(Aus dem Anatomischen Institut Miinchen [Vorstand: Prof. W. Vogt].)

VER~NDEI~UNGEN IM BAU DER NUCLEOPROTEIDE BEIM MENSCHEN W~HREND DER SPERMIOGENESE. ZUGLEICH EIN BEITRAG ZUR F'ARBU~GSTHEORIE.

Von Jo~ STE~T~SEN (Reykjavik).

(Ei~Ayeganaen am 3. Juli 1936.)

Einleitung, Makrochemische Untersuchungen der tierischen Nukleoproteide haben

erwiesen, dab die Nukleins~ure yon ziemlich einheitlichem Bau ist, w~hrend die eiweiBartigen Komponenten mit den Tiergattungen erheb- lich wechseln. Auch innerhalb derselben Spezies hat man verschieden- artige EiweiBkomponenten gefunden, so hat man in den Spermatozoen- k6pfen vieler Fischarten Protamine (Salmin, Culpein, Sturin u. a.) gefunden, w~hrend die Kerne der entsprechenden Spermatozoenvorstufen ein Histon enthalten. Bei der Mehrzahl der Tiere aber ist dieser Unter- schied nicht vorhanden, speziell nicht bei den S~ugetieren (R. B u ~ , 1904 und 1906). Bei den Eiern hat man makrochemisch entsprechende Unterschiede in den EiweiBkomponenten der reifen Eier gegeniiber ihren Vorstufen nicht einwandfrei festgestellt. Von histochemischen Methoden zum Nachweis der Bestandtefle der Nukleoproteide gibt es nur eine, die Nuklealf~rbung (F~uL~.~ 1932) zur Darstellung der Thymusnukleinss Die bisherigen Erfahrungen mit der Nuklea]- f~rbung haben ergeben, dab sic spezifisch fiir Chromatin ist und in allen Zellkernen, ausgenommen denen des reifen Eies, vieler Tiere darstellbar ist (BAU~.R 1932, FEU~G~.~ 1932). DaB die Nuklealf~rbung dieser Kerne nicht gelingt, beruht nach F~rLOENs Ansicht darauf, dab das Chromatin so rein verteitt in dem groflen blasigen EizeUkernen ist, dab die Nukleal- f~rbung es nicht zu enthiillen vermag. Koch (1925) ist dagegen der Anschauung, dab diesem Verhalten eine tiefgreifende chemische Umwand- lung des Chromatins zugrunde liegt und ihm schlieBt sich BAuE~ an. AHem Anschein nach ergibt die Nuklealf~rbung, dab der Nukleins~ure- bestandtefl der tierischen Nukleoproteide yon ziemiich einheitlichem Bau ist; wenigstens enthalten sie alle Thyrausnukleins~ure, ausgenommen vielleicht nur die I~ukleoproteide des reifen Eies. Damit ist aber nicht gesagt, dab die Thymusnukleins~ure, die ein Polynukleotid ist, nicht doch innerhalb der verschiedenen Kerne in ihrem feineren Aufbau ab- weichen kann. Dabei denke ich erstens daran, dab sie Abbauprodukte yon verschiedener LSslichkeit ergeben kSrmte, obschon diese alle Nukleal- f~rbung geben ~ in Analogie mit TH~NHAVS~.~s (1917) Untersuchungen

Z. f. Zel l forschung u. mikr . Ana tomie . Bd. 25. 38

566 Jon Stelfensen: Ver~nderungen im Bau der Nucleoproteide

fiber Hefenukleins~ure, welche zeigten, dab mflde Hydrolyse Spa]t- produkte yon verschiedener LSslichkeit gibt, n~Lmlich ein Mono- und Trinukleotid. Zweitens denke ieh daran, daB, wie F~uLG~ (1932) gezeigt hat, die Thymusnukleins~ure Nukleotide wie Guanyls~ure ent- halten kann, welehe nicht die Nuklealf~rbung geben, weft sie einen anderen ZuckerkSrper enthalten. Das erste kSnnte man wohl mittels der Nuklealf/~rbung und geeigneter LSsungsmitte] untersuehen, aber das letztere ws schwieriger, da es kein der Nuldealf~rbung entsprechendes Reagens auf andere l~ukleins~uren als Thymusnukleins~ure gibt. Neuere Untersuchungen haben jedoeh ergeben, dab die in der Histologie benutzten Chromatinf~rbungen hSchstwahrseheinlich auf der Nukleins~ure der Chromatinsubstanz beruhen. F~.v~o~N (1913), ST~UD~T. und SCHU~GO OS/LTO (1923) fanden, dab basische Farbstoffe viers~urige Salze mit der Nukleins~ure bilden und v. MSLLV.~DOBrF (1924 und 1926), der alle die gebrs Kernfarbstofie untersucht hat, gibt an, dab s~mtliche Niederschl~ge mit sauren Kolloiden, unter ihnen Nukleins~ure, geben. Sehr wahrseheinlich gibt es keine anderen sauren Ko]loide als die Nuklein- s~uren in den Ze]lkernen, und zwar in den Kernen der tierisehen Zellen fast nur die Thymusnukleinss Parallelversuche auf s/~urehydroly- sierte Pr/~parate mit Nuklealf~rbung und geeigneten Kernf~rbungen miissen dann, falls diese nur auf der Nukleins~ure beruhen, in folgender Weise ausfallen: Mit zunehmender Hydrolyse nimmt die F~rbbarkeit der Chromatinsubstanz ab und verschwindet gleichzeitig mit der Nukleal- f~rbung, falls das Chromatin nicht andere Nukleins~uren als Thymus- nukleins~ure enth~lt oder wenigstens nieht Nukleins~uren die resistenter gegen Hydrolyse als sie selber sind. W~re das letztere der Fall, dab n~mlich das Chromatin resistentere anukleale Nukleins/~uren enthielte, so wiirde man erwarten, dab das Chromatin sieh mit Kernfarbstoffen fiixbt, nachdem keine Nuklealf~rbung mehr auftritt. Diesem Gedanken folgend stelle ieh mir vor, dab man ehemische Ver~nderungen des Nuklein- s~urekomp]exes w~hrend der Spermiogenese, falls solche vorhanden sind, mittels der Nuklealf~rbung und geeigneter Kernf~rbungen in Ver- bindung mit LSsungsversuchen nachweisen kSnnte.

Auf der Suehe naeh einer zu diesem Zweek geeigneten histologischen F~rbung bin ich haupts~ehlieh nach zwei Riehtlinien vorgegangen: Erstens, dal3 sie eine mSglichst reine Chromatinf~rbung sei, ohne oder mit sehr wenig Mitf~rbung von anderen Substanzen, namentlich nieht yon Cytoplasma. Man muB erwarten, dal3 die F~rbung um so spezi- fischer fiir Nukleins~ure sei, je reinere Chromatinbilder sie gibt. Zweitens, cl~6 die F~rbung nicht besonders empfindlich gegen Alkohol oder Wasser sei, da die Ergebnisse sonst zuviel von den einzelnen F~rbungsprozeduren abh~ngig sind. Da die meisten Kernf~rbungen mit basisehen Teerfarb- stoffen sehr empfindlich gegen Alkohol und Wasser sind, habe ich auf sie verziehtet und in der anderen Gruppe yon Kernfarbstoffen, den

beim Menschen w~rend der Spermiogenese. 567

Farblacken, nach einer geeigneten F~rbung gesueht. Von dieser schien mir die Gallocyaninchromalaunf~rbung a|s besonders geeignet, da sie eine sehr reine Chromatird~rbung und sehr wiederstandsf~hig gegen die meisten Reagentien ist (B~.CH~R 1921, I~OMEIS 1932). Zun~ehst war zu untersuchen wie weir diese F~rbung als Kriterium auf Nukleins~ure benutzt werden kann. Um diese Frage n~her zu beleuchten, babe ich einen Verg|eich der Gailoeyaninchromalaunf~rbung mit der Nukleal- f~rbung angesteilt. ])ann babe ich zur Pr'~ung des Einflusses der Chrom- alaunbeize Kernf~rbungen mit w~sserigen L6sungen des basischen Farbstoffes Gallocyanin und des sauren Gailaminblau untersucht und diese beiden mit den obigen F~rbungen, Gailocyaninchromalaun- und Nuklealf~rbung, im Vergleich gesteilt. Zweitens ist das Verh~ltnis dieser F~bungen zu der MAcAI~UMschen Reaktion auf ,,maskiertes" Eisen mitte]s H~matoxylin (MAcAT,rJUM 1908, WEIL 1928) YOn mir untersucht worden. Ailerdings ist der Weft dieser Reaktion als Reaktion auf ,,maskiertes" Eisen sehr bezweife]t (W~.IL 1928, HUECK 1912), aber da sie eine sehr reine Chromatinf~rbung gibt und mitte]s S~urehydrolyse erzeugt ist, habe ich sie mituntersucht. Schliel~lich ist in dieser Versuchsreihe eine H~matoxylinbeizenf~rbung eingeschaltet, da sie in ~hnlicher Beziehung zu der MACAIJ~UMschen Reaktion steht, wie die Ga]]ocyaninf~rbung zu der Gailocyaninchroma]aun- fiirbung. Als zweite Versuehsreihe kommen dann die L6s]ichkeitsver. h~ltnisse der mitte]s Hydrolyse dargestellten K6rper.

