Validasi dan Verifikasi Metode Analisis

1

Validasi dan Verifikasi Metode

Analisis

Mochammad YuwonoFakultas Farmasi Universitas Airlangga

E-mail: [email protected]

Alfas – Surabaya, 29 Maret 2014

Sharing KnowledgeIkatan Alumni Universitas Airlangga – Fakultas Farmasi

Sharing Knowledge2

Quality is important in every product or service, but it is vital

in medicines as it involves life.

Regulasi Obat: Persyaratan Sangat ketat !

QualityInvisible when GOODImpossible to ignore when BAD

How good something isIf the quality of a product is low, it means that the product is not really good

3

Sharing Knowledge

Quality of Products

The ability to make the same product the same way, over and over again.

Customer buys today is same as what they bought last month or will buy next month.

Product meets customer’s expectation.

4

Consis

tent

relia

ble

Sharing Knowledge

Quality of Pharmaceutical Products

Quality of thepharmaceutical

products

Man Machine

qualified

calibrated

robust

qualified

Methods

suitable

characterised

documented

MilieuMaterial Management

Quality

Referencestandards

Tempe-rature

Analysts´support

skilled

Humidity

Vibrations Time

Supplies

Irradi-ations

Motivation

Measurements

5 Sharing Knowledge

Quality in Analytical Laboratory

Alat/Instrumen

AnalisBaku Pembanding, Reagensia

Pendidikan

Pelatihan

Pengalaman

Verifikasi KinerjaPresisi

KalibrasiSelektivitas SST

Akurasi, LOD, LOQ

LinieritasLinieritas

Sensitvitas

KualifikasiValiditas

Hasil Valid &

Terpercaya

Metode Analisis

Preparasi sampel

Akomodasi & Lingkungan

6 Sharing Knowledge

Quality of Analytical Data

Sharing Knowledge7

Instrumen Analisis(memenuhi kualifikasi DQ, IQ, OQ, PQ)

Metode Analisis(telah divalidasi/diverifikasi)

Sistem(memenuhi uji SST)

Internal QA(Sampel kontrol masuk rentang)

Hirarki Komponen Mutu Data Analisis

Sampel

Sarana & Prasarana

Bahan Kimia & SRM

SafetyPengelola & Analis

Metode Analisis

Alat/Instrumen

Dokumen sistem Mutu

VALID & TERPERCAYA

8Sistem Manajemen MutuSharing Knowledge

Laporan Hasil

Quality Assurance:

A n a l i s i s

ISO 17025/GLP

Preparasi Sampel – Analisis data

Pengem

bangan

Metode

Validasi /Verifikasi Metode

Sampel Obat, Obat Tradisional, Makanan, Kosmetik

Prosedur Analisis

Sampling9 Sharing Knowledge

Metode Analisis Kimia

GC-MS GC-FTIR/MSLC-MS/MS LC-NMR

Hyphenated Instruments

10 Sharing Knowledge

Metode Analisis

Optimasi

Validasi

Implementasi (rutin)

Pengembangan

Revalidasi

Pre-validasi

Andev

QC11 Sharing Knowledge

Metode Standar/Baku

In House Validation of

Method

Interlaboratory Validation

(Collaborative Study)

Standard Method

Verification of Method

Single Laboratory

Validation Full

Validation


Compendial Methods

Metode yang tertera dalam FarmakopeMerupakan metode Standar yang telah

divalidasi (Full Validation)Termasuk metode Resmi (Official

method) untuk negara-negara tertentu

Sharing Knowledge13

14

Kategori Metode Analisis

Metode analisis untuk identifikasi

Penetapan cemaran atau hasil Degradasi Penetapan kuantitatif (II a) dan uji batas/kualitatif (II b)

Penetapan kadar komponen utama dalam bahan baku obat atau bahan aktif dalam sediaan farmasi

Penetapan karakteristik sediaan (disolusi, pelepasan obat, dll)

