Vergleichende autoradiographische Untersuchungen zur CEA ...sylvester.bth.rwth-aachen.de/dissertationen/1999/6/99_6.pdf · Die Einführung der Hybridoma-Technik 1975 durch Köhler

Vergleichende autoradiographische Untersuchungen

zur CEA-Expression in kolorektalen Karzinomen

sowie zur intratumoralen Verteilung

des anti-CEA Antikörpers BW 431/26 nach intravenöser Injektion

Andreas Kremer

Vergleichende autoradiographische Untersuchungen

zur CEA-Expression in kolorektalen Karzinomen

sowie zur intratumoralen Verteilung

des anti-CEA Antikörpers BW 431/26 nach intravenöser Injektion

Von der Medizinischen Fakultätder Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen

zur Erlangung des akademischen Gradeseines Doktors der Medizingenehmigte Dissertation

vorgelegt von

Andreas Kremeraus

Birkesdorf, jetzt Düren

Berichter: Herr ProfessorDr. med. R. Bares

Herr UniversitätsprofessorDr. rer. nat. Dr. med. habil. H. Korr

Herr UniversitätsprofessorDr. med. Ch. Mittermayer

Tag der mündlichen Prüfung: 24. Juni 1999

Inhaltsverzeichnis 1

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 3

1.1. Das kolorektale Karzinom 3

1.2. Carcinoembryonales Antigen und anti-CEA Antikörper 4

1.3. Anreicherung der Antikörper im Tumorgewebe 9

1.4. Radioimmunszintigraphie bei kolorektalen Karzinomen 16

1.5. Einsatz von Antikörper bei der Tumortherapie 19

1.6. Autoradiographie mikroskopischer Präparate 20

2. Zielsetzung 22

3. Materialien und Methoden 23

3.1. Antikörper 23

3.1.1. anti-CEA Antikörper BW 431/26 23

3.1.2. anti-Maus Antikörper 24

3.1.3. Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) 24

3.2. Untersuchte Gewebe 25

3.2.1. Herkunft und Histologie 25

3.2.2. Vorbereitung der Gewebeschnitte 26

3.3. Antikörperinkubation 27

3.4. Materialien für die Autoradiographie 28

3.4.1. Photoemulsion 28

3.4.2. Sonstige zur Autoradiographie benötigte Geräte 28

3.4.3. Zusammensetzung des Entwicklers 29

3.4.4. Zusammensetzung des Fixierers 29

3.4.5. Hämatoxlylin Färbung (nach Meyer) 30

3.4.6. Eindeckelung mit Entellan 30

3.5. Methode der Autoradiographie 31

3.6. Mikroskopie und photographische Dokumentation 32

Inhaltsverzeichnis 2

Fortsetzung Material und Methoden

3.7. Versuchsbeschreibung 33

3.7.1. Vorversuch 33

3.7.2. Ansatz für die autoradiographische Darstellung

des Antikörpers BW 431/26 33


des Carcinoembryonalen Antigens 34

3.7.4. Kontrollanordnung 34

4. Ergebnisse 35

4.1. Auswertung der Markierungsintensität 35

4.2. Vorversuch 36

4.3. Autoradiographische Darstellung des Antikörpers BW 431/26 37

4.4. Autoradiographische Darstellung des Carcinoembryonalen Antigens 44

4.5. Kontrollanordnung 53

4.6. Auswertung der Ergebnisse 55

5. Diskussion 57

5.1. Autoradiographie 57

5.2. Versuchsanordnung 60

5.3. Ergebnisse 61

6. Zusammenfasssung 66

7. Literaturverzeichnis 68

8. Danksagung 84

9. Lebenslauf 85

Einleitung 3

1. Einleitung

1.1. Das kolorektale Karzinom

Das kolorektale Karzinom stellt in der Mortalitätsstatistik der Bundesrepublik

Deutschland nach den Bronchialneoplasien beim Mann und dem Mammakarzinom bei

der Frau die zweithäufigste Todesursache bei malignen Erkrankungen dar [139]. Die

jährliche Inzidenzrate beträgt 15-30/100.000 Einwohner. Die Tendenz ist zunehmend.

Hierbei hat die Prognose in den letzten Jahren trotz intensiver Forschung auf den Gebiet

der Diagnostik und Therapie keine wesentliche Verbesserung erfahren [42,107].

Die Fünfjahresüberlebensrate aller Tumorstadien beim kolorektalen Karzinom beträgt

etwa 50% [28,53]. Als prognostischer Parameter hat sich das Tumorstadium ent-

sprechend der TNM-Klassifikation bzw. der Dukes-Einteilung bewährt. Durch eine

Diagnose von Primärtumoren und Rezidiven in frühen Stadien ist daher am ehesten eine

Verbesserung der Prognose zu erwarten [107].

Nach radikalen Resektionen ist mit einem Tumorrezidiv in 40% d. F. zu rechnen [149].

Zum Zeitpunkt der chirurgischen Intervention hat bei einem Drittel der Patienten bereits

eine Metastasierung in die organdrainierenden regionären Lymphknoten statt-

gefunden [56]. Die hämatogene Metastasierung des kolorektalen Karzinoms erfolgt zu

75 % in die Leber und zu 20 % in die Lunge.

Diese Organmetastasen sind durch die üblichen Nachweisverfahren wie Ultraschall,

Endoskopie, Röntgen, Computertomographie und Magnetresonanztomographie gut

darzustellen. Bei der Identifikation der lokoregionalen, intraabdominalen und retro-

peritonealen Tumorprogression und der Abgrenzung zu chronisch-entzündlichen und

fibrotischen Veränderungen ist die konventionelle radiologische Diagnostik jedoch oft

unzureichend [56].

Einleitung 4

1.2. Carcinoembryonales Antigen und anti-CEA Antikörper

Die Erstbeschreibung des Carcinoembryonalen Antigens gelang 1965 Gold und Freed-

man in Extrakten von Adenokarzinomen des menschlichen Kolons und des fetalen

Verdauungstraktes [58]. 1968 lokalisierten die gleichen Autoren das CEA an der Ober-

fläche von Tumorzellen des digestiven Systems [59]. Später erfolgte die Isolation eines

chemisch und immunologisch identischen Moleküls aus der Lavage von gesundem

Kolongewebe [43]. Dadurch ging die initiale Hoffnung verloren, das CEA als

tumorspezifisches Antigen für die Diagnose des kolorektalen Karzinoms nutzen zu

können. CEA kommt sowohl im gesunden Gewebe als auch bei verschiedenen benignen

Erkrankungen ( entzündliche Prozesse des Verdauungstraktes, bei Erkrankungen der

Leber wie Zirrhose und Hepatitis, aber auch bei Gallengangsobstruktionen )

vor [43,144]. Das CEA hat sich in den letzten 30 Jahren zu dem am besten erforschten

tumorassoziierten Antigen entwickelt [95]. Es ist primär assoziiert mit Karzinomen des

entodermal entstandenen Verdauungstraktes [147]. In der Klinik ist die Bestimmung der

CEA-Serumkonzentration durch additive oder kompetitive Radio- bzw. Enzym-

immunoassyas als postoperative Verlaufskontrolle etabliert und dient zum Nachweis von

Tumorrezidiven nach Entfernung des Primärtumors [68].

Das Carcinoembryonale Antigen gilt als Prototyp des Tumormarkers, mit dem alle neu

entwickelten Tumormarker verglichen werden. Das CEA ist ein glykolisiertes Protein mit

einem Molekulargewicht von 180-200 kDa [147]. Es besteht aus einem Kohlenhydrat-

und einem Proteinanteil [124]. Durch die Variation der Kohlenhydratkomponente wird

es zu einem sehr heterogenen Molekül [144]. CEA wird konstant von Becherzellen des

Dünndarms, Saum- und Becherzellen des Kolons und Tumorzellen des kolorektalen

Adenokarzinoms synthetisiert [3]. Es wandert durch das Zytoplasma und ist mit der

Zellmembran assoziiert. Die Ausschüttung ins Gewebe erfolgt als lösliches Glykoprotein

mit Akkumulation im interstitiellen Raum [147]. Über die Lymphbahnen erfolgt der

Transport zum drainierenden Lymphknoten und später als Chylus ins Blut [12].

In den Lymphknoten wird das CEA zum Teil an der Oberfläche antigenpräsentierender

Zellen fixiert [45]. Zirkulierendes CEA wird in der Leber an Rezeptoren der Kupferzellen

gebunden. Nach Umwandlung gelangt es durch Exozytose wieder in die Sinusoide.

Einleitung 5

Mittels Endozytose wird das CEA nun von den Hepatozyten aufgenommen und

abgebaut [144]. Nur ein geringer Teil des CEA wird unverändert über die Galle aus-

geschieden. Bei einer Lebererkrankung kommt es zur Lockerung der Zellkontakte

zwischen den Hepatozyten. Dadurch gelangt ein größerer Anteil von CEA in die Gallen-

kapillaren und von hier über die Gallenkanälchen und den Ductus choledochus ins

Duodenum [144]. Die klinisch bekannten Serum-CEA Erhöhungen bei Leber-

erkrankungen lassen sich daher über die enterale Resorption oder durch Cholestase

erklären [12].

Präoperative CEA-Erhöhungen im Serum wurden bei 40-70 % der Patienten mit kolo-

rektalen Karzinomen beschrieben. Bei gut differenzierten Tumoren kommt es in fast

95 % zu einem erhöhten CEA-Wert, bei wenig differenzierten Tumoren nur in 35 % der

Fälle [116].

Im gesunden Dünndarm ist CEA hauptsächlich in der Mucosa an den Zellorganellen der

Proteinbiosynthese und apikal in den Mikrovilli der Becherzellen lokalisiert. Das Ver-

teilungsmuster im Kolon entspricht dem des Dünndarms, jedoch ist das CEA sowohl in

den Mikrovilli der differenzierten Becherzellen als auch der Saumzellen zu finden. Die

Sekretion erfolgt polarisiert hauptsächlich ins Darmlumen. Anschließend wird das CEA

mit dem Stuhl ausgeschieden [144].

Die CEA-Lokalisation bei den kolorektalen Karzinomen korreliert mit dem Grading [3].

Gut differenzierte Karzinome zeigen ein Verteilungsmuster vergleichbar mit normalem

Kolongewebe, während bei wenig differenzierten Karzinomen das CEA gleichmäßig mit

eher basolateraler Ausrichtung über die ganze Zelloberfläche verteilt ist [3]. Insgesamt ist

das CEA jedoch hauptsächlich in der Zellmembran lokalisiert [144]. Die Expresssion

erfolgt nicht polarisiert und ist ein Charakteristikum für neoplastische Zellen [3]. Im

Lumen erscheint das CEA oft in blinden Gängen, wo es gefangen zu sein scheint.

Vermutlich resultiert hieraus der höhere Wert an extrahierbarem CEA im Gewebe kolo-

rektaler Tumoren [144]. Diese Effekte sowie die unterschiedliche CEA-Produktionsrate

und die totale Tumormasse bedingen die Erhöhung von CEA im Serum von Patienten

mit kolorektalen Tumoren [123].

Die Entdeckung von Antikörper erfolgte zwar bereits 1890 ( damals als Antitoxine ),

aber erst Mitte der dreißiger Jahre dieses Jahrhunderts wurden sie durch die Einführung

Einleitung 6

der elektrophoretischen Technik zur Auftrennung von Serumproteinen als Gamma-

globuline eingeordnet. Schon Ende des 19. Jahrhunderts wurde die pathogene Bedeutung

des Diphtherie- und Tetanustoxins erkannt. Behring und Kitasato beschrieben die

neutralisierende Wirkung von passiv übertragbaren spezifischen Antitoxinen gegen das

Diphtherietoxin. Neben der Entwicklung von erregerspezifischen antitoxischen Immun-

sera war es seit den frühen Tagen der Immunologie immer ein Bestreben gewesen,

immunologische Kontrollmechanismen und Therapieformen gegen Tumorzellen zu

entwickeln [61].

Seit Anfang der sechziger Jahre ist die biochemische Analyse der Antikörper möglich. Es

folgten die Aufklärung der Antikörperstruktur, ihrer Primärsequenz und die Charak-

terisierung der verschiedenen Antikörperklassen.

Die Einführung der Hybridoma-Technik 1975 durch Köhler und Milstein ermöglichte die

Produktion von monoklonalen Antikörpern [93]. Dadurch existiert ein neues immuno-

logisches Werkzeug, das die Voraussetzung für einen breiten klinischen Einsatz von

Antikörpern geschaffen hat.

Die Untersuchung des Carcinoembryonalen Antigens durch monoklonale Antikörper

vermittelte wesentlich differenziertere Aussagen über seine Eigenschaften. Alle mono-

klonalen anti-CEA Antikörper reagieren mit Epithelstrukturen der kolorektalen

Adenokarzinome [151]. Durch immunohistologische Färbetechniken oder Autoradio-

graphien läßt sich die Antikörperbindung als ungleichmäßiges Markierungsmuster über

dem Tumor darstellen. Es kommt zu Markierungen der Drüsenlumina, der Zellmembran

und des Zytoplasmas der Tumorzellen, der intraluminalen Sekretion, im Extra-

zellulärraum und in nekrotischen Arealen. Nach Beatty läßt sich die CEA-Verteilung in

das Zytoplasma der Tumorzellen und apikale bzw. intraluminale Anteile der drüsigen

Karzinomverbände unterteilen [12].

Kommt es an der Zelloberfläche zu einem Kontakt zwischen dem membranassoziierten

Antigen und einem anti-CEA Antikörper, so wird der Antigen/Antikörper-Komplex

mittels Endozytose aufgenommen [128]. Diese CEA-Verminderung an der Tumor-

zelloberfläche wird nach der Endozytose innerhalb von 6 Stunden durch Reexpression

rekompensiert als Zeichen der genetischen stabil gehaltenen CEA-Expression [129].

Auffallend ist die fehlende Neutralisation des im Blut zirkulierenden CEA durch

applizierte Antikörper [62,63]. Bosslet zeigte an einem Modell die fehlende Bindung an

Einleitung 7

das zirkulierende Antigen [24]. Er beschreibt eine erhaltene Bindung eines anti-CEA

Antikörpers an das zellassoziierte Antigen, obwohl der Antikörper zuvor mit einem

20 molaren Überschuß an Serum-CEA inkubiert worden war. Dieses Phänomen kann

durch einen Unterschied in der Konformation zwischen zellgebundenem und

zirkulierendem CEA erklärt werden. Behr fand jedoch in einer klinischen Studie, daß

Patienten mit kolorektalen Karzinomen eine raschere Serum- und Ganzkörper-Clearance

für anti-CEA Antikörper haben [18]. Er sieht darin den Beweis für die Komplexreaktion

von anti-CEA Antikörpern mit zirkulierendem CEA.

In einer 1989 erschienenen Multizenter-Studie wurde das Bindungsverhalten von

52 gegen das CEA gerichteten Antikörpern beschrieben. Durch Untersuchung der Kon-

kordanz und Diskordanz der Inhibitionsmuster zwischen den monoklonalen Antikörpern

wurden 5 nicht interaktive Epitopgruppen klassifiziert [75]. Die Einteilung dieser Haupt-

gruppen erfolgt nach Gold 1 bis 5 [80]. Monoklonale Antikörper, die an den

Epitopgruppen Gold 1 bis 3 binden , hatten den höchsten Grad an CEA-Spezifität. Keine

Korrelation konnte zwischen der Antikörperspezifität und der Affinität gegenüber CEA

nachgewiesen werden [114].