Teehnik.

Die Versuche sind auf 5p dicken Schnitten yon in Formolalkohol fixiertem, iiber Methylbenzoatce]]oidin in Paraffin eingebettetem Hoden eines 24j~hrigen Hingerichteten gemacht. Nach den Untersuchungen yon BAUER (1932) soil Formol keinen st6renden EinfiuB auf den Verlauf der Nuklealf~rbung haben, was ich nach meinen Versuehen auch v6Uig best~tigen kann. Die Nuklealf~rbung ist nach dem yon F~ULG~.~ (1932) angegebenen Verfahren ausgefiihrt, doch zeigte es sieh nicht notwendig, in SO2-haltigem Wasser nachzuspii]en, was auch in ~bereinstimmung mit BAUERs Erfahrung ist. Meistens habe ich daher 10 Min. ]ang kr~tig in flieBendem Wasser und nur in Zweife]sf~]len in SO~-haltigem Wasser abgespiilt,

In Galloeyaninchromalaun (0,3 Gallocyanin [HOLLBOR~] 200 5% Chromalaun) und der w~Brigen Gailocyaninl6sung (0,2 Gallocyanin, 100 Aq. dest.) ist 16---24 Stunden gef~rbt und nachher 15 Min. im Wasser abgespiilt worden.

In der Gallaminb]aul6sung (0,5 Gallaminblau [GRC]3LER-HoI~ORI~] 100 Aq. dest.) ist 5 1Kin. lang gef~rbt und 10 Min. im Wasser abgespiilt worden.

38*

568 Jon Steffensen: Ver~mderungen im Bau der Nucleoproteide

Die M~c~LLUMsche Reaktion ist in der Modifikation yon NIC~OLSO~ (1923) ausgeffihrt worden, indem bei 600 C hydrolisiert wurde, start bei 400 C wie in den urspriing]iehen Angaben yon MACALT.U~. Ich habe die Pr~parate 5 Min. in der frisch zubereiteten 0,5%igen H~matoxylin- 15sung (H~matoxylin puriss. CIBA) liegen lassen und nachher 10 Min. in mehrmals gewechseltem Wasser.

Von den H~matoxylinf~rbungen habe ich die yon P. MAY~R mittels saurem H~ma]aun benutzt (RoMEzs 1932).

Die entparaffinierten Sehnitte wurden bei 60 ~ C Hitze in folgenden LSsungen hydrolisiert: 1. 8z/4 ccm konzentrierter Sa]zsi~ure (spez. Gew. 1,19) + 91a/4 ccm Aq. dest. 2. 81/4 ccm konz. Salzs~ure ~- 91a/4 cem 96%igen Alkohol. 3. 4ccm konz. Schwefels~ure (spez. Gew. 1,48) -7 96 ccm Aq. dest. 4. 4 ccm konz. Schwefels~ure ~-96 eem 96%igen Alkohol. 5. 10 ccm AmmoniaklSsung (spez. Gew. 0,910) -~ 40 ccm Aq. dest. und 6. 10 ccm AmmoniaklSsung ~- 40 ccm ,absolut. Alkohol. Nach der Hydrolyse wurden die Pr~parate kurz im Wasser abgespfilt, die aus den alkoholischen LSsungen wurden fiber 80% Alkohol in Wasser fiberffihrt und in der ersten Versuchsreihe (Tabelle 1) danaeh in die ent- sprechenden FarblSsungen bzw. Reagentien gebracht. In der zweiten Versuchsreihe (Tabelle 2 4) wurden die Pr~parate erst in die LSsungs- mittel gebracht und dann nach Abspiilung in die FarblSsungen. S~mt- ]iehe Pr~parate sind in steigendem Alkohol entw~ssert fiber Toluol in Kanadabalsam eingeschlossen und bei hellem Tageslicht untersueht und miteinander verglichen worden. In der Beurteilung der Ergebnisse ist die F~rbungsst~rke mit st (stark), m (mittelstark), schw (schwach), sp (Spur) und 0 bezeichnet. (~-) und (--) hinter dem Zeichen bedeutet, dab die F~rbung ein wenig starker bzw. schw~cher ist. Dieses Verfahren wird natfirlich immer etwas ungenau, selbst wenn man mit der gleichen F~rbung arbeitet, aber sehr ungenau, wenn man F~rbungen yon ver- sehiedenen FarbtSnen vergleichen will. Das Hauptgewicht ist daher auf den Vergleich der mit derselben FarblSsung gef~rbten t)r~parate gelegt. Z. B. ist die st~rkste F~rbung, die mit ]eder der FarblSsungen erreicht worden ist, mit st bezeichnet, und dabei nur gemeint die maxi- male F~rbungsintensit~t mit der in Frage kommenden FarblSsung, aber nicht, dab auch alle gleich stark sind. In der Beurteilung der F~r- bungsergebnisse mit den histologischen F~rbungsmethoden habe ich mich an die yon v. MSLLWNDO~FF eingeffihrte Unterscheidung zwisehen Durchtr~nkufigs- (Dfg.) und Niedersehlagsf~rbung (Nfg.) gehalten und nur die ]etzte, die sich durch ihre Dichtigkeit hervorhebt, als Chromatin- f~,rbung bezeichnet. W'enn daher in der Tabelle z. B. unter K und Sp das Zeichen 0, aber unter C das Zeichen sch angegeben ist, so bedeutet das, daB die Chromatinfs sich in keiner Weise yon der Cytoplasma- f~rbung hervorhebt oder dab das Chromatin im Sinne der Ofg, gef~ixbt ist, aber nicht, dab es ungef~rbt ist.

beim Menschen wahrend der Spermiogenese. 569

Untersuchungsergebnisse. Die Resultate aus der ersten Versuchsreihe sind in Tabel]e 1 nieder-

gelegt; aus ihnen ergibt sich folgendes: Die auf den in w~/]rigen S~ure- 15sungen hydrolysierten Prs dargestellten Nuklealfs zeigen ein rasches Steigen zu maximaler Fi~rbung nach etwa 10 Min. und ein langsameres Abnehmen his zum vSlligen Verschwinden nach 1--2 Stunden Hydrolyse. Dieser Verlauf der Hydrolyse-Nuk]ealf~rbungs- Zeitkurven steht in l~bereinstimmung mit den Angaben yon BAUER (1932), der bei Fixierung in Alkohol-Formalin-Eisessig- also ungef~hr entsprechend meiner Fixierung - - und Hydrolyse I0/~ dicker Schnitte in n/1 HC1-LSsung das gleiche Ergebnis hatte. Es ist kein wesentlicher Unterschied zwischen den ia HC1- und H~SO4-LSsungen hydrolysierten Pr~paraten zu sehen, nur scheint die letztere ein wenig starker zu hydro- lysieren, was damR zusammenh~ngen m~g, dal~ die S~urekonzentration in dieser etwas starker ist. Die Nuklealfiirbung scheint etwas friiher in den Spermien- und SpermatidenkSpfen (Sp.) als in den fibrigen Kernen (K.) zu verschwinden, so sieht man schon nach 30 Min. Hydrolysedauer einige ungef~rbte Sp., w~hrend die K. noch ungefs sind. Am sps bti[3en die Chromatinschleifen in den Spermatocyten ihre F~rbbarkeit ein. Diese Untersehiede sind aber nicht so ausgepr~gt, dal~ man ihnen grSl3ere Bedeutung beimessen kann. Keine andere Substanz als das Chromatin ist gef~rbt, auch nicht die Nukleolen selbst, sondern nur eine Chromatinsehicht die sie wie ein ~Iembran umgibt, was besonders schSn in den S~l~ToLIschen Ze]len zu sehen ist. Die Nuklealfs nach Hydrolyse in HC1-Alkohol verl~uft im ganzen ithnlich wie die vorigen, nur erreicht sic nie die maximale St~rke und die Pr~parate scheinen ein wenig ]~ngere Hydrolysezeit zu fordern, ehe die Kerne ihre Fs keit einbfiBen. Ebenfalls verlieren die Sp. ihre F~rbbarkeit nicht frfiher als die K., im Gegenteil weisen sic eine Neigung auf, sich starker zu f~rben, wie in den Pr~paraten nach 10 und 30 Min. Hydrolyse zum Ausdruek kommt. Ganz anders sind die Fi~rbungsergebnisse in den in H2SO4-Alkohol hydrolysierten Pr~paraten. Diese erreichen wie die in HC1-Alkohol hydrolysierten Pr~parate nicht die F~rbungsstiirke der in den w~i]rigen S~urelSsungen hydrolysierten, aber im Gegensatz zu diesen und den in HC1-Alkohol hydro]ysierten Pri~paraten, die alle nach 3stiindiger Hydrolyse ihre Fiirbbarkeit verloren haben, sind die in H~SO4-Alkohol hydrolysierten Pr~parate noch nach 48stfindiger Hydrolyse f~rbbar. Ebenfalls sin(] die Sp. ausgesprochen sts gef~rbt als die K. ; ihnen kommen am n~chsten die Chromatinschleifen der Spermatocyten. Nach den makrochemischen Erfahrungen fiber die Hydrolysevorgi~nge bei der Thymusnukleins~ure mu/~ man die Ver- sehiedenheiten in der Wirkung der obigen Hydrolyseflfissigkeiten in folgender Weise deuten. Die alkoholischen S~urelSsungen spalten nicht soviel oder ausgiebig Purine und Pyridine ab, wie die w~rigen