I

II

III

IV

Sharing Knowledge

15

Karakteristik kinerja metode USP dan ICH

PresisiAkurasi

Batas Deteksi (DL/LOD)Batas Kuantitasi (QL/LOQ)

Linieritas

Selektivitas/Spesifisitas

Rentang

Validasi Metode

Robustness/RuggednessSystem Suitability Test

Sharing Knowledge

Sharing Knowledge16

USP ICH 1. Presisi2. Akurasi3. Batas deteksi 4. Batas kuantitasi5. Spesifisitas 6. Linieritas7. Rentang

1. Presisi2. Akurasi3. Batas deteksi4. Batas kuantitasi5. Spesifisitas6. Linieritas7. Rentang 8. Robustness 9. Kesesuaian sistem

Parameter Validasi Menurut USP dan ICH

17

Akurasi dan Presisi Metode

Akurasi rendah Presisi tinggi

Akurasi tinggi Presisi tinggi

Akurasi tinggi Presisi rendah(Hasil dirata-rata)

Akurasi rendah Presisi rendah

Sharing Knowledge

Permintaan Validasi

Literature searchTelaah karakteristik AnalitPenyiapan bahan dan alat

Pengembangan/optimasi Metode

Pembuatan protokol Validasi

Percobaan laboratorium sesuai

protokol validasi

Analisis DataPenyusunan Laporan Validasi

Penyerahan dokumen

Tahapan Validasi Metode

ValidasiMetode


Sharing Knowledge19

Validasi Metode Vs.

Verifikasi Metode

Verifikasi

Validasi

• Suatu proses (percobaan laboratorium)• Untuk membuktikan bahwa karakteristik kinerja metode analisis telah memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan sebelumnya

• Suatu proses (percobaan laboratorium)• Untuk membuktikan bahwa laboratorium mampu menggunakan metode analisis baku/standar pada kondisi nyata di laboratoriumnya


Metode baku/Standar Compendial Method

(USP, FI, AOAC, ISO dll.)

Metode tidak baku Metode pengembangan Metode baku yang dimodifikasi Metode baku yang digunakan di luar lingkup

Verifikasi

Validasi


Modifikasi metode kompendial

Jika pada verifikasi metode, kondisi pada Metode kompendial TIDAK diperoleh hasil yang optimal (misal peak tailing, fronting, splitting, resolusi pemisahan tidak terpenuhi) Laboratorium dapat melakukan modifikasi atau adjustment.

Pada USP tertera batas-batas modifikasi atau adjustment yang diperkenankan

Sharing Knowledge22

Modifikasi/Adjustment metode kompendial

Sharing Knowledge23

Sharing Knowledge24

Panduan validasi metode analisis

ICH Q2A : Text on validation of analytical ProcedureICH Q2B Validation of analytical procedures methodologyFDA-CDER (Center for Drug Evaluation and Research)a. Reviewer guidance validation of chromatographic

methodsb. Submitting sample and analytical data for method

validationc. Analytical procedure and method validation for

human studies d. Bioanalytical method validation for human studies

USP: Validation of compendial proceduresUSP: Verification of compendial procedures

Sharing Knowledge25



Verifikasi Metode

Adopsi metode baku/standar Untuk membuktikan bahwa suatu laboratorium mampu melakukan analisis di laboratoriumnya untuk menunjukkan bahwa kinerja metode dapat

ditiru atau diulang oleh laboratorium yang bersangkutan dengan hasil yang sama


Metode baku/Standar Compendial Method

(USP, FI, AOAC, ISO dll.)

