6
Rcprod. Dom. Anim., 27, 130-135 (1992) @ 1992 Paul Parey Scientific Publishers, Berlin and Hamburg ISSN 093&6768 Forsc hungszen tru m fur Tierpro du k tion Dum m erstorf-R osto ck, Germany Veranderungen im Thrombozytengehalt milzektomierter Mause nach Injektion von ,,Embryo derived-Plateletactivating Faktor" U. Tiemann und M. Spitschak Inhalt: Maus- und Kaninchenembryokulturmedium verursachte bei milzektomierten Mausen eine signifikante Verminderung des Thrombozytengehaltes. Das selbe Ergebnis wurde nach Injektion (i.p.) von einer geringen Dosis PAF-acether erreicht. Ein und mehrere Rinderembryonen produrierten in vitro Embryo-derived platelet activating Factor (EDPAF), der in milzektomierten Mausen eine Thrombozytopenie bewirkte. Dieser Effekt trat nach Injektion von Kulturmedium, in dem unbefruchtete Eizellen inkubiert wurden, nicht auf. Der Nachweis des EDPAF im Rinderembryokulturmedium mittels eines Bioassay kann angewendet werden: (1) als eine quantitative und nicht invasive Methode fur die Bestimmung der Vitalitat von in vitro kultivierten Embryonen (2) fur eine qualitative Kontrolle des Embryokulturverfahrens. Contents: Alterations of platelet count in splenectomized mice after injection (i.p.) of embryo derived platelet activating factor The application of mouse and rabbit embryo culture media caused asignvicant reduction in the platelet count of splenectomized mice. The same result was observed after i.p. injection of small dose of PAF-acether. One or several bovine embryos were able to produce an embryo derived platelet activating factor (EDPAF) in vitro which caused thrombocytopenie in splenectomized mice. This effect did not occur after injection of culture medium in which unfertilized ova were incubated. The detection of EDPAF in bovine embryo culture medium by a bioassay can be used: (1) as a quantative and noninvasive method to assess the viability of embryos after in vitro culture (2) as a method for quality control of embryo culture procedures. Key words: Embryo derived Platelet activating Factor, Bioassay, Embryokulturiiberstande (Maus, Kaninchen, Rind) Einleitung Als ein friihers nachweisbares Phanomen einer erfolgreichen Konzeption wurde der Embryo derived Platelet activating Faktor (EDPAF) von O'Neill (1 985 a) beschrieben. Maus- und Humanembryonen produzieren einen PAF (Platelet activating Faktor), der homolog zum PAF-acether (synthetischer PAF) fungieren sol1 (O'Neill, 1985 b). Der EDPAF ist verantwortlich fur die Kontraktion der Milz und einer Thrombozytopenie wahrend der periimplantativen Periode der Graviditat. Im nichtgraviden Zustand ist PAF bei entziindlichen sowie immunologischen Prozessen beteiligt und wirkt als poten- ter Modulator der Immunantwort (Braquet und Rola-Pleszczynski, 1987). U.S. Copyright Clearance Center Statement: 0936-6768/92/2703-130 $ 02.50/0

Veränderungen im Thrombozytengehalt milzektomierter Mäuse nach Injektion von Embryo derived-Platelet activating Faktor

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Veränderungen im Thrombozytengehalt milzektomierter Mäuse nach Injektion von Embryo derived-Platelet activating Faktor

Rcprod. Dom. Anim., 27, 130-135 (1992) @ 1992 Paul Parey Scientific Publishers, Berlin and Hamburg ISSN 093&6768

Forsc hungszen tru m fur Tierpro du k tion Dum m erstorf- R osto c k, Germany

Veranderungen im Thrombozytengehalt milzektomierter Mause nach Injektion von ,,Embryo derived-Platelet activating Faktor"

U. Tiemann und M. Spitschak

Inhalt: Maus- und Kaninchenembryokulturmedium verursachte bei milzektomierten Mausen eine signifikante Verminderung des Thrombozytengehaltes. Das selbe Ergebnis wurde nach Injektion (i.p.) von einer geringen Dosis PAF-acether erreicht. Ein und mehrere Rinderembryonen produrierten in vitro Embryo-derived platelet activating Factor (EDPAF), der in milzektomierten Mausen eine Thrombozytopenie bewirkte. Dieser Ef fek t trat nach Injektion von Kulturmedium, in dem unbefruchtete Eizellen inkubiert wurden, nicht auf. Der Nachweis des EDPAF im Rinderembryokulturmedium mittels eines Bioassay kann angewendet werden: (1) als eine quantitative und nicht invasive Methode fur die Bestimmung der Vitalitat

von in vitro kultivierten Embryonen (2 ) fur eine qualitative Kontrolle des Embryokulturverfahrens.