570 Jon Steffensen: Ver~nderungen im Bau der l~ucleoproteide

S~urelSsungen und es bilden sich deswegen weniger NuklealkSrper, daher die schw~chere F~rbung der in den ersten Fliissigkeiten hydro- lysierten Pr~parate. Dieser NuklealkSrper ist mit nuklealer Nuklein- s~ure gepaart und wird mit dieser als Ganzes in HC1-Alkohol gelSst, dagegen sehr schwer in H~SO4-Alkohol, wenigstens nicht innerhalb von 48 Stunden. DaB der NuklealkSrper sich so verhi~lt, wird da- durch gestiitzt, dab Pr~parate die bzw. 48 Stunden in H2SO4-Alkohol 30 Min. und 2 Stunden in HC]-Alkohol hydrolysiert waren, nach 5 Min. Hydrolyse in w~Brigen S~urelSsungen in den beiden ersten Pr~paraten eine viel st~rkere F~rbung ss Kerne als vorher zeigen; dagegen bleibt das letzte nach wie vor vSllig ungef~rbt. Ob es identische Nukleal- Nukleins~urekSrper sind, die sich in den I-IC1- und H~SO4-Alkoholen bflden, l~Bt sich aus diesen Versuchen nieht sagen. Man kSnnte an iihnliche KSrper wie die Thymins~ure denken.

Die Untersehiede, die sich zwisehen den Sp. und den K. ergaben, deuten in der Riehtung, dal~ jene leiehter abspaltbare Purine bzw. Pyridine enthalten. Man kSnnte glauben, dab as darauf beruht, dai~ die Sp. mehr Purine im Verh~ltnis zu Pyridinen als die K. enthalten, da erfahrungsgem~B die ersteren leichter abzuspalten sind als die letz- teren; aber das widerspricht den makrochemisehen Ergebnissen, die alle auf einen sehr einheitlichen Bestand von Purinen und Pyridinen in den Thymusnukleins~uren versehiedener Herkunft weisen. Man mul3 daher eher daran denken, dab der Unterschied auf einer andersartigen Bindung zwischen Purin- bzw. Pyridinbase und Zuckerk6rper in den Sp. als in den K. beruht.

Mit der M~cA~uLVMschen Reaktion auf ,,maskiertes" Eisen bekomnit man keine Reaktion auf Pr~parate die in der w~Brigen S~urelSsung hydrolysiert sind, dagegen wie zu erwarten eine schSne blaue, auf dan in S~ure-Alkohol hydrolysierten. Es sind genau dieselben Teile gef~rbt wie mit der Nuklealf~rbung, d. h. nur das Chromatin. Mittels HC1- Alkohol-Hydrolyse wird die MACALLVMsehe Reaktion positiv naeh 10 Min. Hydrolysedauer, also etwas spi~ter als die Nuklealfi~rbung, aber sie dauert l~nger als diese. Die st~rkste Reaktion bekommt man nach 3--6 Stunden Hydrolyse oder nachdem die Nukle~lfs er- loschen ist. Nach 16sttindiger Hydrolyse bekommt man keine MACAL- LUMsche Reaktion mehr. In H~SO4-Alkohol hydrolysierten Pr~paraten ist die Reaktion starker als in den entsprechenden in HC1-Alkohol hydrolysierten und sie beginnt wie in d{esen naeh 10 Min., aber ist noch stark positiv nach 48stfindiger Hydrolyse. Mit dieser Reaktion ergab sieh kein Untersehied zwischen dem Verlauf der Reaktion auf den Sp. und dan K., Pr~parate die 2 bzw. 3 Stunden in w~r igen S~urel5sungen hydrolysiert sind und naehher 30 Min. in alkoholischen S~urelSsungen, gaben positive Reaktion in dem ersten Falle, aber keine in dem letzten.

behn Menschen w~hrend der Spermiogenese. 571

Dies bedeutet, dab wenn alles Nuklealfarbung gebendes Material auf- gelSst oder zerstSrt ist (nach 2stiindiger Hydrolyse in waBrigen Saure- 15sungen), so ist noeh etwas M~c~J~LVMsche Reaktion gebendes Material vorhanden. Es scheint mir hSehst zweifelhaft, dab die M~CALLUMsche Reaktion eine Reaktion auf ,,maskiertes" Eisen sei, da es sehr unwahr- seheinlich ist, dab naeh 2stiindiger Hydrolyse in waBrigen SaurelSsungen, die so stark 15send auf das Eisen wirken, dab man naeh MACALLVMs Auffassung deswegen keine Reaktion bekommt, noch mittels Saure- Alkohol ,,maskiertes" Eisen freigemacht werden kSnnte. Vergleicht man die Ergebnisse mit der Nuklealfarbung und der MACALLUMsehen Reaktion miteinander, so sieht man, dab beide an die Chromatinsubstanz gebunden sind, aber auf das Entstehen verschiedener KSrper in dieser beruhen miissen.

Gegen waBrige Saurehydrolyse verhalt sieh die Gallocyaninchrom- alaunfarbung der Chromatinsubstanz in der Weise, dab sie allm~hlieh schw~cher wird. Nach 2 Min. Hydrolyse f~rben sich die Kerne wie in den unhydrolysierten Praparaten, aber schon nach 10 Min. sind sie deutlich sehw~eher gefarbt und nach 30 Min. Hydrolysedauer sind sie, mit Ausnahme der Sp., die noch mittelstark gefarbt sind, nur sehr sehwaeh gefarbt. Nach lstiindiger Hydrolyse ist praktiseh genommen nur die Sp. gefarbt und naeh 6stiindiger Hydrolyse ist alles ungefarbt. Die Nukleolen und eytoplasmatisehen Bestandteile sind in allen Prapa- raten nur sehr sehwach gefarbt und farben sich eher etwas schwacher mit zunehmender Hydrolyse. Die H2SO4-LSsung setzt, wie in den Ver- suehen mit der Nuklealfarbung, die Farbbarkeit des Chromatins etwas stoker herab als die HC1-LSsung. In den in Saure-Alkohol hydroly. sierten Praparaten verliert das Chromatin seine Farbbarkeit mit Gallo- cyaninehromalaun viel langsamer und sparer als in den in waBrigen SaurelSsungen hydrolysierten Praparaten. So hat erst nach 1--3stiindiger Hydrolyse in HCI-Alkohol die Farbbarkeit stark abgenommen und naeh 6 Stunden ist sie in a]len Kernen, auger denen der Spermien und Spermatiden, versehwunden. Aueh in den in H2SO4-Alkohol hydroly- sierten Praparaten hat die Farbbarkeit erst naeh 1--3stiindiger Hydro- lyse starker abgenommen, aber sie scheint yon da ab nicht weiter ab- zunehmen, wenigstens nicht innerhalb von 48 Stunden. Von 30 MSn. Hydrolysedauer aufwarts sind in den in den waBrigen SaurelSsungen und H~SO4-Alkohol hydrolysierten Praparaten die Sp. ausgesproehen starker gef~rbt a]s die K. Dieses kommt aber in den in HCl:Alkohol hydrolysierten Pr~paraten erst yon 3stfindiger Hydrolysedauer ab zum Ausdruck. Die Nukleolen und das Cytoplasma verhalten sieh ahnlieh wie in den in wiiBrigen S~urelSsungen hydrolysierten Praparaten. Ver- gleieht man die Resultate tier Galloeyaninchromalaunfarbung mit denen der Nuklealf~rbung, so ergibt sieh folgendes: Wenn man yon den Sp.