Metode tidak baku Metode pengembangan Metode baku yang dimodifikasi Metode baku yang digunakan di luar lingkup

Verifikasi

Validasi


Sharing Knowledge30

Sharing Knowledge31

Metode “General Test” (LOD, sisa pijar, bilangan asam, pH) tidak perlu diverifikasi

Sharing Knowledge32

Acuan Verifikasi Metode


1. Confirmation of Identity, a method that ensures a material is what it purports to be or confirms the

detection of the target analyte.2. Quantifying an analyte at a low concentration.3. Determining if an analyte is present above or below a specified, low concentration (often called a Limit Test). The specified

concentration is close to the LOQ.4. Quantifying an analyte at a high concentration.5. Determining if an analyte is present above or below a specified, high concentration (often called a Limit Test). The specified concentration is substantially above the LOQ.6. Qualitative test.

Kategori Analisis


Parameter Validasi


Parameter Verifikasi






Parameter Verifikasi Metode

Sharing Knowledge41

Penetapan kadar bahan aktif dalam sediaan farmasi

Selektivitas/spesifisitas, Presisi dan akurasi merupakan parameter penting

42

Selektivitas vs. Spesifisitas

USP dan ICH menggunakan istilah Specificity

IUPAC dan AOAC menggunakan istilah Selectivity

AOAC: Specificity “highest selectivity”

Sharing Knowledge

Sharing Knowledge

43

Specificity (ICH/USP)Specificity (USP/ICH): The ability to assess unequivocally the analyte in the presence of components to expected to be present, such as impurities, degradation products, and matrix components.

Selectivity describes the ability of an analytical method to differentiate various substances in a sample.

44

Spesifik dan SelektifSelektif:Mampu membedakan antara senyawa analit dengan derivat/degradan/ metabolit atau senyawa pengganggu lainnya

Spesifik:Mampu mengenal respons untuk analit tunggal/murni

Sharing Knowledge

45

Spesifisitas/Selektivitas: Jika tersedia zat hasil degradasi:

Suntikkan:Blanko sampel/Placebo (Sampel minus

analit)Zat Hasil degradasi (degradants)Zat yang memiliki struktur mirip (Related

substancesZat metabolit (untuk bioanalisis)

Sharing Knowledge

46

Spesifisitas/Selektivitas: Blanko sampel/Placebo

tidak menghasilkan peak/noda dengan waktu retensi/Rf yang sama dengan analit

Peak/noda analit terpisah dari peak/noda lainnya

(Rs ≥1,5)46

Sharing Knowledge

Placebo

Sampel

(Rs ≥1,5)


Meloxicam dalam tablet (spektrofotometri UV/Vis)


49

Specificity/Selectivity:

Lakukan forced degradation studies (studi degradasi paksa)

Sampel disimpan pada suhu/kelembaban tertentu atau penambahan oksidator

Bandingkan profil pemisahan peak sebelum

dan sesudah perlakuan

Jika tidak tersedia zat hasil degradasi (Degradants)

Sharing Knowledge

50

Forced Degradation Studies

Heat Temperature (50 - 60 oC) Humidity Kelembaban (70 to 80%) Acid Hydrolysis HCl 0.1 N Base Hydrolysis NaOH 0.1 N Oxidation H2O2 (3 to 30%) Light UV/Vis

Sharing Knowledge

Spesifisitas: Uji kemurnian analit Menggunakan Detektor Diode array Teknik Spiking

Peak hasil spiking menunjukkan satu peak/noda dan memiliki tR/Rf sama

Pada TLC menggunakan sistem pengembang berbeda-beda

GC-MS LC-MS; LC-MS/MS


Contoh studi degradasi paksa (HPLC-DAD)

PENETAPAN KADAR PAROXETINE DALAM SEDIAAN TABLET


Overlay spectra UV - analit


Hasil Degradasi terhadap tablet paroxetine 20 mgCondition Time

(h) % Recovery RRT* of degradation

products Acid 0.1 N HC1, 80°C 50 98.0 None detected Base 0.1 , 80°C 50 96.5 1.65 Hydrogen peroxide 0.3%, 80°C

2 73.0 0.19, 0.22, 0.23, 0.27

0.31, 0.35, 0.39, 0.43 0.45, 0.49, 0.52, 0.55 0.59, 0.63, 0.71, 0.76 1.13, 1.36, 1.64

Heat dry, 80°C 72 99.2 None detected Heat wet, 80°C 72 96.2 1.65 Light dry, 1000 foot candles 144 99.5 None detected

Light wet, 1000 foot candles 144 80.3 0.17, 0.20, 0.23, 0.42

0.44, 0.55, 0.82, 0.88 1.13, 1.60

* RRT, relative retention time.


