Embed Size (px)
Citation preview
VERIFIKASI DAN VALIDASI METODE PENGUJIAN
MENDUKUNG PENERAPAN ISO/IEC 17025:2017
UNIVERSITAS SAMRATULANGI-MANADO
IN HOUSE TRAINING 25-26 OKTOBER 2021
Dra Diana Boes MM
Mengapa Metode Harus Divalidasi (Diverifikasi)
• Tuntutan dari Pasar Internasional akan kualitas yangbaik dari produk yang diproduksi/ diperdagangkan
• Kualitas yang baik dapat diketahui dari data hasilanalisis yang absah (andal) terhadap komponen-komponen yang terkandung dalam bahan tersebut
Keabsahan/Keandalan Data Hasil Analisis Kimia
• Jaminan Mutu dari data analisis yang dihasilkan olehlaboratorium yang dapat diterima baik secaranasional, regional maupun internasional
Bagaimana menetapkan Parameter Unjuk Kerja Metode ?
• Diatur dalam EURACHEM GUIDE mengenai Validasi Metode
Didefinisikan dalam ISO/IEC 17025 : 2017
ISO/IEC-17025-2017
• 7.2 Seleksi, verifikasi dan validasi metode
• 7.2.1.1 Laboratorium harus menggunakan metode danprosedur yang sesuai untuk semua pengujian dan / ataukalibrasi. Ini termasuk prosedur untuk pengambilan sampel,penanganan, pengangkutan, penyimpanan dan penyiapanbarang yang akan diuji dan / atau dikalibrasi, dan bila sesuai,untuk evaluasi ketidakpastian pengukuran serta teknikstatistik untuk analisis data uji dan / atau kalibrasi.
• 7.2.2.3 Laboratorium harus memverifikasi bahwa dapatmelakukan metode dengan benar sebelum digunakan denganmemastikan bahwa dapat memenuhi persyaratan kinerja.Rekaman verifikasi harus dijaga. Jika metode direvisi, verifikasiharus diulang sejauh diperlukan.
ISO/IEC-17025-2017
• 7.2.3.1 Laboratorium harus memvalidasi metode non-standar,metode yang dikembangkan oleh laboratorium dan metodestandar yang digunakan di luar lingkup yang dimaksudkan(metode standar yang dimodifikasi).
• Validasi harus sesuai yang diperlukan untuk memenuhikebutuhan. Laboratorium harus mencatat hasil yangdiperoleh, prosedur yang digunakan untuk validasi, danpernyataan apakah metode tersebut sesuai untukpenggunaan yang diinginkan.
Metode Standar
• Metode sudah divalidasi
• Siapa yang memvalidasi metode tersebut ??
Apabila metode standar digunakan di laboratorium :
• Apakah analis di laboratorium tersebut sama trampilnyadengan analis yang memvalidasi metode baku tsb ??
• Apakah peralatan analisis yang ada di laboratorium tsb samabaiknya dengan peralatan yang digunakan untuk memvalidasimetode tsb ??
• Oleh karena itu metode standar masih harus di verifikasi
Bagaimana Melakukan Validasi Metode ?
Diatur dalam berbagai petunjuk
❑ EURACHEM GUIDE
❑ Petunjuk ISO mengenai Validasi Metode
❑ SAC-Singlas Guide
Tujuan Validasi/Verifikasi Metode Pengujian
• Tujuan validasi metode adalah untuk mengetahui sejauh manapenyimpangan yang tidak dapat dihindari dari suatu metode padakondisi normal dimana seluruh elemen terkait telah dilaksanakandengan baik dan benar.
• Dengan memvalidasi metode, maka dapat diperkirakan dengan pastitingkat kepercayaan yang dihasilkan oleh suatu metode pengujian.
• Tujuan verifikasi metode adalah untuk melakukan konfirmasi ulangterhadap metode standar
Variasi hasil pengujian kimia
• Variasi hasil pengujian bisa terjadi :
– Antar laboratorium
– Antar analis
– Antar metode analisis
• Faktor penyebabnya:
– Faktor laboratorium (lingkungan, peralatan, reagen,fasilitas)
– Faktor metode analisa (validasi/konfirmasi)
– Pengumpulan dan pengolahan data (pengamatan, pengolahan dan interprestasi)
– SDM (supervisi, kompetensi)
Perlunya validasi metode analisis :
– Untuk menentukan apakah seluruh tahap pengujian telahmemenuhi standar yang ditetapkan
– Hasil uji yang akurat adalah pencerminan daripelaksanaan yang baik dari seluruh tahapan pengujian.Maka validasi metode dilakukan dengan cara mengujiakurasi hasil analisis
– CRM/SRM adalah salah satu sarana untuk menguji akurasihasil analisis tersebut
Dalam proses validasi metode
Penentuan parameter-parameter unjuk kerja metodedilakukan menggunakan peralatan yang memenuhispesifikasi, bekerja dengan baik dan terkalibrasisecara memadai
Unjuk Kerja Metode Pengujian
Teknik yang digunakan untuk memvalidasi metodemerupakan salah satu, atau kombinasi dari hal-hal berikut:
• kalibrasi menggunakan standar acuan atau bahanacuan;
• pembandingan hasil yang diperoleh dengan metodelain;
• uji banding antar laboratorium;• asesmen yang sistematis pada faktor-faktor yang
mempengaruhi hasil;• asesmen pada ketidakpastian
Rencana validasi/verifikasi metode
Rencana validasi/verifikasi metode :
a. jenis metode yang akan divalidasi/diverifikasi
b. waktu pelaksanaan dan
c. sumber daya yang dibutuhkan yaitu:
• personil yang kompeten
• kondisi akomodasi dan lingkungan pengujian sesuai denganyang dipersyaratkan dalam metode pengujian
• peralatan yang digunakan harus telah dikalibrasi sehinggamampu telusur ke satuan sistem internasional serta telahdilakukan uji kinerja sesaat sebelum digunakan
• bahan kimia termasuk bahan acuan bersertifikat memenuhipersyaratan teknis dalam metode pengujian
Siapa Yang Melakukan Validasi Metode ??