572 Jon Steffensen: Veranderungen im Bau der Nucleoproteide

absieht, so sieht man, dab in den in w/~Brigen S/~urel6sungen hydroly- sierten Pri~paraten die F~rbbarkeit der K. genau den Ergebnissen mit der Nuklealf/irbung folgt, indem mit zunehmender Hydrolyse und Zer- stb'rung yon Nukleins/~ure aueh die F~rbbarkeit mit Gallocyaninehrom- alaun ahnimmt und wenn alles nuklealfiirbunggebende Material aus den Kernen gel6st oder zerstSrt ist, bekomrnt man auch keine F~rbung mit Gallocyaninehromalaun. Dieses Verhalten paBt auch einigermaBen fiir die in S/iure-Alkohol hydrolysierten Pr/~parate, doch sind die Kerne in den in HC1-Alkohol hydrolysierten Prs etwas 1/~nger mit Gallocyaninehroma]aun als mit d~m Nuklealreagens fi~rbbar und in den l/~nger (yon mehr als 1 Stunde ab) in H2SO4-Alkohol hydrolysierten Pr/~paraten wiirde man eigentlich eine sts F/~rbung mit Gallo- cyaninchromalaun erwarten, da diese Pr/~parate noch ziemlich viel Nuklealfi~rbung gebendes Material enthalten, was die naehherige Hydro- Iyse mit w~Brigen S/~ure]Ssungen zeigt (siehe oben). MACALLVMs Reaktion und Galloeyaninchromalaunfi~rbung beruhen seheinbar auf versehiedenen KSrpern oder Eigensehaften des Chromatins.

MAYEgs Hs fi~rbt das Chromatin in unhydrolysierten Prs raten in seh6nen blauen Ton und das Cytoplasma in mehr graulichen Ton. NIit zunehmender Hydrolyse sehl/~gt die blaue Farbe des Chromatins mehr und mehr in eine graublaue, /~hnlieh der des Cytoplasmas um, und da dieses ziemlieh stark mitgefiirbt ist, so wird die Unterscheidung zwischen Nfg. und Dfg. sehwieriger als in den Gallocyaninchromalaun gef/~rbten, die fast keine Mitfiirbung des Cytoplasm~s zeigten. In den Prgparaten, wo es Zweifel gab, ob das Chromatin dureh Nieder- sehlag oder Durchtrs gef/~rbt sei, ist ein Fragezeiehen hinter die Angabe der F/~rbungsst/~rke gesetzt. Im ganzen bekommt man /ihnliche Resultate mit MAYERS H~malaun wie mit der Gallocyanin- chrom~launi~rbung, mit der Ausnahme, da~ die Sp. sich mit H~malaun gleich f/~rben wie die K. und weiter, dab diese nach etwas l~ngerer Hydrolyse in w~Brigen S/iurel6sungen mit Hs noeh fi~rbbar sind, abet nicht mehr mit Gallocyaninehromalaun. Es verhalten sich alle Kerne gegen H~malaun ebenso wie die Sp. gegen Gallocyaninchromalaun. In dem Verhalten gegeniiber den Sp. ist die MACALLUMsehe Reaktion und die H/~malaunfiirbung /~hnlieh, indem beide jene gleichstark wie die K. f/~rben.

Die Ergebnisse mit der Gallocyaninchromalaun- und der Hamalaun- fs einerseits und der Nuklealf/~rbung andererseits best/itigen die Annahme, dab jene Kernfgrbungen, die als Niederschlagsi~rbungen yon v. M6LLV.NDO~YF bezeichnet worden sind, auf der Iqukleins/~ure in den Kernen beruhen. Das Verh~lten der Sp. in den mit Galloeyaninchrom- alaun gef~rbten Pr~paraten in der Weise zu deuten, dab jene eine anukleale Nukieins~ure enthalten, die resistenter gegen Hydrolyse als

beim Menschen w~hrend der Spermiogenese. 573

die nukleale ist, scheint mir nicht erlaubt, da man mit der H~malaun- f~rbung eine F'~rbung s~mtlicher Kerne bekommt nachdem die Nuklea]- fs versehwunden ist.

Die w~Brige GallaminblaulSsung fs die unhydrolysierten Prs rate mit einer diffusen blauen Farbe, aber die Wasch- und Alkohol- prozedur zieht das meiste yon der Farbe wieder aus, so dab nur ein schwachbl~ulicher Farbton auf allen Bestandteilen, abgesehen yon den roten Blutk6rperehen, die ziemlich stark gef~rbt sind, zuriickbleibt. Also eine typische Durchtr~nkungsfs Nach 2 Min. Hydrolyse in den w~l~rigen S~urelSsungen fi~rben sieh die Pr~parate mit Gallamin- blau wie die unhydrolysierten; nach 10 Min. zeigen die Sp. eine deutliche Kernfs (Nfg.) und naeh 30 Min. sind die K. aueh gef~rbt. Eine maximale Kernfi~rbung bekommt man nach lsttindiger Hydrolyse, bei l~ngerer Hydrolyse nimmt die Kernf~rbbarkeit ab und ist nach 24 Stunden Hydrolyse v611ig aufgehoben. Die Cytoplasmaf~rbung ist eher etwas geringer in den hydrolysierten als in den unhydrolysierten Pr~paraten, so dab das Chromatin sehr schSn zur Darstellung kommt. Nach 30 Min. - - lstiindiger ttydrolyse bekommt man mit Gallaminblau eine reine Chromatinf~rbung fast ohne jede Mitf/~rbung von cytoplasmati- schen Bestandteilen. Die Sp. sind dunkelblau gef/~rbt, aber die K. sind vioIettblau gef~rbt, besonders deutlich tr i t t dieser Farbtonunterschied in den in H2SO4-L6sungen hydrolysierten Pr~paraten hervor. Nach ls Hydrolyse (1--6 Stunden) f~rben sich auch die Sp. etwas violett- blau, aber nicht so stark wie die K. In den in Ss hydroly- sierten Pr~paraten fs die Kernf~rbbarkeit gleichzeitig (nach 10 Min.) in den Sp. und in den K. an, sie wird mit zunehmender Hydrolyse bis zu 1 Stunde allmi~hlich starker, um von da ab unver/~ndert zu bleiben. Wie die Kern~rbung verh~lt sieh die Cytop]asmaf~rbung, diese wird auch mit zunehmender Hydrolyse immer starker und starker. Die in H2SO4-Alkohol hydrolysierten Pri~parate f~rben sich etwas sti~rker wie die in HC1-Alkohol hydrolysierten. Meistens sind in den l~nger hydrolysierten Prgparaten die Sp. kr~ftiger gef~rbt als die K., und zwar dunkelblau im Gegensatz zu dieser mehr ins Violett schim- mernder Farbe. Die Nukleolen sind in diesen Prs in gleicher St~rke und Farbe wie die Sp. gefi~rbt im Gegensatz zu allen iibrigen in Tabelle 1 angegebenen Prgparaten, wo keine Hervorhebung der Nuk- leolen zu sptiren war.

