Uvodna znanja

Uvodna znanjaUvodna znanja

Ispitna pitanjaIspitna pitanja 1. Odredjivanje 3D strukture proteina – kristalografija x-zracima1. Odredjivanje 3D strukture proteina – kristalografija x-zracima 2. Odredjivanje 3D strukture protina – difrakcija neutrona2. Odredjivanje 3D strukture protina – difrakcija neutrona 3. Odredjivanje 3D strukture proteina – NMR metode3. Odredjivanje 3D strukture proteina – NMR metode 4. Motivi ili supersekundarne strukture4. Motivi ili supersekundarne strukture 5. Raznolikost proteina - Introni, egzoni, inteini i egzeini5. Raznolikost proteina - Introni, egzoni, inteini i egzeini 6. Divergnetna evolucija familija proteina6. Divergnetna evolucija familija proteina 7. Konvergentna evolucija7. Konvergentna evolucija 8. TIM barrel proteini8. TIM barrel proteini 9. Evolucija proteina fuzijom genskih fragmenata9. Evolucija proteina fuzijom genskih fragmenata 10. Enzimi sa više aktivnosti i nekovalentno udruživanje rezličitih 10. Enzimi sa više aktivnosti i nekovalentno udruživanje rezličitih

aktivnostiaktivnosti 11. ”Arom” kompleks11. ”Arom” kompleks 12. Kompleks piruvat dehidrogenaze12. Kompleks piruvat dehidrogenaze 13. Metode za odredjivanje stukture enzim-supstrat13. Metode za odredjivanje stukture enzim-supstrat 14. 14. Nomenklatura enzimaNomenklatura enzima

Uvodna (pred)znanjaUvodna (pred)znanja

MatematikaMatematika

Fizička hemijaFizička hemija

Organska hemijaOrganska hemija

Biohemija proteina i nukleinskih Biohemija proteina i nukleinskih kiselinakiselina

Struktura proteinaStruktura proteina

Struktura proteinaStruktura proteina

Primarna struktura proteina – aminokiseline (21 Primarna struktura proteina – aminokiseline (21 proteinska aminokiselina) i sekvencaproteinska aminokiselina) i sekvenca

Posttranslacione modifikacije proteina - raznolikostPosttranslacione modifikacije proteina - raznolikost Osnovni gradivni blokovi – peptidna veza (prolin, Osnovni gradivni blokovi – peptidna veza (prolin,

specifična aminokiselina)specifična aminokiselina) Sekundarna struktura (Sekundarna struktura ( heliks i heliks i nabrana ravan). nabrana ravan).

Amfipatična priroda heliksa, dipol ide paralelno sa osom heliksa (pozitivan pol je na N-Amfipatična priroda heliksa, dipol ide paralelno sa osom heliksa (pozitivan pol je na N-kraju). kraju).

-zavijutak (-zavijutak (-bend): -bend): 4 ostatka u nizu formiraju zavijutak kojim glavni 4 ostatka u nizu formiraju zavijutak kojim glavni polipeptidni lanac naglo menja pravac za 180polipeptidni lanac naglo menja pravac za 180oo. Na ovaj način je moguće povezati dve . Na ovaj način je moguće povezati dve antiparalelne nabrane ravni. Tip I, II i III (čijim ponavljam nastaje 3antiparalelne nabrane ravni. Tip I, II i III (čijim ponavljam nastaje 31010 tip heliksa sa 3.0 tip heliksa sa 3.0 ostataka po okretu). ostataka po okretu).

Ramachandran-ov dijagramRamachandran-ov dijagram

Motivi ili supersekundarne struktureMotivi ili supersekundarne strukture-ukosnica (-ukosnica (-hairpin)-hairpin) 4 4 antiparalelne ravni antiparalelne ravni (Greek key, meander)(Greek key, meander) jellyroll (6 jellyroll (6 -ravni)-ravni) Povezivanje paralelnih Povezivanje paralelnih -nabranih ravni nije tako jednostavno – -nabranih ravni nije tako jednostavno –

konektor treba da promeni pravac dva puta. Strukture koje nastaju konektor treba da promeni pravac dva puta. Strukture koje nastaju imaju sledeće topologije: imaju sledeće topologije: i češće su organizovanje po i češće su organizovanje po pravilu desne ruke.pravilu desne ruke.