• Dilakukan oleh laboratorium yang memakai metode yang bersangkutan
– Diperlukan data validasi yang berlaku di laboratorium yangmungkin berbeda dengan kinerja metode asalnya
– Kalau dalam validasi, tidak ada labolaratorium lain untukuji banding, maka validasi terpaksa dilakukan sendiridengan cara :
Melakukan Validasi Sendiri
• Membandingkan hasil uji dari metode yang bersangkutanterhadap metode lain yang berbeda dengan jalan mengukurCertified Reference Material (CRM)
• Bandingkan metode yang akan di validasi terhadap metodelain yang sudah tervalidasi
Parameter validasi/verifikasi metode mencakup penetapan :
• Presisi (Repeatabilitas dan Reprodusibilitas)
• Akurasi : Trueness dan bias
• Batas deteksi minimum dan batas kuantisasi minimum
• Linearitas
• Konfirmasi identitas
• Estimasi ketidakpastian
Presisi (Repeatability dan Reproducibility)
Presisi (kecermatan)
• Presisi adalah variabilitas dari beberapa kali
pengukuran/pengujian.
• Presisi menggambarkan kecermatan data dan
berkaitan dengan kesalahan random (acak)
• Presisi (Kecermatan)
– Repeatability (lab sama, analis sama)
– Reproducibility (ada yang berbeda )
• intra reproducibility – r (lab sama, analis
berbeda)
• interreproducibility - R (lab berbeda, analis
berbeda)
Mengukur Presisi hasil analisis
No Yang diuji Yang dihitung
Standar, Reference Material atau
blanko contoh yang ditambahkan
analit dengan berbagai
konsentrasi
1 Oleh analis, alat & laboratorium
yang sama dalam waktu pendek
(analisis 10 kali)
Hitung deviasi standar (s) pada masing-
masing konsentrasi, RSD (ukuran untuk
repeatibilitas masing-masing
konsentrasi yang bersangkutan)
2 Oleh analis & laboratorium yang
berbeda dalam 1 lab yang sama
(analisis 10 kali)
Hitung seperti diatas (ukuran intralab-
reproducubility pada masing-masing
konsentrasi yang bersangkutan)
3 Oleh analis, alat dan laboratorium
yang berbeda-beda ( yaitu dalam
uji banding antar lab)
Hitung seperti diatas (ukuran interla-
boratory reproducibility pada masing-
masing konsentrasi yang bersangkutan
Simpangan Baku (s)
(x - x )2
s =
( n - 1 )
Simpangan Baku = Akar Variansi
Menghitung Simpangan Baku
( x - x )2
s = ( n - 1 )
24
x ( x - x ) ( x - x )2
58,2 0,2 0,04
61,0 3,0 9,00
56,6 -1,4 1,96 s = 42,10 / 5
61,5 3,5 12,25
53,8 -4,2 17,64 s = 2,902
56,9 -1,1 1,21
Juml 348 42,10
xrata-rata 58,0
Simpangan Baku Relatif/Relatif Standar Deviasi (RSD) dan Koefesien Variasi (CV)
sRSD =
x
= 0,05
sCV(%) = 100 = 5 %
x
=2,902
58
Persamaan Horwitz
• Reproducibility Metode
CV (%) = 21-0,5 log C
Konsentrasi 1 % C = 0,01
Konsentrasi 1 ppm C = 10-6
Untuk Repeatability persyaratan yang dipakai adalah:
0,66 x CVHorwitz
Kurva Horwitz
Persamaan Horwitz
CV (%) = 21-0,5 log C
Untuk konsentrasi 1 % C = 0,01
CV (%) = 21-0,5 log 0,01
CV (%) = 21-(0,5. -2)
CV (%) = 21+1 = 22 = 4
Persamaan Horwitz
CV (%) = 21-0,5 log C
Untuk konsentrasi 1 ppm C = 10-6
CV (%) = 21-0,5 log 0,000001
CV (%) = 21-(0,5. -6)
CV (%) = 21+3 = 24 = 16
Intra Reproducibility (r)
• Tingkat presisi selain mengevaluasi cermat yangberasal dari metode, juga yang berasal dari operator
• Dilakukan sama dengan repeatability, hanyadilakukan oleh operator yang berbeda dan waktupelaksanaan yang berbeda
• Metode memiliki intra reproducibility yang baik jika%RSD≤ 2/3 x CVHorwitz
Inter Reproducibility (R)
• Pelaksanannya sama dengan uji profisiensi
• Metode dikatakan memiliki inter reproducibility baik jika % RSD ≤ CVHorwitz
Analisis Berat Endapangr/100 mL
1 1.4982 1.4913 1.5104 1.4975 1.4966 1.4877 1.4988 1.4939 1.51210 1.482
1. Laboratorium sedang memvalidasi metode gravimetri. Dari 10 kali pengulangan penetapan suatu sampel menggunakan kandidat metode diperoleh hasil sbb:
Presisi metode gravimetri ini valid atau tidak?