Contents: Alterations of platelet count in splenectomized mice after injection (i.p.) of embryo derived platelet activating factor The application of mouse and rabbit embryo culture media caused asignvicant reduction in the platelet count of splenectomized mice. The same result was observed after i.p. injection of small dose of PAF-acether. One or several bovine embryos were able to produce an embryo derived platelet activating factor (EDPAF) in vitro which caused thrombocytopenie in splenectomized mice. This effect did not occur after injection of culture medium in which unfertilized ova were incubated. The detection of EDPAF in bovine embryo culture medium by a bioassay can be used: (1) as a quantative and noninvasive method to assess the viability of embryos after

in vitro culture (2 ) as a method f o r quality control of embryo culture procedures. Key words: Embryo derived Platelet activating Factor, Bioassay, Embryokulturiiberstande (Maus, Kaninchen, Rind)

Einleitung

Als ein friihers nachweisbares Phanomen einer erfolgreichen Konzeption wurde der Embryo derived Platelet activating Faktor (EDPAF) von O'Neill (1 985 a ) beschrieben. Maus- und Humanembryonen produzieren einen PAF (Platelet activating Faktor), der homolog zum PAF-acether (synthetischer PAF) fungieren sol1 (O'Neill, 1985 b). Der EDPAF ist verantwortlich fur die Kontraktion der Milz und einer Thrombozytopenie wahrend der periimplantativen Periode der Graviditat. Im nichtgraviden Zustand ist PAF bei entziindlichen sowie immunologischen Prozessen beteiligt und wirkt als poten- ter Modulator der Immunantwort (Braquet und Rola-Pleszczynski, 1987).

U.S. Copyright Clearance Center Statement: 0936-6768/92/2703-130 $ 02.50/0

Page 2: Veränderungen im Thrombozytengehalt milzektomierter Mäuse nach Injektion von Embryo derived-Platelet activating Faktor

Thrombozytengehalt milzektomierter Mause nach Injektion von EDPAF 131

Beim Menschen korreliert die Bildung des EDPAF rnit der Embryoqualitat und -vita& tat im Rahmen der in vitro-Fertilisation (O’Neill, 1987). Der EDPAF wird mit einem Bioassay nachgewiesen, der die relativen Veranderungen des peripheren Blutthrombo- zytengehaltes nach intraperitonealer Injektion von Embryokulturmedien in milzekto- mierte Mause mifit. Die Verwendung milzektomierter Mause ermoglicht eine hohere Empfindlichkeit des Bioassays. Da die Milz als Thrombozytenreservoir dient, werden nach ihrer Entfernung nur die Veranderungen des Thrombozytengehaltes im periphe- ren Blut bestimmt. In vorliegenden Untersuchungen sol1 die Eignung des Nachweises des EDPAF in Kulturmedien, in denen Maus-, Kaninchen- und Rinderembryonen in- kubiert wurden, als funktionelles Embryo-Vitalitatskriterium gepriift werden.

Material und Methode

Embry onenkultur: Embryonen wurden im 8-16 Zellstadium von trachtigen Mausen und einem Kaninchen aus dem Ovidukt gewonnen. Alle morphologisch intakten Em- bryonen wurden gepoolt, in Gruppen zu 5 und 1 0 (Kaninchen) bzw. 10, 20 und 30 (Maus) in 300 p1 TCM 199 Earl’s Losung (20% FCS) iiber 24 h inkubiert. Unbefruch- tete Eizellen von Mausen und Medium (negative Kontrollen) wurden entsprechend kultiviert. Als positive Kontrolle wurden 0 , l pg PAF-acether/200 p1 PBS (l-O-alkyl-2- acetyl-sn-glyceryl-3-phosphocholin, Calbiochem-Behring) eingesetzt. Eizellen und Embryonen superovulierter Rinder wurden am Tag 7 nach der Insemina- tion gewonnen und anschliefiend 24 h , teilweise bis 72 h, in 300 p1 modifiziertem Dulbecco-Medium (20% NCS) einzeln oder gepoolt (2-11) inkubiert. Auch das Me- dium (Kontrolle) wurde en tsprechend behandelt . Die m orphologische Zustandsbeur- teilung der Rinderembryonen erfolgte nach Kriterien von Kauffold und Thamm (1985) vor und nach der Inkubation. Nach Entfernung der Embryonen oder Eizellen wurden alle konditionierten Medien sofort bei - 20’ C eingefroren.