Das CEA entpuppte sich als ein sehr komplexes Antigen System [147]. 1992 gelang die

DNA-Entschlüsselung des Carcinoembryonalen Antigens [13,81]. CEA ist Mitglied der

Immunoglobulin-Gen-Superfamilie [151]. Es besitzt eine variable Domänen-ähnliche

Region mit 108 Aminosäuren und drei Sets konstanter Domänen-ähnlicher Regionen

durch die Kombination von jeweils 92 bzw. 86 Aminosäuresequenzen [80]. Durch die

genetische Aufschlüsselung, aber auch über die immunochemische Definition mittels

Antikörper sind inzwischen 13 Makromoleküle bekannt, die strukturell und

immunologisch dem CEA ähnlich sind [75]. Sie werden in drei Untergruppen

differenziert [151]. Die Gruppe 1 beinhaltet das CEA, das NCA (non crossreactive

antigen) und das BGP1 (biliäres Glycoprotein 1). Das NCA findet man in der normalen

Lunge, Milz und Granulozyten, während das BCP1 in Epithelzellen der Gallengänge und

in der normalen Leber lokalisiert ist [80]. Alle drei Moleküle sind Zelloberflächen-

Glykoproteine. Der Gruppe 2 wird das PSßG (pregnancy spezific ß glycoprotein) und

das FL/NCA (fetal liver/non crossreactiv antigen) zugeordnet. Die dritte Untergruppe

besteht aus Makromolekülen, die durch das Genom Clone hs CGM-2 repräsentiert

werden. Die CEA-Expression zeigte sich bei der Clonung von verschiedenen Tumor-

Einleitung 8

populationen in vitro als stabil. Daraus schließt man auf eine Kontrolle durch mehr als ein

einzelnes Gen [128]. Es gibt eine transkriptionale Kontrolle, wobei die Menge an

CEA-mRNA nicht mit der CEA Produktion korreliert [144]. Eine Erhöhung der

CEA-Expression konnte durch Interferone und Analoga des cyclischen AMP, aber auch

indirekt durch Theophyllin erreicht werden [70]. Bei der Steigerung der CEA-Expression

in vitro durch Interferon Typ 1 und Typ 2 sah man eine selektive Erhöhung der

CEA-Expression maligner Zellen [69].

Die Frage nach der physiologische Funktion des CEA ist heute noch weitgehend

unbeantwortet. Es ist als Bestandteil des Muzins charakterisiert. Die visköse Sekretion

von Muzin hat biologisch die Hauptaufgabe der Lubrifikation und Protektion. Bei der

Tumortransformation erfährt diese Aufgabe einen wichtigen Wechsel [89]. Durch

Kultivierung von menschlichen Kolonkarzinomzellen konnte in vitro die Funktion des

CEA als intrazelluläres Adhäsionsmolekül und Regulator der Aggregation definiert

werden. Die Rolle des CEA als Adhäsionsmolekül im fetalen Kolon und die Rolle im

kolorektalen Karzinom des Adulten ist jedoch unklar [144].

Einleitung 9

1.3. Anreicherung der Antikörper im Tumorgewebe

Über eine erste radioaktive Markierung von Antikörpern berichteten 1948 Pressman

et al. [121]. 1953 gelang ihnen der Nachweis von Osteosarkomen im Tierversuch mittels

radioaktiv markierter Antikörper [122]. Mach beschrieb 1980 die spezifische Bindung

eines anti-CEA Antikörpers in einem kolorektalen Tumor [104] und eine 2-4 fach

höhere Antikörperaufnahme im Tumor als im normalen Gewebe [105]. Colcher

veröffentlichte 1987, daß radioaktiv markierte monoklonale Antikörper für die

Diagnostik und potentiell auch für die Therapie von kolorektalen Karzinomen eingesetzt

werden können [38].

Nach parenteraler Applikation monoklonaler spezifischer Antikörper, die gegen das CEA

gerichtet sind und mit verschiedenen radioaktiven Isotopen markiert werden, läßt sich

szintigraphisch die Antikörperverteilung bei Patienten mit kolorektalem Karzinom dar-

stellen. Diese als Radioimmunszintigraphie beschriebene Methode beruht auf der

„spezifischen Bindung“ des radioaktiv markierten Antikörpers an seinem Zielantigen-

epitop.

Der Tumornachweis hängt von der absoluten Höhe der Radioaktivitätskonzentration im

Tumor bzw. dem Verhältnis zwischen Tumor und normalen Gewebe ab. Die An-

reicherung des Antikörpers im Tumor wird in der Literatur mit 0,001-0,01 % der

injizierten Antikörperdosis pro Gramm Tumor angegeben [27,66,131].

Neben der immunologischen Spezifität des eingesetzten Antikörpers für das Zielantigen

spielt der Transport bis zum Zielantigen eine wichtige Rolle. Das Verständnis über die

physiologischen Barrieren der Antikörperakkumulation im Tumor ist limitiert. Die Para-

meter, die die Aufnahme von radioaktiv markierten monoklonalen Antikörpern in einen

Tumor beeinflussen, sind vielseitig und in der Tabelle 1 zusammengefaßt.

Einleitung 10

Tabelle 1:

Parameter, die die Aufnahme und Lokalisation monoklonaler radioaktiv markierter Anti-körper in einen Tumor beeinflussen ( nach Schlom [134] )

1. Anzahl der Antigenmoleküle an der Zelloberfläche

2. Anzahl der Zellen mit Expression des Antigens

3. Tumormasse

4. Verhalten des Antigen/Antikörper-Komplexes

a. Stabilität an der Zelloberflächeb. Aufnahmec. Cappingd. Shedding

5. Grad der Vaskularisation des Tumors

6. Nekroseausmaß des Tumors

7. Präsenz und Reaktivität des zirkulierenden Antigens im Blut

8. Dauer der Antikörperbindung an der Zelloberfläche

9. Isotyp des Immunglobulins (IgG Untergruppe oder IgM)

10. Art des Immunglobulins (murin, human, rekombiniert/chimeric)

11. Vollständiges Immunglobulin oder Fragmente (Fab, Fab’, F(ab’)2)

12. Clearance des Antikörpers aus dem Blut (Antikörper Metabolismus) durch

a. Ausscheidungb. Mononukleär-Phagozytäres Systemc. Gabe eines zweiten Antikörpers

13. Dosis des injizierten Antikörpers

14. Art der Antikörperapplikation (i.v., i.p., intralymphal, intraarteriell)

15. Entwicklung einer Immunantwort gegenüber dem Antikörper

16. Eignung des Antikörpers für eine Markierung mit einem Radionuklid

17. Spezifische Aktivität des markierten Antikörpers

18. Affinität des markierten Antikörpers

19. Tiefe des Tumors von der Körperoberfläche (für die Tumorlokalisation)

20. Zeitdauer bis zum Scanning (für die Tumorlokalisation)

21. Wahl des Radionuklides

22. Methode der Markierung des Antikörpers mit einem Radionuklid

a. Metabolismus des Antikörper-Radionuklid-Komplexesb. Katabolismus des Antikörper-Radionuklides

23. Dosis-Fraktionierung des applizierten Antikörpers

Einleitung 11

Parenteral applizierte Moleküle, die über die Gewebedurchblutung die Tumorzellen

erreichen sollen, nehmen den Weg über das Gefäßsystem, Transport durch die Gefäß-

wand und Transport durch den interstitiellen Raum. Dabei verhalten sich Antikörper

nicht anders als klassische Medikamente oder Hormone und unterliegen den gleichen

physiologischen Barrieren [132,136].

Die Penetration eines intakten Immunglobulins der Subklasse G mit einem Molekular-

gewicht von ungefähr 140 kDa verläuft jedoch langsamer als die eines Medikamentes

mit einem Molekulargewicht von einigen hundert Dalton oder eines Hormones von

einigen tausend Dalton [148]. Selbst Immunglobulinfragmente mit ungefähr 50 kDa

verhalten sich grundlegend anders [132].

Um die komplexen Vorgänge der intratumoralen Aufnahme und Verteilung von mono-

klonalen Antikörpern zu beurteilen, sind viele Modelle entwickelt worden [44]. Neben

rein theoretisch mathematischen Modellen gibt es Untersuchungen an multizellulären

Tumorsphäroiden und transplantierten menschlichen Tumorzellreihen bei athymischen

Mäusen [84].

So konnte Ahlström zeigten, daß sich ein anti-CEA Antikörper bei einem

Xenograft-Modell heterogen verteilt, obwohl die CEA-Expression der Tumorzellen

homogen war [2]. Als Erklärung führte er die nicht einheitliche Blutflußverteilung im

Tumor an.

Die Tumorvaskularisation unterscheidet sich vollständig von der Situation im Normal-

geweben. Neben Gefäßrekrutierungen aus dem präexistenten Gefäßnetz kommt es zur

Angioneogenese als Antwort auf die Tumorzellen [87]. Rein makroskopisch kann man

eine gut vaskularisierte periphere und eine zentrale Region mit schlechter Vaskularisation

differenzieren [85]. Mikroskopisch ist die Vaskularisierung des Tumors höchst heterogen

und nicht vergleichbar mit dem Standard der vaskulären Organisation. Die Hauptunter-

schiede liegen in einer sackförmigen gewundenen Dilatation der Blutgefäße. Das

Endothel der Gefäßwände kann Tumorzellen beinhalten. Es gibt keine fixierte Route

zwischen Arterien und Venen. Aufgrund dieser Eigentümlichkeiten variiert die

Organisation der Gefäße innerhalb des Tumors, aber auch zwischen Primärtumor und

Metastasen [85].

Der Blutfluß in nekrotischen und semi-nekrotischen Arealen des Tumors ist gering.

Durch das Tumorwachstum kommt es zur Zunahme der interkapillären Distanzen mit

Einleitung 12

Reduktion des transvaskulären Austausches von Molekülen. Dies führt trotz einer Ver-

längerung der Zeit für die Diffusion zusammen mit der Verringerung der durch-

schnittlichen Perfusion zur verminderten Antikörperaufnahme. Dieser Effekt verstärkt die

sehr heterogene räumliche Antikörperverteilung [85].

Für viele Autoren stellt die Permeabilität der Tumorgefäßwand eine signifikante Barriere

dar, die die Antikörper passieren müssen [132]. Die Extravasation geschieht über

Diffusion, Konvektion und Transzytose, einem spezifischen aktiven Transport-

mechanismus [85]. Die Diffusion ist dabei abhängig von der Gefäßoberfläche und dem

Konzentrationsgradienten zwischen Plasma und interstitiellem Raum. Die Konvektion

geschieht in Abhängigkeit von der Flußrate durch die Leckagen der Gefäßwand. Sie ist

proportional zu Gefäßoberfläche und der Differenz aus hydrostatischem Druck im Blut-

gefäß und intrazellulärem Raum minus der Differenz des onkotischen Druck zwischen

Gefäß und intrazellulärem Raum. Bei der Betrachtung der Ultrastrukturen der

Gefäßwände fallen weite Zellverbindungen im Endothel auf, eine große Anzahl von

Fensterungen, viele transendotheliale Kanäle und eine diskontinuierliche oder fehlende

Basalmembran. Trotz dieser hohen vaskulären Permeabiltät kommt es nur zur geringen

Extravasation [85].

Tumore haben einen signifikant höheren interstitiellen Druck als normales Gewebe [88].

Dies ist durch die Proliferation des Tumors in einem definierten Raum und durch die

Abwesenheit von funktionierenden Lymphgefäßen zu erklären [48]. Hieraus resultiert die

Abnahme der Extravasation von Makromolekülen. Der Anstieg des interstitiellen

Druckes korreliert mit der Reduktion des Tumorblutflusses und der Entwicklung von

Nekrosen in einem wachsenden Tumor [88]. Untersuchungen über den intratumoralen

Druckgradienten zeigen, daß der interstitielle Druck im Zentrum des Tumors am

höchsten ist und daß er in der Peripherie normale physiologische Werte erreicht [85].

Jeder maligne Tumor hat einen hohen Anteil an neoplastischen Zellen, die aktiv

proliferieren. Es entstehen dabei auch verschiedene Stadien der Zelldegeneration und

Zelluntergänge. Hieraus resultiert eine weitere Zunahme der Gefäßpermeabilität [46] und

eine unspezifische Antikörperaufnahme in nekrotischen Tumorarealen [49].

Jain geht in seinem mathematischen Modell für den Transport von Makromolekülen von

einer heterogenen Tumorperfusion, einer behinderten Diffusion in den intrazellulären

Raum, einer extravaskuläre Bindung von monoklonalen Antikörpern und einem erhöhten

Einleitung 13

interstitiellen Druck aus. Resultierend ergibt sich eine geringe Penetration von Anti-

körpern in den Tumor [86]. Van Osdol konnte in seinem Modell für die Antikörper-

verteilung bei einer Reduktion der Antikörperkonzentration eine Zunahme der Uni-

formität der Antikörperpenetration zeigen, gleichzeitig jedoch eine Verringerung der

durchschnittlichen Antikörperkonzentration im Tumor [145]. In einer Modellanalyse

konnten Fujimori und Weinstein eine Antigen/Antikörper-Bindung beschreiben, die eine

weitere Verteilung des Antikörpers im Tumor verzögerte. Durch eine zu hohe

Antikörperaffinität wurde die Antikörperpenetration erniedrigt. Mittels ansteigender

Antikörperdosen erzielten sie eine bessere Penetration und gleichmäßigere Verteilung.

Ihre Beobachtung fand als „binding site barrier“ Eingang in die Literatur. Sie wurde

definiert als Verzögerung des Antikörpertransportes im Tumor durch Bindung an ein

Oberflächenantigen in der Nähe des Austrittsortes aus dem zuführenden Blutgefäß [54].

Diese Vorstellungen bestätigten sie auch an einem Tumormodell [55]. Baxter und Jain

konnten die Hypothese der „binding site barrier“ an einem mikroskopischen Modell

erhärten [9]. Eine signifikante Abnahme der Anzahl frei diffundierender Moleküle, die

tiefer in den Tumor eindringen können, wurde als Folge der Bindung an peripher

lokalisierte Zellen beschrieben [96]. Auch Juweid kam zu diesem Ergebnis. Er folgerte

daraus, daß bei größerer Antigendichte, höherer Antikörperaffinität sowie geringerer

Antikörperinternalisation und Verstoffwechselung durch die Tumorzelle der Effekt der

„binding site barrier“ zunimmt [91]. Nach Baxter und Jain ist die optimale Antigen-

affinität die höchstmögliche, die zur geringsten Limitation des mikroskopischen

Transportes führt [10].

Bei der Analyse dieser Studien muß auch die Möglichkeit diskutiert werden, daß die un-

einheitliche Verteilung des Antikörpers nur die Antigenverteilung reflektiert, d.h. die

Antigenverteilung muß vergleichend mituntersucht werden. Die Rolle der physiolo-

gischen Barrieren für die Durchdringung eines Tumors kann durch vergleichende Studien

mit ähnlichen oder gleichen nichtbindenden, d.h. unspezifischen Antikörpern überprüft

werden. Dabei kann das Problem der immunhistochemischen Technik, daß nichtbindende

Antikörper dem Nachweis entgehen, durch den Gebrauch der Autoradiographie um-

gangen werden [91]. Carlsson konnte an einen Tumormodell zeigen, daß der

monoklonale anti-CEA Antikörper 38S1 homogen den Kugelzellhaufen HT-29 eines

menschlichen Kolonkarzinoms penetriert, aber aufgrund einer heterogenen

Einleitung 14

CEA-Antigenverteilung heterogen bindet [33]. Diese Studie steht in Widerspruch zu den

meisten anderen Studie, die eine Penetrations-Barriere als Erklärung für die heterogene

Antikörperverteilung postulieren. In einem Xenograft-Modell zeigte Moshakis, daß die

Antikörperverteilung in vivo nicht mit der Antigenexpression vergleichbar ist [110].