Contoh Konsentrasidari 7 x ulangan
I 2,43 gr/LII 2,43 mg/100 mLIV 2,43 gr/100 mLV 2,43 ppmVI 2,43 ppbVII 2,43 pptVIII 2,43 µg/grIX 2,43 g/LX 2,43 mg/L
Hitung CVHorwitz dari berbagai konsentrasi dibawah ini:
Akurasi : Trueness & Bias
Akurasi : Trueness & Bias
• Bias merupakan perbandingan selisih nilai rata-rata hasil pengujian dengan nilai benar dari CRM
• Trueness sering dinyatakan sebagai akurasi merupakanperbandingan antara nilai rata-rata hasil pengujian dengan nilai benar dari CRM
dimana := rata-rata hasil pengujian
µ = nilai benar dari CRM
100%xμ
x%Trueness=
x
%100.%
−=
xBias
Truenes
• Truenes sering dinyatakan sebagai akurasi yangmerupakan perbandingan antara nilai rata-ratahasil pengulangan pengujian dengan nilai benardari CRM yang dinyatakan dalam persentase
% Truenes = x/µ×100%
x= rata hasil pengujian
µ=nilai CRM
Bias lebih umum digunakan
• Akurasi dapat ditentukan melalui berbagai cara:
– CRM
– Perbandingan dengan metode lain
– Standar Adisi
Trueness, Bias dan Presisi metode
Langkah penentuan trueness, bias dan presisi metode :
• Siapkan semua peralatan yang terkalibrasi dan memenuhi persyaratan metode;
• Siapkan personil yang kompeten dalam pengujian terkait;
• Kondisi akomodasi dan lingkungan harus memadai;
• Lakukan pengujian analit dalam CRM sebagaimana pengujian sampelminimal 7 kali sesuai tahapan metode;
• Hitung konsentrasi analit dalam CRM,
• Hasil pengujian analit dalam CRM harus berada dalam nilaiketidakpastian yang tercantum dalam sertifikat CRM atau nilai akurasi(%R) memenuhi batas keberterimaan;
• Hitung nilai rerata dan simpangan baku
• Hitung bias dan presisi metode
Pengulangan Hasil (µg/L) %Tureness %Bias
1 21,40 93,0 -1,82 20,40 88,7 11,33 20,80 90,4 9,64 21,70 94,3 5,75 21,20 92,2 7,86 21,00 91,3 8,77 20,60 89,6 10,4
Rerata 21,01 92,6 7,4Simpangan baku 0,46
%RSD 2,17
Contoh : CRM untuk penentuan trueness dan bias
Certified Value : 23,0 ± 0,953 µg/L
%100.arg
%ettNilai
terukurNilaiTrueness =
Persyaratan
1) %RSD < 0,67 HV
2) %R ≈ 70% - 125%
Batas keberterimaan %RSD dan %R untuk penentuan bias dan presisi metode :
Akurasi Cara Menentukannya
Analisis Pengu-
langan
Perhitungan
1. Blanko pelarut dan
2. Bahan acuan
mengunakan kandidat
metode yang akan
divalidasi
10 Rata-rata analit dlm bahan acuan diku-
rangi rata-rata blanko pelarut Bandingkan dengan nilai analit sebenar-
nya dlm bahan acuan Selisihnya memberikan nilai penyimpang-
an dari metode
1. Blanko pelarut dan
2. Bahan acuan/uji
menggunakan:
a) Kandidat metode dan
b) Metode lain (yang
berdiri sendiri/tidak
tergantung dari kandidat
metode)
10 Rata-rata analit dlm bahan acuan/uji diku-
rangi rata-rata blanko Bandingkan dengan hasil pengukuran
serupa menggunakan metode lain. Selisihnya memberikan nilai penyimpang-
an metode relatif terhadap metoda lain
tersebut diatas
Standar Adisi untuk Percobaan Akurasi
Cstandar yang ditambahkan
Y
Canalit dlm contoh
x
x
x x
x
Perbandingan dengan Metode Lain
• Hasil pengujian metode 1 dan hasil pengujian metode 2 di uji dengan student (t)-test
• Metode dikatakan akurat apabila hasil pengujian metode 1 dan hasil pengujian metode 2 tidak berbeda signifikan
• Apabila hasil pengujian metode 1 dan hasil pengujianmetode 2 ternyata berbeda signifikan maka metode yang sedang divalidasi tidak akurat.
Apabila ternyata laboratorium tidak mempunyai
CRM
Maka akurasi dapat diperoleh melalui cara:
• Perbandingan dengan metode lain (metoda
lain tersebut harus tidak bergantung dari
metode yang sedang divalidasi)
• Standar Adisi menggunakan beberapa
(umumnya 5 atau 6) konsentrasi
Perbandingan dengan Metode Lain
• Hasil pengujian metode 1 dan hasil pengujian
metode 2 di uji dengan student (t)-test
• Metode dikatakan akurat apabila hasil pengujian
metode 1 dan hasil pengujian metode 2 tidak
berbeda signifikan
• Apabila hasil pengujian metode 1 dan hasil pengujian
metode 2 ternyata berbeda signifikan maka metode
yang sedang divalidasi tidak akurat.
Jenis-jenis Uji t
1. Uji t untuk suatu kumpulan data dibandingkan
terhadap suatu nilai tunggal
2. Uji-t untuk membandingkan dua kumpulan data
3. Paired t-test (uji-t untuk data berpasangan)
Uji-t untuk Suatu Kumpulan Data Dibandingkan
Terhadap Suatu Nilai Tunggal
Rumus yang digunakan untuk menghitung t :
Di mana x = nilai rata-rata = nilai acuan n = jumlah datas = standar deviasi
Ctt: derajat bebas = n-1
( )s
nxt
−=
Contoh Uji-t Untuk Suatu Kumpulan Data
Dibandingkan Terhadap Suatu Nilai Tunggal
Suatu lab hendak menggunakan metode baru untuk
analisis selenium dalam air. Diadakan percobaan untuk
mengetahui akurasi metoda baru tersebut dengan cara
menguji contoh air ledeng yang telah di-spiked dengan
50 ppb selenium menggunakan metode baru tsb.
