Plan~a 54, 374--393 (1960)

Aus dem Pflanzenphysiologischen Institut der Universit~t GOt~ingen

VERANDEI~UNGEN IN I)ER NUCLEII~S~URE-FRAKTION GI~UNER BLf4TTER IM ZUSAMMENI-IANG MIT PttOTOPEI~IODISCHER INDUKTION*

Von L OTI-IAI% GULICIt

Mi~ 10 Textabbildungen

(Eingegangen am 18. November 1959)

Photoperiodisch empfindliche Pflanzen reagieren aui induktiv wirk- same Licht-Dunkel-Wechsel mit einer Vers der Digerenzierungs- prozesse am Vegetationspunkt. Es hat sich aber gezeigt, dab das Spitzenmeristem selbst gegeniiber periodischer Beleuchtung unempfind- lich ist, dad der photoperiodische Reiz vielmehr yon den Laubbls perzipiert wird (ttARD~ und v. WITSC~ 1940a u.a.). Demnach muir eine ,,l~eiz"-Leitung yon den Bls zum Vegetationskegel stattfinden. Das experimentelle Material ls bis heute keine plausiblere Hypothese zu als die Annahme eines hormonMen blfihauslSsendenFaktors (OAJLAC~- J ~ 1936a, b; KAnDE~ 1937; MELC~S und LA~G 1941 U.a.). Trotz zahlreicher Bemfihungen ist es abet noch nicht gelungen, einen derartigen Wirkstoff zu isolieren; dennoch erlaubt das umfangreiche Beobachtungs- material wenigstens gewisse Aussagen:

])as ,Blfihhormon" wird aul3erordentlich langsam geleitet (OAJLAC~- JA~ 1941); in unterkfihlten Gewebezonen kommt der Transport v611ig zum Stillstand (BonTHWlCK, PA~KER und ttEINZ~ 1941). Es kann fiber Pfropfstellen hinweg fibertragen werden, jedoeh ers%, nachdem es zur Gewebeverw~chsung gekommen ist (~os~xov 1939, WIT~ow nnd W]:TH~OW 1943). Das ls an einen hoehmolekularen K6rper denken. Waiter 1s sich zeigen, dab der Wirkstoff nicht artspezifisch und ffir Lang- und Kurztagpfl~nzen identisch oder wenigstens aus einer identi- schenVorstufe synthetisierbur ist (0~ZL~CKJ~N 1936b, MELC~S 1937, LnN~ und MELC~EnS 1948). In mehreren Fs liel~ sich wahrsehein- lieh machen, dM~ untersehwellige I-Iormonmengen fiber mehrere Zell- generationen hinweg ohne wesentliche Konzentrationsverminderung weitergegebdn werden kSnnen (I-IAM~ und B o ~ E ~ 1938, L A ~ 1952). ])as legt den Schlu[~ auf eine au%okatalytische Vermehrung des ,,Hor- mons" nahe (Lo~A 1947a, Prows u. Gn~ao~:r 1952, L~Na 1952).

* Dissertation der Mathem~tisch-N~turwissenschaftlichen Fakult~t der Uni- versitKt GSt%ingen.

Ver~nderungen in der Nucleins~ure-Fraktion griiner BlOtter 375

Eine Selbstreproduktion ist uns bis hente nur yon Nueleins~uren bekannt. Ebenso wie in der tierisehen Zelle linden wit aueh in der Pflanzenzelle zwei versehiedene Nueleinsiiure-Typen, wobei die tCibo- nueleins/~ure (I~NS) nicht so streng lokalisiert erseheint wie die Desoxy- ribonueleins/ture (DNS), die aul]er in den Chromosomen nur noch in den Grana der Chloroplasten vorkommt (CmBA 1951, M~ZNE~ 1952, CmBA und SUGAgARA 1957, STOCKING und GIFSO~D 1959). Einen ersten Hinweis auf mSgiiehe Mengengndernngen der DNS geben die Untersuehungen yon v. WITscg und Fn~]s~ (1951, 1952), die zeigen konnten, dal] in Kurztagbl/~ttern der Crassu~acee KaIanchog Bloss/eldiana die Zellkerne einen hSheren Polyploidiegra~ aufweisen als in Langtag- blgttern. W/~hrend ausgewaehsene Langtagbl~tter oktoploid sind, be- sitzen die sukkulenten I(nrztagbl/~tter den 132fachen Chromosomensatz. Im Zusammenhang damit dfirfte die ZuOahme der KerngrSl]en im Spitzenmeristem photoperiodisch induzierter Kalanchog-Exemplare stehen (METzNER, unver6ffentlicht).

Es sind versehiedene Methoden ausgeart Nueleins/iuren aus pflanzliehen Geweben qu sollte nun versucht werden, ob sieh allein d~ messungen Veriinderungen in der Nueleins~ im Verlaufe photoperiodiseher Induktion fe~

eitet worden, um die beiden ~ntitativ zu extrahieren. Es �9 ch quantitative Vergleiehs- ure-Fraktion grfiner B1/itter ~tstellen lassen. Glfieklieher-

weise ist die in den eytologischen Untersu ?hnngen studierte Kurztag- pflanze Kalanchog Bloss/eldiana in ihrem p ~otoperiodischen Verhalten, vor allem dureh die Arbeiten yon t:~At~DER 1~. ~i tarb. , sehr gut bekannt. Augerdem liegen gerade an diesem Objekt suehungen fiber den EinfluB der photo t (?r 1954, 1955; ~ADAX 1956). Wenn an organisehen S/iuren und insbesondere mit Kalanchog-Bl~ttern erheblieh ersehwert VergleiehsmSgliehkeiten wegen, die Nueleir an diesem Objekt studiert werden. D a n ~eristemen mit einer NucMns/iure-Vermeh 1947b), war yon vornherein mi~ einem l versehieden alter Bli~tter zu reehnen. In di essierten vor allem die B1/itter mittleren A sehen Reiz am emp{indliehsten aufnehme~ 1940a, b), sodann die jungen Blattanlage: dem sieh die Differenzierung der Blfitenteil sollten abet aueh /~Itere Blgtter mit unt( zugleieh Daten fiber die quantitative Verteih Typen innerhalb der Pflanze zu gewinnen. Arbeit einen weiteren Beitrag zur .Frage

erste biochemisehe Unter- eriodischen Induktion vor gMch aueh der hohe Gehalt a Gerbstoffen das Arbeiten so sollten doeh, der besseren ~iiure-Ver~ndernngen gerade 6glicherweise allein in den cung zu reehnen ist (Lo~A :nterschiedlichen Verhalten ~sem Zusammenhang inter- [ters, die den photoperiodi-

(HA~D~ und v. WITSC~ am Vegetationskegel, an

vollzieht. Vergleiehsweise xsueht werden, um damit ag der beiden Nueleins/~ure- ~omit stellt die vorliegende ochemischer Veriinderungen

im Lau/e der photoperiodischen Indu/ction dar.

376 LOTHAR GULICH:

Methodik 1. P/lanzen~naterial. Die Hauptversuche wurden aussehlieBlieh an Kalanchog

Blossfeldiana durehgeffihrt. Es wurden 4 Induktionsreihen ausgewertet, bei denen die Pflanzen zu Versuehsbeginn 51/2 Monate alt waren. Damit hatten sie das fiir die photoperiodisehe Induktion optimale Alter (Yovc~Is 1955). Sie waren in T5pfen mit ,,Standarderde" herangew~chsen und dnrch regelmgl~ige Behandlung mit dem Pflanzensehutzmittel E 605 vor Seh~dlhlgsbefall geschlitzt worden. Die Aufzueht effolgte in Gew~ehsh~usern bei annghernd konstanter Temperatur yon d-180 C und einer relativen Luftfeuehtigkeit yon etw~ 80%. Bis zu Beginn des eigen~liehen Versuchs standen die Pflanzen im natiirliehen sommerlichen Langtag (Tageslgnge langer als 13 Std). Far alle Experimente wurden gleiehmgl3ig ent- wickelte Pflanzen ausgesucht, die 8--10 Blattwirtel besaBen; die BlOtter unterhalb des 8. Wirtels (vom Vegetationspunkt aus naeh unten gezahlt) warden entfernt, ebenfalls alle Aehseltriebe. Jede Versuchspflanze war somit unverzweigt und besa~ 8 makroskopiseh siehtbare Wirtel.

Die Induktion wurde im Gewgehshaus durehgefiihrt. Die Versuchspfl~nzen kamen in einen 9stiindigen Kurztsg, der jeweils yon 8--17 Uhr dauerte; Lang- n~eht war also yon 17--8 Uhr. Dieser Lieht-Dunkel-Rhythmus bewirkt bei Kalanchog eine optimsle Induktion (HAUSCIHLD 1943). Zur Kontrolle verblieb eine AnzaM gleieh welt entwiekelter Pfl~nzen in der nattirliehen Tageslgnge; im Spgtherbst wurde eine Bliiteabildung der Kontrollen dureh StSrlicht yon jeweils 0--2 Uhr verhindert.