Für Beatty erfolgt die größtmögliche Aufnahme von markiertem Antikörper, wenn der

Tumor einen hohen Gehalt an Antigen hat, das an der Zelloberfläche vorliegt und wenn

der Antikörper das Antigen gut erreicht. Dies ist möglich, wenn der Tumor klein ist und

eine günstiges Verhältnis zwischen der Vaskularisation und der Tumormasse vorliegt, die

Blutgefäße hochdurchlässig für den markierten Antikörper sind und der Blutfluß aus-

reichend schnell ist [11].

An unterschiedlich differenzierten multizellulären Tumorsphäroiden konnte Sutherland

die unterschiedliche Bindung von monoklonalen Antikörpern und deren Fragmenten in

Abhängigkeit von der differenten CEA-Expression darstellen. Diese war sehr heterogen

und oft assoziert mit differenzierten drüsigen Strukturen [142].

Für Pedley ist der Transfer des Antikörpers vom Blut über die Extravasation zur end-

gültigen Bindung eher von physiologischen Faktoren, die die Extravasation beeinflussen,

als von der Verteilung des Antigens im Gewebe abhängig [118]. Jain errechnete eine

Zeitdauer von ungefähr 10 Stunden für einen intakten monoklonalen Antikörper, um im

Tumorinterstitium die Strecke von 100 µm zu diffundieren [85]. Auch für Pervez liegt

das Hauptproblem monoklonaler Antikörper in der Erreichbarkeit des Antigens.

Naturgemäß sind Tumormodelle zwar geeignet, grundlegende Zusammenhänge

systematisch zu untersuchen. Sie weisen jedoch prinzipielle Schwachpunkte auf, die die

Übertragbarkeit der durch sie gewonnen Ergebnisse einschränken [16,17]. Die klinische

Realität sind keine homogenen Tumormassen, sondern multiple Tumorknoten mit jeweils

verschiedenen Anteilen an Nekrosen, Seminekrosen und vitalem Tumorgewebe mit

Übergangszonen [86]. Die Zellen in einem Tumor sind sehr heterogen in ihrer Funktion,

Differenzierung, Grad der Malignität und Antigenexpression [66].

Bei den Sphäroid-Modellen werden viele pharmakologische Reaktionen der Antikörper

ignoriert. Die Verteilung im intravasalen Raum bei parenteraler Applikation, die Rolle

der Plasmabindung, der Transport im Gefäßsystem zum Zielgewebe, der Effekt des inter-

stitiellen Flußes und das Potential des Metabolismus bleiben unberücksichtigt [21]. Auch

die Ergebnisse der Xenograft-Modelle sind kritisch zu werten. Sands sieht die Limitation

Einleitung 15

der Xenograft-Modelle darin, daß die Tumorwachstumsrate für die meisten Xenografts

größer ist als die klinische Tumorwachstumsrate [132]. Das Tumorgewebe wird dadurch

in Relation zum Wirtsorganismus (z.B. Maus) wesentlich größer als beim Menschen.

Dadurch entsteht bezogen auf das Körpergewicht eine 1000-fach größere Antikörpe-

aufnahme bei der Maus als beim Menschen [150]. Das Fehlen der Immunkompetenz der

athymischen Mäuse erzeugt neben dieser Wachstumszunahme auch eine Veränderung in

der Tumorphysiologie, die mit dem natürlich entstandenen primären Tumor oder einer

Metastase nicht vergleichbar ist [132].

Neben dieser Immunsuppression im Gasttier spielt die veränderte Vaskularisation auch

eine wichtige Rolle. Die Durchblutung des Xenograft wird durch eine murine

Vaskularisation aufrecht gehalten [131]. Ein weiterer Nachteil ist der immunologische

Unterschied durch die Anwendung eines murinen Antikörpers in einem

Maus-Xenograft-Modell und die wesentlich höhere applizierte Antikörperdosis im Ver-

gleich zum klinischen Einsatz [131].

Bei einer Studie von Lewis sah man, daß Subpopulation der Zellen eines primären

Tumors in Xenografts zum Teil weniger CEA produzierten als der primäre Tumor,

obgleich sie sich histologisch nicht unterschieden [102].

Trotz dieser Schwachpunkte kann man unter Extrapolation der Ergebnisse von Tumor-

modellen Rückschlüsse für den klinischen Einsatz ziehen [132]. Die Geschichte der

Xenograft-Modelle zeigt ihre Wichtigkeit für das Studium von Antikörpern gegen

tumorassoziierte Antigene [22].

Einleitung 16

1.4. Radioimmunszintigraphie bei kolorekaten Karzinomen

Das gewebeständige Carcinoembryonale Antigen benutzt man heute indirekt zur bild-

gebenden Diagnostik des kolorektalen Karzinoms. Dabei wird das CEA als Zielantigen

durch Bindung radioaktiv markierter Antikörper in vivo szintigraphisch lokalisiert.

Während der klinischen Erprobung wurde die Radioimmunszintigraphie sehr unter-

schiedlich beurteilt. So verzeichnet Abdel-Nabi „enttäuschende Ergebnisse“ durch die

Markierung von nicht tumorösem Gewebe in 10-13 % der Fälle [1]. Andere Autoren

berichten dagegen über eine Sensitivität von 70-90 % für die Diagnostik abdomineller

Rezidive von kolorektalen Karzinomen [8,57,78,97]. Die Empfehlungen über den

klinischen Einsatz der Radioimmunszintigraphie reichen von „Routineuntersuchung“ über

„Zusatzmethode bei negativer konventioneller Diagnostik“ bis hin zu „Spezial-

untersuchung bei besonderer Indikation“ [29,65,108].

In einer klinischen Multizenter-Studie zur Diagnostik vermuteter Lokalrezidive kolo-

rektaler Karzinome wurde die Radioimmunszintigraphie mit der konventionellen

Diagnostik verglichen [31]. Dabei wurde die Sensitivität der Radioimmunszintigraphie

mit 89% nur von der Magnetresonanztomographie mit 93% übertroffen.

Der im deutschsprachigen Raum am häufigsten eingesetzte Antikörper gegen das

Carcinoembryonale Antigen ist der Antikörper BW431/26 [14,15,20,103]. Dieser

Antikörper ist ein intakter muriner monoklonaler Antikörper der Subklasse IgG1 und

besitzt eine hohe Affinität für ein spezifisches Proteinepitop der Klasse III des Carcino-

embryonalen Antigens [14].

In der klinischen Anwendung konnte die Eignung des Präparates zur anti-CEA Radio-

immunszintigraphie für die Differentialdiagnostik von Lokalrezidiven bei Patienten mit

kolorektalen Karzinomen gezeigt werden. Die Sensitivität der Methode wird mit

70-100 % angegeben [14,53,72,99,120,140].

1995 wurde eine europäische Multizenterstudie veröffentlicht, die 730 Patienten ein-

schloß, die mit diesem Antikörper untersucht wurden [140]. Dabei wurden Rezidive

eines kolorektalen Karzinom mit einer Sensitivität von 90 % diagnostiziert. Auffallend

war die Tatsache, daß das histologische Grading keinen Einfluß auf das Resultat der

Radioimmunszintigraphie hatte, ebensowenig die Serum-CEA Konzentration. Dies

Einleitung 17

entspricht Ergebnissen früherer Untersuchungen über die Akkumulation von BW431/26

in Operationspräparaten kolorektaler Karzinome [5]. Hierbei fiel auch auf, daß in

Nekrosen unabhängig von der Anwesenheit des Zielantigens eine hohe Radioaktivitäts-

konzentration gemessen wurde, so daß eine spezifische Akkumulation im nekrotischen

Gewebe auszuschließen ist. Als Erklärung kann die passive Extravasation durch eine

erhöhte vaskuläre Permeabilität dienen. Unter Annahme einer gleichzeitig verzögerten

Antikörperdrainage im Nekrosegebiet resultiert eine Antikörperakkumulation ohne

spezifische Bindung.

Positive Ergebnisse erreicht die Radioimmunszintigraphie in der Rezidivdiagnostik mit

einer klinisch akzeptablen Sensitivität erst ab einer Tumorgröße von 2 cm [6]. Dies

dürfte vorwiegend auf meßtechnische Limitationen der Szintigraphie zurückzuführen

sein [5], da andererseits die Tumorantikörperaufnahme als Funktion der Tumormasse mit

inverser Korrelation beschrieben wurde. Bei kleineren Tumoren wäre daher eine

besonders hohe Speicherung zu erwarten [150].

Für einen erfolgreichen Tumornachweis müssen drei Voraussetzungen erfüllt sein [7]:

Erstens eine stabile Markierung des Antikörpers, um aus der Radioaktivitätsverteilung

auf die Verteilung des Antikörpers zu schließen. Zweitens muß der Antikörper selektiv

an sein Zielantigen binden, um aus der Anreicherung des Antikörpers im Gewebe auf die

Präsenz des Zielantigens schließen zu können. Drittens ist die Tumorspezifität des Ziel-

antigens erforderlich, um aus der Bindung des Antikörpers den gesuchten Tumor zu

diagnostizieren.

Satoh sieht das Hauptproblem der Radioimmunszintigraphie mit monoklonalen Anti-

körpern in der geringen Anreicherung des injizierten Antikörpers im Tumor [133].

Hieraus resultiert ein geringes Radioaktivitätsverhältnis zwischen Tumor und dem

gesunden Gewebe. Dieses Problem verhindere die Entdeckung kleiner Tumoren.

Dippold konnte zeigen, daß sich von 2 mg injizierter Antikörpermenge nur 0,01-0,03 %

in einem Gramm Tumorgewebe anreichern [42]. Ähnliche Ergebnisse wurden auch von

anderen Arbeitsgruppen mitgeteilt [7].

Bezüglich des Beitrages zur Verbesserung der Radikalität bei der Resektion von kolo-

rektalen Karzinomen konnten durch eine intraoperativen Radioimmunszintimetrie

Lymphknotenmetastasen mit einer Sensitivität von 100 % und einer Spezifität von 57 %

nachgewiesen werden [50].

Einleitung 18

Trotz dieser klinischen Erfolge scheinen die Aussagen über Indikationen und

diagnostischen Gewinn der Radioimmunszintigraphie bisher uneinheitlich [7]. So sieht

Hach den hohen technischen und zeitlichen Aufwand einer Radioimmunszintigraphie nur

bei bestehendem Rezidivverdacht in der Tumornachsorge nach unergiebiger kon-

ventioneller Tumordiagnostik gerechtfertigt [72], während Goldenberg ein weites

Spektrum potentieller Indikationen vorschlägt (Tabelle 2).

Tabelle 2:

Potentielle Indikationen für die Radioimmunszintigraphie nach Goldenberg [66]

z Präoperatives Staging

z Postoperative Therapiekontrolle

z Bestätigung des Tumorverdachts bei konventioneller Diagnostik

z Rezidivdiagnostik bei ansteigendem Tumormarker im Blut

z Bestätigung der Antikörperbindung vor einer Immuntherapie

Einleitung 19

1.5. Einsatz von Antikörper bei der Tumortherapie

Neben dem diagnostischen Einsatz der monoklonalen Antikörper war es immer auch ein

Bestreben, die spezifische Bindung der Antikörper an ihrem Zielantigen für die Tumor-

therapie zu benutzen [61]. Dazu können monoklonale Antikörper in vielfältiger Form

und Zielsetzung eingesetzt werden.

Eine Wirkung unkonjugierter („nackter“) Antikörper ist über verschiedene Mechanismen

möglich. Durch direkte Aktivierung von Komponenten oder Effektorzellen des Immun-

systems können sie zytotoxisch wirken. Daneben spielen Antikörper gegen Rezeptoren

der Wachstumsfaktoren durch Beeinflussung der Zellproliferation und -differenzierung

eine Rolle [66].

Unter dem Schlagwort der Immunisierung eines Patienten gegen seinen Tumor versteht

man den versuchsweisen Einsatz von anti-Idiotyp Antikörpern, die an der antigenen

Determinate eines Antikörpers binden. Dadurch kommt es über ein Mimikry des

eigentlichen Zielantigens zur Immunisierung des Patienten, zum Beispiel gegen ein

tumorassoziiertes Antigen [66].

Auch der subtilere Einsatz von Chemotherapeutika bei der Tumortherapie mit Hilfe von

monoklonalen Antikörpern wird erforscht. Jedoch ist der Einsatz von Antikörpern, die

mit Chemotherapeutika oder Zytotoxinen konjugiert sind, limitiert. Nicht jede Tumor-

zelle wird erreicht und kann das Konjugat aufnehmen. Die zum Teil durch das Konjugat

bedingte noch stärker reduzierte Antikörperaufnahme, die fehlende Selektivität und die

Toxizität für die normalen Zellen schränken die Dosis der Therapeutika ein [74].

Eine weitere mögliche Form der Tumortherapie stellt die Radioimmuntherapie dar.

Hierbei werden monoklonale Antikörper mit Radionukliden konjugiert, so daß Tumor-

zellen über die radioaktive Strahlung zerstört werden [32]. Dieser Therapieansatz wird

durch die Heterogenität der Antikörperbindung, durch die physikalischen Eigenschaften

des Antikörpers und durch die histologischen Eigenschaften des Tumors unkalkulierbar

und stellt ein Risiko für das gesunde Gewebe dar [118].

Insgesamt finden diese neuen Formen der Tumortherapie ihre Limitation in einer zu

geringen Antikörperaufnahme im Tumor [74]. Neben der Spezifität des Antikörpers für

das Zielantigen spielen die Barrieren, die der Antiköper bei seinem Transport überwinden

muß, eine entscheidende Rolle [66].

Einleitung 20

1.6. Autoradiographie mikroskopischer Präparate

Bei einer Autoradiographie von mikroskopischen Objekten wird eine Photoemulsion

einige Zeit in unmittelbarer Nähe zu einem radioaktiven Präparat exponiert. Durch

energiereiche radioaktive Strahlung werden die in der Photoemulsion dicht gepackten

Silberbromidkristalle in einen entwickelbaren Zustand versetzt [73]. Nach der photo-

graphischen Entwicklung der Emulsion entsteht ein Schwärzungsbild, das sogenannte

Autoradiogramm [51]. Dabei korreliert die Anzahl der entstandenen Silberkörner mit

der Expositionszeit und stellt das Produkt aus Aktivität und Exposition dar. Die Auto-

radiographie ist eine photographische Methode zur Darstellung der räumlichen

Verteilung von Radioisotopen im Gewebe [73]. Besonders bei der Untersuchung von

Tumorantigenen und der Interaktionen eines Antikörpers mit dem Tumor und normalen

Gewebe ist die Methode der Autoradiographie hilfreich. Im Gegensatz zur

Immunhistochemie ist die spezifische Bindung sensibler darstellbar [39].

Für die erfolgreiche Anwendung der Autoradiographie müssen einige grundsätzliche

Voraussetzungen erfüllt sein [141]. Die Strahlungsreichweite des radioaktiven Isotopes

und der Typ der Photoemulsion müssen der erwarteten strukturellen Auflösung angepaßt

sein. Die zu untersuchende Präparation muß eine hohe spezifische Aktivität besitzen. Der

Antikörper muß mit dem Radioisotop chemisch stabil verbunden sein. Zum Zeitpunkt der

Applikation sollte der markierte Antikörper radiochemisch rein sein. Bei der Lokalisation

von diffusiblen Substanzen muß eine Translokation während der Herstellung des Auto-

radiogrammes vermieden werden. Es kann sowohl bei der Präparation des Gewebes als

auch der Autoradiogramme zur Translokation der radioaktiven Markierung kommen.