Die w~13rige Gallocyaninl6sung f~rbt die unhydrolysierten Prs in schwachem unschSnem graubl~ulichem Ton, am sts gef~rbt sind die Sp., dann folgen die K. und am wenigsten das Cytoplasma. Man bekommt also eine Kombination yon Niederschlags- und Durch- trs Die F~rbbarkeit der hydrolysierten Pr~tparaten m i t Gallocyanin verl~uft im wesentlichen wie die mit Gallaminb]au, nur

574 Jon Steffensen: Veriinderungen im Bau der Nucleoproteide

sind die Kerne in den ersten Pr~paraten (2 und 10 Min.) sts gef~rbt und im allgemeinen wird eine reinere Chromatinf~rbung mit Gallocyanin als mit Gallaminblau erreicht, was verst~ndlich ist, da jener schon ohne Hydrolyse wie ein Kernfarbstoff wirkt. Auch sind in diesen Pr~paraten die Sp. in gleiehem Farbton wie die K. gef~rbt und die Nukleolen sind nicht besonders hervorgehoben. In den mit Gallaminblau und Gallo- eyanin gefi~rbten Pr~iparaten ergeben sich dieselben Schwierigkeiten wie in den mit H~malaun gef~rbten bezfiglieh der Unterscheidung zwischen Nfg. und Dig. Vergleicht man die Kernf~rbungen dieser zwei letzten F~rbungen mit denen der Gallocyaninchromalaun, so ergibt sieh: In den in ws S~urelSsungen hydrolysierten Pr~paraten f~ngt das Chromatin in den K. an sieh mit Gallaminblau zu f~rben bzw. mit Gallo- cyanin sich starker zu f~rben, nachdem die F~rbbarkeit mit Galloeyanin- chromalaun nahezu erloschen ist (nach etwa 30 Min. Hydrolyse) und erreicht ihr Maximum nachdem jene vSllig er]osehen ist (nach 1--3 stiin- diger Hydrolyse). Die Sp. sind dagegen etwa gleich lang mit Gallocyanin- chromalaun, Gallaminb]au und Galloeyanin fi~rbbar, obwohl etwas schw~cher mit dem ersten wie mit den beiden letzteren. In den in Skure- Alkohol hydrolysierten Pr~parate wird die Chromatinf~rbarkeit mit Gallaminblau und Gallocyanin mit zunehmender Hydrolyse immer stgrker, also umgekehrt wie mit Gallocyaninchromalaun, wo sie immer schw~cher wird. Diese Ergebnisse mit den Gallaminblau- und Gallo- cyaninf~rbungen auf den in S~ure-Alkohol hydrolysierten Pr~parate scheinen auf einer allgemeinen Eigenschaft des Protoplasmas zu beruhen, da die F~rbung ss Bestandteile der Prs Cytoplasma, kollagene Fasern, Granula und Nukleoli parallel der Chromatinf~rbung verl~uft. Und man hat den Eindruck, da[3 mit zunehmender Hydrolyse auch jene Bestandtefle mehr oder weniger im Sinne der Nfg. sich f~rben. Ich habe daher die Untersuchung zweier nichtlackbildender Farbstoffe, des sauren Farbstoffes Chromotrop und des basischen Fuchsins hieran angeschlossen um ihr Verhalten in diesen Beziehungen zu sehen. Dabei bekommt man mit zunehmender Hydrolyse sowohl in w~i~rigen wie alkoholischen S~urel6sungen auch zunehmende Fi~rbung s~mtlieher Bestandteile der Pri~parate mit Chromotrop; also dasselbe Verhalten, ausgenommen dab die Sp. gleich den K. gef~rbt sind, wie mit Gallamin- blau und Galloeyanin auf den in Sgure-Alkohol hydrolysierten Pr~paraten. Fuchsin dagegen fgrbt um so weniger, je li~nger die Pr~parate hydroly- siert sind, gleiehgiiltig, ob man w~13rige oder alkoholische S~urel6sungen benutzt. Eigentiimlich ist dabei, dab Alkohol den Farbstoff aus s~mt- lichen Bestandteilen der unhydrolysierten in Fuchsin gef~rbten Pr~parate nach etwa 10 Min. auszieht, auger aus den Sp., die erst nach 1 Stunde oder mehr ausgewaschen sind. Ein s Verhalten weisen die Sp. gegenfiber Auswaschen tier Farbe mit Ss auf. Im ganzen

beim Menschen w~hrend der Spermiogenese. 575

verh~lt sich die Chromotrop- und Fuchsinf~rbung wie man nach dem Einflu0 des p~ auf die F~rbbarkeit erwarten konnte, indem das F~r- bungsvermSgen der sauren Farbstoffe zu- und das der basischen ab- nimmt mit zunehmendem PH (PIscHI~GER 1926). Diese Erkl~rungs- weise kann man aber nich~ auf die Gallaminblau- und GaUocyanin- f~rbung iibertragen. Erstens f~rben sich beide im gleichen Sinne, trotzdem das eine ein saurer, das andere ein basischer Farbstoff ist, und zweitens zeigen sie eine selektive Chromatinf~rbung in den in w~Brigen S~ure]5sungen hydrolysierten Pr~paraten. Es ws inter- essant zu untersuchen, ob dieses Verhalten ein fiir die lackbildenden Farbstoffe spezifisches ws zwar scheint das nicht beziiglich des H~matoxylin zu gelten, abet es ist auch das H~matein, welches das lackbildende Verm5gen besitzt, und in den in S~ure-Alkoho| hydro- lysierten Prs zeigt doch das H~matoxylin selektive Chroma- tinf~rbung {die MACALLUMsche Reaktion). MSgen so die Gallamin- blau- und Gallocyaninf~rbungsergebnissc der in S~ure-Alkohol hydro. lysierten Pr~parate auf allgemcinen Protoplasmaeigensehaften beruhen, so miissen jedenfalls die Ergebnisse der F~rbung der in w~rigen S~urelSsungen hydrolysierten Prs auf einer spezifischen Eigen- schaft der Chromatinsubstanz beruhen. Wie aus Tabe]le 1 hervorgeht, kann diese Eigenschaft nicht an die Thymusnukleins~ure gebunden sein, da die Chromatinfs der in w~i]rigen Ss hydro- lysierten Pr~parate mit Gallaminblau und Gallocyanin am st~rksten ist, nachdem die Nuklealfs verschwunden ist, Jene Fs beruhen daher wahrscheinlich auf dem Proteinbestandteil der Nukleo- proteide.

Die in Tabelle 1 mit S~urehydrolyse angestellten Versuche sind entsprechend auch mit w~Brigen und alkoholischen Ammoniak]Ssungen (siehe unter Technik) wiederholt worden. Die Hydrolyse in der ws AmmoniaklSsung konnte jedoch nicht l~nger als etwa 2 Stunden dauern, da nach ls Hydrolyse die Pr~parate vom Objekttr~ger weg- schwammen. S~mtliche Versuche gaben keine oder nur Spuren Nukleal- f~rbung und M~cxLLV~sche Reaktion, und mit Gallocyaninchromalaun, M x v ~ s H~malaun, Gallaminblau und Gallocyanin f~rbten sich die hydrolysierten Pr~parate ungefs so wie die unhydrolysierten. Wenn man die in den AmmoniaklSsungen hydrolysierten Pr~parate nachher in den S~urel5sungen hydrolysierte, so gaben sie dieselben Resultate wie die nicht vorher in Ammoniak hydrolysierten Pr~parate. Es ergibt sich aus diesen Versuchen, dab die Ammoniakl6sung nieht oder wenigstens sehr wenig die Chromatinsubstanz angre~ft, was gut mit den makrochemisehen Ergebnissen iibereinstimmt, die Ammoniak als sehr mildes Hydrolysierungsmittel ergeben, das erst nach dem Koehen in st~rkeren L6sungen (25 % ) die Nukleins~ure angreift (T~A~N~USER 1917).

576 Jon Steffensen: Ver/inderungen im Bau der Nucleoproteide

W a -

Hydro lysedaue r

Hydrolyse ~

Nuklealf~rbung. . m 0 m 0 0 Maeallum . . . . Galloeyaninchrom-

tIamalaun . . . . st st sch [ m + m + sch I sch [ s c h + sc + 0 0 Gallaminblau " " ' s c h - - ' s c h [ / s c h - - sc t o s ch I s ch m § sch !