Geerntet wurde nach fo]gendem Plan" Anzahl der

Induktionstage . . 1 2 3 4 5 6 8 10 14 20 21 25 49 K u r z t a g p f l a n z e n . . . d- d- d- d- d- d- d- d- d- d- ~- -[- L a n g t a g p f l a n z e n . . . d- d- ~ ~-

Zur Ernte wurden yon jeweils 6 Pflanzen die BlOtter dreier Regionen unmittelbar am Ansatz der Spreite abgetrennt 1. ttierbei entspreehen die mittleren Blgt~er der Region m~ximaler photoperiodiseher Empfindliehkeit.

2. Au]bereitung und Konservlerung des P]lanzenmaterlcds. Die Ernte erfolgte bei allen Versuehspflanzen morgens um 10 Uhr, also jeweils genau 2 Std nach Lichtbeginn. Dadureh wurde ein mSgliehst gleiehmgl3iger Assimilatspiegel an- gestrebt. Die Blgtter der 3 versehiedenen Regionen warden sofort naeh dem Abtrennen gewaschen und zerkleinert. Das ttomogenisieren erfo]gte dabei in den ersten Versuchen vergleiehsweise n~eh 3 verschiedenen Methoden.

a) Zerldeinern in 96%igem Athanol (mittels ,,Starmix" oder ,,Kress-tIomo- genisator") ;

b) Vakuumtroeknung der Blatter bis zur Gewichtskons~anz (ira Vakuum- thermostaten bei d-350 C), ansehlieBend Zerkleinern in der Reibsehale;

e) Zerkleinern naeh vorheriger Gefrier~rocknung. Die Anforderungen der vorliegenden Arbeit - - mSgliehst rasehes AbtSten und

Zerkleinern der Bla.tter, v511ige Entw~sserung und lange Haltbarkeit des Trocken- pulvers [bei tgglieh neuer Ernte kann das Pulver nieht sofort untersucht werden) - - wurden am besten yon der Ge/riertrocknungsmethode erfiillt:

1 Die Blatter des 8. Wir~els (yore Veget~tionspunkt naeh unten gez~hlt) werden im folgenden als ,,nntere Blgtter", die des 5. und 6. Wirtels ~ls ,,mittlere Blgtter", die Vegetationskegel und die Blgtter des 1.--3. Wirtels als ,,Spitze '~ bzw. ,,Spitzen- region" bezeichnet.

Veranderungen in der Nucleins~ure-Fraktion grfiner Bli~tter 377

Die geernteten und gereinigten Bliitter wurden allseitig in Trockeneis ein- gebettet. Sie gefroren dabei augenblicklich und konnten dann leicht in vor- gekfihlten Reibschalen zerkleinert werden. Das rein zerriebene Pulver wurde in diinner Sehicht in Petrischalen gesehfittet und dann im Exsicc~tor dem IIoch- vakuum einer zweistufigen l~Sntgenpumpe (Endvakuum ~ 10 -~ Torr) ausgesetzt. Wurde anfangs eine ansreichende ~Ienge yon I(ohlens~nreschnee zugesetzt, so blieb die Temperatur des Pulvers stets unter de m Taupunkt. Bei den Lang~ag- bl~ttern dauerte das Trocknen etwa 6 Std, bei !den sukkulenten Bl~ttern lang- fristig induzierter Pf]anzen bis zu 2 Tagen. Des fertige Trockenpulver wurde noehmals fein zerrieben und dann bis zur weit~ren Verarbeitung im gekiihlten Vakuumexsiccator (0 ~ C) fiber Phosphorpentoxyd aufbewahrt. Die mikroskopische Untersuchung des Gefriertrockenpulvers lie~ kqine unzerriebenen Zellen mehr erkennen. Aueh ergab eine weitere Zerkleinerung ~les lPulvers mit I-Iflfe yon Quarz- mehl bei der naehfolgenden Extraktion keine ~rhShte Nuc]eins~ure-Ausbeute. Damit durfte das Blattmaterial ffir die l~ueleins~iure-Extraktion als hinreiehend zerkleinert angesehen werden.

3. ExtraCtion und Messung der Nucleins~iuren. Ffir die Extraktion yon Nuclein- s~iuren aus tierischen Geweben sind zahlreiche brauehb~re Methoden entwickelt worden (Scg~EIDE~ 1945, SC~IDT U. T}TA~I~]ZAVSSR 1945 n. a.), doeh lassen sich diese Verfahren nicht ohne wei~eres auf die Ge~vinnung und Bestimmung yon Nucleins~uren ans Pflanzengeweben fibertragen (vgl. H ~ und v. EuLE~ 1946a, OGVR nnd ROSE~ 1950, MARK~A~ 1955, FI~Cg und CARR 1956, Cn~A nnd SVGA- HA~A 1957). Das liegt vor allem daran, da~ pflapzliche Zellen in der Regel ver- schiedene Inhaltsstoffe besitzen, die einmal die sp~teren Nachweisreaktionen st6ren, zum anderen komplexe Verbindungen mit der Nncleins~iure eingehen k6nnen (IqEUBE~ nnd ROBEI~TS 1949, T~O~AS un.~ S]~[ERRAT 1956). AIs Ausgangs- punkt lfir Extraktion und Bestimmung der i~uclei~s~iuren aus Kalanchog-Bl~ttern konnte allein die Methode yon Ocv~ und ROSEN i(1950) zugrunde geleg~ werden. Ein besonderer Vorteil dieses Verfahrens liegt in der Verwendung yon Perehlor- s&ure an Stelle der sonst zumeist~ benutzten T~iehloressigs~ure. Perehlorsi~ure besitzt im Absorptionsgebiet der iNucleins&uren, d" h. im Wellenl&ngengebiet nm 260 rote, keine Absorptionsbanden und gestattet somit eine sp~tere spektrophoto- metrische Analyse der Extrakte.

Die Ogur-Rosen-Methode, bei der m6gliche St6rstoffe noch vor der eigentlichen Extraktion der Nueleinsauren durch Auszug de~ Pflanzengewebe mit ~thanol und eh~em J~thanol-Ather-Gemiseh beseitigt werden , wurde speziell ffir Keim- wnrzeln entwickelt. Sie last sieh nieh~ ohne wqiteres ~uf die Extraktion yon Nueleins&uren aus assimilierenden Pflanzenteilen itber~ragen (vgl. ttO~DE~ 1952, 1953; M~KHA~ 1955; Cm~A und SVGA}~Al~A 19~7; B6TTG~ und W o L ~ E ~ 1958). Bei Kalancho~'-Bl~ttern reiehen die angegebenen Extraktionszeiten bzw. -temperaturen nicht aus, um die RNS auch nur anniihernd quantitativ aus dem Gewebe herauszu]6sen. So blieb kein anderer W~g, als in langwierigen Vorver- suehen die Ex~raktionsbedingungen zu variieren, um zu einer geeigneten Modifika- tion zu gelangen. Dabei wurde bald eine ErhOhung der HC10~-Konzentration als beden!dich erkannt, da diese zur I-Iydrolyse sorest ungel6ster Zellinhaltsstoffe ffihren und fiberdies die Nueleinsi~uren selbst a~grei~en kann. Es verblieben Anderungen der Temperatur sowie der Extraktions~eiten (vgl. Abb. 1). Nueh den Ergebnissen der Vorversuche wurde sehlie~lieh der naeh~olgende Trennungsgang als besonders geeig~et erkannt:

Die eingewogenen Trockenpulvermengen wurdep in jeweils einem Zentrifugen- glas den nachstehenden Extraktionsbedingungen unterworfen. Zwischen den ein- zelnen Extraktionsschritten wurde seharf zentri~ugiert und vorsichtig dekantiert.

378 LOT~AR GvLIC~:

Dutch die Aussehaltung aller Filtrationen konnten so die Substanzverluste minimal gehalten ~verden:

1. Extrakt ion der eingewogenen Troekenpulvermenge (100 rag) mittels 15 cm a kalten (0 ~ C) 70%igen J~thanols; Dauer der Extrakt ion 20 min.

2. Extrakt ion des l~iiekstandes yon 1. in 10 cm a kalter (0 ~ C) 0,1%iger &thano]i- seher tIClOa-LSsung. Vereinigen der Extrakte yon 1. und 2.

3. Extraktion des Rilekstandes yon 2. mittels 10 em a eines Xthanol-~ther- Gemisehes (3:1) im siedenden Wasserbad; Dauer der Extraktion 5 rain. Diese Extrak~ion wurde bis zur vSlligen Entfi~rbung des Rilekstandes wiederholt; die einzelnen Extrakte wnrden vereinigt.

4. ZweimMige Extrakt ion des Riickst~ndes yon 3. in 10 cm a ka]ter (0 ~ C) 0,2 n HC1Oa; Vereinigen der beiden Extrakte. Bei dieser Extraktion mug sehr

sehnell gearbeitet werden, da die

/,0

�9 ~ 4 5

~ s ~ 6 8 /0 /2 /F /~ Extmkhbnsd~uer (S'id.)

Abb. 1. Zeitlicher Verlauf der RNS-Extraktion aus getrockneten Kalanchog-Blf~ttern bei versehie- denen Temperaturen des LSsungsmit~els (HC10~)

Perehlorsaure sonst bereits RNS bus dem Troekenpulver heraus- 15st. Daher wurde eine standige Kontrolle dieser Fraktion auf etwaige Nueleins~urespuren vor- genommen.