Bioassay fiir den EDPAF: Der Assay wurde in Anlehnung an O’Neill (1985) durchge- fuhrt. Hybridmause (Zucht, FZT Dummerstorf) wurden unter lO%iger Pentobarbital- Anesthesie dorsal durch einen paramedialen Schnitt auf der linken Seite milzektomiert. Nach etwa 1 Woche Erholungszeit wurden die Tiere fur den Bioassay verwendet, dabei wurde ihnen unter leichter Ethernarkose zunachst aus dem rechten periorbitalen Plexus mit Hilfe einer Pasteurpipette Blut entnommen. Je einer Maus wurden dann 200pl vom embryo-, eizellkonditionierten bzw. Kontrollmedium i.p. injiziert, und 30 min spater wurde die selbe Maus aus dem linken Orbitalplexus geblutet. Das Blut wurde 1 : 200 mit Lidokainoxalat verdiinnt und der Thrombozytengehalt nach der Methode von Becker und Cronkite (1 950) bestimmt. Pro Maus wurde eine Doppelbestimmung vorgenommen.

Statistische A uswertung: Die Ergebnisse werden ausgedriickt als prozentuale Reduk- tion des peripheren Thrombozytengehaltes nach der Injektion im Vergleich zur Throm- bozytenzahl vor der Injektion. Es wurden Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (SD) berechnet. Signifikante Unterschiede der Differenzen der Mittelwerte wurden mit dem t-Test nach Student gepriift.

Ergebnisse und Diskussion

Kulturmedium, in dem 30 8-16 Zell-Mausembryonen 24 h inkubiert wurden, enthalt einen Faktor(en), der eine signifikante ( 3 1 %) Reduktion des Thrombozytengehaltes milzektomierter Mause verursachte (Abb. 1). Dieses Ergebnis stimmt rnit den von O’Neill (1985 a ) publizierten Werten iiberein. Medium, in dem 30 unbefruchtete Ei- zellen kultiviert wurden, bewirkte nur eine nicht signifikante Verminderung der Thrombozytenzahl um 14%. Die Injektion des durch vitale Mausembryonen produ- zierten thrombozytenaktivierenden Faktors (PAF) fiihrte schon nach 30 min zur Throm- bozytopenie bei den milzektomierten Mausen. Die Werte unterscheiden sich nicht wesentlich von denen, die nach 60 min ermittelt wurden (Abb. 1). Deshalb wurde in

Page 3: Veränderungen im Thrombozytengehalt milzektomierter Mäuse nach Injektion von Embryo derived-Platelet activating Faktor

132 U. Tiemann und M. Spitschak

1 2 0

LOO

8 0 -

allen anschlieflenden Untersuchungen der Thrombozytengehalt 30 rnin nach der In- jektion der verschiedenen Kulturmedien bestimmt. Eine Verringerung der Mausembry- onen auf 10 bzw. 20 pro 300 p1 Kulturmedium verursachte ebenfalls nach der Appli- kation eine signifikante Reduktion des Thrombozytengehaltes bei den Versuchstieren. Das gleiche Ergebnis wurde nach der Injektion von 0,l pg PAF-acether beobachtet (Abb. 2). Die Resultate bestatigen die von O’Neill (1985 a) getroffene Feststellung, daB

D C a e a a,b P( 0.02

c,e P( 0.05

- C,d P( 0,05 1 _L

EB vor Injektion U 30 min p.i. 60 rnin p i . (2) a.6 P< 0.05

a ,

4

Medium

9 10 3 9

Medium Medium 30 Oocyten 30 Embryonen

Abb. 1: Veranderungen im Thromborytengehalt von milrektomierten Mausen 30 und 60 min nach ip. Injektion von (1) Medium, in dem Mausembryonen 24 h inkubiert wurden (2) Medium, in dem unbefruchtete Eizellen kultiviert wurden