Gallocyanin . . . s c h - - [ sch q- ,11 sch - - ] sch + m sch - - I

Hydrolyse in

Nuklea l f~rbung . . I 10n m 0 ] ~ Macallum . . . . 0 Galloeyaninchrom-

. . . . i + Gallaminblau . . 0 s Gallocyanin . . . [ s c h - - ] sch s c h - - [ s c h +

Nukle 'a l f~rbung. . Macallum . . . . Gallocyaninchrom -

alaun . . . . . Hamalaun . . . . Gallaminblau . , Gallocyanin . . .

sch 0

st st

0 sch - -

st stSt s t 0 s c h - - | sch

sch s c h - - | sch +

Nuklea l f i i rbung. . [ s c h - - Macallum . . . . Gall~176 I s~ /

alaun . . . . . st HRmalaun . . . . GaUaminblau . �9 Gallocyanin . . �9 ] s c h - - /

sch 0 I sch 0 0 [ sch

I st sp ] s t - - st sch I s t - - 0 s c h - - ] sch

sch s c h - - [ sch +

o -

s t - - sc~P Isc~P+ mmm% I seh - - [ sch +

s e h - - [ seh

i n - - 0 sch + s c h - 0 sch +

st st 2 s m - - m +

sch s c h - - sch -k IXI Sch n l - -

sch + 0 0 sch

s t - - : s s t - - seh seh - - m sch

sch + ] sc + ram§ / s c h - ]

seh - - I

Hydrolyse in m - - 0

sch + 0

m sch - - +_ sch +

~ch sch

Hydrolyse in sob+ m 0 ] , st st

m - - I m s c h - -

m - - s c h + I sch m - - sch [

K Die ZeUkerne mit Ausnahme der Spermien- und Spermatidenkerne. Sp Die

Die H a u p t e r g e b n i s s e de r L6s l ichke i t sverh /~ l tn i sse d ieser m i t t e l s S / i u r ehyd ro ly se d a r g e s t e l l t e n K 6 r p e r n s ind in den T a b e l l e n 2---4 an- gegeben . A u s d iesen e r g i b t s ich: D e r N u k e l a l k 6 r p e r (siehe Tabe l l e 2), de r m i t t e l s H y d r o l y s e in w/ igr igen S~ure l6sungen in d e n Sp. e r zeug t is t , i s t f a s t unl6s l ich in k a l t e m Wa sse r , d a g eg en i s t der , de r in den i ib r igen K e r n e n d a r g e s t e l l t is t , d a r i n 16slich. I n 600 he iBem W a s s e r i s t de r N u k l e a l k 6 r p e r s/~mtlicher K e r n e l e i ch t 16slich, obschon de r de r Sp. sich e twas l a n g s a m e r 16st. I n k a l t e m 8 0 % i g e n A l k o h o l i s t de r N u k l e a l - k 6 r p e r sehr schwer 16slich; e twas besser 16st er s ich in heiBem 8 0 % i g e n Alkoho l . D e r N u k l e a l k S r p e r de r Sp. i s t a u c h in 8 0 % i g e m Alkoho l s chwere r 16slich als de r de r K . I n a b s o l u t e m A l k o h o l i s t de r N u k l e a l -

beim Menschen wi~hrend der Spermiogenese. 577

sp? sob

sch + Ill

belle 1.

1 Std. ] 3 Std.

- I

wa'~ri~le HC1-L6"sung. oolooo m - - S C : + I 0 I~oh+ sch { s e h - seh - - J

st--st-- seeP+ [ semh~ ram--

I 6 Std.

0 0

0 r f l - -

sp seh

0 sp sp? sch

w~flrige H2SO4.LSsung. sp 0 ! o o / o ~ o o

sch sch sch + m+ 8~ ~ m%

st sch + ] sch +

alkoholische HC1-Lgsung.

! ~~ ~~ ~ I m - - m - - 0 0 0 ~

m - - s c h + l s ; h - - s c h I =~+ ~o~ + ~ + sch + - - sc

alkoholische HzSO~-Lb'sung.

% § m - s t - st

st

o

sp sch

m +

seh sp?

m +

m m

K

16--24 Std. I sp I c

o oo 0 0

sp ? sp ?

o o 0 0

sp? sp?

olo o sch o o ~o

I -- 0 ]sch-- o ~:: ~ ~ ~ : o j ~ , ~ o ~ _ 1~ sch-- sch-- seh + / sch- - [ sch- - sch + sch--[sch-- sch + sch + sch + m- - [sch + sc~st+ Isch+ m - - [ sch sch+ m+ st-- in ist-- ~ m [ m+ st sch+ m - - st s e h + i m - - m - - i m - - st

Spermien- und Spermatidenkerne, C Cytoplasma.

0 m - -

sp sch +

0 m - - seh - - sch +

0

0 m - -

i n m - -

0 0

sch -- r a -

m

m--

k6rper s/~mtlicher Kerne unl6s]ich, dagegen leicht 15slich in w/~Briger AmmoniaklSsung, doch der der Sp. ein wenig schwerer 15slich als der der K. Diese Versuehe zeigen, dab die Thymusnulfleins/~ure tier Sp. in ihrem Bau yon der in den K. abweicht.

Der MACalmCrasche K6rper (Tabelle 3) ist in allen benutzten L6sungsmitteln schwer- oder unl6slich, auBer in den w/~Brigen S/s 16sungen, in denen er sich ]eicht ]5st. Die LSslichkeitsverh/fltnisse sind die gleichen ffir den MAcalmlZMschen K6rper der Sp. wie fiir den der K. Diese Ergebnisse lassen keine Schlfisse fiber die Natur dieser Reaktion zu. Es l~B~ sich nur sagen, dab sie nichts mit dem Nukleal. kSrper zu tun hat.

578 Jon Steffensen: Verimderungen im Bau der ~ucleoproteide

Tabelle 2. D i e L 6 s l i c h k e i t s v e r h / i l t n i s s e des N u k l e a l k 6 r p e r s .

L6sungsmitteln: Lsslichkeit: Aqua dest. bei 18~ Iqach 24 Std. K: gel6st, Sp: nichts gelSst

. . . . . . 18 o C ,, 72 ,, ,, gel6st, ,, etwas gel6st

. . . . . . 60 o C ,, 2~/~ . . . . gel6st, ,, etwas gelSst

. . . . . . 60~ ,, 4 . . . . gelSst, ,, gel6st 80% Alkohol bei 180 C ,, 24 ,, ,, etwas gelSst, ,, nichts gelSst 80% . . . . 600 C ,, 21/~ ,, ,, etwas gel6st ,, nichts gelfst 80% . . . . 60 ~ C ,, 4 . . . . fast gel6st, ,, etwas gel6st 80% . . . . 60 o C ,, 24 . . . . fast gel6st, ,, viel gel6st Absoluter Alkohol bei 180 C ,, 24 . . . . nichts gel6st, ,, nichts gel6st

. . . . . . 600 C ,, 24 . . . . nichts gel6st, ,, nichts gel6st Wi~flrige Ammoniakl6sung ,, 1/~ . . . . etwas gel6st, ,, weniger gel6st

bei 180 C als in K W~Brige Ammoniakl/~sung ,, 4 . . . . gel6st, ,, gel6st

bei 180 C Die Pri~parate sind erst 10 Min. in w~l~rigen S/iurelSsungen hydrolysiert,

dann in Wasser abgespiilt und in die LSsungsmittel gesteUt worden. 5Iach Ab- spiilung in Wasser mittels F~.UV,GV.l~s Verfahren gef~rbt. Sp. Der lquclealk6rper in den Spermien und Spermatiden. K. Der Nuclealk6rper in den iibrigen Kernen.

Tabelle 3. D ie L S s l i c h k e i t des K S r p e r s , de r die MACALLUMsche R e a k t i o n b e d i n g t ~ der MACALT,UMsche K 6 r p e r .

LSsungsmittel: Aqua dest. bei 18 o C Nach 24

. . . . . . 600 C ,, 2

. . . . . . 600 C ,, 24 80% Alkohol bei 180 C ,, 24 80% . . . . 600 C ,, 24 Absoluter Alkohol bei 180 C ,, 24

60 o C 24 W~Brige Ammoniakl6sung bei 180 C ,, 24 HC1- oder HaSO4-LSsung bei 180 C ,, 24

, , , , , , , , 60~ ,, 1/4 . . . . . . . . 600 C ,, 1/~

LSslichkeit: Std. K: etwas geltist, Sp: etwas gelSst

. . . . nichta gelSst, ,, nichts gelSst ,, ,, viel gel6st, ,, viel gelSst . . . . nichtsgelSst, ,, niehtsgelSst . . . . etwas gelSst, ,, etwas gelSst . . . . nichtsgelSst, ,, nichtsgelSst . . . . nichts gelSst, ,, niehts gel6st . . . . etwas gelSst, ,, etwas gel6st . . . . gelSst, ,, gelSst . . . . viel gelSst, ,, viel gel6st ,, ,, gelSst ,, gelSst

Die Pr~tparate sind erst 30 Min. in H2SOa-Alkohol hydrolisiert, dann in Wasser und in die LSsungsmittel gebracht worden. Nach Absptilen in Wasser wurden sie in der w~flrigen H~matoxylinlSsung gef~rbt. Sp. Der MAc~LvYmche KSrper in den Spermien und Spermatiden. K. Der MACALLUMsche KSrper in den iibrigen Kernen.