Diperoleh hasil sbb:
50,4; 50,7; 49,1; 49,0; 51,1 ppb
Apakah hasil tersebut akurat?
Contoh Uji-t Untuk Suatu Kumpulan Data
Dibandingkan Terhadap Suatu Nilai Tunggal (lanjutan)
• Ho: hasil uji metode baru akurat
• H1: hasil uji tidak akurat
• Nilai rata-rata dari 5 data hasil percobaan ( x ) adalah 50,06 ppb dan standar deviasi (s) 0,956 ppb.
• Nilai tunggal acuan () = 50 ppb
• Menggunakan rumus
• Dari tabel diperoleh nilai kritis, t4 = 2,78 (P=0,05)
• Karena t-hitung < t-tabel, maka Ho diterima, yangberarti bahwa hasil uji metode baru akurat (tidakberbeda secara nyata dengan nilai acuan)
( )14,0
956,0
55006,50=
−=t
Uji-t Untuk Membandingkan 2 Kumpulan Data
Untuk menguji apakah dua nilai rata-rata, x1 dan x2
berbeda secara nyata, maka t dihitung menurut
rumus:
di mana s dihitung menurut rumus:
Catatan: derajat bebas = n1 + n2 -2
21
21
11
)(
nns
xxt
+
−=
( ) ( )( )2
11
21
2
22
2
11
−+
−+−=
nn
snsns
Contoh Uji-t Untuk Membandingkan 2 Kumpulan
Data
• Perbandingan antara dua metode analisis analit x dari
suatu contoh memberikan data sbb:
Metoda 1: rata-rata = 1,48; s1 = 0,28
Metode 2: rata-rata = 2,33; s2 = 0,31
Dari masing-masing metode diperoleh 5 data
• Apakah hasil dari kedua metode tersebut berbeda
secara nyata?
Contoh Uji-t Untuk Membandingkan 2 Kumpulan
Data (lanjutan)
• Ho: hasil kedua metode sama
• H1: hasil kedua metode berbeda secara
nyata
• Standar deviasi gabungan, s, dihitung menurut rumus
( ) ( )( )
295,0255
31,01528,015 22
=−+
−+−=s
Contoh Uji-t Untuk Membandingkan
2 Kumpulan Data (lanjutan)
• t dihitung menurut rumus :
• Nilai kritis dari tabel dengan derajat bebas = 8 (n1+n2-2), diperoleh t8= 2,31 (P=0,05)
• Karena nilai t-hitung > t-tabel, maka Ho ditolak. Berartihasil kedua metode berbeda secara nyata
56,4
5
1
5
1295,0
)48,133,2(=
+
−=t
Paired t-test (uji-t berpasangan)
Rumus untuk menghitung t:
Di mana: d = selisih nilai dari sepasang data
d = nilai rata-rata dari d
sd= standar deviasi dari d
Ctt: derajat bebas = n - 1
ds
ndt =
Contoh paired t-test (uji-t berpasangan)
• Dilakukan analisis paracetamol dengan
menggunakan 2 metode berbeda. Sebanyak
10 tablet dari batch yang berbeda disiapkan,
dan masing-masing tablet dianalisis
menggunakan kedua metoda tersebut.
• Hasil percobaan sbb:
Contoh paired t-test (uji-t pasangan) (lanjutan)
Batch Metode A (%) Metoda B (%)
1 84,63 83,15
2 84,38 83,72
3 84,08 83,84
4 84,41 84,20
5 83,82 83,92
6 83,55 84,16
7 83,92 84,02
8 83,69 83,60
9 84,06 84,13
10 84,03 84,24
Contoh paired t-test (uji-t berpasangan) (lanjutan)
• Untuk mengetahui apakah hasil kedua metode
berbeda secara nyata, dilakukan uji-t pasangan
• Ho: Hasil uji kedua metode sama
• H1: Hasil uji kedua metode berbeda secara
nyata
Contoh paired t-test (uji-t berpasangan) (lanjutan)
Metode A (%) Metoda B (%) Differences (d)
84,63 83,15 + 1,48
84,38 83,72 + 0,66
84,08 83,84 + 0,24
84,41 84,20 + 0,21
83,82 83,92 - 0,10
83,55 84,16 - 0,61
83,92 84,02 - 0,10
83,69 83,60 + 0,09
84,06 84,13 - 0,07
84,03 84,24 - 0,21
Rata-rata, d 0,159
Standar deviasi, sd 0,570
Contoh paired t-test (uji-t berpasangan) (lanjutan)
• t dihitung menurut rumus :
• Nilai kritis dari tabel dengan derajat bebas = 9 (n-1),
diperoleh t9= 2,26 (P=0,05)
• Karena nilai t-hitung < t-tabel, maka Ho diterima. Berarti
hasil kedua metode sama atau tidak berbeda secara
nyata
88,0570,0
10159,0==t
Penetapan akurasi melalui uji perolehan kembali
❑ Untuk memberikan pengaruh yang nyata terhadap evaluasi akurasi, maka:
▪ konsentrasi akhir sampel setelah ditambahkan analit (spiked) berkisar
antara 2 – 5 kali konsentrasi sampel sebelum ditambahkan analit
(unspiked);
▪ nilai konsentrasi sampel yang telah ditambahkan analit tidak boleh
melebihi batas rentang kerja tertinggi pada ruang lingkup metode
pengujian yang digunakan
▪ konsentrasi sampel yang telah ditambahkan analit harus masuk dalam
regresi linear kurva kalibrasi yang digunakan.