5. l~NS-Fraktion: 14 Std lunge Extr~ktion des I~ilckstandes yon 4. mittels 10 em 8 kalter (-t-40 C} 1 n HC10~; ansehlieBend noeh- malige gleieh lange dauernde Extrakt ion bei d-8 ~ C, ebeMalls mittels 1 n HC10~. Vereinigen der beiden Extrakte.

6. DNS-Fralction: 14 Std lange Extraktion des Rilckstan- des Yon 5. mit~els ~- 370 C war- met 0,5 n HCIOa - - oder 20 rain

lange Extrakt ion mi t der gMchen S&urekonzentration bei -~ 70 ~ C - - ; Wieder- holung der Extrakt ion und Vereinigen der beiden Extrakte.

Zur quantitativen Bestimmung der Nucleins&uren wurde die Brauchbarkeit sehr verschiedener Verfahren iiberprilft; dabei wurden alle 3 Bausteine des Mole- kills beriicksichtigt, d. h. Basen-, Zueker- und Phosphorsi~ure-Best~ndtefl.

a) Phosphorbestimmungen wurden kolorimetrisch n~eh GoMo~I (194I) dureh- gefiihrt. Die Blaufi~rbung wurde im Elko I I (Zeiss) unter Vorschalten des Filters I 66,9 gemessen.

b) Zuclcerbestimmungen. Die Bestimmung der Pentose (Ribose) erfolgte nach 2 Methoden:

1. Orein-Methode nach M~J~AV~ (1939). Die Griinfgrbung wurde nueh 2 Std ira Elko I I mit dem Filter I 66,9 gemessen. Diese Methode erwies sieh ]edoeh flit die untersuehten Extrakte als wenig geeignet (vgl. HADST und v. E~JL]~ 1946a).

2. Phlorogluein-Methode nach HAhN und v. EvI~E~ (1948). Diese Methode ergab bei den Extrakten eine blaugrilne F&rbung, die naeh 4 Std im Elko I I mit Filter I 62,5 gemessen wurde.

Die Bestimmung der d-Desoxyribose erfolgte vergleiehsweise n~eh 3 Methoden:

1. Phlorogluein-Methode nach ItA~T und v. E v L ~ (1948). Diese Methode erwies sieh filr die vorliegenden Extrakte als ungeeignet.

2. Carbazol-Reaktion naeh DXSCHE (1930}. :Die l~eaktion war fiir die DNS- Extrakte nicht eindeutig.

Ver/~nderungen in der Nucleins/~ure-Fraktion griiner B1/~tter 379

3. Diphenylamin-Reaktion nach DIsc~n (1930). Die Blauf/~rbung wurde im Elko I I m i t Filter S 57 E gemessen. Da diese Reaktion verhaltnismi~Big konzen- trierte DNS-LSsungen verlangt, mu$ten die 20cm a DNS-Extrakte zuvor am Wasserstrahlvakuum eingeeng~ werden. Fiir die kolorimetrische d-Desoxyribose- Bestimmung und damit fiir die Bestimmung der DNS war nur diese Disehe-Reaktion geeignet.

c) Bestimmung des Basenanteils. Die quantitative Bestimmung des Basenanteils erfolg~e sowohl bei RNS als auch bei DNS durch Messung der UV-Absorption der Extrakte im Zeiss-Opton-Spek~ralphotometer. Es ~vurde immer die Extinktion im Bereieh yon 230--300 mtt durchgemessen, und zwar yon 230--250 mtt in Abst/~nden yon jeweils 5 m/~, yon 250--275 m/z in Abst/~nd~n yon 2 m/~, im Maximum yon 1 m/~ und yon 275--300 m/t wieder in Abst/~nden vop 5 m/~, gelegentlieh yon 10 m/t.

Ein Beispiel fiir die spektralphotometrisehe Messung einer Serie yon RNS- Extrakten gibt die Tabelle. Die angefiihr~en Zafilen sind Extinktionswerte der

Tabelle. Extinktionswerte der RNS-Extrakte ver~chieden lange photoperiodisch induzierter Kalanchog.Laubbl~itter

Wellen-.] ZaM der gebotenen K~rzt&ge

l a n g e - 0 I l m / ~ [ ~~ [ 3 I 4 I 5 [ 6 ~l 10 I 16 I 21 [ 25 I 49

225 230 235 240 245 250 252 255 257 259 260 261 262 263 264 265 267 270 280 290 3O0

0,309 0,243 0,223 0,242 0,292 0,349 0,373 0,397 0,408 0,416 0,417 0,r 0,416 0,414 0,412 0,407 0,398 0,378 0,294 0,185 0,077

0,282 0,228 0,207 0,232 0,262 0,334 0,341 0,358 0,373 0,377 0,378 0,382 0,378 0,377 0,376 0,373 0,367 0,351 0,277 0,182 0,088

0,212 0,157 0,151 0,174 0,218 0,272 0,297 0,317 0,328 0,333 0,336 0,336 0,336 0,335 0,333 0,331 0,323 0,308 0,236 0,145 0,053

0,284 0,222 0,207 0,232 0,279 0,336 0,362 0,384 0,396 0,402 0,404 0,404 0,404 0,403 0,398 0,397 0,388 0,367 0,288 0,184 0,082

0,221 0,170 0,168 0,196 0,244 0,303 0,327 0,347 0,357 0,363 0,366 0,366 0,366 0,364 0,361 0,357 0,349 0,330 0,251 0,156 0,062

1 Extinktionsmaxima kursiv gedruckt.

0,187 0,175 0,190 0,227 0,273 0,293 0,312 0,322 0,328 0,328 0,329 0,328 0,326 0,325 0,323 0,318 0,306 0,237 0,153 0,073

0,287 0,248 0,222 0,193 0,204 0,182 0,219 0,196 0,265 0,234 0,324 0,284 0,348 0,306 0,369 0,321 0,383 0,330 0,393 0,337 0,394 0,337 0,396 0,337 0,396 0,337 0,393 0,334 0,394 0,333 0,392 0,331 0,385 0,323 0,372 0,307 0,297 0,232 0,193 0,142 0,090 0,056

l~NS-Extrakte verschieden lange photoperiodisch ~nduzierber Pflanzen bei ver- sehiedenen Wellenlangen. Die Extinktionsmaxima wurden dabei durch Kursiv- druck hervorgehoben 1.

Im allgemeinen wurde eine gute Ubereinstimmung der naeh den versehiedenen Methoden ermittelten Werte fiir die Nucleinsaute-Konzentrationen erreieht.

In die Abbildungen der Extinktionskurven konnten jeweils nut einige be- zeichnende Me~punkte eingetragen werden, da die Markierung aller gemessenen Werte die Darstellungen untibersichtlich gemacht~ h~te .

380 LOT~nl~ GroucH:

Traten Differenzen auf, so wurde Ms ausschlaggebend immer der Wert der UV- Absorption gewertet.

Die ~m Absorptionsmaximum gemessenen absoluten Extinktionswerte kSnnen nut dann dizekt miteinander verglichen werden, wenn - - gMche optische Eigen- schaften der Megkfivetten vorausgesetzt - - in allen Proben neben den Nuclein- s~uren jeweils gleiche Mengen identischer Begleitsubstanzen vorh~nden sind, d. h . wenn nur die Konzentration des zu untersuehenden Stoffes v~riiert. Da diese Voraussetzungen bei pflanzlichen Extrakten besterffalls annahe~d erfiillt werden, gibt man als MaB flit die Konzentration der Nucleins~uren nicht die Extinktion im Absorptionsmaximum an, sondern die Differenz zweier Extinktionswerte, wovon der eine Wert der des Absorptionsmaximums ist (vgl. OGU~ und ROSEN

0,#

/0 20 30 ~ i(onzentratlon (rnoll.)

Abb. 2. Zusammenh~ng zwischen Nucleins~ure- Konzentration und Extinktion. o o RNS,

x x DNS

1950 u.a.). In der vorliegenden Arbeit wurde die Differenz zwi- schen den Extinktionswerten bei 230 und 260 m/~ gemessen. Abb. 2 zeigt, dab im untersuehten Konzen- trationsbereieh sowohl fi~r DNS Ms ~uch ffir RNS ein linearer Zu- sammenhang zwischen Extinktion und Nucleins~ure-Konzentr~tion existiert.

4. Bezugssystem. Als mSgliche Bezugswerte ffir die Nucleinsgure- konzentrationen tier induziel~en Pflanzen bieten sich 3 GrSBen an: Trockengewicht, Nucleins~ure- gehalt niehtinduzierter g]eich alter Kontrollpflanzen und der Gehalt an Gesamtstickstoff. Das Trocken- gewieht kann nur dann als Bezugs-

grSBe dienen, wenn es sich nieht selbst im Verlaufe der photoperiodischen Induktion ver~ndert. DeshMb wurden Trockeagewichtsbestimmungen induzierter Kalanchog- Pflanzen durchgefiihrt. Die Pflanzenwurden under den gleichen BedingungengehMten wie die zur NueMns~ure-Bestimmung angezogenen Versuchsexemplare. Geerntet wurden die mit~leren BlOtter. Sie wurden gewaschen, und mit einem Korkb0hrer wurden je 100 gleich groBe Blattstiicke ausgestanzt. Diese Gewebestiicke wurden auf Filtrierpapier in einen Thermostaten gelegt und bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Die Versuche wurden mehrfach wiederholt; jedesmM ergab sich, daft innerhMb der untersuchten Induktionsspanne keine wesentlichen Schwankungen des Trockengewichts, bezogen auf Blattfl~che, erfolgten. D~s Trockengewicht war demn~ch eine fiir die vorliegende Untcrsuchung der Nucleins~uren brauchbare BezugsgrSBe.