Adäquate Techniken für die Autoradiographie diffusibler Stoffe sind entwickelt und

entsprechende Standards aufgestellt worden [126,130].

Für die Autoradiographie von mikroskopischen Objekten gibt es mehrere

Methoden [51]. Dabei wird eine Schwärzung im Autoradiogramm dem Ausgangsort der

Strahlung im Präparat zugeordnet. Bei der Kontaktmethode (apposition-technique)

kommt es nach der gemeinsamen Exposition zur Trennung von Objekt und photo-

graphischer Schicht. Dieses Verfahren erschwert die erwünschte Zuordnung. Daneben

gibt es Techniken mit ständigem Kontakt des Präparates und der Filmschicht.

Einleitung 21

Beim Strippingfilm-Verfahren (mounting-technique) wird eine fertige Filmfolie in einem

Wasserbad auf das Präparat aufgebracht. Dieses Verfahren ist durch die Verarbeitung

und das Aufbringen der Filmschicht in Lichtabwesenheit sehr schwierig. Beim Gebrauch

von Photoemulsionen unterscheidet man die Coating-Technik von der Dipping-Technik.

Bei der ersteren wird eine schlecht definierbare und ungleichmäßige Filmschicht auf den

Präparaten durch Auftropfen und Verstreichen erreicht. Bei der Dipping-Technik werden

die Objektträger in die Photoemulsion getaucht und langsam herausgezogen.

Durch anschließende lotrechte Lagerung entsteht eine relativ homogene, gut haftende

dünne Photoschicht auf den Präparaten. Abhängig von der Verdünnung der Photo-

emulsion wird eine 1-2 µm Schichtdicke erreicht, die in ihrer Dicke und Qualität

reproduzierbar ist.

Die Auswahl der kommerziell angebotenen Photoemulsion für die Autoradiographie

richtet sich nach der Radioaktivität des Radionuklides, Energie der emittierten Teilchen

und der erforderlichen Auflösung [51,83].

Zielsetzung 22

2. Zielsetzung

In der vorgelegten Arbeit soll geprüft werden, ob die Verteilung eines applizierten Anti-

körpers der Verteilung des Zielantigens im Sinne einer spezifischen Bindung entspricht.

Den hier untersuchten Patienten mit einem kolorektalen Karzinom wurde präoperativ ein

anti-CEA Antikörper intravenös injiziert. Über die exakte Analyse der Operations-

präparate hinsichtlich der Verteilung des Carcinoembryonalen Antigens und des

Antikörpers sowie durch Vergleich beider Verteilungsmuster soll die Spezifität des

applizierten Antikörpers untersucht werden.

Daneben soll die Arbeit Aussagen über den Umfang unspezifischer Phänomene der Anti-

körperanreicherung liefern, aber auch Erkenntnisse über die Faktoren, die die

Antikörperverteilung im Tumor modulieren.

Anhand der Ergebnisse sollen Forschungsansätze zur Verbesserung der Antikörper-

aufnahme bei der klinischen Anwendung der Radioimmunszintigraphie und Radioimmun-

therapie entwickelt werden.

Materialien und Methoden 23

3. Materialien und Methoden

3.1. Antikörper

3.1.1. anti-CEA Antikörper BW 431/26

Der Antikörper BW431/26 ist durch Bosslet et al. entwickelt worden [23]. Der

ursprüngliche Vertrieb über die Behringwerke Marburg ist inzwischen von der Firma CIS

übernommen worden. Derzeit ist dieser Antikörper unter dem Handelsnamen

„Scintimun CEA“ kommerziell erhältlich.

Der Antikörper ist ein intakter muriner monoklonaler Antikörper der Subklasse IgG1 mit

einer Molekularmasse von 150.000 Dalton [75]. Er besitzt eine hohe Affinität

(Ka = 1010 l/mol) für ein spezifisches Proteinepitop der Klasse III des membranständigen

Carcinoembryonalen Antigens [14,146]. BW431/26 bindet nicht an periphere Blutzellen,

Knochenmarkszellen oder anderes menschliches Gewebe [14]. Ebensowenig wird die

Antikörper/Antigen Reaktion durch erhöhte Serum-CEA Werte gestört [24]. Die Blut-

clearance für den injizierten Antikörper BW431/26 wird mit einer Halbwertzeit von

38.2 Stunden angegeben [74]. Trotz der genauen Kenntnisse über das CEA incl. der

N-verbundenen Kohlenhydratkette und der N-terminalen Aminosäuresequenz durch

Sequenzaufschlüsselung der cDNA ist die genaue Struktur der Epitope, die durch den

monoklonale Antikörper definiert werden, unklar.

Wegen der kommerziellen Verfügbarkeit und seiner einfachen Markierung mit

Technetium 99-m ist der Antikörper BW431/26 im deutschsprachigen Raum der am

häufigsten zur Radioimmunszintigraphie verwendeter Antikörper [14]. Im Rahmen der

klinischen Forschung zur Radioimmunszintigraphie wurde der Antikörper BW431/26

auch in mehreren Studien an der RWTH Aachen untersucht [5,6,7,8,50,140].

Der zur anti-CEA Autoradiographie verwendete Antikörper wurde von der Arbeits-

gruppe Nuklearchemie und Radiopharmazie der Klinik für Nuklearmedizin an der Uni-

versitätsklinik Essen mit 125I mittels der Chloramine-T Technik markiert [51,82,106]. Die

Chloramine-T Technik ist eine Iodierungsmethode, bei der nur geringe bzw. nicht


nachweisbare Veränderungen im biologischen Verhalten der Immunglobulin-Moleküle

auftreten [27].

Die so hergestellte Lösung hatte eine Antikörperkonzentration von 40 µg/ml und eine

spezifische Radioaktivität von 53,8 KBq/µg. Für die Inkubation der Gewebeschnitte

wurde die Antikörperlösung mit Phosphatpuffer, der 1% BSA enthielt, auf eine Kon-

zentration von 20 µg/ml verdünnt.

3.1.2. anti-Maus Antikörper

Zum Nachweis des präoperativ injizierten murinen Antikörpers BW431/26 wurde ein

kommerziell erhältliches intaktes anti-Maus Immunglobulin vom Schaf, Code IM.131 der

Firma Amersham international verwendet. Die Markierung mit 125I war hier ebenfalls

nach der Chloramine-T Methode erfolgt, zusätzlich war eine Reinigung durch Gel-

filtration vorgenommen worden. Das Molekulargewicht des Antikörpers betrug

150.000 Dalton. Die spezifische Radioaktivität für den Versuchsansatz zur Ermittlung

der idealen Inkubationskonzentration betrug 590 KBq/µg bei einer Konzentration von

6.27 µg/ml [4]. Durch Verdünnung mit Phoshatpuffer und 1% BSA erhielten wir

5 verschiedene Konzentrationsansätze von 6.27 µg/ml in Zehnerpotenzen bis zu

627 pg/ml.

Zur definitiven Inkubation der Gewebeschnitte benutzten wir einen Antikörperansatz mit

der spezifischen Radioaktivität von 703 KBq/µg und einer Konzentration von

5,52 µg/ml. Durch weitere Verdünnung mit Phosphatpuffer und 1% BSA ergab sich eine

Antikörperkonzentration von 2,76 µg/ml, mit der wir die Präparate inkubierten.

3.1.3. Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS)

Der Ansatz für die verwendete Phosphatgepufferte Salzlösung beinhaltete

8,0 g Natriumchlorid (NaCl), 1,15 g Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) und

0,2 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) mit Aqua destillata auf 1000 ml. Der

pH-Wert der Lösung lag bei 7,6. Durch Zusatz von 10 g Rinder-Serum-Albumin (BSA)

auf 1000 ml ergab sich eine Phosphatpuffer-Lösung mit 1% BSA Anteil.


3.2. Untersuchte Gewebe

3.2.1. Herkunft und Histologie

Für die Versuchsreihe wählten wir 15 Operationspräparate von kolorektalen Karzinomen

und ein Leberteilresektat mit zwei Metastasen eines Adenokarzinoms des Kolons.

Präoperativ, in einem Abstand von 3-5 Tagen, war den Patienten 2 mg des

Tc-99m markierten monoklonalen Antikörpers BW431/26 zur Radioimmunszintigraphie

intravenös verabreicht worden. Die pathologische Aufarbeitung aller Operationsresektate

erfolgte durch das Institut für Pathologie der RWTH Aachen. Die Kenndaten der Unter-

suchungspräparate sind in Tabelle 3 aufgeführt. Zur Negativkontrolle diente das

Operationspräparat eines mäßiggradig differenzierten Rektumkarzinoms (Präparat 15).

Diesem Patienten war präoperativ kein muriner Antikörper injiziert worden.

Tabelle 3:

Kenndaten der Untersuchungspräparate

Nr. Ident. Sex Alter Histologie Lokalisation Staging Grading

1 FA w 69 tubuläres Adenokarzinom Kolon pT3N0MX G1

2 GE w 50 tubuläres Adenokarzinom Rektum pT2N0Mx G1

3 BR w 66 tubuläres Adenokarzinom Kolon pT3N3Mx G2

4 MM m 66 muzinöses Adenokarzinom Kolon pT2N1MX G3

5 LF m 48 Adenokarzinom Rektum pT3N1MX G3

6 BA w 61 muzinöses Adenokarzinom Kolon pT2N1MX G2

7 KH m 63 Adenokarzinom Kolon pT2N0MX G3

8 GN m 56 Adenokarzinom Kolon pT3N0MX G2

9 MW m 58 tubuläres Adenokarzinom Rektum pT3N2MX G2

10 SM w 59 muzinöses Adenokarzinom Kolon pT3N2MX G3

11 SM w 54 tubuläres Adenokarzinom Rektum pT2N1MX G1

12 WE w 68 tubuläres Adenokarzinom Rektum pT3N1MX G2

13 BA w 66 Adenokarzinom Kolon pT3N2MX G2

14 DM w 79 Adenokarzinom Kolon pT3N1MX G2

15 FW m 66 Adenokarzinom Rektum pT3N0MX G2

16 JL w 57 Filiae, Adenokarzinom (Kolon) Leber G2


3.2.2. Vorbereitung der Gewebeschnitte

Die formalinfixierten Resektate wurden in Paraffin eingebettet und als 2µm Paraffin-

schnitte auf sogenannte K-Objektträger mit Aqua destillata aufgezogen. Das Glas dieser

speziellen Objektträger ist kaliumarm und wegen des geringen 40K-Gehaltes besser für

die Autoradiographie geeignet, da der Nulleffektes verringert wird. Zur Reinigung

stellten wir die Objektträger in eine Äther-Ethanol Lösung (1:4) und trockneten sie vor

Aufziehen der Schnitte mit einem Baumwolltuch. Nach einer Latenz zum Abklingen der

Radioaktivität des primär injizierten Antikörpers wurden die Paraffinschnitte angefertigt.

Nach Entparaffinierung in einer absteigenden Ethanolreihe wurden sie in einer

PBS-Lösung gespült. Die so vorbereiteten Gewebeschnitte transportierten wir in einer

feuchten Kammer zur weiteren Verarbeitung in das Isotopenlabor der Klinik für Nuklear-

medizin der RWTH Aachen.


3.3. Antikörperinkubation

Die entparaffinierten Gewebeschnitte wurden mittels einer Mikropipette mit jeweils

200 µl der Antikörperlösungen beträufelt, so daß die gesamte Gewebefläche benetzt war.

Zur Antikörperinkubation verweilten die Gewebeschnitte für 60 Minuten in einer

feuchten Kammer [77]. Anschließend erfolgte eine zweimalige Spülung für jeweils

5 Minuten in einer PBS-Lösung und anschließend jeweils 5 Minuten zweimal in Aqua

destillata. Zur Qualitätskontrolle wurde die Radioaktivität der Spülflüssigkeit mittels

eines Spektral-Geiger-Zählrohres gemessen, um eine ausreichende Spülung zu

gewährleisten. Durch die vier Spülvorgänge reduzierte sich die Aktivität um

durchschnittlich 90%. Zur weiteren Verarbeitung wurden die behandelten Gewebe-

schnitte in einer feuchten Kammer zum Autoradiographie-Labor des Lehr- und

Forschungsgebietes Anatomie und Zellbiologie der RWTH Aachen transportiert.


3.4. Materialien für die Autoradiographie

3.4.1. Photoemulsion

NUCLEAR RESEARCH EMULSION K2, in Gelform

Firma Ilford, England

Aus der Serie der Photoemulsionen der Firma Ilford besitzt die Emulsion Typ K mit dem

Sensitivitätsgrad 2 die besten Empfehlungen beim Einsatz des radioaktiven Isotop 125I

und einer lichtmikroskopischen Auswertung der Autoradiogramme. Mit einem Silber-

korndurchmesser von 0,20 µm liegt die Emulsion Typ K im mittleren Vergleichsbereich.

Die NUCLEAR RESEARCH EMULSION in Gelform enthält 0,162 g Silber und

0,042 g Gelatine pro Gramm Emulsion. Eine Flasche mit 50 ml enthält 65 g Emulsion.

Nach der Anlieferung lagerten wir die Emulsion in ihrer Außenverpackung bei 4 °C im

Kühlschrank, geschützt vor Licht und lokaler Radioaktivität maximal 2 Monate [83].

3.4.2. Sonstige zur Autoradiographie benötigte Geräte

Zur Lagerung der Objektträger während der Exposition dienten Kunststoffboxen. Dazu

benutzten wir Färbetröge POM der Firma Mohren, Deutschland mit Einsätzen zur Auf-

nahme der Objekträger.

Die weiteren Gerätschaften zur Herstellung der Autoradiogramme und deren Ent-

wicklung waren Eigenentwicklungen des Lehr- und Forschungsgebietes Anatomie und

Zellbiologie der RWTH Aachen (vgl.[94]).


3.4.3. Zusammensetzung des Entwicklers

Für die Entwicklung von 24 Objektträger, entsprechend dem Inhalt einer Kunststoffbox,

wurden 300 ml Entwicklungslösung wie folgt angesetzt.

1,35 g Amidol (4 Hydroxy-1,3 Phenylendiammoniumdichlorid)5,40 g Natriumsulfit (Na2SO3)2,40 g Kaliumbromid 10 % (KBr)gelöst in 300 ml Aqua bidestillata

Nach Lösung der Substanzen unter einer Abzugsanlage und persönlichem Kon-

taminationsschutz wurde die Lösung gefiltert und direkt zur Entwicklung benutzt.

Alle Chemikalien zum Ansatz des Entwicklers wurden von der Firma Merck,

Deutschland bezogen.

3.4.4. Zusammensetzung des Fixierers

Da die Fixierlösung in Kühlschrank bei 8 °C für 6 bis 8 Wochen lagerbar ist, wurde sie

für mehrere Entwicklungsprozeße nach folgender Rezeptur angesetzt.

90 g Natriumthiosulfat-Pentahydrat reinst (Na2S2O3 x 5H2O)gelöst in 300 ml Aqua bidestillata

Die Chemikalien zum Ansatz des Fixierers wurden von der Firma Merck, Deutschland

bezogen.


3.4.5. Hämatoxylin Färbung (nach P. Mayer)

Die Lösung zur Hämatoxylin-Färbung ist mehrere Monate lang haltbar und wurde einmal

angesetzt.

1,0 g Hämatoxylingelöst in 1000 ml Aqua destillata

In dieser Stammlösung wurden folgende Substanzen gelöst.