Neuredjeni delovi (petlje) se često nalaze na površini i mogu da Neuredjeni delovi (petlje) se često nalaze na površini i mogu da imaju vrlo važnu funkcijuimaju vrlo važnu funkciju

Generalna pravila za povezivanje sekundarnih struktura u Generalna pravila za povezivanje sekundarnih struktura u proteinima u motive tj. supersekundarne strukture:proteinima u motive tj. supersekundarne strukture:

1. Delovi sekundarnih struktura koji su bliski po sekvenci, često su u kontaktu i u 3D1. Delovi sekundarnih struktura koji su bliski po sekvenci, često su u kontaktu i u 3D

2. 2. -X--X- struktura je češće organizovana po pravilu DR, nego po pravilu LR struktura je češće organizovana po pravilu DR, nego po pravilu LR3. Veze medju sek. str. ne prave čvorove, niti se ukrštaju.3. Veze medju sek. str. ne prave čvorove, niti se ukrštaju.

Jedinica u strukturi globularnih proteina - domen i pravilo interakcijeJedinica u strukturi globularnih proteina - domen i pravilo interakcije

Trodimenzionalna (3D) stukturaTrodimenzionalna (3D) stuktura

3D struktura i 4 klase proteina; “pakovanje” 3D struktura i 4 klase proteina; “pakovanje” sekundarnih struktura.sekundarnih struktura.

Kvaternerna strukturaKvaternerna struktura

Metode za odredjivanje 3D Metode za odredjivanje 3D strukture proteinastrukture proteina

1. 1. x-ray kristalografija (difrakcija x-zraka na kristalisanim x-ray kristalografija (difrakcija x-zraka na kristalisanim proteinima); proteinima); isomorphous replacement, isomorphous replacement, molecular replacementmolecular replacement

2. Difrakcija neutrona (locira atome vodonika i važan je metod za 2. Difrakcija neutrona (locira atome vodonika i važan je metod za rasvetljavanje reakcionih mehanizama)rasvetljavanje reakcionih mehanizama)

3- NMR u rastvoru3- NMR u rastvoru

4. Small angle x-ray light scattering4. Small angle x-ray light scattering

5. Nisko rezolutne metode za odredjivanje topologije površine 5. Nisko rezolutne metode za odredjivanje topologije površine proteina masenom spektrometrijomproteina masenom spektrometrijom

6. Predvidjanje 3D strukture na osnovu sekvence proteina ili DNK 6. Predvidjanje 3D strukture na osnovu sekvence proteina ili DNK

Vidljiva svetlost – talasna duzina: stotinak nm

x-ray – 0.1 nm

Amplifikacija signalaAmplifikacija signala Fazni problemFazni problem PodesavanjePodesavanje

Validacija (Ramachandranov dijagram)Validacija (Ramachandranov dijagram)

Prakticni detaljiPrakticni detalji

KristalizacijaKristalizacija


1. x-ray kristalografija (difrakcija x-zraka na kristalisanim 1. x-ray kristalografija (difrakcija x-zraka na kristalisanim proteinima); proteinima); isomorphous replacement, isomorphous replacement, molecular replacementmolecular replacement






Difrakcija neutronaDifrakcija neutrona

Difrakcija Difrakcija neutronaneutrona








1D NMR proteina1D NMR proteina







6. Predvidjanje 3D strukture na osnovu sekvence proteina ili DNK6. Predvidjanje 3D strukture na osnovu sekvence proteina ili DNK

Kvaternerna struktura – nekovalentno povezani Kvaternerna struktura – nekovalentno povezani oligomerioligomeri