Eine ~ndere BezugsmSglichkeit ergibt sich dutch den Vergleich mit nicht- induzierten Kontrollexempl~ren. Zu diesem Zweck wurden in bestimmten Ab- st~nden zugleich mit den induzierten Kurztagexemplaren Langtagkontrollen der- selben Aussaat geerntet und deren Nucleins~uremenge analog der der Kurztag- pflanzen bestimmt.

Als dritte BezugsgrSge wurde die Menge des Gesamtstickstoffs untersucht. Aus den Gefriertrockenpulvern verschieden lange induzierter Pflanzen wurde nach der Kjeldahl-Methode mit jodometrischer Titration (0,01 n L6sungen) der Gesamtstickstoff bestimmt (CraB,ALL, R~ES nnd WILLIAMS 1943). AnMysiert wurden Proben yon jeweils etw~ 40 rag, die mit 1 cm 8 H~SO~ unter Zusatz yon

Vergnderungen in der Nucleinsgure-Fraktion grfiner Blgtter 381

,,Selen-SpezialkatMysator" (MErcK) verasch~ wurden. Die Schwankungen dieser GrbBe waren betrgchtlicher als die des Trockengewichts, das daher - - neben dem Vergleich mi~ Langtagkontro]len - - a]s BezugsgrbBe verwendet wurde.

Ergebnisse A. Vorversuche

Die quantitative Bestimmung yon Nucleinsguren dureh Auswertung der UV-Absorption pflanzlicher Extrakte set~t die vorherige Abtrennung aller iibrigen im Absorptionsgebiet der Nacleins/iuren absorbierenden Zellinhaltsstoffe voraus. Insbesondere Gerb~toffe sowie Indolverbindun- gen und einzelne der freien Aminosguren zeigen im Gebiet um 260 m# ausgeiorggte Absorptionsbanden. Die Ogur;gosen-Metbode ist nun so angelegt, daft diese St6rsubstanzen durch s~ufenweise Vorextraktionen mbglichst beseitigt werden. Urn auch die bei den sukkulenten Kalancho& Blgttern besonders ins Gewicht fallenden Gerbstoffe zuverlgssig aus- schMten zu kbnnen, mugte die Behandlung des Trockenloulvers mit dem Athanol-Ather-Gemisch gegenfiber d~r Original-Vorschrift ver- lgngert werden (s. oben).

In den Vorversuehen wurden die bei der Vorreinigung des Pulvers anfallenden Extrakte nicht verworfen, so~dern znsammen mit den beiden Nueleinsgure-Fraktionen spektralpho~ometrisch untersucht. Zu- ngchst wurden Blgtter aller drei untersuehten Regionen sowohl ffir Langtagkontrollen als auch ffir 10 und 49 Tage lang induzierte Kurz- tagexemplare extrahiert; insgesamt wurden nlehr als 20 derartige Ver- suehsreihen durchgef/ihrt. Die (auf Troekengewicht bezogenen) Ergeb- nisse zeigen die Abb. 3--5. Naturgemgg si~ld Angaben fiber absolute Konzentrationen nieht m6glich, da ffir die ~nbekannten Stoffgemisehe keine Eiehkurven anfgestellt werden k6nnen. Die MeBergebnisse ge- statten abet einerseits einen Vergleieh zw~schen den verschiedenen Blattwirteln; andererseits zeigen sie die im Verlaufe der Induktion auftretenden Mengen/inderungen.

1. A'thanol-+HClO4-~thanol-Fraktion. I n dieser ~raktion liegt das Absorptionsmaximum der Extrakte stets bei 280 m# (vgl. Abb, 3), Die Konzentration der absorbierenden Inhaltsstoife - - in erster Linie wohl freie Aminosguren - - ist in den B1/ittern der Sloitzenzone am gr6Bten; zur Basis bin fs die Menge bestgndig ab.. Dieses Ergebnis stimmt vbllig fiberein mig den Befunden yon MADAN', (1956), der bei der Unter- suchung der freien Aminosguren in Kalanchog die gleiehe Verteilung innerhalb der Wirtel versehiedenen Alters fa~d.

Im Laufe der Kurztag-Behandlung kommt es in allen Wirteln zu einem Konzentrationsrfiekgang. Dieser Abfall ist in den jiingsten Blgt- tern - - allerdings erst naeh dem 10. Kurztag - - am deutliehsten aus- geprggt. Die ffir die photoperiodisehe Induk~ion wesentlichen Prozesse

Planta . Bd. 54 26

382 L o ~ Gv~w~:

laufen aber sicherlich sehon innerhalb der ersten 10 Tage ab. Da w~hrend dieser Zeit keine deutlichen Mengen/~nderungen feststellbar sind, liegen keine Anhaltspunkte darer vor, dal] in dieser Fraktion f~r die Entwicklungsumstimmung des Vegetationspunktes entseheidende stoffliche Umsetzungen ablaufen.

z; f "

;,o t

250 s 2~0 ~10

i

250 270 Z~O _~I0 s Z/O 290 Wellenl~7oqe ~(T~t)

310

2xbb. 3, Ve rande rungen 4er E x t i n k t i o n der ersten bei der l~uc le ins~ure-Extrakt ion aus ge t rocknoten Kalanchog-Bls anfa l lenden Vorfrak t ion (~ thano l + H C 1 O c ~ t h a n o l ) i m Verlaufe photoperiodischer Induk t ion . a Spi tzenregion; b mi t t l e re BlOtter; c untere BlOtter. �9 I Langtagkontro l le ; • . . . . . x m i t 10 E:urz tagen induzier te E x e m p l a r e ;

o - - - - o m i t 49 K u r z t a g e n induzier te E x e m p l a r e

O,G

350 370 2go 305 350 37O 2gO 8O5 Wellen/#nge g. ( ~ )

, r !

350 ZTO 390 80#

Abb. 4. Veris tier E x t i n k t i o n der z w e i t e n bei 4er Nucleins~1lre-Extrakt ion allS ge troekne ten Kalancho~-Bliittern anfal lenden Vorfrak t ion (Xthanol -~ther ) i m Verlaufe photoperiodischer Induk t ion . a Spi tzenregion; b mi t t l e re BlOtter; c un te re BlOtter.

@ @ Langtagkontrolle; • 2 1 5 mit i0 Xurztagen induzierte Exemplea~e; o Omit 49 Kurztagen induzierte ExemDlare

2. ~thanol-~ther-Fraktion. In dieser Fraktion befinden sich vor ahem Lipoide und die bei Kalancho~ mengenm/~Big so hervortretenden Gerbstoffe. Vergleicht man bier die Absorptionskurven ffir die ver- schiedenen Bl~ttetagen (vgl. Abb. 4), so f~llt sogleich auf, daJ~ die L~ge des Absorptionsmaximums nicht mehr konstant ist. Es hat ~fir obere und mittlere B1/~tter den Anschein, als wenn es w/~hrend der Kurztag- Behandlung um f~st 10 m/~ zum Langwelligen bin verschoben wfirde. Bei den/~lteren Blattern lgBt sich, insbesondere ffir die Langtagkontrollen, kaum noch ein M~ximum angeben.

Ver~nderungen in der Nucleins~ure-Fraktion griiner BlOtter 383

Weiterhin f/illt auf, dal~ zwischen den einzelnen Blattetagen praktisch keine Konzentrationsdifterenzen mehr festzustellen sind. Wghrend die Kurztag-Behandlung in der Spitzenregion yon Anfang an einen schwa- ehen l~fickgang bedingt, sieht es in den ~lteren mid vor allenl in den mittleren Bli~ttern nach einem voriibergehenden Anstieg der Extinktions- werte aus. Inwieweit hier ein Zusammenhang mit der Induktion vorliegen kSnnte, toni3 vSllig often bleiben. Zmi~chst einmal mfil3te diese Fraktion auf ihre genaue stoftliche Zusammensetzung hin untersucht werden.

3. HClOt-Frak t ion . Auch ffir diese Frakti0n wissen wir noch nichts fiber die stoffliche Zusammensetzung auszusagen. ~anlich wie in der

0,3

~ o , / - -

I ; I ! i 250 270 290 30~" 250 270 s YU~-

~VellenlJzge~(~jz) 25O 27O 290 YOY

Abb. 5. Ver~nderungen der Ex t ink t ion der dr i t ten bei ,der Nucle ins~ure-Ext rak t ion aus ge~rockneten Kalancho~,-Bl~ttern anfa l lenden Vorf rakt ion (ttC104) ira Verlaafe photo- periodischer Induk t ion . a Spi tzenregion; b mi t t l e re BlOtter; c un te re Bli~tter. �9 �9

Lang tagkon t ro l l e ; • • m i t 10 K u r z t a g e n incluzierte E x e m p l a r e ; O o nlit 49 K u r z t a g e n induzier te Ex emp la r e

J~thanol-Xther-Fraktion ist auch hier nur in einzelnen Fallen ein deut- fiches Absorptionsmaximum auszumachen (vgl. Abb. 5). In allen Fi~llen kommt es hier im Verlaufe der Induktion zu einer Extinktionszunahme der Extrakte, wobei aber sehr versehieden is~, wann sich dieser Anstieg im Verlauf der insgesamt 7 Wochen andauernden Induktionsphase voll- zieht.