❑ Analit yang ditambahkan tidak mengubah matrik sampel atau menghindari
pengenceran, serta volume analit yang ditambahkan tidak boleh melebihi
2 % dari volume sampel
Recovery
• Kapan recovery harus diperhitungkan dalam metode analisis?
• Apabila prosedur pre-treatment contoh atau preparasicontoh pada metode yang digunakan cukup panjang
• Recovery tidak perlu diperhitungkan apabila contohhanya disaring dengan membran dan setelah itu siapdiinjeksikan pada kolom HPLC.
Recovery
• Faktor yang dilihat dari percobaan recovery?
• Apakah analit 100% lepas dari matriks pada prosesdestruksi atau ekstraksi
• Apakah melalui proses hidrolisa sebagian analit tidakada yang rusak, sehingga pada tahap pengukuran hanyasebagian saja yang terukur
• Apakah pada proses pre-treatment contoh yang cukuppanjang (mis pada analisis residu pestisida) sebagiananalit tidak hilang dijalan?
Percobaan Recovery
• Yang diperlukan untuk percobaan Recovery
• Contoh
• Standar Analit
• Pada percobaan recovery :
• Sejumlah diketahui standar analit ditambahkan kedalamcontoh
• Sejumlah sama contoh seperti diatas, dianalisis terpisah.
Percobaan Recovery
• Contoh pada percobaan Recovery :
• Gangguan yang ada pada analisis sebenarnya harus
dipertahankan
• Seberapa banyak (100%, 95% atau 50%) analit lepas
dari contoh tidak akan dapat terpantau apabila pada
percobaan hanya digunakan standar analit
• Pemakaian standar analit hanya akan dapat
memberikan informasi mengenai ada tidaknya analit
yang hilang pada proses preparasi contoh.
Percobaan Recovery
• CRM digunakan untuk percobaan Recovery
• asalkan CRM yang digunakan berupa matriks dan
bukan senyawa murni.
Percobaan Recovery Melalui Spike
1. Siapkan sampel dan masukkan kedalam masing-masing
wadah sejumlah sama contoh.
2. Masukkan kedalam hanya salah satu dari ke-2 wadah
tersebut, sejumlah diketahui analit (di-”spike” dengan
analit).
Percobaan Recovery Melalui Spike
4. Misalkan konsentrasi analit yang ditambahkan(C1)
5. Analisis
6. Didapat 2 data yaitu:
• Konsentrasi analit dalam wadah yang hanya berisikan contoh saja; yang diberi notasi Cspl
• Konsentrasi analit dalam wadah yang berisikan contoh yang sudah dispike dengan analit; yang diberi notasi Cspike
Percobaan Recovery Melalui Spike
Dari kedua data hasil analisis % Recovery dapat dihitung, melalui rumus:
Recovery (%) = {(Cspike-Cspl)/C1} x 100
dimana:
Cspike = konsentrasi analit dalam campurancontoh + sejumlah tertentu analit
Cspl = konsentrasi analit dalam contoh (sampel)C1 = konsentrasi analit yang ditambahkan
kedalam contoh.
Batas keberterimaan akurasi
Batas keberterimaan akurasi dapat mengacu pada metodeyang digunakan oleh laboratorium atau acuan lain (AOAC)sebagai persyaratan awal sebelum membuat control chart.Jika laboratorium telah membuat control chart maka bataskeberterimaan disesuaikan dengan control chart
Konsentrasi (unit) Batasan % Recovery
100 %10 %1 %
0.1 %100 ppm10 ppm1 ppm10 ppb
98 – 10195 – 10292 – 10590 – 10885 – 11080 – 11575 – 12070 – 125
Sumber : AOAC Guidelines for Singles Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals
Liniaritas
Disebabkan oleh adanya kesalahan dalam proses pengukuran, pada suatu kurva kalibrasi,
Tidak semua data akan jatuh secara tepat pada garis
Yang harus dicari adalah The “best” straight line
Analisis Regresi (Analisis Korelasi & Regresi)
Menggunakan
Metoda Kuadrat Terkecil
Method of Least Squares
y
x
Least Square
Jumlah Kuadrat Penyimpangan (dari semua titik terhadap garis) yang paling
kecil
Kapan Metode Least Square digunakan untuk membuat Kurva Kalibrasi ??
Bila terdapat hubungan linier antara nilai input dan nilai isyarat (respon).
Hubungan ini dinyatakan sebagai
y = bx + a
a : intercept (nilai dari y bila x = 0)
b: slope/kemiringan dari garis
Linear square regression
Apa arti Linear-squares Regression?
Linearitas adalah kemampuan metoda untuk mendatangkan hasil uji yang secara langsung sebanding dengan konsentrasi analit dalam suatu rentang
kerja yang diberikan.
Koefisien Korelasi (r) : suatu ukuran hubungan linier antara dua set dataRentang dari -1 (hubungan yg sempurna)
0 (tidak ada hubungan)1 (hubungan yang sempurna)
Bagaimana cara mengetahui korelasi (r) ini signifikan atautidak?