Metode za odredjivanje kvMetode za odredjivanje kvaaternerne struktureternerne strukture

Da li se na osnovu seDa li se na osnovu sekkvence može predvideti vence može predvideti katalitička funkcija enzima (više R ostataka ima katalitička funkcija enzima (više R ostataka ima katalitički potencijal) i značajne a.k. moraju da budu u katalitički potencijal) i značajne a.k. moraju da budu u odredjenom prostornom rasporedu tj. na odredjenoj odredjenom prostornom rasporedu tj. na odredjenoj udaljenosti da bi obavile katalitizu.udaljenosti da bi obavile katalitizu.

Zašto su molekuli enzima relativno veliki? Zašto su molekuli enzima relativno veliki?

Da li su promene u sekvenci letalne za katalitičku Da li su promene u sekvenci letalne za katalitičku funkciju?funkciju?

Struktura kompleksa enzim-supstratStruktura kompleksa enzim-supstrat

Vezivanje malih molekula za protein u kristalu, Vezivanje malih molekula za protein u kristalu, molecular replacement za enzime čija 3D molecular replacement za enzime čija 3D struktura je odredjenastruktura je odredjena

Dobijanje stabilnih kompleksa Enzim-Supstrat: Dobijanje stabilnih kompleksa Enzim-Supstrat: inhibitori, analozi supstrata, supstrati, ali u inhibitori, analozi supstrata, supstrati, ali u nereaktivnim uslovimanereaktivnim uslovima

Nove kristalografske tehnike (time-resolved Nove kristalografske tehnike (time-resolved crystalography). von Laue metodcrystalography). von Laue metod

Fleksibilnost i konformaciona Fleksibilnost i konformaciona pokretljivost proteinapokretljivost proteina

Da li su kristalna struktura i struktura enzima u Da li su kristalna struktura i struktura enzima u rastvoru identične?rastvoru identične?

Rotacija u rastvoruRotacija u rastvoru ““Disanje” regiona u proteinuDisanje” regiona u proteinu Rotacija bočnih ostatakaRotacija bočnih ostataka Kretanje domena – fleksibilnost segmenataKretanje domena – fleksibilnost segmenata

http://www.chem.ucsb.edu/~molvisuhttp://www.chem.ucsb.edu/~molvisual/ABLE/induced_fit/index.htmlal/ABLE/induced_fit/index.html

http://www.chem.ucsb.edu/~molvisual/ABLE/induced_fit/index.html

http://www.chem.ucsb.edu/~molvisual/ABLE/induced_fit/index.html

Raznolikost i evolucija proteinaRaznolikost i evolucija proteina

Gen = Protein (produkt gena)?Gen = Protein (produkt gena)? Introni i egzoni (ribozimi); Introni i egzoni (ribozimi); obrada obrada

RNA, alternativna obrada RNARNA, alternativna obrada RNA Inteini i eksteini; protein splicingInteini i eksteini; protein splicing

Divergentna i konvergentna evolucija proteinskih familija

Serin proteaze su primer divergentne evolucije i verovatno su nastale od zajedničkog pretka.

Homologi proteini

Konvergentna evolucija proteina – različita 3D struktura, ali isti mehanizam delovanja

Endopeptidaza termolizin i karboksipeptidaze

Konvergentno ili divergentno?Konvergentno ili divergentno?

Kriterijumi za testiranje – da li su dva Kriterijumi za testiranje – da li su dva proteina evoluirala od zajedničkog proteina evoluirala od zajedničkog pretka?pretka?

1.1. Sličnost DNK sekvenciSličnost DNK sekvenci2.2. Sličnost amino kiselinskih sekvenciSličnost amino kiselinskih sekvenci3.3. Sličnost 3D strukturaSličnost 3D struktura4.4. Interakcije Enzim-Supstrat su sličneInterakcije Enzim-Supstrat su slične5.5. Katalitički mehanizmi su sličniKatalitički mehanizmi su slični6.6. Sekvenca fragmenata polipeptidnog niza Sekvenca fragmenata polipeptidnog niza

koji su esencijalni za katalizu je očuvana.koji su esencijalni za katalizu je očuvana.