Es meg naeh diesen Vorversuchen lohne~d erscheinen, diese in der vorliegenden Arbeit sonst verworfenen Frakttonen sps einmal n~her zu untersuehen. Selbstverst~ndlich kann allein die spektralphotometri- sche Untersuehung eines Stoftgemisches keinr Aufsehlfisse geben. Erst die prKparative Auftrennung der Sammelfrak~ionen und eine naeh den einzelnen Komponenten getrennte Untersuchung vermag eventue]l weitere Informationen zu liefern.

4. Nucleins~iure-Fraktion. Dutch eine Reihe yon Vorversuchen konnte zun~ehst einmal gezeigt werden, dab die aus jfingeren Langtag- bl~ttern yon Kalanchog extrahierten Nucleinsiiuren Absorptionskurven ergeben, die vSllig mit den in der Literatur verSffentlichten Darstellungen fibereinstimmen. Auch ein Vergleieh mit Handelspr~paraten (Bayer, Schuchardt) zeigte sowohl ffir die I~NS als auch ffir die DNS keinerlei

26*

$8~ L o ~ GcHe~:

Abweiehungen. Sod~nn wurde ~iir nichtinduzierte Kalanchoe-Exempl~re die Verteilung yon I~NS und DNS innerh~lb der BlOtter verschiedener Wirtel untersucht. Abb. 6 gibt d~s Ergebnis f/it die I~NS wieder. Es zeigte sich, d~8 die l~NS-Konzentr~tion mit zunehmendem Bl~ttalter deutlich ~bsinkt. In Bl/~ttern des 8. Wirtels ist (~uf d~s Trockengewieht bezogen) weniger als die H~lfte der in der Spitzenregion vorliegenden Nueleinss enth~lten. Dieser Befund deekt sieh vSllig mi t den ~lteren Anguben so- wohl yon L ~ c n (1954) als auch yon S ~ s s ~ K ~ und 0 9 ~ z o w h (1954).

~'~ . / " - _ _

o , g - - ~

250 280 ~ F# ~80 290 Z/ellenlo'nge X (rap)

A b b . 6

14/e//en/#nge 2c (rag) .A_bb. 7

A b b , 6. E x t i n k t i o n der aus h q u i v a l e n t e n P r o b e n verseh iee len a l t e r Kalanchog-Bl~tter e x t r a h i e r b a r e n R N S - M e n g e n . �9 �9 Sp i t z e lu ' eg ion ; x • m i t t t e r e B l g t t e r ;

O o u n t e r e Bl~tt ter

Abb , 7. E x t l n k t i o n cler aus ~ q u i v a l e n t e n P r o b e n v e r s c h i e d e n e r Kalancho~-Blgtter bzw. - B l i i t e n e x t r a h i e r b a r e n D N S - M e n g e n . �9 �9 B l i i t e n ; o . o s u k k u l e n t e B l g t t e r

i m K u r z t a g a u f g e z o g e n e r E x e m p l a r e ; � 9 - - �9 B l g t t e r n a e h 30 ]Kurz tagen ; O - - - - 0 B l f i t t e r y o n L a n g t a g k o n t r o l l e n

Fiir die DNS finder sich ein sehr ~thnliches Ergebnis. Der Konzen- tr~tionsubf~ll yon tier Spitze zur B~sis ist sogar noch ~usgepr~gter ~ls bei der I~NS. Zum Unterschied yon der RNS zeigt sich bei der DNS aber in den Bl~ttern mittleren Alters - - schw&cher ~uch in noch ~Iteren Bls - - eine Verschiebung des Absorptionsm~ximums um beinahe 10 m# zu grSl~eren Wellenl~ngen bin. Dies lie8 zun~chst an eine Ver- unreinigung der DNS-Frakt ion durch Proteine denken. U m dieser Vermutung n~chzugehen, wurden die Nucleinss mehrfach ~uf eventuell adsorptiv mitgeschlepptes Eiweil~ untersucht 1. D~zu wurden Proben der Extr~kte mi t konzentrierter S~lzss versetzt, uuf Filtrierp~pier ~ufgebr~cht und im Thermost~ten vorsichtig ein-

1 Perchlorsgure ist an sich ei.n recht wirksames EiweiB-F~llungsmittel. Es war aber noch besonders uuszuschlieBen, d~l~ nicht adsorp~iv Proteinspuren. mit in die Nucleins~ure-Fraktionen gelangen.

Ver/~nderungen in der Nucleinss grfiner Bliitter 385

gedampft. Bei dieser Behandlung h~tte es zur Itydrolyse yon EiweiB- k6rpern kommen miissen. Die Fleeken wurden dann mit NaOt{ neutrMi- siert, mit Ninhydrin bespriiht und erneut erhitzt. Es lieBen sich dabei niemMs ninhydrinpositive Subs~anzen nachweisen. Demnaeh waren in den Nueleinsgure-Extrakten keine Eiweil~e enthMten. Die Ursache der Absorptionsversehiebung, die bei induzierten Blgttern besonders dent- lieh hervortrat, muB daher zun/~ehst nnaufgekls bleiben. Es ist nicht ausgeschlossen, dab sie auf eine Verunreinigung zurfickgeht, die dnreh die Vorextraktionen nicht entfernt wnrde, m6glicherweise sogar erst wghrend der DNS-Extraktion (-~70~ in den Extrakt gelangte. Diese Versehiebung wurde bei den sps Auswertungen berfiek- siehtigt.

Die letzten Vorversuche wurden unternommen, um zu kl/iren, ob es bei fortgesetzter Knrztag-Behandlung tats/~chlieh zu einer Zunahme der DNS-Menge kommt. Es wurden verglichen: LangtagkontroYlen, 30 Tage hindurch induzierte Exemplare der gleichen Aussaat, ans- gesproehen sukkulente B1/~tter im Kurztag herangezogener Kalancho~- Exemplare (etwas ~ltere Aussaat) und sehlieBlieh Kalanchog-Blfiten. Abb. 7 zeigt, daft es bei der Umstimmung zur Blfitenbildnng zu einer eindeutigen Konzentrationszunahme der DNS kommt. Bereiis inner-

hMb yon 30 Tagen wird die DNS-Konzentration nahezu verdreifaeht. Dieses Ergebnis f/ihrte nun zu den Reihenuntersuchungen, in denen fiir beide Nueleinsgure-Typen die Konzentrations/~nderungen im Verlaufe der wirksamen Induktionsphase untersucht wurden.

B. Hauptversuche

Photoperiodisch empfindliche Pflanzen benStigen zum Ubergang yon der vegetativen zur reproduktiven Phase ihrer Entwieklung eine ganz bestimmte Anzahl yon Licht-Dunkel-Cyclen. Nach dieser Behand- lung ist der Vegetationspunkt zur Anlage yon Blfiten umgestimmt; die Pflanzen k6nnen wieder unter nich{indnktive Bedingungen gebracht werden. Die zur Bliitenbildung f/ihrenden Prozesse - - allgemeine Stoff- weehsel-Vers odor die Bildung eines ,,Blfihhormons" - - miissen also innerhalb dieser wenigen Cyelen, der Schwelleninduktion, ablaufen. Die in der vorliegenden Untersuehung verwendete Kurztag- pflanze Kalanchog Bloss/eldiana ben6tigt zu dieser Umstimmung mit dem fiir sie optimMen Licht-Dunkel-Wechsel yon 9:15 Std (HAusCmLD I943) eine viert~gige Induktion (I-IA~DE~ und v. WI~scH 1940a). Hieraus ergibt sieh eine Zweiteilung der Untersuchungen. Es sind zun/iehst die Ver/inderungen der Nueleins~ure-Konzentrationen bis zum Erreichen der Sehwelleninduktion zu betraehten, bei Kalanchog also die Zeit bis etwa zum 5. Induktionstag. Dariiber hinaus ist der weitere Verlauf der Induktion mit zu untersnchen, um Ver~ndernngen der DNS, deren

386 LOT~AI~ (JULICtI :

Umbau im VergMch zu dem der I~NS wesentlich langsamer vonstatten geht, zu erfassen.

Aus Griinden einer fibersichtlieheren Darstellung sind die Nuclein- sgure-Absorptionskurven jedoch yore 0. bis zum 20. Kurztag dureh- gezeichnet worden. Um sogMch eine gewisse Mittelwertbildung zu erreiehen, sind die angegebenen Konzentrationswerte bereits aus den Megdaten dreier aufeinanderfolgender Tage gemittelt (vgl. M]~TZ~a 1955), so dab die zum Tell noch viel st/irker hervortretenden Gipfel und Tiiler der Kurven etwas gegli~ttet erseheinen.