Fig. 1: Alterations of platelet count in splenectomued mice after i.p. injection 30 and 60 min (Z sd) (1) medium in which mouse embryos incubated 24 h (2) medium in which unfertilized eggs cultivated

ao

0

Abb. 2: Relative Veranderungen im Thromborytengehalt von milrektomierten Mausen nach ip . Injektion von 200 p l Kulturmedium, in dem Mauseembryonen und unbefruchtete Eizellen 24 h inkubiert wurden

Fig. 2: Relative changes of platelet count in splenectomued mice after i p . injection of 2 0 0 ~ 1 culture medium in which mouse embryos and unfertilized eggs incubated for 24 h

Page 4: Veränderungen im Thrombozytengehalt milzektomierter Mäuse nach Injektion von Embryo derived-Platelet activating Faktor

Thrombozytengehalt milzektomierter Mause nach Injektion von EDPAF 133

der praimplantative Mausembryo einen Platelet-activating Faktor produziert, dessen Wirkung dem des synthetischen PAF-acether gleicht. Experimentell wurde diese Tat- sache von Spints und O’Neill (1988) untermauert, indem sie die Fahigkeit des PAF- acether und die des EDPAF eine Thrombozytopenie in der Maus zu induzieren, durch Antagonisten inhibierten. Abbildung 3 zeigt, daB auch Kaninchenembryonen nach einer 24stundigen Inkubations- zeit einen Faktor bilden, der nach Injektion dieses Mediums eine 45 %ige Verminderung (P < 0,001) der Thrombozytenzahl im Vergleich zu den mit Kontrollmedium injizier- ten milzektomierten Mausen bewirkte.

a.6 PI 0,001 a

100

8 0

60

40

2 0

0 Medium Medium

5-10 Embryonen

Abb. 3: Relative Veranderungen im Thrombozy tengehalt von milzektomierten Mausen nach i. p . Injektion uon 200 p1 Kulturmedium, in dem Kaninchenembryonen 24 h kultiviert wurden

Fig. 3 : Relative changes of platelet count in splenectomzied mice after injection (ip.) of 200 pC culture medium in which rabbit embryos cultivated for 24 h

In Medien, in denen Rinderembryonen 24 h kultiviert wurden, konnte erstmals der EDPAF bestimmt werden. Sowohl gepoolte als auch einzeln kultivierte vitale Rinder- embryonen sind fahig, einen loslichen Faktor zu bilden, der eine Thrombozytopenie bei milzektomierten Mausen hervorruft. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und Abbil- dung 4 dargestellt. Alle Embryonen wurden nach einer 24stundigen Inkubationszeit morphologisch beurteilt. Von den 9 einzeln kultivierten Rinderembryonen entwickel- ten sich 7 zu intakten Blastozysten, deren Medien in milzektomierten Mausen eine sig- nifikante Reduktion (36,370 f 14,O) des peripheren Thrombozytengehaltes ausloste (Abb. 4). Auch nach der Injektion von Medien, in denen sich nach 24 h 2-3 intakte Blastazysten entwickelt hatten, wurde annahernd der gleiche Effekt (32,6% * 2,7), (Tabelle 1 ) festgestellt. Keine Thrombozytopenie wurde induziert nach Applikation von Inkubationsmedien, in denen sich die Embryonen nicht weiterentwickelt hatten. Die Anwendung dieses Bioassays zum Nachweis des EDPAF ware eine technisch ein- fache Methode, die zusatzlich zur morphologischen Beurteilung eine Aussage noch vor dem Tranfer ermoglicht. Der Erfolg des Transfers hangt in hohem MaBe von der Vitali- tat der Embryonen ab. Humanembryonen, die morphologisch als normal beurteilt wur- den, produzieren in unterschiedlicher Qualitat den EDPAF. Nur die Ubertragung von denjenigen Embryonen, die zur Bildung eines thrombozytenaktivierenden Faktors be- fahigt waren, (Reduktion des Thrombozytengehaltes um etwa 28 %), fuhrte zu einer erfolgreichen Schwangerschaft (O’Neill u. Mitarb., 1985). Der Nachweis des EDPAF im Rinderembryokulturmedium erweist sich als ein geeigne- tes funktionelles Kriterium. das eine besondere Bedeutung fur die Beurteilung in vitro

