐/‐;Tbx2+/‐  13 17  0 13 0 0 0 

Tbx1+/+;Tbx2‐/‐  7 8.4  6 0 1 0 0 

Tbx1+/‐;Tbx2‐/‐  17 17  15 0 2 0 0 

Tbx1‐/‐;Tbx2‐/‐  4d 8.4  0 0 0 0 4 

Total  134    107 20 3 0 4 

       

Tbx1+/+;Tbx3+/+  13 9.75  13 0 0 0 0 

Tbx1+/‐;Tbx3+/+  17 19.5  16 1 0 0 0 

Tbx1‐/‐;Tbx3+/+  7 9.75  0 7 0 0 0 

Tbx1+/+;Tbx3+/‐  19 19.5  17 1 1 0 0 

Tbx1+/‐;Tbx3+/‐  34 39  29 0 5 0 0 

Tbx1‐/‐;Tbx3+/‐  26 19.5  0 23 3 0 0 

Tbx1+/+;Tbx3‐/‐  12 9.75  2 0 8 1 1 

Tbx1+/‐;Tbx3‐/‐  16 19.5  2 0 12 1 1 

Tbx1‐/‐;Tbx3‐/‐  12 9.75  0 1 2 1 8 

Total  156    62 65 15 4 10 

 

a Number of embryos collected of each genotype between E9.0 and E10.5 

b Number of embryos expected of each genotype 

c Phenotypic severity was determined according to the following criteria: 

1: wildtype configuration (example panel 3A) 

2: arches 2‐6 absent, distal outflow tract hypoplastic (example panel 4B) 

3: right ventricle and outflow tract hypoplastic (example panel 3G) 

4: pharyngeal hypoplasia and severe right ventricular and outflow tract  hypoplasia (example panel 3D) 

5: C‐looped dilated heart tube, edema, pharyngeal hypoplasia (including arch 1) (example panel 4D) 

 

d Of which 3 embryos were necrotic 

135

SUPPLEMENTAL FIGURES 

 

Supplemental  Figure  S1. 3D‐reconstruction of  Tbx1,  Tbx2  and  Tbx3  transcript distrubution  in wildtype  E9.5 embryos. Expression patterns of Tbx1/Tbx2, Tbx1/Tbx3 and Tbx2/Tbx3  in different embryos were determined using  in  situ  hybridization  and  subsequently  used  to  generate  3D  reconstructions  of  these  combinations (Supplementary Material, 3D‐PDF file). 

 

 

Supplemental Figure S2.   Tbx3 expression  in the caudal pharynx  is affected by  loss of Tbx1.  In E9.5 Tbx1 null embryos, Tbx3 expression was found to be reduced in pharyngeal mesenchyme (red arrows in B), in the dorsal pericardial wall (black arrows  in B) but not  in ventral endoderm (arrowhead  in B). 3D‐reconstructions of the dorsal pericardial wall showed a smaller overlapping region of Tbx1/Tbx3 (compare orange region in D with C) in Tbx1‐/‐ embryos. dpw, dorsal pericardial wall; la, left atrium; ph, pharynx; ra, right atrium. 

 

136

 

 

Supplemental Figure S3.  Transcript distribution of Mlc2a, Isl1, Fgf8 and Tbx1 in Tbx2; Tbx3 compound mutants.  A  shortened  outflow  tract  and  right ventricular hypoplasia was observed  in compound mutants  (C)  compared  to wildtypes  (A).  Isl1 was relatively unaffected  in  the dorsal pericardial wall and  outflow  tract  (D).  Sagittal  section  of  an  E9.5 wildtype  embryo  (E,  E’),  illustrating  the  plane  of the  sections  in  F‐I.  In Tbx2‐/‐;Tbx3‐/‐ mutants,  Fgf8 was upregulated  in  the dorsal pericardial wall  (K, arrowhead), and Tbx1 was upregulated  in ventral endoderm (L, arrow). dpw, dorsal pericardial wall; la,  left  atrium; oft, outflow  tract; ph, pharynx; V‐end, ventral endoderm. 

 

 

 

Supplemental  Figure  S4.  Heterozygosity  for  Tbx3 does  not modify  the  frequency  or  severity  of  the Tbx1+/‐  fourth  pharyngeal  arch  artery  (PAA) phenotype. Ink  injection at E10.5 showing the right 3rd, 4th and 6th PAAs of a wildtype embryo (A) and absence  of  the  right  4th  PAA  in  Tbx1+/‐  (B)  and Tbx1+/‐;Tbx3+/‐  (C)  embryos.  (D) Bar  graph  showing the  incidence  of  unilateral  (hypoplastic  or  absent) and  bilateral  (hypoplastic,  hypoplastic/absent  and absent)  4th  PAA  defects  for  wildtype,  Tbx3+/‐, Tbx1+/‐  and  Tbx1+/‐;Tbx3+/‐  genotypes.  Examples  of retro‐oesophageal right subclavian artery  in Tbx1+/‐ (E, arrow) and Tbx1+/‐;Tbx3+/‐ (F, arrow) embryos at E14.5. da, descending aorta. 