D i e Ga l locyan inch roma laun f /~ rbung be ruh t , wie die H y d r o l y s e - v e r s u c h e ze ig ten , z u m grSl~ten Tei l auf de r u n h y d r o l y s i e r t e n Nu lde in - s~ure, die j a y o n d e n b e n u t z t e n L S s u n g s m i t t e l n n i ch t angegr i f f en oder ge l6s t wi rd . I c h h a b e dahe r die L S s u n g s v e r s u c h e auf den schwer hyd ro ly - s i e rba ren Ante i l in den Sp. beschr/~nkt, u m zu sehen, wie er sich zu d e n L S s u n g s m i t t e l n verh~l t . D ie Ve r suche s ind d~her auf P r ~ p a r a t e n , die 1 S t u n d e in d e n w/~l~rigen S~ure lSsungen h y d r o l y s i e r t w a r e n u n d in d e n e n n u r die Sp. f/~rbbar s ind, anges te l l t . D a b e i ze ig te sich, dab al le die in Tabe l l e 2 b e n u t z t e n L S s u n g s m i t t e l k e i n e n ode r wen igs tens sehr ge r ingen Einf luB auf die F /~rbbarke i t de r Sp. h a t t e n .

beim Menschen w/~hrend der Spermiogenese. 579

Tabelle 4. Der Einf luB v e r s c h i e d e n e r L 6 s u n g s m i t t e l auf die F g r b b a r k e i t h y d r o l y s i e r t e r P r ~ p a r a t e mi t G a l l a m i n b l a u .

L6sungsmittel: Beeinflussung der Fgrbung: Aqua dear. bei 180 C Naeh 24 Std. K: sehr wenig (et- Sp: viel (rotviolett,

was rotlicher), keine blaue Farbe)

. . . . . . �9 60 ~ C ,, 1 . . . . sehr wenig ,, viel (fast keine blaue Farbe)

. . . . . . 600 C ,, 24 . . . . wenig, ,, viel (keine blaue Farbe)

80% Alkohol bei 18 oC ,, 24 ,, ,, nichts, ,, nichts 80% . . . . 60 ~ C ,, 24 . . . . nichts, ,, sehr wenig (et-

was r6tlieh) Absoluter Alkohol bei 180 C ,, 24 . . . . nichts, ,, nichts

,, ,, ,, 60 ~ C ,, 24 . . . . niehts, ,, nichts Alkoholische Ammoni~k~ , , 2 4 . . . . ein werdg ,, nichts

16sung bei 18 ~ C sehw/~cher gef/~rbt

Alkoholische Ammoniak- ,, 24 . . . . viel schw/~eher ,, etwas sehw/~cher 16sung bei 60 e C gefarbt gef/~rbt

W/iBrige Ammoniakl6sung ,, 24 . . . . etwas schw/~eher ,, etwas schw&cher bei 18 o C gefgrbt gefgrbt

Die Prgparate aind erst 1 Stunde in w~l]rigen H~SO 4- bzw. HC1-L6sungen hydrolisiert, dann nach Abspiilen in Wasser in die L6sungsmittel gestellt und nach Abspiilen in Wasser mit Gallaminblau gef~rbt worden.

Die Bedingungen, die die Kernfgrbungen mi t t e l s Gal laminblau zu- s tande kommen lassen, s ind yon den LSsungsmi t te ln verschieden beein- fluflt (siehe Tabel le 4). I n P rgpara ten , die 1 S tunde in wgl~rigcn Sgure- 15sungen hydro lys ie r t s ind und naehher 24 S tunden ka l t em oder heiBem Wasse r ausgesetz t sind, fgrb t sich das Chromat in al ler Kerne in rot - vio}ettem Ton und g]eichstark in al len Kernen. Diese Pr/~par~te wirken da der blaue Antefl der Fg rbung verschwunden ist, als schwgcher gefgrbt als die n ich t mi t Wasse r behande l ten Pr~para te , nament l ich die 8p., die j a in diesen dunke lb lau gef~rbt sind. 80%iger A]kohol (kalt oder heiB) beeinfluBt nach 24stfindigem Einwirken die nachher ige GaBamin- b laufgrbung sehr wen/g, nur die Sp. s ind e twas werdger b laugefgrbt als in den n ich t mi t Alkohol behande l ten Prgpara ten . Absolu te r Alkohol h a t keinen EinfluB. Alkoholische und w~Brige Ammoniak l6sungen haben keinen EinfluB auf den F a r b t o n , aber die Fa rb s tg rke ist e twas herabgesetz t . Diese in Tabel le 4 benu tz ten L6sungsmit te l haben den gleichen Einflufl auf die nachfolgende Gal laminblaufgrbung yon in a]koholischen Sgurel6sungen hydro lys ie r t en wie in w~Brigen Sgure- 16sungen hydro lys i e r t en Prgpara ten . I n den in a lkohol ischen Sgure- 16sungen hydro lys ie r t en P r g p a r a t e n fgrb t sich mi t Gal laminblau n icht nu t die Chromat insubs tanz , sondern auch Cytoplasma, kol lagene Fasern , Granula und NukleoIi , und zwar meis tens in mehr bls Ton als die Chromat insuhs tanz (die der Sp. ausgenommen). Alle jene Bes tandte i le

580 Jon Steffensen: Ver~nderungen im Bau der Nucleoproteide

werden v o n d e r Wasserbehandlung gleich beeinflugt wie die Chromatin- substanz, indem sie sich wie diese rotviolett f~rben. AuBerdem scheint die Farbst~rke dieser nichtchrom~tinhaltigenBestandteile sti~rker herabgesetzt zu sein als die der Chromatinsubstanz, so dab diese deutlicher hervor- tritt . Die w/~grigen und alkoholisehen AmmoniaklSsungen wirken in der Weise auf diese niehtchromatinhaltigen Bestandteile, dab sie sich fast gar nicht mit Gallaminblau f/irben, so dab die Pr/~parate wie die ent- sprechend in w/~grigen S/~urelSsungen hydrolysierten Pr~parate aussehen.

Diese mit Gallaminblau vorgenommenen Versuche sind entsprechend auch mit Gallocyanin gemacht worden. Sie ergaben im ganzen ~hnliehe Resultate wie jene mit Gal]aminblau, nur war keine ~nderung im Farbton bei den mit Galloeyanin gef/~rbten Pr/~paraten zu bemerken. In den Gallocyaninpr/~paraten entsprach die St~rke der F/~rbung der der Gall. aminblaupr/iparate, jedoch beseitigte eine Behandlung mit Wasser nicht den Untersehied in der TSnung der Sp. und der K.

Fagt man ss Versuche mit den Gallaminblau- und Gallo- cyaninf/~rbungen zusammen, so sieht man, dag einerseits (in den in alko- holischen S/iurelSsungen hydrolysierten Pr/iparaten) eine gewisse Ver- wandtschaft mit den Cytoplasmaf/~rbungen besteht etwa im Siime der Dfg.; andererseits (in den in w/~grigen S~urelSsungen hydrolysierten Pri~parate) haben sie eine Affinit~t zu der Chromatinsubstanz wie der Nfg. Diese _A_ffinit/~t beruht sehr wahrscheinlich, wie oben angedeutet, auf der Proteinkomponente des Nukleoproteids, und da diese F/~r- bungen ein verschiedenes Verhalten in den Sp. gegeniiber der K. zeigen, so mug das auf Verschiedenheit in den Proteinkomponenten beruhen.