55

Linieritas (Linearity)

Kemampuan suatu metode untuk menunjukkan hubungan secara langsung atau proporsional antara respons detektor dengan perubahan konsentrasi analit.

A B C D

●

●●

●●

Respon alat

Sharing Knowledge

56

Linieritas

Melalui analisis statistik Linear Regression (y = mx + b) Correlation Coefficient (r), y-intercept (b), slope (m), residual sum of squares

Disarankan menggunakan minimum 5 macam konsentrasi analit

Disarankan terhadap sampel yang independen, bukan dari sampel hasil pengenceran

Dapat digunakan larutan baku hasil pengenceran dan/atau larutan spike

2/122 })(){())((

1 yyxxyyxx

ri

ii

Sharing Knowledge

57

Evaluasi terhadap Linieritas

Relative process standard deviation (Vxo)

Mandel’ testResidual testANOVA-linearity testingRSD of the Plot of response factor Vs.

concentrationXp value- Funk’s et al. r value Homogeneity of the linear-curve

Sharing Knowledge

58

Evaluasi Linieritas

i

iiY

YXO

xoXO

bxayN

yyS

bSS

XSV

ˆ , 2

ˆ where

%100

0.05 p and

2-N ffor factor student t t , 1

11. .Y

with.

11. . 2

22

2

P

2

2

iiXX

XXtableY

XX

PtableXOP

XN

XQ

QX

NtSa

QbYY

NtSX

Sy/x = simpangan baku residu dari regresi linear Vxo = koefisien variansi regresi linear

Vxo = <2-5%Sharing Knowledge

Koefisien korelasi

Nilai r ternyata TIDAK menjamin linieritas respons dan konsentrasi

Kurva non linier dapat memiliki r yang tinggi Korelasi linier jika rhitung > rtabel. Harga r

tergantung jumlah konsentrasi. Contoh n = 5 rtabel = 0,878; n = 10 r tabel = 0,632

r membuktikan linieritas jika rentang tidak terlalu lebar dan r ≥ 0,999


Residual dan Least square

Makin kecil atau makin besar konsentrasi deviasi makin besar dikuadratkan dan diminimasi Least square

Oleh karena itu, respons harus memiliki varians yang sama (Homogeneity of variance = homoscedasticity) 60 Sharing Knowledge

Persamaan garis regresi

koefisien korelasi r ≥ 0,999 Persamaan garis melewati titik 0,0 Intersep tidak berbeda secara bermakna

dengan nol lakukan uji t Slope berbeda secara bermakna dengan harga

nol lakukan uji t


Respons faktor = y/x


Uji Homogenitas

digunakan untuk mengetahui homogenitas varian pada persamaan garis regresi

Uji F menguji homogenitas batas atas dan bawah

Uji Cochran dan uji Barlett menguji keseluruhan titik pada rentang persamaan garis



65

Rentang (Range)

Interval antara konsentrasi terbesar dan terkecil dari analit dalam sampel

Memenuhi syarat dalam hal presisi, akurasi dan linieritas

Sharing Knowledge

66

Minimum Specified Range:

For Drug Substance & Drug product Assay 80 to 120% of test Concentration

For Content Uniformity Assay 70 to 130% of test Concentration

For Dissolution Test Method +/- 20% over entire Specification Range

For Impurity Assays From Reporting Level to 120% of Impurity Specification for

Impurity AssaysSharing Knowledge

67

Uji Homogenitas kurva kalibrasi

Sharing Knowledge

Metode Analisis pada Cleaning Validation

Validasi Metode untuk analit konsentrasi sangat rendah (Residu)

Parameter LOD dan LOQ berperan sangat penting

Sharing Knowledge68

69

Akurasi

Biasanya dinyatakan dalam persen perolehan kembali (% recovery)

Dapat dilakukan melalui pebandingan hasil analisis antara metode yang divalidasi dengan metode standar uji t harus tidak berbeda makna

Dapat dilakukan metode adisi standar terhadap blanko atau sampel.