Melalui Uji Koefisien Korelasi Pearson
Korelasi yang signifikan terjadi apabila:
rhitung > atau = rtabel
DF (n-2) 95% 99%
2 0.950 0.990
3 0.878 0.959
4 0.811 0.917
5 0.754 0.875
6 0.707 0.834
7 0.666 0.798
Melalui Uji Koefisien Korelasi Pearson
Untuk 4 buah pasangan data atau 4 titik
berarti df=2
Apabila:
rhitung = - 0,94, pada level confidence 95% korelasi-nya tidak signifikan,
karena rtabel = 0,95
Korelasi signifikan apabila
rhitung ≥ rtabel ( r ≥ rcritical)
Contoh:
Melalui Pasangan Data x dan y berikut ini
x (Kons mg/ml) y (Abs, Luas Puncak dll)
1 133
2 278
4 558
10 1192
Akan ditarik garis regresi yang dipaksakan lewat titik nol
Persamaan Garis Regresi Lewat Titik Nol
b = xiyi / x2
Dari Analisis Kromatografi diperoleh pasangan data berikut ini:
Kons (pg/mL) Luas Puncak
0 2,1
2 5,0
4 9,0
6 12,6
8 17,3
10 21,0
12 24,7
dicari persamaan garis regresi yang tidak melalui titik nol (mempunyai intercept)
Persamaan Garis
Hitung b dan a dari persamaan garis y = bx + a
y = 1,93 x + 1,52
Limit Deteksi dan Limit Quatisasi
Penentuan limit deteksi
Penetapan IDL (Instrumental Detection Limit), diperlukan untuk melihat kemampuan deteksi alat, sbb:1) Lakukan pengujian 10 kali pengulangan terhadap blanko reagen dari air bebas
analit dan rekam hasil pengujian kemudian hitungrata-rata serta standar deviasi sebagai berikut :
dan
Keterangan : x = rata-rata hasil pengulangan pengujianxi = hasil pengujian ke in = jumlah pengulangan pengujiansd = standar deviasi
2) Tentukan nilai IDL dengan menggunakan rumus IDL = 3sd
=
=n
i
ixn
x1
1
1
)(1
2
−
−
==
n
xx
sd
n
i
i
Contoh : Penentuan Instrumental Detection Limit (IDL)
Pengulangan pengujian
BlangkoAbsorbansi Konsentrasi (mg/L)
Spike1 0,715 1,018
Spike 2 0,715 1,051
Spike 3 0,716 0,834
Spike 4 0,715 1,065
Spike 5 0,717 0,566
Spike 6 0,716 0,829
Spike 7 0,716 0,915
Rerata 0,897
Standar Deviasi 0,176
IDL = 3 X SD 0,53
a. Pembuatan kurva kalibrasi :
1) buat kurva kalibrasi awal didasarkan pada rentang metode pengujian yang sedangdiverifikasi, minimal 10 deret larutan kerja tanpa blanko digunakan untuk pembuatan kurva kalibrasi awal;
2) buat kurva kalibrasi yang merupakan hubungan antara kadar larutan kerja denganrespon instrumen (absorbansi, intensitas atau tinggi puncak) serta tentukanpersamaan garis regresinya dengan r ≥ 0,995
3) tentukan method slope (b) yang diperoleh dari kemiringan kurva kalibrasi
Penetapan MDL dan LoQ sbb :
b. Lakukan uji repeatabilitaslakukan pengujian minimal 7 kali pengulangan sampel atau aquades yang telahditambahkan analit (spike), secara repro, lakukan pengujian sesuai dengantahapan metode yang ditetapkan dan rekam hasil pengujian kemudian hitungrata-rata dan standar deviasi
MDL = 3,143 SD
LoQ = 3,18 MDL = 3,18(3,143 SD) = 10 SD
Dalam penentuan MDL, harus dilakukan:- minimal satu blanko metode (method blank) harus dianalisis sebagai kontrol
kontaminasi- nilai kadar blanko metode harus sangat kecil (<MDL perkiraan)- bila kadar blanko metode cukup besar maka penentuan MDL harus diulang
c. Lakukan uji perolehan kembali (recovey test, %R) yang merupakan perbandingan nilai terukurdengan nilai target yang diperoleh dari hasil pengujian harus memenuhi batas keberterimaanyang disyaratkan oleh metode pengujian yang sedang diverifikasi.
d. Hitung the signal to noise ratio (S/N) yang dinyatakan dalam perbandingan antara rerata hasilpengulangan pengujian dengan simpangan baku harus berkisar antara 2,5 – 10.
- Bila S/N < 2,5 maka hal ini menunjukan kesalahan acak yang terjadi dalam pengulanganpengujian terlalu tinggi dan menghasilkan MDL yang tinggi. Artinya penambahan analit kesampel (spike) harus pada kadar yang lebih tinggi agar dapat meningkatkan signal yang ada.
- Jika S/N > dari 10 maka penambahan kadar analit ke sampel (spike) biasanya terlalu tinggi,karena itu kadar analit yang ditambahkan harus pada kadar yang lebih rendah S/Nmerupakan evaluasi kesalahan acak (random error) yang terjadi pada pengujian tertentu danperkiraan presisi yang diharapkan dari sejumlah pengulangan pengujian.
= 2,5 – 10
e. Pemilihan kadar spike dalam penentuan MDL harus sedemikian rupa sehingga hasil yang diperoleh memenuhi batas keberterimaan sebagai berikut:
MDL < kadar spike < 10MDL
f. Bila secara statistika MDL yang dihasilkan telah memenuhi batas keberterimaan maka
MDL < Nilai Baku Mutu
- bila MDL yang dihasilkan lebih besar dari nilai baku mutu lingkungan hidup maka laboratorium harus mencari metode pengujian lainnya hingga diperoleh nilai MDL dibawah nilai baku mutu lingkungan hidup.