I. Die Veriinderungen der RNS-Konzentration. In den oberen Bl~ttern erfolgt sogleich nach Beginn der photoperiodischen Induktion ein steiler

Anstieg der l~NS-Konzentration

~ o .

O0 2 4 8 8 10 15 ,~6 Zndukt/ozsdauer (Tage)

Abb. 8. Ver~nderungen der R N S - ~ e ~ g e in versehieden a l t en Kalanchog-Bl~ttern ira

Verlallfe !ohotoperiodischer Induk t ion . �9 �9 Spitzei~region; O O mi t t l e re

BlOtter; x x un te re Bl~itter

(vgl. Abb. 8), die am 2. Kurztag ein Maximum erreicht und bis zum 5. Tag ebenso steil wieder abf~llt. Vom 5. zum 7. Kurztag erfolgt eine langsame und geringe Zunahme der t~NS-Menge, die jedoch nicht wieder den hohen Wert des 2. Kurztages erreicht. Nach dem 7. Kurztag ist eine zu- n/ichst langsame, sp/~ter raschere Abnahme der RNS-Konzentra- tion, die am 20. Tag zu einem - - in der bier untersuchten Zeit-

spanne - - nieht mehr unterschrittenen Minimalwert ffihrt, zu beobaehten. Der I{NS-Gehalt der B1/~tter mittleren Alters bleibt innerhalb der

bier untersuchten Induktionszeit anni~hernd konstant. In den Blgttern der unteren Wirtel 1/~Bt sieh gleieh naeh Beginn der

Induktion bis zum 2. Kurztag eine starke Zunahme der RNS-Menge beobaehten. Die erreiehte Konzentration wird dann mehr oder weniger beibehalten.

Die stgrksten quantitativen Vergnderungen der RNS treten also in der Spitzenregion und dort innerhalb der ersten 5 Induktionstage auf. Das ist bei Kalanchog Bloss/eldiana unter den bier gegebenen Versuehsbedingungen die Zeit der Sehwelleninduktion. Der allm/~hliehe Abfall tier l~NS-Konzentration in den Blgttern der oberen Wirtel wird aueh yon Slss.xJ~IA~ und ODr~zowA (1954) besehrieben. Dieso Autoren stellen lest, dab in der Blfihphase eine gewisse Verarmung der Bli~tter des oberen Bereiehs an Nueleins/~uren eintritt, was offenbar mit einem Abfliegen yon RNS in die Bliiten verbunden ist.

II. Die u der Dl~S-Konzentration. In den Bl~ttern der oberen Wirtel erfolgt unmittelbar nach dem Beginn der lohotoperiodi-

Ver~nderungen in der Nucleins/~ure-Fraktion griiner Blatter 387

schen Induktion eine starke Abnahme der DNS-Konzentration, deren Menge am 2. Kurztag einen Tiefstand erreieht (vgl. Abb. 9). Es er- Iolgt dann eine geringe Zunahme bis zum 4. Knrztag und - - nach vor/ibergehender Depression - - yore 7. Induktionstag an ein be- stgndiger Anstieg, dutch den am 20. Kurztag etwa das Doppelte der DNS-Konzentration des 7. Kurztages erreieht wird. Die Meg- werte Iiir den 21. und 25. Induktionstag liegen noch viel h6her als es die Abbildung wiedergeben kann; der gezeiehnete Endwert ist durch die Mittelwertbildung (s. oben) erniedrigt worden.

/,Yi I

�9 l ,

~ o 2 4 8 8 lO /5 20 Indu~Non~d~uer (Tage)

Abb. 9. Ver~onderungen tier DNS-Menge in verseh ieden a l ten Kalanchog-Bli~ttern im V e r l a ~ e photoper iodischer Indukt ion . �9 �9 Spi tzenregion, o c> mi t t l e re

BlOtter; • x un te re Bla t t e r

~ 2 Y 8 8 /o /5 20 YndukfionSddLier (TaQe)

Abb. 10. Ver~nderungen der RNS- und DNS- ~/Ienge in der Spitzo~eegion yon Kalancho~ Blossfel, dlana im Ver la~e photoperiodischer Induktlon. �9 �9 DNS; O O RNS

Auch in den B1/~ttern der mittleren Wirtel vollziehen sieh starke quantitative Ver~nderungen. Bis zum 2. Kurztag erfolgt zunachst eine Zunahme, anschlieBend eine geringe Abnahme und sehlieglich, etwa yore 5. Induktionstage an, eine konstante Zunahme der DNS-Konzen- tration.

In den unteren B1/~ttern finder eine stetige Zunahme der DNS-Menge start; am 20. Kurztag ist etwa der doppelte Wert der Langtagkontrolle erreieht.

Der Gehalt an DNS, der in der vorliegenden Arbeit vor allem inter- essierenden Kernsubstanz, nimmt also in allen 3 Wirtelbereiehen yon Kalanchog unter dem EinfluB der photoperiodisehen Induktion zu. Diese Zunahme erfolgt in den unteren Bls stetig. Da sich die Schwelleninduktion nicht ausprggt, ist es fraglich, ob diese DNS- Zunahme im Zusammenhang mit der Induktion steht, zumal aueh Langtagexemplare mit zunehmendem Alter eine gewisse Polyploidi- sierung erfahren sollen (v. WITSCH und FL~GEL 1952). In den photo- deriodisch empiindlicheren mittleren und oberen ]31/~ttern vollziehen

388 Lo~:~Aa GcLic~:

sieh iin Verlaufe der Sehwelleninduktion starke Versehiebungen der DNS-Mengen - - ganz iin Gegensatz zur I~NS, deren Konzentration in den Inittleren Bls etwa konstant bleibt. In beiden Wirteln erfolgt aber nach der Schwelleninduktion, vein 5.--7. Induktionstag an, eine konstante Zunahme der DNS-Konzentration.

Auffallend ist noeh ein Vergleieh yon RNS- und DNS-Konzentration in den Bl~ttern der oberen Wirtel. Die l~NS-Konzentrationskurve dieser Region verlauft genau gegensinnig zur DNS-Konzentrationskurve (vgl. Abb. 10). Das ist sehr auff~llig ain 2. Induktionstag, we einein H6ehstwert der RNS-Konzentration ein Minimum der DNS-Konzen- tration gegeniibersteht. Es ist weiterhin beinerkbar vein 10. zum 20. Induktionstag, we einein recht starken Abfall der RNS-Konzen- tration eine starke Zunahme der DNS-Menge entgegensteht. Es scheint bier in den oberen Blgttern eine Weehselbeziehung zwisehen lZNS- und DNS-Konzentration siehtbar zu werden (vgl. MAlCSl~AK und MARSI~AX 1954).

Diskussion Die vorhegende Untersuehung erbraehte als wesentliehes Ergebnis

den Naehweis einer starken Vermehrung der DNS iin Verlauf photo- periodiseher Induktion. v. WiTsclt und FLi~GEL hatten seinerzeit den h6heren Polyploidiegrad yon Kurztagblattern dadurch festgestellt, dab sie die Mitosechroinosoinen in dureh Verwundung zu erneuter Teilung angeregten Mesophyllzellen ausz~hlten. Ihr Ergebnis konnte nuninehr dureh quantitative eheinisehe Analyse der Nucleinsaure-Fraktionen best~tigt werden. Diese DNS-Werte wurden in der vorliegenden Arbeit in ,,normalein" - - d .h . unverletztem - - Gewebe gefunden. Die bier vorgelegten Ergebnisse stehen aueh im Einklang Init friiheren Unter- suehungen yon SOS~_-]~OUI~DOUIL (1948). Die Autorin land an Ginkgo biloba eine starke Verinehrung der Nueleins~uren iin Verlauf der Inflores- zenzentwicMung. Naeh der Ausbildung der Polleninutterzellen nahin der Gehalt an Nueleinsauren - - zwisehen den beiden Typen wurde bedauerlicherweise nicht untersehieden - - zunaehst stark, dann bis zur Pollenreife langsainer zu.

Es konnte nun gezeigt werden, dab sieh innerhalb der fiir die Bliiten- bildung notwendigen Induktionszeit, der Schwelleninduktion, starke Konzentrationsgnderungen sowohl der RNS als aueh der DNS voll- ziehen. Nach dem 5.--7. Induktionstag, nachdem die zur Uinstiminung der Pflanze zur reproduktiven Phase ihrer Entwieklung wirksalnen Prozesse vollzogen oder doch irreversibel eingeleitet sind, laBt sich in den Bl~ttern aller Wirtel ein konstanter Anstieg der DNS-Konzentration beobaehten. Dieser Anstieg ist in den B1Kttern der oberen Wirtel am

Ver~nderungen in der Nueleins~ure-Frak~ion griiner Bl~ttter 389

st~rksten 1. In den ausgewaehsenen Bls der unteren Wirtel ist die Zunahme der DNS-Konzentrat ion verhgltnism~Sig gering.

Die naeh jeder Mitose vielleieht zu erwartende sprunghafte Ver- mehrung der DNS prs sich in den Konzentrat ionsknrven nieht aus, einmal weft ganze B1/~tter untersueht wurden, zum anderen, weft es sieh bei der Angabe der DNS-Konzentrat ionen immer nm die DNS-Werte der gesamten Protoplasten handelt, also aueh um DNS, die nieht in den Chromosomen lokalisiert ist und somit, vermutlieh aueh nieht an der dutch PolyploidieerhShung verursaehten DNS-Vermehrung teilhat. Wahrseheinlieh geht die Vermehrung der DNS aueh nieht in allen Zellen synehron.