Sharing Knowledge

70

Akurasi

Persen perolehan kembali (% recovery)

Persyaratan untuk assay validation = 98-102%

Dianjurkan menggunakan tiga macam konsentrasi masing-masing 3 kali replikasi

Adisi standar pada blanko/plasebo

%100Re% xyasesungguhnKadar

diperolehyangKadarc

Sharing Knowledge

71

KURVA AKURASI menurut Funk et. al.

- Untuk mengetahui ada atau tidaknya kesalahan sistematis, Dibuat kurva regresi antara Xf (konsentrasi analit hasil analisis) terhadap Xc (konsentrasi nominal analit)

Xf = af + bf. Xc

- Dihitung confidence range (Cr) dari intercept {VB(af)} dan slope {VB(bf)} dari recovery Pada p = 0.05

QxxXc

N1 . S . ta =aCr

2

yftableff

Qxx.Stb=bCr yftable

ff

2-N)]X-b+(a-[X

=S2

iffifyf

t = Student-t-factor f = N-2, P = 95 %. Sharing Knowledge

72

M. Yuwono & G. Indrayanto, Validation method of Chromatography Methods of Analysis, Profiles of Drugs Substances, Excipients and Related Methodology, Vol. 32, Elsevier Academic Press, San Diego, New York, Boston, London, Sydney, Tokyo, Toronto. In Press (2005)

Sharing Knowledge

Sharing Knowledge73

Analyte recovery at different concentration

AOAC manual for the Peer-Verified Methods program

Analyte Ingred. (%)

Analyte ratio Unit Mean recovery

(%)100 1 100 % 98-102≥ 10 10-1 10 % 98-102≥ 1 10-2 1% 97-103

≥ 0.1 10-3 0.1% 95-1050.01 10-4 100 ppm 90-1070.001 10-5 10 ppm 80-110

0.0001 10-6 1 ppm 80-1100.00001 10-7 100 ppb 80-1100.000001 10-8 10 ppb 60-115

0.0000001 10-9 1 ppb 40-120

74

PresisiKedekatan dari suatu seri pengukuran yang diperoleh dari sampel yang homogen

Dalam bentuk RSD (relative standard deviation)

Meliputi: - Repeatability - Intermediate Precision - Reproducibility

Sharing Knowledge

75

Repeatability

Kondisi sama pada interval waktu yang singkat

Satu larutan uji disuntikkan berkali-kali pada hari yang sama, alat yang sama, analisis serta kondisi lain yang sama.

Disebut juga Intra-assay precision

Sharing Knowledge

76

Intermediate Precision

Disebut juga “within-laboratory varia-

tions”.

Berbeda hari, atau analis, atau instru-

ment (dalam satu laboratorium)

Sebagai bagian Ruggedness menurut USP

Sharing Knowledge

77

Repeatability test at different labs.Berbeda analis atau instrument dari

laboratorium yang berbeda

Reproducibility

Sharing Knowledge

78

Uji Presisi :

Dianjurkan menggunakan 3 macam konsentrasi berbeda, misal 80, 100 dan 120 % dari konsentrasi target

Masing-masing konsentrasi dilakukan 3 replikasi

Dapat dilakukan pada satu konsentrasi dengan 6 kali replikasi

Dianjurkan juga dilakukan pada hari yang berbeda dan analisis yang berbeda

Kriteria penerimaan: tergantung kategori analisis atau konsentrasi analit

Contoh: RSD < 2% (kategori I)Sharing Knowledge

Sharing Knowledge79

Analyte concentration vs precision

AOAC manual for the Peer-Verified Methods program

Analyte % Analyte ratio Unit RSD (%)100 1 100 % 1.3≥ 10 10-1 10 % 2.7≥ 1 10-2 1 % 2.8