0,2 g Natriumiodad (NaIO3)50 g Kaliumalaun, chemisch rein ( Aluminiumkaliumsulfat)50 g Chloralhydrat1,0 g kristalline Zitronensäure

Alle Chemikalien für die Hämatoxylin-Färbung wurden von der Firma Merck,

Deutschland bezogen.

3.4.6. Eindeckelung mit Entellan

Zur Eindeckelung der fertigen Autoradigramme wurde Entellan der Firma Merck,

Deutschland benutzt.


3.5. Methode der Autoradiographie

Für die Herstellung der Autoradiogramme orientierten wir uns an der „Arbeitsanweisung

zur Herstellung von Autoradiogrammen“ von Professor Dr. Dr. H. Korr, Lehr- und

Forschungsgebiet Anatomie und Zellbiologie der RWTH Aachen (vgl. [94]). Zur

Herstellung der Autoradiogramme wurden die Gewebeschnitte zunächst in die

Dunkelkammer gebracht. Eine diskrete Dunkelkammerbeleuchtung erfolgte durch eine

15 Watt Lampe mit einem Ilford 904 Lichtfilter [83]. Durch eine Klimaanlage mit

Schleusensystem erhielt die Dunkelkammer eine Raumtemperatur von 20 °C mit einer

konstanten Luftfeuchtigkeit von 60 %. Die Staubreduktion erfolgte durch das Filter-

system der Klimaanlage. In der Vorbereitungsphase wurden bei Dunkelkammer-

beleuchtung (siehe oben) 15 g der Photoemulsion abgewogen und mit 10 ml Aqua

destillata in einem auf 42 °C temperierten Wasserbad vollständig gelöst. Bei allen

Arbeiten wurde auf eine umsichtige Arbeitsweise und Arbeitsmaterialen zur Vermeidung

von elektrostatischer Aufladung und hieraus resultierender Entladungen geachten, da

hierdurch der Nulleffekt erhöht würde. Zunächst wurde die gelöste Emulsion durch eine

Mullage gefiltert. Anschließend wurde nach Aneinanderlegen von jeweils zwei

Objektträgerrückseiten und Eintauchen in die Photoemulsion eine gleichmäßige dünne

Schicht auf den Gewebeschnitten an der Oberseite der Objektträger erzielt. Zum

Trocknen wurden die Objektträger dann einzeln in einer fast senkrechten Position in ein

Trockengestell verbracht. Nach ca. 3 Stunden Trocknungszeit in absoluter Dunkelheit

sortierten wir die emulsionsbeschichteten Objektträger in lichtdichte Kunststoffboxen ein,

die durch einen Einsatz für die Aufnahme der Objektträger vorbereitet waren. Unter

Zusatz von Calciumsulfat (CaSO4) zur Absorption von Feuchtigkeit wurden die Boxen

luftdicht verschlossen und für die Expositionszeit im Kühlschrank bei 4 °C strahlungsarm

gelagert. Als strahlungsarm ist ein allseitig gemauerter Raum zur Reduktion der

kosmischen Strahlungseinflüsse und Abwesenheit von lokaler Radioaktivität zu

verstehen. Nach Beendigung der autoradiographischen Exposition wurden die noch ver-

schlossenen Kunststoffboxen mit den Präparaten zunächst für eine Stunden bei

Raumtemperatur gelagert, um eine Kondensation von Wasser auf den Schnitten und dem

Film beim Öffnen der Präparatekästen zu vermeiden. Nach Ansatz der Entwickler-


und Fixierlösung wurde die Entwicklerlösung in einem Wasserbad auf 18 °C gekühlt. Zur

photographischen Entwicklung der emulsionsbeschichteten Objektträger überführten wir

die Einsätze aus den Kunststoffboxen unter Lichtausschluß mit den Präparaten in die

gekühlte Entwicklerflüssigkeit. Eine Schüttelapparatur garantierte eine gleichmäßige

Konzentration der Entwicklungsflüssigkeit. Nach genau vier Minuten erfolgt eine

Zwischenwässerung für eine Minute in Aqua destillata. Danach wurden die Präparate für

10 Minuten in der Fixierlösung ebenfalls durch eine Schüttelapparatur bewegt. Erst nach

der Fixierung waren die Autoradiogramme unempfindlich für Licht. Abschließend

erfolgte eine Wässerung in fließendem kalten Wasser für 20 Minuten. Nach kurzer

Überführung in Aqua destillata wurden die Schnitte in einem Wärmeschrank bei 37 °C

über 2 bis 3 Tage getrocknet. Zur histologischen Färbung wurden die Schnitte für

30 Sekunden in eine Hämatoxylinlösung getaucht. Anschließend wurden sie für

20 Minuten in Leitungswasser gebläut, dann für 2 Minuten in Aqua destillata überführt,

bevor sie wiederum im Wärmeschrank bei 37 °C über 2 bis 3 Tage getrocknet wurden.

Nach Eindeckelung mit Entellan unter einer Absauganlage und dessen Aushärtung waren

die Autoradiogramme für die mikroskopische Auswertung bereit.

3.6. Mikroskopie und photographische Dokumentation

Für die Lichtmikroskopie und Mikrophotographie verwendeten wir den Mikroskop-Typ

BH-2 und den Kameraaufsatz C-35AD-4 der Firma OLYMPUS, Deutschland. Die Be-

lichtung wurde über die automatische Belichtungs Kontroll Box PM-CBAD, ebenfalls

Firma OLYMPUS, gesteuert. Die Auswertung der Autoradiogramme erfolgte bei einer

10 x 40 fachen Vergrößerung. Zur photographischen Dokumentation benutzten wird den

Schwarzweiß-Film ILFORD PAN F 50 DX 135, der Firma ILFORD, England. Die Ent-

wicklung und Vergrößerungen der Bilder ließen wir in einem kommerziellen Photolabor

durchführen.


3.7. Versuchsbeschreibung

3.7.1. Vorversuch

Für den autoradiographischen Nachweis des präoperativ injizierten intakten murinen

monoklonalen Antikörpers BW431/26 durch einen 125I-markierten anti-Maus Antikörper

fehlten Erfahrungswerte. Somit führten wir eine Vorversuchreihe mit dem Ziel durch,

eine adäquate anti-Maus Antikörperkonzentation für die Inkubation und die optimale Ex-

positionszeit zu finden. Dazu wählten wir drei Operationspräparate und eine

Negativkontrolle aus. Zur Findung der geeigneten Antikörperkonzentration wurden

korrespondierende Schnitte mit fünf verschiedenen Antikörperkonzentrationen inkubiert.

Dieser Ansatz wurde in dreifacher Ausführung angelegt und auf verschiedene Kunst-

stoffboxen verteilt. Nach der gemeinsamen autoradiographische Verarbeitung aller drei

Ansätze erfolgte die Exposition. Zur Ermittlung der optimalen Expositionszeit

entwickelten wir jeweils einen Ansatz nach 7 Tagen, 15 Tagen und 63 Tagen.


des Antikörpers BW431/26

Zum Nachweis und zur autoradiographischen Darstellung des in vivo applizierten

murinen Antikörpers BW 431/26 inkubierten wir aufgrund der Ergebnisse des Vor-

versuches alle Gewebeschnitte mit dem 125I-markierten anti-Maus Antikörper in einer

Konzentation von 2,63 µg/ml bei einer spezifischen Aktivität von 703 KBq/µg. Dieser

Ansatz wurde zweifach angelegt. Nach 36 Tagen Expositionszeit erfolgte die photo-

graphische Entwicklung des ersten Ansatzes. Die Begutachtung der autoradio-

graphischen Qualität veranlaßte auch die Entwicklung des zweiten Ansatzes am 36. Tag

der Exposition.



des Carcinoembryonalen Antigens

Für den Nachweis und die autoradiographische Darstellung des Carcinoembryonalen

Antigens beim kolorektalem Karzinom inkubierten wir alle Gewebeschnitte mit dem125I-markierten Antikörper BW431/26 in einer Konzentation von 40 µg/ml und einer

spezifischen Aktivität von 53,8 KBq/µl. Der dreifach angelegte Ansatz wurde nach

42 Tagen bzw. nach 49 Tagen photographisch entwickelt.

3.7.4. Kontrollanordnung

Jeder Ansatz führte einen Gewebeschnitt mit, der vom Prozeß der Antikörperinkubation

ausgeschlossen war. Bei der Herstellung der Autoradiogramme wurde jeder Ansatz von

zwei leeren Objektträgern begleitet. Dabei verteilten wir diese Leerproben so, daß jeder

Ansatz von einem leeren Objektträger angeführt bzw. beendet wurde.

Diese Kontrollanordnung diente der Qualitätssicherung der Autoradiographie, um den

Nulleffekt und die Chemographie der Autoradiogramme abschätzen zu können.

Ergebnisse 35

4. Ergebnisse

4.1. Auswertung der Markierungsintensität

Zur Auswertung wurden die Autoradiogramme nach ihrem Markierungsmuster und dem

Grad ihrer Markierung, d.h. der Ansammlung von Silberkörnern, mikroskopisch

ausgewertet. Dabei differenzierten wir Markierungen über den Lumina der Krypten, den

Epithelzellen und den bindegewebigen Schichten des angrenzenden normalen

Darmgewebes. Die tumorösen Gewebeareale wurden hinsichtlich der Ansammlung von

Silberkörnern über den Lichtungen der drüsigen Karzinomverbände, über den

Tumorzellen und dem umgebenem Bindegewebe untersucht. Die Intensität der

Markierung in den einzelnen Gewebearealen teilten wir semi-quantitativ in fünf

Kategorien ein (Tabelle 4).

Tabelle 4:

Kategorien der Markierungsintensität

„ negativ „ ( - )

„ diskret positiv „ ( + )

„ schwach positiv „ ( ++ )

„ deutlich positiv „ ( +++ )

„ stark positiv „ ( ++++ )

Ergebnisse 36

4.2. Vorversuch

Diese Anordnung war als Versuchsreihe zur Definition der erforderlichen Antikörper-

konzentration und der optimalen Expositionszeit konzipiert worden. Wir entwickelten

den ersten Ansatz nach 7 Tagen und den zweiten Ansatz nach 15 Tagen Expositionszeit.

Die Autoradiogramme wurden hinsichtlich der mikroskopisch sichtbaren Ansammlung

von Silberkörnern untersucht. Die Präparate, die mit 0,627 ng/ml, 6,27 ng/ml und

62,7 ng/ml Antikörperlösung inkubiert worden waren, zeigten kaum eine Markierung.

Die Schnitte, die mit 0,627 µg/ml Antikörperkonzentration inkubiert worden waren,

zeigten im Autoradiogramm eine diskrete Markierung über den drüsigen

Karzinomverbänden. Dabei lagen Silberkörner über Tumorzellen, in deren Drüsenlumina

und auch im Tumorstroma. Im angrenzenden gesunden Gewebe war keine Markierung

erkennbar. Bei der Auswertung der Präparate, die mit der höchsten Konzentration

inkubiert worden waren, zeigte sich nur eine diskrete Zunahme an Silberkörner. Bei der

Auswertung der Autoradiogramme, die 63 Tage exponiert waren, wiesen die Präparate,

die mit den Antikörperkonzentrationen 0,627 ng/ml bis 62,7 ng/ml inkubiert worden

waren, eine äquivalentes Markierungsmuster mit steter Zunahme über die

Verdünnungsstufen auf. Zwischen den Ergebnisse der Antikörperkonzentrationen

0,627 µg/ml und 6,27 µg/ml war nur noch eine geringe Zunahme bei der Ansammlung

von Silberkörnern zu beobachten.

Somit definierten wir die optimale Antikörperkonzentration mit einen Wert, der zwischen

0,627 µg/ml und 6,27µg/ml liegen sollte. Als optimale Expositionszeit betrachteten wir

einen Zeitraum innerhalb der ersten Halbwertzeit von 60 Tagen für das Isotop 125I.

Ergebnisse 37

4.3. Autoradiographische Darstellung des Antikörpers BW431/26

Bei der autoradiographischen Darstellung des anti-CEA Antikörpers im Gewebe durch

einen 125I-markierten anti-Maus Antikörper beobachteten wir ein homogenes

Markierungsmuster über den angrenzenden gesunden Arealen des Dickdarms. Über den

Lichtungen der Kolonkrypten zeigte sich keine einheitliche Ansammlung von

Silberkörnern. Die Becher- und Saumzellen des drüsenbildenden Epithels hatten nur

teilweise eine Markierung im basalen Bereich, während das umgebende bindegewebige

Stroma durch eine diskrete Anzahl von Silberkörnern markiert war (Abbildung 1). Über

den Blutgefäßen war keine Markierung erkennbar. Auch zeigten die perivaskulären

Areale in ihrem Markierungsverhalten keine Zunahme in der Anzahl der Silberkörner

verglichen mit dem bindegewebigem Stroma.

Abbildung 1

Autoradiographische Darstellung des anti-CEA Antikörpers im angrenzenden gesundenGewebe eines kolorektalen Karzinoms (Präparat 2):Lumen der Krypten ohne Markierung (-), basale Markierung der Epithelzellen (+) undAnsammlung von Silberkörnern über dem umgebenen bindegewebigem Stroma (++).

Ergebnisse 38

Die Intensität der Markierung in den Autoradiogrammen für die tumorösen Präparat-

anteile zeigten eine Heterogenität in Abhängigkeit von der Differenzierung des Tumors.

Deshalb wurden die Ergebnisse gesondert nach ihrer histologischen Differenzierung

aufgeführt. Die Betrachtung der Blutgefäße und perivaskulären Areale im Tumorgewebe

erbrachte auch hier keine ausgeprägten Markierungen.

Die gut differenzierten Abschnitte der kolorektalen Adenokarzinome zeigten nur eine

sehr geringe Anzahl von Silberkörnern über den Lichtungen der drüsigen Karzinom-

verbände. Hauptsächlich lag die Markierung homogen über den Tumorzellen und dem

umgebenem Bindegewebe (Abbildung 2). Dieses Markierungsmuster war einheitlich

auch im Vergleich mit Präparaten gleicher Differenzierung.

Abbildung 2

Autoradiographische Darstellung des anti-CEA Antikörpers in einem gut differenziertenAdenokarzinom des Kolons (Präparat 1):Markierungsmuster kaum in den Lichtungen (+), hauptsächlich über den Tumorzellen (++)und dem umgebenen Bindegewebe (++).

Ergebnisse 39

Die Intensität im Markierungsmuster der mittelgradig bis gering differenzierten Adeno-

karzinome war unterschiedlich. Während die unregelmäßigen Lumina der drüsigen

Karzinomverbände ebenfalls kaum eine Markierung zeigten, lag die Ansammlung von

Silberkörnern über den Tumorzellen in einem stark variablen Ausmaß vor

(Abbildungen 3-5).

In der Negativkontrolle sahen wir nur eine sehr schwache Markierung über dem

Bindegewebe der tumorösen Gewebeabschnitte (Präparat 15).

Abbildung 3

Autoradiographische Darstellung des anti-CEA Antikörpers in einem wenig differenziertenAdenokarzinom des Rektums (Präparat 5):Diskrete Markierung der Lichtungen der drüsigen Karzinomverbände (+), während überden Tumorzellen (++/+++) und dem umgebenden Bindegewebe (++/+++) schwach bisdeutlich Silberkörner zu sehen sind.

Ergebnisse 40

Abbildungen 4 und 5

Autoradiographische Darstellung des anti-CEA Antikörpers in einem mäßiggradigdifferenzierten Kolonkarzinom (Präparat 14): Unterschiedliches Markierungsmusterinnerhalb eines Präparates:Die Markierung der Tumorzellen und des umgebenden Bindegewebes reicht von diskretbis deutlich (+/+++).