Die Ver~nderungen der RNS-Konzentrat ion im Verlauf photo- periodiseher Indukt ion sind mit den yon M~Tz~]~ (1955) gefundenen Vergnderungen der Blattproteine zu vergleichen. Die RNS-Synthese verl/~uft der Eiweil3synthese proportional, wghrend die DNS vermutlieh ohne direkte Beziehung zur EiweiBsynt.l~ese ist (Wv~BsT~ und JogNsoN 1955, vgl. Sc~aMM 1958). Die gNS-Konzentra t ionsknrve verlguft fiir die Blgtter der Spitzenregion parallel zu den yon M~Tz~R - - der selbst nur diese Spitzenregion untersueht hat - - gefundenen Ver&nderungen der basisehen Komponenten der Eiweil3e. Insbesondere konnte M ~ z ~ eine Zunahme des ttistongehalts 2 im Spitzenmeristem wahrseheinlieh maehen, was mi t dem in der vorliegenden Arbeit gefundenen h6heren l~NS-Gehalt der j/ingsten B1/~tter in Einklang steht. In engem Zn. sammenhang mit den Untersnehnngen yon M ~ . T z ~ mug die Arbeit yon NIAI)A~r (1956) betraehtet werden. MADabr finder an Kalanchog BlossJeldiana im Verlaufe der photoperiodisehen Induktion Ver/~nderun- g e n d e r Fraktion freier Aminos/~uren, die sieh mit den hier vorgelegten Ergebnissen fiber die Verteilung und Konzentrations/~nderung der I~NS in den 3 Wirtelregionen vergleiehen lassen.

Die Verteilung yon I~NS und DNS in den versehiedenen Wirteln entspricht den Differenzierungs- und Stoffweehselaufgaben dieser Zonen. Aueh yon LAXCE (1954) wurde ein hoher RNS-Gehal t im Spitzen- meris~em fes~gestellt. Zu demselben Ergebnis kommen S~ssA]~IA~ und

1 ~i~ diesem starken Anstieg gerade in der oberen Region der Pflanze dtirfte die Zunahme der Kerndurehmesser (M]~Tz~I~, unverSffentlicht) in Verbindung zu bringen sein. l~l~z~r~z land bei den Kernen der subepidermalen Schicht des Kalancho~-Vegetationspunktes eine Zunahme der Kernvolumina im Verlauf photo- periodiseher Induktion, was Mederum auf eine Polyploidisierung sehlieSen l~tSt (vgl. S w E ~ 1955).

tIistone sind die EiweiBkomponenten der Chromosomen-NucleinsKuren. Aus diesem Grunde sind die Beobach~ungen tiber Konzentrations/~nderungen in der Fraktion der basischen Aminos~uren (insbesondere Histidin) ftir einen Vergleieh mit den Nucleins~ure-Ver/~nderungen yon Interesse.

390 LOT~AlZ GVLIC~:

ODI~ZOWA (1954), die darfiber hinaus fanden, da$ in der Bliihphase eine Verarraung der BlOtter oberer Wirtel an I~NS zugunsten der unteren Wirtel erfolgt, eine Erseheinung, die in der vorliegenden Arbeit am Verlauf tier 1%NS-Konzentration vom 7. Induktionstage an siehtbar ist und sorait fiir Kalanchog best/~tigt werden konnte.

Often bleibt die Frage naGh tier Beteiligung der Nucleins~uren an der Bliitenbildung, vielleieht als bliitenbildender Faktor selbst, wie es nach dera selbstreproduktiven Charakter eines ,,Bltihhormons" ra6glich w~re. In jiingster Zeit konnte H~ss (1959) fiir Streptocarpus wendlandii zeigen, da$ sigh die Blfitenbildung dureh geringe Mengen yon Thiouraeil heraraen 1~$t; dabei liegen die erforderliGhen Dosen deutlieh unter denen, die alas BlattwaGhstum beeinflussen. Interessant ist vor allera der Befund, da$ die frfihen Stadien der Induktion gegen Thiouraeil besonders erapfindlieh sind. Wir diirfen hierin einen weiteren ttinweis darauf sehen, dal~ Nueleins~uren - - in diesera Falle der RNS - - fiir die Prozesse der Blfitenbildung eine besondere Rolle zukorarat. Die Frage, wie wit uns diese Rolle vorzustellen haben, kann jedoeh durGh quantitative Untersuchungen oder durch Herarastoff-Experiraente night entsehieden werden. Naeh Angaben yon SlSSAXlA~ (1954) konnten aber bereits qualitative Ver~nderungen gefunden werden; der Autor beriehtet yon einer VersGhiebung des Purin-Pyriraidin-Verh~ltnisses. Alle diese Beobaehtungen lassen jedenfalls ein weiteres Studiura der Nucleo- proteide ira Zusararaenhang rait der Blfitenbildung wiinschenswert ersGheinen. Dabei sollte vor allera versuGht werden, rait raoderner Methodik Einblicke in die qualitative Zusararaensetzung der Nuelein- s/~ure-Fraktion zu gewinnen.

Zusammenfassung Es wurde eine ~e thode zur Isolierung yon l~ibo- und Oesoxyribo-

nucleins~ure aus den gerbstoffreiehen Laubbls der Kurztag-Cras- sulacee Kalanchog Bloss]eldiana entwickelt.

Die Vertei]ung der beiden Nucleinss auf verschiedene Blattwirtel wurde untersucht. Dabei wurden die Spitzenregion des Sprosses, die - - photoperiodisch raaxiraal erapfindliGhen - - BlOtter raittleren Alters sowie roll ausgewaehsene Laubbls studiert.

In allen Wirteln koram* es irn Verlaufe der photoperiodisGhen Induk- tion zu Konzentrations~nderungen der Nucleinsguren, insbesondere zu einera Konzentrations~nstieg der Desoxyribonuel~inss

Die ra6gliehen Zusararaenhgnge dieser Erscheinung rait anderen bioeheraischen Ver~nderungen wghrend der photoperiodisGhen Induktion werden besprochen.

Ver/inderungen in der Nueleins~ure-Fraktion griiner Rl~tter 391

Die der vorliegenden Arbeit zugrunde liegenden Experimente wurden in den Jah ren 1954--1956 im Pflanzenphysiologischen Ins t i tu t der Universit/~t GOttingen durchgefiihrt. Herrn Prof. Dr. Dr. h. e. R. I-IAgDE~ m6ehte ich fiir die Anregung zu diesen Untersuchungen nnd fiir das Interesse, das er ihnen entgegenbrachte, herzlich danken. Zu ganz besonderem Dank bin ieh t t e r rn Dozent Dr. l~I. MSTZb;ER fiir seine Hi]re bei der Durchfiihrung and Answertung der Versuehe verpflichtet.

Literatur

R(DTTGER, I., n. R. WOLLGIEIClN: Untersuchungen fiber den Zusammenhang zwischcn Nucleins/~ure- und Eiweigstoffweehsel in grfinen B1/ittern h6herer Pflan- zen. Flora (Jena) 146, 302 (1958). - - RO~THWJC~, l-I. A., M. W. PAI~K~ and P. H. H~I~ZE: The influence of localized low temperature on Biloxi soybeans during photoperiodic induction. Rot. Gaz. 102, 792 (1941). - - CAZLACHJA~, M. C. : On the hormonal theory of p lant development. C. R. Acad. Sci. URSS., N. s. 3, 443 (1936a). - - New facts in support of the hormonal theory of p lant development. C. R. Acad. Sci. URSS. , N. s. 4, 79 (1936b). - - Translocation of flowering hor- mones in the p lant as effected by temperature and narcotics. C. R. Acad. Sci. URSS., N. s. 31, 945 (1941). - - CmBA, Y. : Cytochemical studies on chloroplasts. I. Cytological demonstrat ion of nucleic acid in chloroplasts. Cytologia (Tokyo) 16, 259 (1951). - - CmBA, Y., and K. SVGAJ~A~A: The nucleic acid content of chloro- plasts isolated from spinach and tobacco leaves. Arch. Biochem. 71, 367 (1957).-- CraB,ALL, A.C., M.W. t~EES and E. F. WILLIAMS: The tota l nitrogen content of egg albumin and other proteins. Biochem. J. 37, 354 (1943). - - DlSC~E, Z. : ~ b e r einige neue eharakterist ische Farbreakt ionen der Thymonucleinsaure und eine Mikromethode zur Best immung derselben in ticrischen Organen mi t Hilfe dieser Reaktionen. Mikrochem. 8, 4 (1930). - - E~E~BEnG, M.: (fiber die Be- s t immnng yon Fermenten in Gegenwart yon Gerbstoffen. Riochem. Z. 325, 102 (1954). - - Fl~o~, L . R . , and D. J. CARa: Nucleic acid content of Petkus rye embryos in relation to vernalization and devernMization. Aust. J . biol. Sci. 9, 355 (1956). - - Go~o~I, G. : A modification of the colorimetrie phosphorus deter- minat ion for use with the photoelectric eolorimeter. J . Lab. clin. D/led. 27, 955 (1941). - - HAm~, L., and H. v. E v L ~ : A new method for the quant i ta t ive deter- minat ion of r ibonucMc acid in animal tissues. Svensk kern. T. 58, 251 (1946a). - - Eine neue Methode zur Best immung yon RNS in Anwesenheit yon I)NS. Ark. Kemi 22a, 23 (1946b). - - Studies on est imation of desoxyribonucleic acid in animal tissues. Arch. n~erl. Physiol. 29, 423 (1948). - - ]-IAM~ER, K. G., and J . B O ~ E R : Photoperiodism in relat ion to hormones as factors in floral ini t iat ion and development. Rot. Gaz. 1O0, 388 (1938). - - HA~D~R, R. : Blii~e und Bliihen als Gegenstand neuerer physiologischer Untersuehungen. Abh. Ges. Wiss. G6ttin- gen, math.-physik. K1. 18, 41 (1937). - - HARDER, t~., O. RO~)E u. H. V. WITSC~: ~ b e r Weehselbeziehungen zwischen Bliitenbildung, Rrakteenverlaubung and Sukkulenz der Laubbla t te r bei Kalancho~" Blo/3#ldiana. Flora (Jena) 36, 85 (1942). - - I-IAI~DEa, R., u. J:I. v. WITscm Wirkung yon Photoperiodismus und Yarowisation auf die Rlii tenbildung yon Kalancho~" Blofi/eldiana. Gartenbanwiss. 15, 226 (1940a). - - Iffber die Bedeutung des Alters fiir die photoperiodische l~eak- t ion yon Kalancho~" Bloss#ldiana. Plan ta (Berl.) 31, 192 (1940b). - - }tAVSCm~D, J. : ~ b e r die an der photoperiodischen Reaktion der Knrztagspflanzen beteiligten Vorg~tnge. Diss. math.-nat . Fakul t /~ G6tt ingen 1943. - - HESS, D. : Die selektive Blockierung eines an der Bli ihinduktion beteiligten Ribosenucleins/~ure-EiweiB- Systems durch 2-Thiouracil (Untersuchungen an Streptocarpus wendlandii). Plan ta