≥ 0.1 10-3 0.1% 3.70.01 10-4 100 ppm 5.3

0.001 10-5 10 ppm 7.30.0001 10-6 1 ppm 110.00001 10-7 100 ppb 15

0.000001 10-8 10 ppb 210.0000001 10-9 1 ppb 30

Kurva Horwitz

SBR atau KV = + 2(1-0,5 log C)

C adalah konsentrasi (fraksi desimal)

Misalnya : Untuk kadar C = 100% maka fraksi desimalnya = 100/100 = 1

SBR atau KV = + 2(1-0,5 log 1) = 2%

HORRAT = SBRobs/SBRcalc

Dapat dilakukan pada satu konsentrasi


Sharing Knowledge81

Validasi Metodepada

Cleaning Validation

Analytical Method for Cleaning Validation

• Metode Analisis hendaknya divalidasi sebelum validasi pembersihan

• Pemilihan metode analisis untuk analisis residu berkaitan erat dengan sifat kimia target residu dan batas deteksinya

• Metode yang digunakan mampu mendeteksi residu atau kontaminan secara spesifik Kromatografi (HPLC, GC, and HPTLC). Metode lainnya (sendiri atau kombinasi): TOC, pH,

Konduktivitas, Spektrofotometri UV, ELISA

Sharing Knowledge82


Validasi Metode meliputi : Presisi, Linieritas dan Selektivitas (jika target

berupa analit spesifik); LOD LOQ Recovery (melaui spiking analit) reproducibility

Batas Deteksi merupakan paramater sangat penting.

LOD di bawah batas konsentrasi residu/ kontaminan yang diperkenankan



Recovery < 50% is consideredquestionable

> 80% is considered good > 50% is considered

reasonable


Batas Deteksi

Batas Deteksi?

Batas Deteksi:Konsentrasi terendah analit dalam sampel yang masih dapat terdeteksi


86

Lowest amount of analyte in a sample that can be detected but not necessarily quantitated.

Estimated by Signal to Noise Ratio of 3:1.

Detection Limit (DL)

Lowest amount of analyte in a sample that can be quantified with suitable accuracy and precision.

Estimated by Signal to Noise Ratio of 10:1.

Quantitation Limit (QL)

Sharing Knowledge

87

Detection Limit (DL) and Quantitation Limit (QL)

1. Based in Visual Evaluations- Used for non-instrumental methods

2. Based on Signal-to Noise-Ratio- 3:1 for Detection Limit- 10:1 for Quantitation Limit

3. Based on Standard Deviation of the Response and the Slope menggunakan sampel konsentrasi rendah dapat digunakan SD dari residual; SD intrersep

Sharing Knowledge


89

Based on Signal-to Noise-Ratio

Sharing Knowledge

90

Based on the Standard Deviation of the Response and the Slope

where s = the standard deviation of the response ( SD of blank samples or SD of intercepts of regression line)S = the slope of the calibration curve

Sharing Knowledge

91

Definition: Capacity to remain unaffected by small variations in method parameters

Determination: Comparison results under differing conditions with precision under normal conditions Variations may include: stability of analytical

solution, variation of pH in a mobile phase, different column (lot/supplier), temperature, flow rate.

Robustness

Sharing Knowledge

92

Re-Validation

“When sponsors make changes in the analytical procedure, drug substance, drug product, the changes, may necessitate revalidation of the analytical procedures.”

“The degree of revalidation depends on the nature of the change.”

Sharing Knowledge

93

Terima Kasih

Mochammad YuwonoFakultas Farmasi Universitas Airlangga, Surabaya

E-mail: [email protected]

Sharing Knowledge

Documents

Validasi dan Verifikasi Metode Analisis