TIM barrel proteini

Evolucija proteina fuzijom genskih fragmenataEvolucija proteina fuzijom genskih fragmenata

Domenska struktura Domenska struktura NADNAD++-zavisnih -zavisnih dehidrogenaza: dehidrogenaza: gen koji vezuje nukleotid + gen koji vezuje nukleotid + gen koji kodira katalitički domengen koji kodira katalitički domen DomenDomen kompaktna strukturna jedinicakompaktna strukturna jedinica Da li su egzoni funkcionalne jedinice u evoluciji proteina?Da li su egzoni funkcionalne jedinice u evoluciji proteina? Evolucija fuzijom fragmenata se odvijala preko osnovnih Evolucija fuzijom fragmenata se odvijala preko osnovnih

jedinica “domena”.jedinica “domena”. Razmeštanje domena Razmeštanje domena in vitroin vitro (E. coli aspartat (E. coli aspartat

transkarbamoilaza (ATCaza)) ima dva globularna domena. transkarbamoilaza (ATCaza)) ima dva globularna domena. E. coli ornitin transkarbamoilaza ima 32 % identičnu E. coli ornitin transkarbamoilaza ima 32 % identičnu sekvencu.sekvencu.

Oligomerizacija razmenom domena (domen swapping). Oligomerizacija razmenom domena (domen swapping). Intra i intemolekularno uparivanje domenaIntra i intemolekularno uparivanje domena (oligomerni (oligomerni proteini)proteini)..

Homologija, sličnost i identičnost sekvenceHomologija, sličnost i identičnost sekvence

Viši nivoi organizacijeViši nivoi organizacije enzimskih aktivnostienzimskih aktivnosti

Viši nivoi organizacije: multienzimski kompleksiViši nivoi organizacije: multienzimski kompleksi

EEnzimi uključeni u metaboličke procese koji su u sekvencinzimi uključeni u metaboličke procese koji su u sekvenci,, ili ili složene biohemijske procese su složene biohemijske procese su često često organizovani u fizičke organizovani u fizičke agregate: agregate:

triptofan sitriptofan sinnttetetaza, aza, sintsintetetaza masnih kiselina, aza masnih kiselina, primozom primozom ribozomi.ribozomi.

Enzimi sa više aktivnih centara i Enzimi sa više aktivnih centara i nekovalenta asocijacija različitih aktivnostinekovalenta asocijacija različitih aktivnosti

- Triptofan sintaza, Triptofan sintaza, 2222 tetramer i nalazi se u okviru tetramer i nalazi se u okviru triptofanskog operonatriptofanskog operona

Indol-3-glicerol fosfat + serin ------Indol-3-glicerol fosfat + serin ------>> Trp + gliceraldehid-3- Trp + gliceraldehid-3-fosfatfosfat ( (2222))

Indol-3-glicerol fosfat ------Indol-3-glicerol fosfat ------>> indolindol + gliceraldehid-3-fosfat ( + gliceraldehid-3-fosfat ())indolindol + serin ------ + serin ------>> Trp + gliceraldehid-3-fosfat ( Trp + gliceraldehid-3-fosfat (2222))

Podjedinice u komplesku su povezane 25-30 Podjedinice u komplesku su povezane 25-30 ÅÅ dugačkim dugačkim tunelom.tunelom.

Enzimi sa više aktivnih centaraEnzimi sa više aktivnih centara

- IIndol-3-glicerol fosfat-sintaza-ndol-3-glicerol fosfat-sintaza-fosforibozil antranilat izomeraza fosforibozil antranilat izomeraza (bifunkcionalni enzim).(bifunkcionalni enzim).