Ergebnisse 41

Die Tumorzellen der schleimbildenden muzinösen Adenokarzinome waren geringgradig

differenziert. Ihre Markierungsmuster zeigte sich heterogen innerhalb des Präparates und

der Vergleichspräparate. Über den Tumorzellen konnten wir eine geringe Markierung

sehen. Das Gewebe um die Tumorzellen und der Schleim hatten kaum eine Markierung

(Abbildung 6). Über den bindegewebigen Septen lag nur eine geringe Anzahl an

Silberkörnern.

Das Verteilungsmuster über den Metastasen eines mittelgradig differenzierten Adeno-

karzinoms in der Leber zeigte das gleiche Markierungmuster wie der Primärtumor

(Abbildung 7). Die Sinusoide und Hepatozyten hatten eine homogene diskrete An-

sammlung von Silberkörnern (Abbildung 8).

Abbildung 6

Autoradiographische Darstellung des anti-CEA Antikörpers in einem muzinösenAdenokarzinom des Kolons (Präparat 6):Schwaches Markierungsmuster über den Tumorzellen (++).

Ergebnisse 42

Abbildung 7 und 8

Autoradiographische Darstellung des anti-CEA Antikörpers in einer Metastase einesmäßiggradig differenzierten Adenokarzinoms und im umgebenden Lebergewebe(Präparat 16).

Ergebnisse 43

Tabelle 5:

Markierungsintensität des 125I-markierten anti-Maus Antikörpers

zur Darstellung des Antikörpers BW 431/26

angrenzendes gesundes Gewebe tumoröse Gewebeareale

Nr. Krypte Epithelzellen Bindegewebe Lichtung Tumorzellen Bindegewebe

1 - - ++ + ++ ++2 - + ++ - + +11 - - ++ + ++ ++

Markierungsintensität der gut differenzierten Adenokarzinome



3 - - + + +/++ +5 + ++/+++ ++/+++7 - + ++ - +/++ ++8 - + ++9 - +/++ +/++12 - + ++ + ++/+++ ++13 - - + - + +14 - + ++ - +/+++ +/+++15 - - - - - +16 Sinusoide + Hepatozyten + + +/++ ++

Markierungsintensität der mäßiggradig und gering differenzierten Adenokarzinome

Präparat 15: Negativkontrolle (ohne in vivo Antikörper)



4 - - + + + ++6 - + ++ - ++ +10 - + ++ + +/++ +/++

Markierungsintensität der muzinösen Adenokarzinome

Anmerkung: Die Gewebeschnitte 5, 8 und 9 enthielten kein gesundes Gewebe.

Ergebnisse 44

4.4. Autoradiographische Darstellung des Carcinoembryonalen Antigens

Bei der Auswertung der Autoradiogramme, die nach Inkubation der interessierenden

Schnitte mit dem 125I-markierten anti-CEA Antikörper BW 431/26 hergestellt worden

waren, sahen wir das typische Markierungsmuster für das CEA im gesundem

Kolongewebe und bei kolorektalen Adenokarzinomen. In allen Gewebeschnitten zeigten

sich nur geringe Ansammlungen von Silberkörnern über den Lichtungen der

angrenzenden gesunden Darmkrypten. Im Epithel sah man eine diskrete Markierung über

den Zellmembranen der Becher- und Saumzellen mit teilweiser apikaler Präsenz

(Abbildung 9). Diese Intensität und das Markierungsmuster war bei allen Präparaten

gleich. Die umgebenden bindegewebigen Schichten des Dickdarms zeigten eine eher

heterogene Überlagerung mit Silberkörnern. Neben sehr diskreten Markierungen sahen

wir in einigen Präparaten auch Areale mit einer zunehmenden Anzahl von Silberkörnern,

besonders über den Zellmembranen der Epithelzellen und dem bindegewebigen Stroma in

tumornahen Arealen (Abbildung 10 und 11).

Abbildung 9

Autoradiographische Darstellung des Carcinoembryonalen Antigens in einem an-grenzenden gesunden Gewebe eines kolorektalen Karzinoms (Präparat 1):Kolonkrypte (+), Epithelzellen (+/++), Bindewebe (+/++).

Ergebnisse 45

Abbildung 10 und 11

Autoradiographische Darstellung des Carcinoembryonalen Antigens in einemangrenzenden gesunden Gewebe eines gut differenzierten Adenokarzinoms. Zunahme derMarkierung in Abhängigkeit von der Tumornähe (Präparat 2):Kolonkrypten (+/++), Epithelzellen (+/+++), Bindegewebe (++/++++).

Ergebnisse 46

Die Markierungen der tumorösen Präparatanteile zeigten in den Autoradiogrammen eine

Heterogenität in Abhängigkeit von der Differenzierung des Tumors. Deshalb werden die

Ergebnisse gesondert nach der histologischen Differenzierung aufgeführt.

Die Präparate mit gut differenzierten drüsenbildenden Adenokarzinomen des Kolons

zeigten einheitlich eine starke Schwärzung in den Lichtungen der drüsigen Karzinom-

verbände. Diese Markierung differierte gering in ihrer Ausprägung innerhalb eines

Präparates (Abbildung 12 und 13), aber auch beim Vergleich mit anderen Adeno-

karzinomen mit gleicher Differenzierung. In allen Vergleichs-Autoradiogrammen blieb

dieses Markierungmuster jedoch dominant. Über den Tumorzellen der drüsigen

Karzinomverbände zeigte sich eine Ansammlung von Silberkörnern, aber mit geringerer

Ausprägung und apikaler Ausrichtung. Das umgebende Bindegewebe zeigte nur eine

mäßige Markierung. Dieser Befund war in allen Schnitten gleichermaßen erkennbar.

Die Adenokarzinome mit mittelgradiger bis geringer Differenzierung zeigten eine sehr

unterschiedliche Intensität im autoradiographischen Markierungsverhalten. Sofern

Lichtungen im drüsigen Karzinomverband vorkamen, waren diese sehr unregelmäßig

konformiert. Die Ansammlung von Silberkörnern in diesen Lichtungen variierte sehr

stark, war aber im Vergleich zur Markierung anderer Strukturen dominant (Abbildung 14

und 15). Über den Tumorzellen zeigte sich eine mäßige Markierung ohne eine

Ausrichtungsprävalenz. Das bindegewebige Stroma um die Tumorzellverbände war

unterschiedlich gering markiert.

Das Präparat 15 (Negativkontrolle ohne in vivo applizierten Antikörper) hatte ein

Markierungsmuster und eine Markierungsintensität, die vergleichbar war mit einen

Adenokarzinomen geringer Differenzierung.

Ergebnisse 47

Abbildung 12 und 13

Autoradiographische Darstellung des Carcinoembryonalen Antigens in einem gutdifferenzierten Adenokarzinom des Kolons mit typischem Markierungsmuster (Präparat 1):Lichtungen der drüsigen Karzinomverbände (+++/++++), Tumorzellen (++/+++),umgebende Bindegewebe (++).

Ergebnisse 48

Abbildung 14 und 15

Autoradiographische Darstellung des Carcinoembryonalen Antigens in einem wenigdifferenzierten Adenokarzinom des Rektums. Unterschiedliches Markierungsmusterinnerhalb des Tumors (Präparat 5):Lichtungen der drüsigen Karzinomverbände (++/+++), Tumorzellen (+), umgebendeBindegewebe (+/++).

Ergebnisse 49

Als dritte Gruppe hob sich die Markierungsintensität von schleimbildenden muzinösen

Adenokarzinomen mit geringgradiger Differenzierung ab. Die Tumorzellen zeigten eine

Ansammlung von Silberkörnern über ihrem Zytoplasma und teilweiser Ausrichtung auf

die Zellmembran (Abbildung 16). Das die Tumorzellen umgebene Stroma und der

Schleim war unregelmäßig markiert. Innerhalb dieser Gruppe zeigt sich sowohl in dem

einzelnen Schnitt als auch im Vergleich mit anderen Schnitten eine heterogene

Markierung mit Silberkörnern. Über den bindegewebigen Septen konnte man eine

homogene diskrete Markierung erkennen.

Abbildung 16

Autoradiographische Darstellung des Carcinoembryonalen Antigens in einem muzinösenAdenokarzinom des Kolons (Präparat 4):Tumorzellen (++/+++).

Ergebnisse 50

Die Lebermetastasen des mäßiggradig differenzierten Adenokarzinoms

(Abbildung 17) zeigten das gleiche Markierungsmuster wie der Primärtumor. Das

umgebende Lebergewebe war durch eine starke Ansammlung von Silberkörnern

über Randbereichen der Sinusoide und über den Hepatozyten homogen markiert

(Abbildung 18).

Abbildung 17

Autoradiographische Darstellung des Carcinoembryonalen Antigens in einer Metastaseeines mäßiggradig differenzierten Adenokarzinoms (Präparat 16).

Ergebnisse 51

Abbildung 18

Autoradiographische Darstellung des Carcinoembryonalen Antigens im umgebenenLebergewebe einer Adenokarzinommetastase (Präparat 16).

Ergebnisse 52

Tabelle 6:

Markierungsintensität des 125I-markierten Antikörpers BW 431/26zur Darstellung des Carcinoembryonalen Antigens


Nr. Krypte Epithelzellen Bindegewebe Lichtung Tumorzellen Bindegewebe1 + +/++ +/++ +++/++++ ++/+++ ++2 +/++ +/+++ ++/++++ +++ +/++ ++11 + + ++ +++ ++ ++

Markierungsintensität der gut differenzierten Adenokarzinome


Nr. Krypte Epithelzellen Bindegewebe Lichtung Tumorzellen Bindegewebe3 + + +/++ +++ ++ +/++5 ++/+++ + +/++7 + ++ +/++ ++ + +8 ++/++++ +/+++ ++9 ++/+++ +/++ +/++12 +/++ +/++ +++ ++/+++ ++ ++13 +/++ ++ ++ +++ ++ +/++14 + ++ ++ ++/+++ ++ +/++15 + +/++ +/++ +/+++ ++ +/++16 Sinusoide ++ Hepatozyten ++ +/++ + ++

Markierungsintensität der mäßiggradig und gering differenzierten Adenokarzinome

Präparat 15: Negativkontrolle (ohne in vivo Antikörper)


Nr. Krypte Epithelzellen Bindegewebe Lichtung Tumorzellen Bindegewebe4 +/++ +/++ ++ +/++ ++/+++ ++6 - + ++ + ++/+++ +/++10 +/++ ++ +/++

Markierungsintensität der muzinösen Adenokarzinome

Anmerkung: Die Gewebeschnitte 5, 8 und 9 enthielten kein gesundes Gewebe.

Ergebnisse 53

4.5. Kontrollanordnung

Die Autoradiogramme der Kontrollanordnung, d.h. Präparate, die an der Antikörper-

inkubation nicht teilgenommen hatten, zeigten keine Silberkörner über den

Gewebeschnitten (Abbildung 19 und 20). Dies läßt den Schluß zu, daß die Präparate

keine eigene Radioaktivität mehr enthielten. Eine Verschleppung von Antikörpern durch

die Waschvorgänge wird dadurch ebenfalls ausgeschlossen. Diese Ergebnisse zeigten

auch, daß die Autoradiogramme keiner relevanten positiven Chemographie unterlagen.

Über den Objektträgern ohne Gewebeschnitte, die zur Qualitätskontrolle der Herstellung

der Autoradiogramme angefertigt worden waren, sah man eine sehr schwache

Background-Markierung, die innerhalb der Ansätze konstant war. Eine Verschleppung

von Radioaktivität während der Herstellung der Autoradiogramme wird somit aus-

geschlossen. Dies bestätigt auch, daß keine Effekte durch positive Chemographie

entstanden sind. Der Nulleffekt der Autoradiographie war so gering, daß er keinen

Einfluß auf die übrigen Ergebnisse hatte.

Ergebnisse 54

Abbildung 19 und 20

Kontrollautoradiogramme, ohne Antikörperinkubation, bei einem muzinösen Adeno-karzinom (Präparat 6) und tumornahe gesunde Darmkrypten (Präparat 1).

Ergebnisse 55

4.6. Auswertung der Ergebnisse

Zur Beurteilung der intratumoralen Verteilung des in vivo applizierten Antikörpers

BW 431/26 wurde das Markierungsmuster und die Markierungsintensität des anti-Maus

Antikörpers mit der CEA-Expression in den Operationspräparaten verglichen.

In den angrenzenden gesunden Gewebearealen der Adenokarzinome lag der Antikörper

BW 431/26 im Bindegewebe in einem vergleichbaren Ausmaß wie die CEA-Expression

vor. Während die Markierung in den Epithelzellen nur in geringem Umfang der

CEA-Expression folgte, wurde in den Kolonkrypten das vorhandene Carcinoembryonale

Antigen überhaupt nicht durch den Antikörper BW 431/26 dargestellt.

Der Markierung der CEA-Expression in den tumorösen Anteilen der Präparate war

uneinheitlich. In dem Bindegewebe, das die Tumorareale umgibt, lag der Antikörper

BW 431/26 ebenfalls in einem vergleichbaren Ausmaß wie die CEA-Expression vor. Die

Tumorzellen selber waren in der gleichen Intensität und Variabilität markiert, in der auch

das Carcinoembryonale Antigen vorlag. Die Lichtungen der drüsigen Karzinomverbände,

die sehr viel Carcinoembryonales Antigen enthielten, wurden durch den Antikörper

BW 431/26 nur sehr diskret markiert. Insgesamt war das Markierungsmuster und die

Markierungsintensität sowohl für den Nachweis des anti-CEA Antikörpers als auch für

das Carcinoembryonale Antigen abhängig von der Differenzierung des Adenokarzinoms.

Das Leberpräparat mit Metastasen eines Kolonadenokarzinoms verhielt sich im

tumorösen Anteil entsprechend dem Primärtumor. Im umgebenen Lebergewebe zeigte

die Markierung des Antikörpers BW 431/26 ein unspezifisches Markierungsmuster beim

Vergleich mit der CEA-Expression. Das intensive Markierungsmuster für CEA an den

Rändern der Sinusoide spiegelt den CEA-Metabolismus der Leber wider. Das

Markierungsmuster des anti-CEA Antikörpers korrelierte nicht mit dieser

CEA-Prävalenz.

Bei den Präparaten der Negativkontrolle, die keinen in vivo applizierten Antikörper

enthielten, kam es nur über dem Bindegewebe, das die Tumorareale umgab, zu einer sehr

schwachen Markierung. Es kann somit von einer sehr geringen unspezifischen Reaktion

des anti-Maus Antikörpers ausgegangen werden. Diese unspezifische Markierung war

Ergebnisse 56

jedoch so minimal, daß sie die übrigen Ergebnisse nicht verfälschte. Die Markierung des

Carcinoembryonalen Antigens in diesen Kontrollpräparaten hingegen lag in dem gleichen

Ausmaß vor wie in den Versuchspräparaten gleicher Differenzierung.

Unsere Ergebnisse zeigten, daß der murine monoklonale Antikörper BW 431/26, der

in vivo zur Radioimmunszintigraphie eingesetzt wurde, nicht alle CEA-positiven

Gewebeformationen erreichte. Er markierte zwar spezifisch die CEA-Expression, jedoch

nicht in allen Präparatarealen. Seine hauptsächliche Akkumulation lag im bindegewebigen

Stroma, das die Tumorzellen und das angrenzende gesunde Drüsengewebe umgab, und

an den Tumorzellen. An den Stellen mit der größten Prävalenz des Carcinoembryonalen

Antigens, den Lichtungen der drüsigen Karzinomverbände, kam er nur in sehr geringer

Konzentration vor. Ebenso wurde das CEA der gesunden Epithelzellen und der

Kolonkrypten nicht adäquat markiert.