Syarat keberterimaan MDL
1) MDLx10 > Spike
2) MDL < Spike
3) MDL < baku mutu
4) Signal/noise (S/N)= rerata/sd = 2.5 - 10
5) %R = 70 – 125% (sesuai persyaratan metode )
6) %RSD ≤ 2/3 RSD Horwitz
A. Penentuan konsentrasi spike matriks untuk pengujian MDL dan LoQ berdasarkan nilai IDL
Pengulangan Absorbansi Konsentrasi
Pengujian Blanko (mg/L)
1 0.043 0.009
2 0.043 0.009
3 0.043 0.009
4 0.041 0.007
5 0.042 0.008
6 0.041 0.007
7 0.040 0.006
8 0.042 0.008
9 0.042 0.008
10 0.041 0.007
Rata-rata 0.008
Standar Deviasi (SD) 0.0010
IDL = 3xSD 0.003
Perkiraan spike untuk MDL = (1-5) x IDL= (0,003 – 0,15) mg/L
B. Penentuan konsentrasi spike matriks untuk pengujian MDL dan LoQ berdasarkan
kisaran metode
• IDL : LDD : MDL : LOQ = 1 : 2 : 4 : 10
• Jika kisaran konsentrasi suatu metode pengujian analit (sesuai SNI, APHA dll) adalah antara 0,2 – 10 mg/L, artinya LoQ metode ini adalah 0,2 mg/L
• MDL : LoQ = 4 : 10
MDL estimasi = 4/10 x 0,2 = 0,08 mg/L
Maka lar kerja dengan kadar 0,2 mg/L dapat di spike ke dalam sampel yang mengandung analit sangat kecil , kemudian dilakukan pengujian sesuai tahapan metode.
Perkiraan target untuk MDL = (1-5) x MDL estimasi= (0,08 – 0,4) mg/L
C. Penentuan konsentrasi spike matriks untuk pengujian MDL dan LoQ berdasarkan baku mutu
• Baku mutu air sungai parameter total fosfor adalah 0,2 mg/L
• MDL estimasi adalah < 0,2 mg/L, misalnya 0,1 mg/L
• Perkiraan spike untuk MDL = (1-5) x MDL estimasi
Perkiraan target untuk MDL = (1-5) x MDL estimasi= (0,1 – 0,5) mg/L
Contoh : Penentuan Detection
Limit (MDL dan LoQ)
Pengulangan SampelKons spl
(mg/L)
Kons
Target
(mg/L)
spike -
sampel
(mg/L)
% Recovery
sampel
+
standar
(mg/L)
Vol
sampel
(mL)
Vol
spike
(mL)
Kons.
Standar
(mg/L)Vol Total
(mL)
1 0,002
0,01
0,008 80,020 0,010
24,975 0,025 10 25
2 0,004 0,009 90,040 0,013
3 0,004 0,008 80,040 0,012
4 0,004 0,011 110,040 0,015
5 0,003 0,009 90,030 0,012
6 0,005 0,008 80,050 0,013
7 0,003 0,009 90,030 0,012
Rerata 0,009 88,607
Standar Deviasi (SD) 0,001
MDL = 3.143xSD 0,003
LoQ = 10xSD 0,011
Signal/noise (S/N) 8,285
% RSD 12,070
Batas Keberterimaan
1) 10% Spike < MDL < Spike 0,001 < 0,003 < 0,010 Diterima
2) Signal/noise (S/N): 2.5 < S/N < 10 8,285 Diterima
3) %RSD ≤ 20% 12,070 Diterima
4) %R = 100% ± 20% 88,607 Diterima
5) %RSD < 2/3 Horwitz 12,070 < 21,835 Diterima
KESIMPULAN MDL 0,003
KESIMPULAN LoQ 0,011
Pengesahan metode pengujian tervalidasi/terverifikasi
1) Seluruh hasil validasi/verifikasi metode yang dilakukan olehanalis dilaporkan kepada Penyelia Laboratorium untukdiverifikasi;
2) Apabila hasil verifikasi dapat diterima, maka pengujian tersebutdikaji ulang oleh Manajer Teknis dan disahkan oleh Manajer Mutuuntuk dapat diberlakukan dan diterapkan di laboratorium.
081318888067
Ketertelusuran, Bahan Acuan dan Kontrol
Sampel
Ketertelusuran
• Sifat dari hasil suatu pengukuran yang dapat dikaitkan
dengan standar tertentu yang sesuai, (biasanya standar
nasional atau internasional), melalui rantai perbandingan
yang tak terputus.
• Kemampuan dari suatu pengukuran untuk dihubungkan
ke:
- Standar nasional/internasional untuk satuan ukuran
- Sistem pengukuran yang disahkan secara nasional/
internasional melalui suatu rantai perbandingan yang
tak terputus
Standar Internasional dan Nasional
• Pada pengukuran fisika untuk massa
misalnya mengacu pada internasional
prototype 1 kg di BIPM, Paris.
• Standar Nasional Satuan Ukuran (SNSU -
BSN) merupakan autoritas tertinggi dalam
metrology di Indonesia
Standar atau Sampel atau Hasil Analisis yg ditimbang
Neraca terkalibrasi yang dimiliki laboratorium
Standar Nasional yang dimiliki NMI disetiap Negara
Standar lokal yang dimiliki laboratorium kalibrasi terakreditasi
Standar Internasional yang dimiliki BIPM-Paris
SI pada Pengukuran Fisika
• Panjang (length), dinyatakan dalam meter, m
• Massa (mass), dinyatakan dalam kilogram, kg
• Waktu (time), dinyatakan dalam detik (second), s
• Arus listrik (electric current), dinyatakan dalam
Ampere, A
• Suhu (temperature), dinyatakan dalam Kelvin, K
• Intensitas cahaya (luminous intensity) dinyatakan
dalam candela, cd
SI pada Pengukuran Kimia
• Kuantitas zat (amount of substance), dinyatakan dalam mole, mol
– Ketertelusuran pengukuran/pengujiankimia dipandang lebih kompleks daripadapengukuran fisika, karena rangkaianproses pada analisis kimia sangatpanjang.
– Dalam proses mungkin terjadi kehilangananalit atau terjadi penambahan dari luarkarena kontaminasi, sehingga rantaiperbandingan menjadi terputus.