- Genetskim inženjeringom razdvojene Genetskim inženjeringom razdvojene podjedinice imaju istu katalitičku podjedinice imaju istu katalitičku aktivnost. ?aktivnost. ?

- Arom kompleks (šikamat mehanizam Arom kompleks (šikamat mehanizam biosinteze aromatičnih jedinjenja), biosinteze aromatičnih jedinjenja), kompleks piruvat dehidrogenazekompleks piruvat dehidrogenaze

Enzimi sa više aktivnih centaraEnzimi sa više aktivnih centara

Arom kompleks Arom kompleks (šikamat (šikamat mehanizam mehanizam biosinteze biosinteze aromatičnih aromatičnih jedinjenjajedinjenja))

E. coli Saccharomyces cerevisiae, N. crassa

5 monofunkcionalnih enzima

5 aktivnih centara u jednom polipeptidnom nizu

ZaZašto multienzimski kompleksi?što multienzimski kompleksi?

Poboljšana kataliza: smanjuje se vreme difuzije Poboljšana kataliza: smanjuje se vreme difuzije intermedijera u povezanim procesima od intermedijera u povezanim procesima od jednog do drugog enzimajednog do drugog enzima

Kanalisanje supstrataKanalisanje supstrata Zaštita hemijski reaktivnih intermedijera od Zaštita hemijski reaktivnih intermedijera od

izlaganja vodenoj srediniizlaganja vodenoj sredini Servis (u slučaju piruvat dehidrogenaze, jedna Servis (u slučaju piruvat dehidrogenaze, jedna

podjedinica može da prosledi reagens podjedinica može da prosledi reagens (servisira) ostale podjedinice)(servisira) ostale podjedinice)

Kooridinisana regulacijaKooridinisana regulacija Koordinisana ekspresijaKoordinisana ekspresija

Kompleks piruvat dehidrogenazeKompleks piruvat dehidrogenaze

Enzim Prosteticna grupa

Piruvat dehidrogenaza (a2) E1 Tiamin pirofosfat TPP

Dihidrolipoil transacetilaza E2 Lipoamid

Dihidrolipoil dehidrogenaza (a2) E3 FAD

Sectioned schematic view of an icosahedral pyruvate dehydrogenase complex based on electron cryo-Sectioned schematic view of an icosahedral pyruvate dehydrogenase complex based on electron cryo-microscopic analysis of an E1E2 sub-complex from microscopic analysis of an E1E2 sub-complex from B.stearothermophilusB.stearothermophilus. Three of the 60 E2 molecules . Three of the 60 E2 molecules (colored red, green and yellow) are highlighted. The movement of the swinging E2 lipoyl domain in the (colored red, green and yellow) are highlighted. The movement of the swinging E2 lipoyl domain in the annular region between the inner core (cyan) of E2 molecules and the outer shell of E1 molecules (purple) annular region between the inner core (cyan) of E2 molecules and the outer shell of E1 molecules (purple) is proposed to be a critical feature underlying active site coupling in the complex. is proposed to be a critical feature underlying active site coupling in the complex.

Multifunkcionalni enzimi – DNK Multifunkcionalni enzimi – DNK polimerazepolimeraze

DNK polimeraza I E. coli (928 a.k.)DNK polimeraza I E. coli (928 a.k.) 324-518 polimer324-518 polimeriizacija lanca DNKzacija lanca DNK 1-320 1-320 5’->3’ egzonukleazna aktivnost5’->3’ egzonukleazna aktivnost 520-928 3’->5’ egzonukleazna aktivnost520-928 3’->5’ egzonukleazna aktivnost

DNK polimeraza (reverzna transkriptaza) DNK polimeraza (reverzna transkriptaza) HIV virusa, ima i ribonukleazni domen HIV virusa, ima i ribonukleazni domen kojim iz DNK-RNK hibrida uklanja RNK kojim iz DNK-RNK hibrida uklanja RNK tokom procesa replikacije RNK genoma tokom procesa replikacije RNK genoma virusa.virusa.

Documents

Uvodna znanja