137

 

 

 

Supplemental Figure S5. 3D‐reconstructions of pharyngeal endoderm  in wildtype, Tbx1‐/‐, and Tbx1+/‐;Tbx2‐/‐ 

E9.5 embryos. Proper segmentation and expansion of the foregut  is severely affected  in Tbx1‐/‐ embryos, but also affected in Tbx1+/‐;Tbx2‐/‐ embryos. 

 

 

 

Supplemental  Figure  S6.  Expression  of  Isl1  in Tbx1;Tbx3 compound nulls and of Msx1 and Msx2 in  Tbx3‐deficient  embryos.  Expression  analysis  of Isl1  revealed  no  differences  in  Tbx1‐/‐  and  Tbx3‐/‐ single mutant embryos but a reduced contribution to  the  Tbx1‐/‐;Tbx3‐/‐  compound  mutant  outflow tract.  BMP  target  genes  Msx1  and  Msx2  were downregulated  in  severely  affected  Tbx3‐/‐ embryos.  dpw,  dorsal  pericardial  wall;  lv,  left ventricle; oft, outflow  tract; pa1, pharyngeal arch; ph, pharynx. 

  References 

  (1)   Wilson DI, Burn J, Scambler P, Goodship J. DiGeorge syndrome: part of CATCH 22. JMG 1993 October;30(10):852‐6. 

  (2)   Hoffman JI, Kaplan S. The incidence of congenital heart disease. J Am Coll Cardiol 2002 June 19;39(12):1890‐900. 

  (3)   Pierpont ME, Basson CT, Benson DW, Jr. et al. Genetic basis  for congenital heart defects: current knowledge: a scientific  statement  from  the  American  Heart  Association  Congenital  Cardiac  Defects  Committee,  Council  on Cardiovascular Disease  in  the  Young:  endorsed by  the American Academy of Pediatrics. Circulation  2007  June 12;115(23):3015‐38. 

138

  (4)   Buckingham M, Meilhac S, Zaffran S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet 2005 November;6(11):826‐37. 

  (5)   Dyer LA, Kirby ML. Sonic hedgehog maintains proliferation in secondary heart field progenitors and is required for normal arterial pole formation. Dev Biol 2009 June 15;330(2):305‐17. 

  (6)   Rochais F, Mesbah K, Kelly RG. Signaling pathways controlling second heart field development. Circ Res 2009 April 24;104(8):933‐42. 

  (7)   Tirosh‐Finkel  L,  Zeisel  A,  Brodt‐Ivenshitz  M  et  al.  BMP‐mediated  inhibition  of  FGF  signaling  promotes cardiomyocyte differentiation of anterior heart field progenitors. Dev 2010 September;137(18):2989‐3000. 

  (8)   Stankunas K, Shang C, Twu KY et al. Pbx/Meis deficiencies demonstrate multigenetic origins of congenital heart disease. Circ Res 2008 September 26;103(7):702‐9. 

  (9)   Hoogaars WMH, Barnett P, Moorman AFM, Christoffels VM. T‐box factors determine cardiac design. Cell Mol Life Sci 2007;64:646‐60. 

  (10)   Scambler PJ. The 22q11 deletion syndromes. Hum Mol Genet 2000 October;9(16):2421‐6. 

  (11)   Jerome LA, Papaioannou VE. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T‐box gene, Tbx1. Nat Genet 2001 March;27(3):286‐91. 

  (12)   Lindsay EA, Vitelli F, Su H et al. Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice. Nature 2001 March 1;410(6824):97‐101. 

  (13)   Merscher S, Funke B, Epstein JA et al. TBX1 is responsible for cardiovascular defects in velo‐cardio‐facial/DiGeorge syndrome. Cell 2001 February 23;104(4):619‐29. 

  (14)   Xu H, Morishima M, Wylie JN et al. Tbx1 has a dual role  in the morphogenesis of the cardiac outflow tract. Dev 2004 July;131(13):3217‐27. 

  (15)   Kelly RG, Brown NA, Buckingham ME. The arterial pole of the mouse heart forms from Fgf10‐expressing cells  in pharyngeal mesoderm. Dev Cell 2001;1:435‐40. 

  (16)   Liao  J,  Aggarwal  VS,  Nowotschin  S,  Bondarev  A,  Lipner  S, Morrow  BE.  Identification  of  downstream  genetic pathways of Tbx1 in the second heart field. Dev Biol 2008 April 15;316(2):524‐37. 