Ketertelusuran pada Pengukuran/Pengujian
Kimia
• Hanya dapat dicapai melalui metode absolut (primer),
yang mempunyai bias minimum karena mampu telusur
langsung ke standar massa (kg)
• Beberapa contoh metode absolut (primer) adalah:
– Metode Gravimetri
– Metode Titrimetri
– Metode Coulometri
– Metode ID-MS (Isotop Dilution Mass Spectrometry)
Bagaimana bila dalam analisis tidak
digunakan Metode Absolut (Primer)?
• Dalam prakteknya pengujian kimia lebih banyak
menggunakan metode instrumental seperti UV/VIS,
AAS, GLC, HPLC, dll.
• Efesiensi atau recovery proses analisis umumnya
kurang dari 100% atau bahkan lebih dari 100% bila ada
kontaminasi dari luar
• Ketertelusuran pengukuran/pengujian kimia disini
dilakukan melalui penggunaan bahan acuan bersertifikat
(CRM).
Bahan Acuan
Suatu bahan yang mempunyai satu atau lebih
sifat bahan yang homogen dan cukup stabil
untuk dapat digunakan dalam mengkalibrasi
peralatan, menguji metode atau sebagai
standar dalam pengukuran/analisis contoh.
Beberapa Contoh Metode Absolut
(Primer)
– Metode Gravimetri
– Metode Titrimetri
– Metode Coulometri
– Metode ID-MS (Isotop Dilution Mass
Spectrometry)
Metode Gravimetri
Contoh ditimbang menggunakan neraca yang terkalibrasi (traceable)
Dilarutkan (diandaikan efisiensi 100%)
Ditambahkan pereaksi pengendap dalam keadaan berlebih (diandaikan efisiensi 100%)
A + B C
Diendapkan, disaring, dicuci, dikeringkan (diandaikan efisiensi 100%)
Ditimbang kembali menggunakan neraca terkalibrasi (traceable)
Metode Titrasi
Dibuat larutan standar primer Standar ditimbang menggunakan neraca terkalibrasi
(traceable)
Standar dilarutkan dalam labu takar terkalibrasi. (Bagaimanamengkalibrasi labu takar ?)
Titrasi contoh menggunakan standar primer Contoh ditimbang menggunakan neraca terkalibrasi
(traceable)
Contoh dilarutkan, larutan dititrasi dengan standar primer
menggunakan buret terkalibrasi. (Bagaimana mengkalibrasiburet ?)
Disini diandaikan efesiensi reaksi titrasi 100%
Metode Spektrometri UV/VIS
• Contoh ditimbang, dilarutkan dan diaddkan dalam labu takar terkalibrasi.
• Dipipet sejumlah volum tertentu larutan contoh diatas, ditambahkan pereaksihingga membentuk warna.
• Disiapkan larutan standar dengan berbagai konsentrasi. (standar ditimbang, dilarutkan dalam labu takar terkalibrasi, dipipet dengan pipet terkalibrasisejumlah volum berbeda)
• Ditambah pereaksi, diaddkan dalam labu takar terkalibrasi.
• Diukur pada panjang gelombang tertentu dengan peralatan spektrofoto-meter.
Bahan Acuan yang Tersedia
• Bahan Acuan Tersertifikasi (CRMs)– NIST : National Institute of Standards and Technology,
Gaithersburg, Maryland, USA.
– BCR : Community Bureau of Reference, Belgia
– LGC : Laboratory of Government Chemist di UK
• Bahan Acuan yang diperoleh dari Uji Profisiensi
– IAEA : International Atomic Energy Agency
– NATA : National Association of Testing Authorities, Australia
– BRI : Bread Research Institute, Australia
– FAPAS: Food Analysis Performance Assesment Scheme
Kontrol Sampel
Sama seperti CRM, Kontrol sampel harus:
• Homogen.
• Stabil dalam kurun waktu tertentu.
• Idealnya (meskipun pada praktek-nya sukar dicapai) harus
serupa dan mempunyai kandungan analit yang hampir sama
dengan bahan yang akan dianalisis.
• Mudah diperoleh
• Relatif Murah
Bagaimana Menggunakan Kontrol Sample
• Pilih jenis contoh control yang sesuai dan lakukan analisis
terhadap contoh tersebut sekurang-kurangnya tujuh kali.
• Hitung harga rata-rata dan simpangan baku
• Gambarkan harga rata-rata pada kertas grafik
• Gambarkan garis +/- 2 dan +/- 3 simpangan baku pada kertas
grafik
• Gunakan contoh control ini pada analisis berikutnya dan catat
hasil yang diperoleh pada control chart
• Apabila hasil analisis dari contoh control dapat diterima, hasil
analisis contoh yang diperiksa dapat dilaporkan
• Apabila hasil analisis contoh control tidak dapat diterima,
analisis dari contoh yang diperiksa harus diulang kembali
Control Chart
X
X - 1s
X - 2s
X - 3s
X + 1s
X + 2s
X + 3s UCL
LCL
UWL
LWL
Tanggal 1 5 6 9 13 17 dst…
Operator A B A C D B dst …
Jam 8.00 12.30 15.00 8.00 12.00 15.00 dst ..
Evaluasi Terhadap Control Chart
Apabila hasil analisis kontrol sampel berada dalam batas:
Xr ± 1 s atau
Xr ± 2 s,
maka data hasil analisis sampel (dapat dilaporkan pada
penyelia, manajer teknis untuk diteruskan pada klien)
Kondisi out of control terjadi jika Xr ≥ + 3 s
Control chart
X
X - 1s
X - 2s
X - 3s
X + 1s
X + 2s
X + 3s UCL
LCL
UWL
LWL
A
A
B
C
B
C
112