Da unsere Ergebnisse keine nennenswerte unspezifische Markierung durch den anti-CEA

Antikörper BW 431/26 zeigten, kann man das intratumorale Verteilungsverhalten des in

vivo applizierten Antikörpers als spezifisch bezeichnen. Die Tatsache, daß der Anti-

körper nicht in allen Präparatanteilen das Carcinoembryonale Antigen markiert, läßt auf

einen ungleichmäßigen Antikörpertransport im Tumor schließen.

Diskussion 57

5. Diskussion

5.1. Autoradiographie

Der Nachweis eines gewebeständigen Antigens nach Inkubation mit einem Antikörper ist

ein Standardverfahren. Meist wird hierzu die immunhistochemische Technik ange-

wandt [26,77,105,122]. Bei der direkten Anfärbung des spezifischen Antikörpers,

z.B. durch eine Peroxidase-Reaktion, ist das Farbsignal jedoch zu gering, um auch kleine

Antigenmengen mit einer ausreichenden Sensitivität zu erfassen. Deshalb werden

indirekte Markierungsmethoden eingesetzt, bei denen durch Bindung verschiedener

Antikörper an den spezifischen Primär-Antikörper und besondere Markierungssysteme,

wie z.B. die Avidin-Biotin-Methode, ein stärkeres Farbsignal und damit eine erhöhte

Empfindlichkeit erreicht wird. Es erhöht sich aber auch der Anteil unspezifischer

Bindungen und somit falsch positiver Ergebnisse [143].

Als methodische Alternative wurde 1988 von Del Vecchio die Inkubation mit einem

radioaktiv markierten Antikörper vorgeschlagen [39]. Dabei wird der gebundene

spezifische Antikörper direkt durch die von ihm emittierte Strahlung als Autoradiogramm

nachgewiesen. Dadurch, daß bei der Autoradiographie die Nachweisempfindlichkeit

durch eine Verlängerung der Belichtungszeit vergrößerbar ist, ergibt sich mit dieser

Methodik insgesamt eine höhere Sensitivität als bei einer immunhistologischen Reaktion.

Unspezifische Antikörperbindungen sind prinzipiell möglich, werden aber in einem

wesentlich geringen Ausmaß beobachtet als bei der indirekten Immunhistochemie [141].

Dies wird durch Kontrollansätze zum Erkennen von unspezifischen Bindungen und

Maßnahmen zur Verhinderung bzw. Kontrollen der positiven oder negativen

Chemographie erreicht [141].

Das Phänomen der Entstehung von Silberkörnern ohne Anwesenheit eines Radioisotops

wird als positive Chemographie bezeichnet. Bei der negativen Chemographie wird das

Bild, das durch die Radioaktivität entsteht, teilweise oder ganz entfernt. Ursächlich

kommen gewebeständige Enzyme, mechanischer Druck, die Gewebefixation, hohe

Konzentrationen von Formaldehyd und Färbungen in Frage, die zu chemischen

Diskussion 58

Interaktionen zwischen Gewebekomponenten und der Photoemulsion führen. Auch eine

Verschleppung oder Lösung der radioaktiv markierten Substanzen ist denkbar. Durch

Kontrollansätze mit der gleichen Verarbeitung, jedoch ohne Radioaktivität, und

belichtete Kontrollansätze werden diese Phänome erkennbar.

Die Ergebnisse unserer Kontrollanordnung zeigten, daß bei der Herstellung der Auto-

radiogramme keine Chemographie nachweisbar war.

Als weitere Fehlerquelle wird der Nulleffekt angesehen [141]. Er beschreibt die Summe

aller Silberkörner, die unspezifisch entstanden sind. Als Ursachen gelten die kosmische

Höhenstrahlung, unbeabsichtigte Lichteinwirkung sowie Herstellungs- und Ver-

arbeitungseffekte beim Umgang mit dem photographischen Material. Auch hier zeigten

die Ergebnisse unserer Kontrollanordnung, daß der Nulleffekt unserer Autoradiographie

so gering war, daß er keinen Einfluß auf die Ergebnisse hatte.

Der Einsatz von 125I als Radioisotop in der Autoradiographie erwies sich als günstig.

Der hauptsächliche Zerfall über Auger-Elektronen mit einer Energie von 30 KeV

ermöglichte kurze Expositionszeiten in Rahmen der ersten Halbwertzeit von

60 Tagen [73]. Gleichzeitig konnte die erforderliche Aktivität reduziert werden. Dadurch

erhält man einen niedrigen Backgroundeffekt bei Maximierung der Auflösung [41].

Resultierend verringerte sich auch die Strahlenbelastung für den Untersucher bei der

Herstellung der Autoradiogramme [51].

Bei der Verwendung von 125I als Radioisotop zur Autoradiographie ist die Photoemulsion

K-2 der Firma Ilford wegen ihres geringen Backgroundeffektes bei hoher Sensibilität gut

geeignet [51]. Generell wird für die mikroskopische Autoradiographie die K-Serie der

Ilford-Photoemulsionen am häufigsten gebraucht [83].

Auch die eingesetzte Dipping-Technik [25,34,111,119,136], der Gebrauch von

Formalin-fixierten Gewebeschnitten, die Paraffineinbettung und Entparaffinierung mit

Xylol wurde vielfältig beschrieben [2,34,41,47,100]. Die genannten Methoden zählen zu

den Standardverfahren im Rahmen der Autoradiographie.

In der Literatur gibt es jedoch auch Kontroversen zu diesem Thema. So beschreibt

Moshakins einen 50-60 % Verlust an radioaktiv markiertem anti-CEA durch die

Fixierung in Formalin und Einbettung in Paraffin [111]. Ahnen und Zoubir zeigten in

ihren Studien mit gleicher Verarbeitungstechnik eine selektive Reduktion der Immun-

reaktivität von CEA in normalem Gewebe [3,151]. Ob dies durch quantitative oder

Diskussion 59

strukturelle Unterschiede zwischen CEA im normalen Gewebe und Tumorgewebe

bedingt war, bleibt zu klären. Der vergleichende Einsatz von Gefrierschnitten zeigte in

Arbeiten von Bosslet wie auch Harwood keinen Unterschied in der Intensität oder Ver-

teilung des Markierungsmusters [23,77]. Die Erkennung der Epitope war gleich, so daß

auf eine Stabilität der Antigendeterminate bei der Fixierung mit Formalin und Einbettung

in Paraffin geschlossen werden kann.

Eine histologische Färbung mit Hämatoxylin ohne positiven Chemographieeffekt der

Autoradiogramme und ohne Anfärbung der Gelatinebasis der Photoemulsion wurde

mehrfach veröffentlicht [34,47,98,100].

Die von uns angewandte Methode der Autoradiographie ist ein gängiges Verfahren, das

sich gegenüber anderen Techniken besonders durch seine hohe Sensitivität auszeichnet.

Durch Maßnahmen zur Verhinderung von unspezifischen Antikörperbindungen und der

methodenspezifischen Chemographie ließ sich eine hohe Spezifität erreichen.

Diskussion 60

5.2. Versuchsanordnung

Zunächst wurde untersucht, ob die Zeitspanne zwischen der Antikörperinjektion und der

Operation des Patienten ( gleichbedeutend mit dem Zeitpunkt der Fixierung des Prä-

parates ) einen Einfluß auf das Ergebnis haben könnte. Der Antikörper BW431/26 hat

eine Blutclearance von 38,1 Stunden. Haisma beschreibt bei einem Xenograft-Modell

einen gleichbleibenden Uptake im Tumorgewebe zwischen 8 und 120 Stunden [74].

Somit müßte zum Zeitpunkt der Gewebefixierung ( 3-5 Tage nach der Applikation ) der

Antikörper in einer optimaler Konzentration im Tumorgewebe vorliegen. Falls es eine

langsamere Clearance von 58,8 Stunden für Tumorgewebe geben sollte [74], würde das

Uptake-Verhältnis zwischen Tumor und gesundem Gewebe ebenfalls noch in einem

günstigen Bereich liegen

In unserer Untersuchung war den Patienten präoperativ ein Tc-99m markierter Anti-

körper intravenös injiziert worden. Mit einer Halbwertzeit von 6 Stunden zerfällt das

Radionuklid zu schnell, um es für eine direkte Autoradiographie nutzen zu können.

Deshalb haben wir den murinen Antikörper BW431/26 indirekt über einen radioaktiv

markierten anti-Maus Antikörper im Gewebe dargestellt [4]. Der Möglichkeit der un-

spezifischen Bindung des murinen Antikörpers wurde Rechnung getragen. Da das

Ergebnis unserer Versuche eine spezifische Bindung des Antikörpers BW431/26 durch

den Vergleich mit der CEA-Expression belegt, ist im Umkehrschluß das Ausmaß einer

unspezifischen Bindung des murinen Antikörpers als vernachlässigbar gering anzusehen.

Beide Antikörper wurden nach einer Modifikation der von Harwood [77] bzw.

Zoubir [151] beschriebenen Methode inkubiert.

Die untersuchten 15 Präparate stellen nur eine Auswahl dar. Für eine statistische Aus-

wertung reichte die Präparateanzahl nicht aus. Durch die Vorversuchsanordnung, die

parallelen Ansätze innerhalb der Anordnungen und die Kontrollansätze wurden für diese

Arbeit 150 Autoradiogramme angefertigt und untersucht.

Die beschreibende Auswertung der Autoradiogramme stellt kein quantitatives Verfahren

dar. Die subjektive Beschreibung der Autoradiogramme, der Markierungsmuster und der

Markierungsintensitäten erfährt durch die photographische Dokumentation jedoch einen

objektiven Charakter.

Diskussion 61

5.3. Ergebnisse

Die Expression des Carcinoembryonalen Antigens bei kolorektalen Karzinomen wird als

sehr heterogen beschrieben [64,117]. Das Muster der Antikörperbindung ist vor allem

von Histologie und CEA-Gehalt der Tumoren abhängig [151]. Eine Heterogenität in der

CEA-Struktur, die von dem Tumortyp abhängt, wird vermutet [19]. Im gesunden Kolon-

gewebe ist das Markierungsmuster homogen. Es kommt zur Markierung der apikalen

Zellmembran der Drüsenzellen, der Innenoberfläche der Drüsenzellen und der Drüsen-

krypten mit Präferenz der Kryptenausgänge [151].

Lewis beschreibt nach Immunperoxidase-Darstellung eines anti-CEA Antikörpers

differente heterogene Markierungsmuster bei verschieden Typen von kolorektalen

Karzinomen [102].

Ein muzinöses Adenokarzinom mit zentraler Nekrose und einem inhomogenem Zellbild

inklusive gut differenzierter Becherzellen, kleinen Saumzellen und Siegelringzellen zeigte

ein Markierungsmuster über fast allen Zellen. Dabei waren viele Zellgruppen sowohl an

der Zelloberfläche als auch im Zytoplasma gefärbt. Die Siegelringzellen hatten eine

Färbung des peripheren Zytoplasmaringes, aber nicht des intrazellulären Muzins. Das

extrazelluläre Muzin war ebenfalls negativ. Die feinen granulären Zelltrümmer der

nekrotischen Zellen hingegen zeigten eine intensive Anfärbung.

Das Markierungsmuster bei einem gut differenzierten muzinösen Adenokarzinom mit

hohen Saumzellen in drüsenähnlicher Anordnung mit muzinösen Lumen zeigte eine

Positivität über allen Tumorzellen mit intensiver Färbung der apikalen Zelloberfläche.

Zelltrümmer, nekrotische Zellen ohne neoplastische Drüsenlumina und extrazelluläres

Muzin erschienen positiv, oftmals sogar extrem stark gefärbt.

Ein weiterer Tumortyp war ein mäßig differenziertes Adenokarzinom mit hohen Saum-

zellen, die große drüsenähnliche Strukturen formten. Die Zellen zeigten einen mäßigen

nukleären Pleomorphismus. Es gab muzinöse Areale und lokale Nekrosen. Das Muster

der Immunperoxidase-Färbung war ähnlich dem des vorbeschrieben Tumortyps, ebenso

das Färbemuster eines gut differenzierten Adenokarzinoms, das ausgeprägte Areale mit

drüsenähnlichen Räumen aus Saumzellen ausbildete.

Ein Adenokarzinom mit geringer Differenzierung zeigte eine geringe spezifische Färbung

Diskussion 62

des vitalen Tumors. Die meisten Zellen waren negativ. Eine positive Markierung war nur

vereinzelt im Zytoplasma undifferenzierter Zellen und an der Zelloberfläche bei drüsigen

Strukturen zu sehen. Nekrotische Zelltrümmer waren immer stark positiv markiert. Bei

allen Tumortypen wurden sehr kleine Areale mit positiver Färbung im fibrösen Stroma

gesehen.

Diese unterschiedlichen Markierungsmuster sahen auch wir in unseren Autoradio-

grammen verschiedener kolorektaler Adenokarzinome.

Die gut differenzierten Adenokarzinome hatten eine einheitlich starke Schwärzung in den

Lichtungen der drüsigen Karzinomverbände. Die Tumorzellen waren durch eine

geringere Ansammlung von Silberkörnern mit apikaler Ausrichtung markiert.

Die weniger differenzierten Adenokarzinome zeigten ein sehr unterschiedliches

Markierungsmuster im Autoradiogramm. Die Ansammlung von Silberkörner in den

unregelmäßigen Lichtungen im drüsigen Karzinomverband variierte sehr stark. Über den

Tumorzellen lag eine mäßige Markierung ohne eine erkennbare Ausrichtungsprävalenz

vor.

Die untersuchten Präparate enthielten kaum nekrotische Gewebeanteile, so daß wir keine

sicheren Aussagen zum Markierungsverhalten von Nekrosen machen konnten.

Bei der autoradiographischen Darstellung des CEA im angrenzenden gesunden Gewebe

von gut differenzierten Adenokarzinomen beobachten wir eine Zunahme der

CEA-Markierung in Abhängigkeit von der Tumornähe. Zoubir beschrieb dieses

Phänomen in ähnlicher Weise [151]. Diese Auffälligkeit wirft die Frage nach der bisher

ungeklärten Funktion des Carcinoembryonalen Antigens auf. Obwohl das CEA zu den

am besten erforschten tumorassoziierten Antigenen gehört, bestehen auf diesem Gebiet

noch keine gesicherten Erkenntnisse.

Bei der Analyse der intratumoralen Verteilung des in vivo applizierten Antikörpers

BW 431/26 sahen wir eine heterogen Aufnahme in das Tumorgewebe. Die unter-

schiedliche autoradiographische Darstellung variierte in Abhängigkeit von der Dif-

ferenzierung der Adenokarzinome.

Da die Expression des Carcinoembryonalen Antigens in gleicher Weise von der histo-

logischen Differenzierung abhängt und unspezifische Markierungsreaktionen durch den

Antikörper BW 431/26 fehlten, kann die intratumorale Verteilung als spezifische

Bindung an das Carcinoembryonale Antigen angesehen werden.

Diskussion 63

Der Detailvergleich der autoradiographischen Lokalisation des anti-CEA Antikörpers mit

der CEA-Expression zeigte jedoch, daß der systemisch applizierte Antikörper nicht alle

möglichen Antigenlokalisationen im Gewebe erreicht hatte. Die stärkste Akkumulation

fand sich im bindegewebigen Stroma, das die Tumorzellen umgibt und in dem die Blut-

gefäße lokalisiert sind, und an den Tumorzellen. Die Lichtungen der drüsigen Karzinom-

verbände, die die intensivste Expression des Carcinoembryonalen Antigens aufwiesen,

zeigten jedoch keine entsprechende Antikörperanreicherung.