  (17)   Chen  L,  Fulcoli  FG,  Tang  S,  Baldini  A.  Tbx1  regulates  proliferation  and  differentiation  of  multipotent  heart progenitors. Circ Res 2009 October 23;105(9):842‐51. 

  (18)   Vitelli F, Taddei  I, Morishima M, Meyers EN,  Lindsay EA, Baldini A. A genetic  link between Tbx1 and  fibroblast growth factor signaling. Dev 2002 October;129(19):4605‐11. 

  (19)   Vitelli F, Lania G, Huynh T, Baldini A. Partial rescue of the Tbx1 mutant heart phenotype by Fgf8: genetic evidence of impaired tissue response to Fgf8. J Mol Cell Cardiol 2010 November;49(5):836‐40. 

  (20)   Bamshad M, Lin RC, Law DJ et al. Mutations in human TBX3 alter limb, apocrine and genital development in ulnar‐mammary syndrome. Nat Genet 1997 July;16(3):311‐5. 

  (21)   Christoffels VM, Smits GJ, Kispert A, Moorman AF. Development of the pacemaker tissues of the heart. Circ Res 2010 February 5;106(2):240‐54. 

  (22)   Bakker ML, Boukens BJ, Mommersteeg MTM et al. Transcription  factor Tbx3  is required  for the specification of the atrioventricular conduction system. Circ Res 2008;102:1340‐9. 

  (23)   Mesbah  K,  Harrelson  Z,  Theveniau‐Ruissy  M,  Papaioannou  VE,  Kelly  RG.  Tbx3  is  required  for  outflow  tract development. Circ Res 2008 September 26;103(7):743‐50. 

139

  (24)   Harrelson  Z,  Kelly  RG,  Goldin  SN  et  al.  Tbx2  is  essential  for  patterning  the  atrioventricular  canal  and  for morphogenesis of the outflow tract during heart development. Dev 2004 October;131(20):5041‐52. 

  (25)   Aanhaanen WT, Brons JF, Dominguez JN et al. The Tbx2+ primary myocardium of the atrioventricular canal forms the atrioventricular node and the base of the left ventricle. Circ Res 2009 May 7;104(11):1267. 

  (26)   Theveniau‐Ruissy M, Dandonneau M, Mesbah  K  et  al.  The  del22q11.2  candidate  gene  Tbx1  controls  regional outflow tract identity and coronary artery patterning. Circ Res 2008 July 18;103(2):142‐8. 

  (27)   Kelly RG,  Jerome‐Majewska LA, Papaioannou VE. The del22q11.2 candidate gene Tbx1  regulates branchiomeric myogenesis. Hum Mol Genet 2004 November 15;13(22):2829‐40. 

  (28)   Vitelli F, Morishima M, Taddei I, Lindsay EA, Baldini A. Tbx1 mutation causes multiple cardiovascular defects and disrupts neural crest and cranial nerve migratory pathways. Hum Mol Genet 2002 April 15;11(8):915‐22. 

  (29)   Calmont  A,  Ivins  S,  Van  Bueren  KL  et  al.  Tbx1  controls  cardiac  neural  crest  cell migration  during  arch  artery development by regulating Gbx2 expression in the pharyngeal ectoderm. Dev 2009 September;136(18):3173‐83. 

  (30)   Zirzow  S,  Ludtke  TH,  Brons  JF,  Petry  M,  Christoffels  VM,  Kispert  A.  Expression  and  requirement  of  T‐box transcription factors Tbx2 and Tbx3 during secondary palate development in the mouse. Dev Biol 2009 December 15;336(2):145‐55. 

  (31)   Goddeeris MM,  Schwartz R, Klingensmith  J, Meyers  EN.  Independent  requirements  for Hedgehog  signaling by both  the anterior heart  field and neural crest cells  for outflow  tract development. Dev 2007 April;134(8):1593‐604. 

  (32)   Garg V, Yamagishi C, Hu T, Kathiriya IS, Yamagishi H, Srivastava D. Tbx1, a DiGeorge syndrome candidate gene, is regulated by sonic hedgehog during pharyngeal arch development. Dev Biol 2001 July 1;235(1):62‐73. 

  (33)   Yamagishi H, Maeda J, Hu T et al. Tbx1 is regulated by tissue‐specific forkhead proteins through a common Sonic hedgehog‐responsive enhancer. Genes Dev 2003 January 15;17(2):269‐81. 

  (34)   Vitelli F, Zhang Z, Huynh T, Sobotka A, Mupo A, Baldini A. Fgf8 expression  in  the Tbx1 domain  causes  skeletal abnormalities and modifies the aortic arch but not the outflow tract phenotype of Tbx1 mutants. Dev Biol 2006 April 4. 