Ieh finde es hier angebracht, einige Bemerkungen fiber die F~r- bungen der hydro]ysierten Pr/~parate mit Gallaminblau zu geben, da sie nicht in den Rahmen der sonst vielverspreehenden Einteilung von v. MOLLENDORFF in Dfg. und Nfg. zu passen scheint, v. MO~LEN])O:KFF und TOMITA (1926) fanden, dag Gallaminblau mittelsehnell diffundiert, keinen Niederschlag mit sauren Kolloiden gibt und - - was mit diesen Ver- h/~ltnissen fibereinstimmt - - wie ein saurer Farbstoff f~rbt. Augerdem gibt v. MOLLENDOI~FF (1924) an, dab Metachromasie immer auf Nfg. beruht und da$ saure Farbstoffe nie Nfg. geben. Heine Ergebnisse mit Galiaminblauf~rbungen der hydrolysierten Pr/~parate stehen, wie aus der Besehreibung hervorgeht, im Widerspruch mit diesen Angaben und lassen sich auch nicht als Nfg. im Sinne von v. M6LLE:NDORFF erkl/~ren. Vielleicht k6nnte man BECrIERs Auffassung, die Beizen- fi~rbungen als eine Trippelverbindung yon Gewebe, Beize und Farbstoff annehmen. Dafiir k6nnte sprechen, dag die laekbildenden Farbstoffe (Gallaminblau und Gallocyanin) eine Affinit~t zu dem Proteinbestandteil des Nukleoproteids haben und dag die Beizen Niederscht/~ge mit Nuklein-

Protein ~:Nukleins~ure s/~ure bilden. Die Trippelverbindung w/~re dann \ / Farbstoff-Beize

beim Menschen wiihrend der Spermiogenese. 581

Da nun der Farbstoff keine Affinitgt zu den Nukleoproteiden hat, aber zu der freien Proteinkomponente dieser, und dal~ die Farbstoffbeize keine Affinit/it zu dieser, aber zum Nukleoproteid hat, so scheint es, dal~ der Farbstoff sieh an derselben Stelle im Molekiil an die Beize und an die Proteinkomponente bindet, und dab diese sieh wieder an derselben Stelle im Molekiil mit dem Farbstoff verankert, wo sie frfiher mit der Nukleins/~ure verbunden war.

Es geht aus der Beschreibung der Versuchsergebnisse hervor, dab das Nuldeoproteid der Sp., sowohl in seinem Nukleins/iure- als Protein- bestandteil von dem Nukleoproteid der K. abweicht. Diese Ver/~nde- rungen im Bau des Nukleoproteids setzen ein im 4. Stadium der Spermio- genese, mit der Umbildung der Spermatiden zu reifen Spermien. So zeigen die Kerne der Spermatiden die noeh rundlich sind, ebenso wie die Pr/~spermatidenkerne kein abweiehendes Verhalten gegeniiber den K. ; erst mit der Verdichtung und Verl/~ngerung der Spermatidenkerne fangen die Veriinderungen an, sie werden immer st/~rker mit zunehmender Reifung und sind am ausgepr/igtesten in den reifen Spermien. Die Ver- /inderungen in der Nukleins/~ure und der Proteinkomponente verlaufen parallel, so dal~ es den Anschein hat, als ob sie abh/~ngig voneinander w/~ren; aber welche Bedeutung sie sonst haben, ist schwer zu sagen. Da die Ver/inderungen nicht mit der Reduktionsteilung auftreten, sondern erst sp/iter, so ist zu vermuten, dab sie niehts mit den Erb- faktoren zu tun haben, wenigstens nieht direkt. Richtiger ist es wohl, die Ver/~nderungen als einen allgemeinen Stabilisierungsvorgang zu deuten in dem Sinne, dal~ das Nukleoproteid stabiler oder resistenter gegen/~uBere Einwirkung wird, so dab es auf dem ]angen Weg, den die Spermien bei der Befruchtung zuriicldegen miissen, nicht geseh/idigt wird. Oder sind die Ver/~nderungen vielleicht in Verbindung mit dem groBen Energieverbrauch zu bringen, welchen die Spermien auf- wenden miissen um das Ei zu erreichen. Aus meinen Versuchen kann man keinen zuverl/issigen SchluB auf den Sinn dieser Veri~n- derungen ziehen. Sehr wahrscheinlich werden die Ver/~nderungen durch die SERTOLIsehen Zellen vermittelt, da j ene erst auftreten, nachdem die Spermatiden in organiseher Verbindung mit den S~TOLIschen Zel]en getreten sind.

Zusammenfassung. 1. Der Verlauf der MACALLUMschen Reaktion auf ,,maskiertes"

Eisen, der blukleal-, Gallocyaninchromalaun., ~V[AYERs H/imalaun-, Gallaminblau- und Gallocyaninf/~rbung auf hydrolysierten Pr/~paraten wurde verfolgt. Zugleich wurde die LSs]ichkeit der durch Hydrolyse dargestellten KSrper untersucht. Zur Hydrolyse wurden w/~l~rige und alkoholische S/s und AmmoniaklSsungen benutzt.

Z. f. Zel l forschung u. m ik r . Ana tomie . Bd. 25. 39

582 Jon Steffensen.

2. Durch die w/~l~rigen S/iurelSsungen wird die Nukleins/~ure vSllig aufgespal ten, nur zum Teil durch die a]koholischen S/iurelSsungen und gar n ich t durch die AmmoniaklSsungen.

3. Die Niederschlagsf/~rbungen mi t M~YE~s H/~malaun und Gallo- cyan inchromalaun im K e r n c h r o m a t i n beruhen auf de r Nukleins/~ure.

4. W e n n die Nuk]eins/iure durch Hydro ly se in w/~l~rigen S/~ure- 15sungen ve rb rauch t ist, f i irben die GaUaminblau- und Gal locyanin- 15sungen das Chromat in selektiv, was auf der res t ie renden Prote in- komponen te des Nukleopro te ids zur i ickgefi ihr t wird.

5. Die ~qLkcALLUMsche R e a k t i o n be ruh t hSchstwahrscheinl ich n ich t auf , ,maskie r tem" Eisen und n icht auf Nuk]eins/mre, sondern s teh t wahrscheinl ich in i rgendeiner Verb indung mi t der P ro t e inkomponen te des Nukleoprote ids .

6. Sowohl gegen Hydro lyse wie gegen LSsungsmit te l ve rha l t en sich in mancher Hins ich t die Spermien- und Spe rma t idenkerne anders als die i ibrigen Kerne. Einersei ts beruhen die Untersch iede auf Verschieden- hei ten in der Aufspa l tung der Nukleins/~ure, was wieder auf Verschieden- hei ten in ihrem feineren Bau zuri ickzuffihren ist. Andererse i t s auf Ver- schiedenhei ten im Bau der P r o t e i n k o m p o n e n t e des Nuk leopro te ids .

Litcratur. Bauer, H.: Feulgensche Nuklealf~rbung in ihrer Anwendung auf cyto-

logische Untersuchungen. Z. Zellforsch. 15 (1932). - - Becher, S.: Untersuchungen fiber Echtfarbung tier Zellkerne. Berlin 1921. - - Burian, It.: Chemic der Sperma- tozoen. 1. und 2. Mitteil. Erg. Physiol. 3 (1904); 5 (1906). - - Feulgen, R.: Das Verhalten der echten Nukleinsaure zu Farbstoffen. 1. u. 2. Mitteil. Z. physiol. Chem. 80, 84 (1913). - - Die Nuklealfarbung. Handbuch der biologischen Arbeits- methoden, Abt. V, 2, 2. H~tlfte. 1932. - - Hueck, W.: Pigmentstudien. Beitr. path. Anat. 54 (1912). - - Koch, A.: Morphologie des Eiwachstums der Chilopoden. Z. Zellforsch. 2 (1925). - - Macallum, A. B.: Erg. Physiol. 7 (1908). - - Mifllendorff, W. u. M.: Durehtrankungs- und Niedersehlagsfarbung als Haupterscheinungen bei der histologischen F~rbung. Erg. Anat. 25 (1924). - - MiJllendorff, W. v. u. T. Tomita: Durchtrankungs- und Niederschlagsfarbung bei der Wirkung der Beizen- farbstoffe. Z. Zellforsch. 3 (1926). - - Nieholson, F. M.: The changes in amount and distribution of the iron-containing proteins of nerve cells following injury to their axones. J. of Neur. 36 (1923). - - Pisehinger, A.: Die Lage des isoclektrischen Punktes histologischer Elemente als Ursache ihrer verschiedenen F/irbbarkeit. Z. Zellforsch. 3 (1926). - - Romeis, B.: Taschenbuch der mikroskopischen Technik. Mfinchen u. Berlin 1932. - - Steudel, H. u. 0sato $hungo: Chemische Untcrsuchungen fiber Kernf~rbung. Z. physiol. Chem. 124 (1923). - - Thannhauser, S. J.: ~ber den chemischen Aufbau des Nukleinsauremolekfiles. Habil. Mfinchen 1917. - - Well, A.: Mikroskopiseher Nachweis einzelner Zellbestandteile. Handbuch der biologischen Arbeitsmethoden. Abt. V, 2., 1. Hiilfte. 1928.