392 Lo~A~ G ~ c z :

(Berl.) 54, 74 (]959). - - HOLDEI~ ~, M. : The fr~ctionation and enzymic breakdown of some phosphorus compounds in leaf tissue. Biochem. J. 51, 433 (1952). - - A comparison of the applicability to plant extracts of three methods of determining desoxyribonueleic acid. Analyst 78, 542 (1953). - - LAncE, A.: R6partition de l 'acide ribonucl6ique dans les m6rist~mes apicaux de deux compos6es. C. 1%. Acad. Sci. (Paris) 239, 1238 (1954). - - LAwG, A. : Physiology of flowering. Ann. Rev. Plant Physiol. 3, 265 (1952). - - LANG, A., u. G. 1V[ELC~IEI~S: AuslSsung yon Bliiten- bildung bei Langtagpflanzen unter Kurztagbedingungen durch Aufpfropfung yon Kurztagpflanzen. Z. Naturforseh. ]b , 108 (1948). - - Lo~A, F.: Sui fenomeni di induzione, postcfetto c localizzazione fotoperiodica. L'induzione antogena indiretta delle foglie primordia]i di Xanthium italieum Moretti. Nuovo Giorn. bot. ital., N. s. 53, 548 (1947 a). - - Sul comportamento fotoperiodico di alcune specie di Xanthium. Brevidiurne the fioriscono a luee continua. Nuovo Giorn. bot. ital., N. s. 53, 635 (1947b). - - MADAm, C.L. : Die Verteilung der freien Aminos~uren in der Pflanze nnd ihre Beeinflussung dutch photoperiodisehe Induktion (Untersuchungen an Kalanchog Bloss/eldiana). Planta (BEE.) 47, 53 (1956). - - MARKHAM, R.: Nucleic acids, their components and related compounds. In K. PA~Gtr u. M.V. T~AC]~Y, Moderne Methoden der Pflanzenanalyse, Bd. 4, S. 246. Berlin-G5ttingen- Heidelberg: Springer 1955. - - MAI~SHA~:, A., and C. MAX~SttAK: Biological role of desoxyribonucleie acid. Nature (Lond.) 174, 919 (1954). - - MEZBAC~, W. : l~ber die Bestimmung kleiner Pentosemengen, insbesondere in Derivaten der Adenyl- s~ re . Hoppe-Seylers Z. physiol. Chem. 258, 127 (1939). --~XLC~EXS, G.: Die Wirkung yon Genen, tiefen Temperaturen und bliihenden Pfropfpartnern auf die Bli~hreife yon Hyoscyamu8 niger L. Biol. Zbl. 57, 568 (1937). - - M~LCgEas, G., u. A. LA~r Weitere Untersuchungen zur Frage der Bliihhormone. Biol. Zbl. 61, 16 (1941). - - Nf~TZ~R, H.: Cytochemische Untersuchungen iiber das Vor- kommen yon Nukleins~turen in Chloroplasten. Biol. Zbl. 71, 257 (1952). - - Unter- schiede in der EiweiSfraktion bei Lang- und Kurztagsexemplaren yon Kalanchog Bloss]eldiana. Nachr. Akad. Wiss. GSttingen, math.-physik. KI., 8, 19 (1954). - - Ver~nderungen der Blattproteine bei photoperiodiseher Induktion. Planta (Berl.) 45, 493 (1955). - - Mos~xov, B. S.: Transfer of photoperiodic reaction from leaves to growing points. C. 1~. Acad. Sci. URSS., N. s. 24, 489 (1939). - - N ~ c ~ , C., and J. S. P~or~Ts: Remarkable properties of nucleic acids and nucleotides. Arch. Biochem. 20, 185 (1949). - - OCv~, M., and G. ~OSE~: The nucleic acids of plant tissues I. The extraction and estimation of desoxypentose nucleic acids and pentose nucleic acid. Arch. Biochem. ~5, 262 (1950). - - P r o w s , O. ~N., and F. G. G~E~o~Y: Studies in vernalisation. XII . The reversibility by high temperature of the vernalised condition in Petkus winter rye. Ann. Bot., N. s. 16, 1 (1952). - - S c ~ x n ~ , G., and S. T ~ A ~ A V S ~ : A method for the deter- mination of desoxyribonucleic acid, ribonueleic acid and phosphorproteins in animal tissues. J. biol. Chem. 161, 83 (1945). - - S C g ~ D ~ , W. C.: Phosphorus compounds in animal tissues. J. biol. Chem. 161, 293 (1945). - - Sc~m~v~, G.: Die identische Reproduktion der Proteine. In Handbuch der Pflanzenphysiologie, Bd. 8, S. 452. Berlh~-GSttingen-Heidelberg: Springer 1958. - - S ~ s s x x ~ , N. M.: Biochemie der Plastiden. [Russisch.] Acad. Sei. UI~SS., Soc. Bot. Ut~SS. 1954. - - S x s s ~ x ~ , N. M., i M. S. OD~ZOWX: ~ber die Verandernngen der Ribonuclein- s~ure der Plastiden im Entwicklungsproze{l des Organismus. [Russiseh.] C. R. Acad. Sci. URSS. 97, 119 (1954). - - SOs~-BovnDOV~L, C. : Sur les acides nucl6iques au tours du d6veloppement des inflorescences de Ginkgo biloba L. C. R. Acad. Sci. (Paris) 2~6, 953 (1948). - - S ~ r r r ~ , K. : Kern- und Nucleolenwachstum bei endomitotischer Polyploidisicrnng. (Ein Beitrag zur karyologischen Anatomic

Ver~nderungen in der Nucleinsi~ure-:Praktion griiner Blgtter ~9~

yon Pedicularls palustris L.) Planta (Berl.) 45, 379 (1955). - - STOCKI~C, C. R., and E. M. GIFFOm) jr. : Incorporation of thymidine into chloroplasts of Spirogyra. ]3iochem. biophys. Res. Comm. 1, 159 (1959). - - THOMAS, A. J. , and H. S. A. SHE~- !~A~: The isolation of nucleic acid fractions from plant leaves and their purine and pyrimidine composition. Bioehem. J. 62, 1 (1956). - - W ~ s T ~ , G. C., and M. I ). JoHnson: Effects of ribonuclcic acid on amino acid incorporation by a particulate preparation from pea seedlings. J. biol. Chem. 217, 641 (1955). - - WITHROW, A.P . , and 1%. B. WI~HRow: Translocation of the floral stimulus in Xanthium. Bot. Gaz. 194, 409 (1943). - - Wissc~, H. v., u. A. FLiP,EL: ~ber photoperiodisch induzierte Endomitose bei Kalancho~ Bloss/eldiana. Naturwiss. 38, 138 (1951). - - ~bcr Polyploidieerh6hung im Kurztag yon Kalancho~ Bloss/el- diana. Z. Bot. 40, 281 (1952). - - u A . F . : Studies on the photoperiodism of Kalancho~ Bloss/eldiana. I. Effect of age on response to short-day treatment. physiol. Plantarum 8, 223 (1955).

Dr. LOTHAR GULICH, Braunschweig, Wilhelm-]3ode-Str. 32