  (35)   Aggarwal  VS,  Morrow  BE.  Genetic  modifiers  of  the  physical  malformations  in  velo‐cardio‐facial syndrome/DiGeorge syndrome. Dev Disabil Res Rev 2008;14(1):19‐25. 

  (36)   Crossley PH, Martin GR. The mouse Fgf8 gene encodes a family of polypeptides and is expressed in regions that direct outgrowth and patterning in the developing embryo. Dev 1995 February;121(2):439‐51. 

  (37)   Ilagan  R,  bu‐Issa  R,  Brown  D  et  al.  Fgf8  is  required  for  anterior  heart  field  development.  Dev  2006 June;133(12):2435‐45. 

  (38)   Prall  OWJ,  Menon  MK,  Solloway  MJ  et  al.  An  Nkx2‐5/Bmp2/Smad1  negative  feedback  loop  controls  heart progenitor specification and proliferation. Cell 2007 March 9;128(5):947‐59. 

  (39)   Peterkin T, Gibson A, Patient R. GATA‐6 maintains BMP‐4 and Nkx2 expression during cardiomyocyte precursor maturation. EMBO J 2003 August 15;22(16):4260‐73. 

  (40)   Naiche LA, Harrelson Z, Kelly RG, Papaioannou VE. T‐Box Genes in Vertebrate Development. Annu Rev Genet 2005 July 5;39:219‐39. 

  (41)   Dupays L, Kotecha S, Mohun TJ. Tbx2 misexpression impairs deployment of second heart field derived progenitor cells to the arterial pole of the embryonic heart. Dev Biol 2009 June 26;333(1):121‐31. 

  (42)   Kirby ML, Hutson MR. Factors controlling cardiac neural crest cell migration. Cell Adh Migr 2010 October 1;4(4). 

140

  (43)   Wang  J,  Greene  SB,  Bonilla‐Claudio M  et  al.  Bmp  signaling  regulates myocardial  differentiation  from  cardiac progenitors through a MicroRNA‐mediated mechanism. Dev Cell 2010 December 14;19(6):903‐12. 

  (44)   Guo T, McGinn DM, Blonska A et al. Genotype and Cardiovascular Phenotype Correlations with TBX1  in 1,022 Velo‐Cardio‐Facial/DiGeorge/22q11.2 Deletion Syndrome Patients. Hum Mutat 2011 July 27. 

  (45)   Nowotschin  S,  Liao  J,  Gage  PJ,  Epstein  JA,  Campione  M,  Morrow  BE.  Tbx1  affects  asymmetric  cardiac morphogenesis by regulating Pitx2 in the secondary heart field. Dev 2006 April;133(8):1565‐73. 

  (46)   Guris  DL,  Duester  G,  Papaioannou  VE,  Imamoto  A.  Dose‐dependent  interaction  of  Tbx1  and  Crkl  and  locally aberrant RA signaling in a model of del22q11 syndrome. Dev Cell 2006 January;10(1):81‐92. 

  (47)   Randall V, McCue K, Roberts C et al. Great vessel development requires biallelic expression of Chd7 and Tbx1 in pharyngeal ectoderm in mice. J Clin Invest 2009 November;119(11):3301‐10. 

  (48)   Wakker V, Brons  JF, Aanhaanen WT,  van Roon MA, Moorman AF, Christoffels VM. Generation of mice with a conditional null allele for Tbx2. Genesis 2010 January 21. 

  (49)   Davenport TG, Jerome‐Majewska LA, Papaioannou VE. Mammary gland, limb and yolk sac defects in mice lacking Tbx3, the gene mutated in human ulnar mammary syndrome. Dev 2003 May;130(10):2263‐73. 

  (50)   Hoogaars WMH,  Tessari A, Moorman AFM et al.  The  transcriptional  repressor  Tbx3 delineates  the developing central conduction system of the heart. Cardiovasc Res 2004 June 1;62:489‐99. 

  (51)   Moorman AFM, Houweling AC, de Boer PAJ, Christoffels VM. Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole‐mount in situ hybridization protocol. J Histochem Cytochem 2001;49:1‐8. 

  (52)   Chapman DL, Garvey N, Hancock S et al. Expression of  the T‐box  family genes, Tbx1‐Tbx5, during early mouse development. Dev Dyn 1996;206:379‐90. 

  (53)   Kelly RG, Papaioannou VE. Visualization of outflow  tract development  in  the  absence of  Tbx1 using  an  FgF10 enhancer trap transgene. Dev Dyn 2007 March;236(3):821‐8. 

  (54)   Soufan  AT,  van  den  Berg  G,  Moerland  PD  et  al.  Three‐dimensional  measurement  and  visualization  of morphogenesis applied to cardiac embryology. J Microsc 2007;225:269‐74.