Dieses Ergebnis ist vergleichbar mit Arbeiten über die Antikörperverteilung bei

Xenograft-Modellen. DePalatis beschreibt in einer Arbeit, daß die Gewebeverteilung

eines spezifischen Antikörpers mit dem Zielantigen (TAG-72) kaum übereinstimmt [41].

Über ein ähnliches Ergebnis berichtete Jones bei Verwendung von zwei anti-CEA

Antikörpern [90]. Das Muster der Antikörperverteilung bei Xenografts korrelierte nicht

mit der entsprechenden CEA-Expression. Auch bei Lewis stimmte die Akkumulation von

anti-CEA Antikörpern nicht mit der CEA-Verteilung überein [101]. In einer weiteren

Arbeit fand er mehr Antikörper im Extrazellulärraum als im CEA-positiven

Tumorgewebe [74]. Lewis schloß daraus, daß das extrazelluläre Carcinoembryonale

Antigen für den spezifischen Antikörper besser zu erreichen ist als das Antigen an der

Zelloberfläche. Ein entsprechendes Verteilungsverhalten beschrieb auch Moshakis [111].

Beatty sah überwiegend eine Bindung des anti-CEA Antikörpers an Antigen im

Extrazellulärraum und nur im geringen Maße an der Zellmembran oder im Zyto-

plasma [12].

1992 führte Boxer direkte autoradiographische Untersuchung zur Lokalisation eines

monoklonalen anti-CEA Antikörpers (Mab A5B7) an Präparaten von Patienten mit kolo-

rektalen Karzinomen durch [26]. Er fand eine vorwiegende Lokalisation des Antikörpers

an den Tumorzellen. Er deutete die heterogene Verteilung als multifaktoriell, wobei

neben der CEA-Expression die limitierte Penetration des Antikörpers im Gewebe eine

Rolle spielte. In einer weiteren Studie konnte Boxer nachweisen, daß der untersuchte

Antikörper sein Zielantigen nicht erreichte, wenn dieses an der luminalen Oberfläche

exprimiert wird. Epitope an basalen oder basolateralen glandulären Strukturen seien für

Antikörper besser über Diffusion zugänglich [25]. Auch Colcher beschriebt eine

Abhängigkeit der Verteilung des Antikörpers von der Erreichbarkeit des Epitops an der

Zelloberfläche [36]. Diese Erkenntnisse stehen im Einklang mit den zahlreichen in der

Diskussion 64

Einleitung beschriebenen Faktoren, die Aufnahme und Verteilung eines Antikörpers im

Tumor beeinflußen. Unsere Ergebnisse über die Verteilung des Antikörpers BW431/26

sind vergleichbar und ebenfalls durch die pathophysiologischen Besonderheiten des

Tumorgewebes zu erklären. In welchem Umfang die Vaskularisation, Transportbarrieren

oder die „binding site barrier“ für die intratumorale Verteilung entscheidend sind, läßt

sich durch diese Studie nicht klären. Die genannten Faktoren spielen aber eine elementare

Rolle bei der Erörterung der Frage, warum der Antikörper das Zielantigen zwar

spezifisch erkennt, aber nicht alle Tumorabschnitte erreicht.

Das unspezifische Markierungsverhalten des Antikörpers BW 431/26 im Lebergewebe

bei spezifischer Markierung des Carcinoembryonalen Antigen in Lebermetastasen eines

Adenokarzinoms läßt sich durch die physiologische Bindung der Immunglobuline und

deren Metabolismus in der Leber erklären [148]. Hieraus resultiert auch die bekannte

limitierte Sensitivität der Radioimmunszintigraphie für Lebermetastasen der kolorektalen

Adenokarzinome [8,72].

Die genannten Besonderheiten der intratumoralen Antikörperverteilung widersprechen

der spezifischen Bindung des Antikörpers nicht. Sie deuten aber grundsätzliche

methodische Probleme der Radioimmunszintigraphie und der Tumortherapie mit Anti-

körpern an, die vor allem in einem nur geringen Kontrast zwischen Antikörper-

anreicherung im Tumor und im gesunden Gewebe bestehen.

Die derzeitigen Forschungsansätze konzentrieren sich auf eine Verbesserung der Anti-

körperaufnahme in den Tumor, um die Sensitivität der Radioimmunszintigraphie noch

weiter zu verbessern und eine „selektive Tumortherapie“ zu verwirklichen.

Dabei geht man von verschiedenen methodischen Ansätzen aus. Modulationen der Anti-

körper stellen eine Möglichkeit dar. So kommen Antikörperfragmente, Kombinationen

aus humanen und murinen Antikörpern und chemisch modifizierte Antikörper zum

Einsatz [30,35,40,60,71,109,115,125,137]. Daneben versucht man, die Antikörper-

aufnahme des Tumors über eine Zunahme der Tumorvaskularisation und Permeabilität zu

erhöhen, zum Beispiel durch vasoaktive Medikamente, externe Bestrahlung oder

Hyperthermie [66]. Fooli konnte zeigen, daß durch Injektion von Tumornekrose-

faktor (TNF) die Permeabilität der Tumorgefäße zunimmt und die Antikörperaufnahme

verbessert wird [52].

Diskussion 65

Ein andere Forschungsrichtung beschäftigt sich mit der Modulation des Tumorantigens.

Durch Interferone kann selektiv die Antigenexpression im Tumor gesteigert werden [69].

Auf diese Weise wird auch die Antikörperaufnahme erhöht [135]. Dies wird jedoch

durch das Ergebnis der vorliegenden Arbeit in Frage gestellt. Wenn die Aufnahme des

Antikörpers durch die Antikörperkinetik limitiert wird, dürfte eine erhöhte Antigen-

präsenz allenfalls einen geringen Einfluß auf die Gesamtaufnahme haben. Dies wird von

dem Befund unterstrichen, daß der Antikörper kaum die Stellen erreicht, die in unseren

Autoradiogrammen die höchste CEA-Konzentration aufwiesen.

Als weitere Alternative zur Optimierung der Antikörperaufnahme wurden in den letzten

Jahren sogenannte Zwei-Schritt-Systeme entwickelt. Dabei wird zunächst ein

spezifischer Antikörper appliziert. Nach Bindung am spezifischen Antigen und

Elimination des zirkulierenden Antikörpers aus dem Blut wird in einem weiteren Schritt

ein Radionuklid oder ein zytotoxisches Agens appliziert, das rasch an den Antikörper

bindet [92,113,118,138]. Zwar läßt sich durch Einsatz eines Zwei-Schritt-Systems die

absolute Antikörperaufnahme in den Tumor nicht erhöhen, durch Reduktion

unspezifischer Bindungen kann jedoch der Tumorkontrast erhöht und im Fall einer

Radioimmuntherapie die Bestrahlung von Normalgewebe reduziert werden [127].

Das Ergebnis dieser Arbeit zeigt, daß die Antikörperaufnahme wesentlich von den patho-

physiologischen Eigenschaften des Tumorgewebes abhängt, die die Antikörperkinetik

determinieren. Da diese Faktoren einzeln nur schwer beeinflußbar sind, bietet der

Therapieansatz zur Reduktion unspezifischer Bindungen prinzipiell Vorteile. Die

Therapieerfolge bei Tumoren mit kleinen Volumina und Mikrometastasen sind ver-

ständlich, da die Antikörperaufnahme mit der Tumorgröße invers korreliert [150].

Abschließend sei angemerkt, daß nach David M. Goldenberg die größte Bedeutung in

der Entwicklung, Erforschung und im Gebrauch monoklonaler Antikörper vielleicht in

der Möglichkeit der Tumortherapie liege, wobei aber momentan die Perfektion der

tumorspezifischen Therapie durch die Komplexität der menschlichen Karzinome

frustriert werde [61,67].

Zusammenfassung 66

6. Zusammenfassung

Die Radioimmunszintigraphie beruht auf dem Grundprinzip, daß ein Zielantigen durch

Bindung eines radioaktiv markierten Antikörpers in vivo lokalisiert wird. Dabei ist der

Erfolg von der Intensität der Akkumulation des radioaktiv markierten Antikörpers bzw.

vom Tumor/Background Verhältnis abhängig. Ebenso ist die spezifische Bindung des

Antikörpers an sein Zielantigen Voraussetzung dieser Methode. Trotz methodischer

Verbesserungen wird die Sensitivität der anti-CEA Radioimmunszintigraphie für die

Differentialdiagnostik eines Lokalrezidiv bei kolorektalen Karzinomen mit einer weiten

Spanne von 70-100 % angegeben. Als Ursache wird die sehr geringe Anreicherung des

Antikörpers im Tumorgewebe angeführt. Der aufgenommene Anteil der Radioaktivität

pro Gramm Tumor liegt in der Größenordnung 0,001-0,03 % der injizierten Radio-

aktivität.

Neue Formen der Tumorbehandlung durch radioaktive Antikörper oder Konjugation des

Antikörpers mit Chemotherapeutika oder Zytotoxinen finden ebenfalls ihre Limitationen

in der zu geringen Antikörperanreicherung im Tumor und der zu geringen Spezifität des

Antikörpers für das Zielantigen.

In der vorgelegten Arbeit wurde analysiert, ob die Verteilung eines applizierten Anti-

körpers der Verteilung des Zielantigens im Sinne einer spezifischen Bindung entspricht.

Dazu wurden Operationspräparate kolorektaler Karzinome von 15 Patienten untersucht.

Präoperativ war jeweils der murine monoklonale anti-CEA Antikörper BW431/26 intra-

venös injiziert worden. Die CEA-Expression und die intratumorale Antikörperverteilung

wurden an Gewebeschnitten der Operationspräparate miteinander verglichen.

Zur Darstellung des Antikörpers wurden die Gewebeschnitte mit einem anti-Maus Anti-

körper, markiert mit 125I, inkubiert. Korrespondierende Gewebeschnitte inkubierten wir

mit einem anti-CEA Antikörper. Dazu benutzten wir erneut den Antikörper BW431/26

mit einer 125I-Markierung.

Durch eine anschließende autoradiographische Aufarbeitung erhielten wir eine Dar-

stellung der histologischen Mikroverteilung des in vivo applizierten murinen Antikörpers

und der CEA-Expression in vergleichbaren Gewebeschnitten.

Zusammenfassung 67

Die Autoradiographie zeigte ein typisches Markierungsmuster für das Carcino-

embryonale Antigen im gesunden Kolongewebe und beim kolorektalen Adenokarzinom.

Die Radioaktivität war deutlich in den Lichtungen der drüsigen Karzinomverbände und

über den Tumorzellen zu sehen. Hierbei war das Ausmaß der Markierung abhängig von

der Differenzierung des Tumors. Die Verteilung des in vivo applizierten anti-CEA Anti-

körpers BW 431/26 ergab ein ähnlich differentes Markierungsmuster. An den Tumor-

zellen und im umgebenden Bindegewebe entsprachen sich Antikörperverteilung und

Antigenexpression. In den Lichtungen der drüsigen Karzinomverbände, die sehr viel

CEA enthielten, lies sich der Antikörper jedoch nur in diskreter Menge nachweisen.

Hieraus läßt sich einerseits die spezifische Bindung des anti-CEA Antikörpers an das

Carcinoembryonale Antigen ableiten. Andererseits deuten diese Ergebnisse an, daß sich

der Antikörper im Tumor nicht gleichmäßig verteilt hat und demzufolge nicht alle

Antigen-positiven Tumoranteile erreichen konnte. Dies dürfte durch Besonderheiten der

Tumorpathophysiologie, insbesondere der Vaskularisation und den gestörten Substrat-

transport, bedingt sein. Eine quantitative Einschätzung der Einflüsse der genannten

Faktoren konnte im Rahmen dieser Studie nicht erreicht werden.

Die erhobenen Befunde widersprechen nicht der spezifischen Bindung des Antikörpers.

Sie unterstreichen aber die Bedeutung von Forschungsansätzen zur Verbesserung der

Radioimmunszintigraphie und Radioimmuntherapie, bei denen eine vermehrte intra-

tumorale Antikörperaufnahme zur Erhöhung des Uptake-Verhältnis zwischen Tumor und

gesundem Gewebe angestrebt wird.

Literaturverzeichnis 68

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Danksagung 84

8. Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die mir ermöglicht haben, diese

Studie durchzuführen:

Herrn Professor Dr. med. R. Bares, Direktor der Abteilung und Lehrstuhl für Nuklear-

medizin des Universitätsklinikums Tübingen, für die freundliche Überlassung des

Themas, die Betreuung der Arbeit und die vielen wertvollen Anregungen.

Herrn Professor Dr. rer. nat. Dr. med. H. Korr, Lehr- und Forschungsgebiet Anatomie

und Zellbiologie der RWTH Aachen, für die freundliche Anleitung zur Methode der

Autoradiographie, die Möglichkeit, die Autoradiogramme in seiner Abteilung herzustellen,

und die vielen Anregungen.

Herrn Professor Dr. med. C. Mittermayer, Direktor des Institutes für Pathologie der

RWTH Aachen, für die Überlassung der histologischen Präparate.

Herrn Professor Dr. med. U. Büll, Direktor der Klinik für Nuklearmedizin der

RWTH Aachen, für die Möglichkeit, die Inkubationsexperimente in seiner Abteilung

durchzuführen.

Herrn Professor Dr. med. S. Hauptmann, Institut für Pathologie der Charité Berlin,

für die Anleitung zur Auswertung der histologischen Präparate und seine Anregungen.

Herrn Professor Dr. med. G. Konrad, Chefarzt der Klinik für Urologie, Kinder-

urologie und urologische Onkologie, Kliniken Maria Hilf in Mönchengladbach, für die

Möglichkeit, die mikroskopische Dokumentation in seiner Abteilung durchzuführen.

Lebenslauf 85

9. Lebenslauf

Persönliche Daten:

Name: Kremer

Vorname: Andreas

Geburtsdaten: 9. Juni 1967 in Birkesdorf, jetzt Düren

Familienstand: ledig

Konfession: römisch-katholisch

Eltern: Konrad Kremer, Bankangestellter

Theresia Kremer (=), Bankangestellte

Schulausbildung:

Grundschule: 1973-1977 Städtische Grundschule Nord, Düren

Gymnasium: 1977-1987 Stiftisches Gymnasium, Düren

Berufsausbildung:

Studium der Humanmedizin: 1987-1994 RWTH Aachen

Praktisches Jahr: 1994 Kreiskrankenhaus Marienhöhe in Würselen,

Wahlfach Anästhesie

Ärztliche Prüfung: 1994 RWTH Aachen

Approbation als Arzt: 1995 Bezirksregierung Köln

Berufstätigkeit als Arzt:

• 1994-1995 Maria Hilf Krankenhaus in Bergheim/Rheinland (AiP)

Abteilung für Anästhesie und operative Intensivmedizin

Chefärztin Frau Dr. med. E. Doepke

• seit 1996 Kliniken Maria Hilf in Mönchengladbach

Klinik für Anästhesie und operative Intensivmedizin

Chefarzt Herr Dr. med. G. Zentgraf

• 1996 Fachkunde Rettungsdienst

• 1997 Ausbildung zum Arzt im Zivilschutz

• 1998 Fachkunde Strahlenschutz

• 1998 Facharzt für Anästhesiologie

• 1998 Ausbildung zum Leitenden Notarzt

• 1999 Zusatzbezeichnung Sportmedizin

Documents

Vergleichende autoradiographische Untersuchungen zur CEA ...sylvester.bth.rwth-aachen.de/dissertationen/1999/6/99_6.pdf · Die Einführung der Hybridoma-Technik 1975 durch Köhler