Page 5: Veränderungen im Thrombozytengehalt milzektomierter Mäuse nach Injektion von Embryo derived-Platelet activating Faktor

134 U. Tiemann und M. Spitschak

a.c PI 0.001 % e.c PI 0.001

9

4 2 120

a _L

b

T C

Medium Oocyten

Medium 1 Embryo

Abb. 4: Relative Veranderungen im Thrombozytengehalt von milzektomierten Mausen nach ip. Injektion von 200 p l Kulturmedium, in dem ein Rinderembryo 24 h inkubiert wurde

Fig. 4: Relative changes of platelet count in splenectornized mice after injection (ip.) of 200 rl culture medium in which one bovine embryo incubated for 24 h

Tabelle 1: Relative Veranderungen im Thromborytengehalt milzektomierter Mause, verursacht durch; (1) Kulturmedium, in dem 2-11 Rinderembryonen f i r 24 h inkubiert wurden (2) Kulturmedium, in dem Rinderoocyten kultiviert wurden

Table 1: Relative changes to the platelet count from splenectomired mice caused by: (1) culture medium in which 3-11 bovine embryos were incubated for 24 h (2) culture medium in which bovine ova were cultured

Zahl der Embryonen

Morphologie der Embryonen Thrombozytenzahl relativiert zum Wert vor der Injektion (%)

8

2

3

1 1

2

2 intakte Blastozysten 6 degenerierte Embryonen

2 intakte Blastozysten

3 intakte Blastozysten

5 degenerierte Embryonen 6 Morulae bis Blastozysten, die dann degenerierten

degenerierte Embryonen

69,O

63,6

69,5

91,3

88,O

10 Oocyten

10 Oocyten

48 h inkubiert

72 h inkubiert

112,s

1 16,4

Page 6: Veränderungen im Thrombozytengehalt milzektomierter Mäuse nach Injektion von Embryo derived-Platelet activating Faktor

Thrombozytengehalt milzektomierter Mause nach Injektion von EDPAF 135

erzeugter Embryonen nach Langzeitkultivierung haben konnte. Der Vorteil dieser Methode ist die Priifung der Embryovitali tat in vitro auf eine nichtinvasive Weise. In anschliefienden Versuchen sol1 die Implantationsrate nach d e m Transfer von EDPAF bildenden Embryonen untersucht werden.

Literatur

Becker, G. & E. Cronkite, 1950: Morphology and enumeration of human blood platelets, J. Applied. PhysioL 3, 365-371. - Braquet, P. & M. Rola-Pleszczynski, 1987: Platelet-activating factor and cellular immune responses, Immunology Today, Vol. 8, No. 11, 345-352. - Kauffold, P. & I. Thamm, 1985: Zustandsbeurteilung von Rinderembryonen, Katalog, FZT Dummerstorf. - O’Neill, C., 1985 a: Examination of the causes of early pregnancy-associated thrombocytopenia in mice, J. Reprod. Fert. 73, 567-577. - O’Neill, C., 1985b: Partial characterization of the embryo-derived platelet-activating factor in mice, J. Reprod. Fert. 75, 375-380. - O’Neill, C., A.A. Gidley-Baird, LJ. Pike & D.M. Saunders, 1987: Use of a bioassay for embryo-derived platelet-activating factor as a means of assessing quality and pregnancy potential of human embryos, Fertility and Sterility 47, 969-975. - O’Neill, C., J.L. Pike, R.N. Porter, A.A. Gidley-Baird, M.J. Sinosich & D.M. Saunders, 1985 : Maternal recognition of pregnancy prior to implantation-methods for monitoring embryo viability in vitro and in vivo, Ann. N.Y. Acad. Sci. 442, 429-439. - Spinks, N.R. & C. O’Neill, 1988: Antagonists of embryo-derived platelet-activating factor prevent implantation of mouse embryos, J. Reprod. Fert. 84, 89-98.

Eingang des Manuskriptes: 22.3.1991

Adresse der Autoren: Dr. Ute Tiemann, Forschungszentrum fur Tierproduktion, Dummerstorf- Rostock, Dr.-Lorenz-Weg 1, 0-2500 Rostock, Germany.