Vorlesung Analytische Chemie - .hplc: Verbesserung der Auflösung durch Verwendung kleiner Partikel

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Vorlesung Analytische Chemie (fr Biol./Pharm.Wiss.)

ZUSAMMENFASSUNG

Chromatographie

Grundlagen: Techniken: Grundlegende Formeln LC Trenneffizienz, Peakbreite & theoretische Bden GC Asymmetrische Peaks (berladungseffekte) Elektrophorese Auflsung & Optimierung einer Trennung Probenvorbereitung Quantifizierung & Kalibrierung (Probenaufarbeitung)

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Chromatographie

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Definition: Chromatographie ist ein physikalisch-chemisches Trennverfahren, bei dem die zu trennenden Substanzen zwischen einer mobilen und einer stationren Phase verteilt werden. Die beiden Phasen sind nicht mischbar, und die Trennung beruht auf unterschiedlichen Verteilungskonstanten der verschiedenen Substanzen. Die Technik ist so konzipiert, dass sich das Verteilungsgleichgewicht in einer kontinuierlichen Abfolge mehrmals whrend des Trennprozesses einstellen kann.

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Chromatographie-Check

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Damit eine Technik eine Chromatographie ist, mssen folgende Punkte vorhanden bzw. erfllt sein:

Trenntechnik

Zwei nicht mischbare Phasen

Eine mobile und eine stationre Phase

Trennung beruht auf der Verteilung von Substanzen zwischen den Phasen

Kontinuierliche Abfolge von Gleichgewichtseinstellungen

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Grundlegende Formeln zur Chromatographie

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Verteilungsgesetz und Phasenverhltnis

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Verteilungskonstante (Verteilungskoeffizient) KC:

Gleichgewichtsverteilung von Analytmoleklen in der mobilen (AM) und stationren (AS) Phase.

Nernstsches Verteilungsgesetz Bei gegebener stationrer und mobiler Phase ist KC fr einen Analyten bei konstanter Temperatur eine Konstante.

AM AS

KC =cScM

= Analytkonzentration in der stationren PhaseAnalytkonzentration in der mobilen Phase

Phasenverhltnis :

! = VMVS

= Volumen der mobilen PhaseVolumen der stationren Phase

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Das Chromatogramm

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Durchflusszeit (Totzeit) tM: Retentionszeit einer Inertsubstanz

Lineargeschwindigkeit u:

u = LtM

= SulenlngeDurchflusszeit

Retentionszeit tR Reduzierte Retentionszeit tR:

! t R = tR " tM

Retentionsfaktor (Kapazittsfaktor) k:

k = tR ! tMtM

=" t R

tM= KC

VSVM

= KC#

Trennfaktor (Selektivitt) :

per Definition: 1

! = tR2 " tMtR1" tM

= # t R2# t R1

= k2k1

= KC 2KC1

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Peakbreite (idealer Gauss-Peak)

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Peakbreite zwischen den Wendepunkten wi: Breite bei e-1/2 = 0.607 bzw. 60.7% der Peakhhe.

wi = 2!

Basisbreite wb: Breite zwischen den Schnittpunkten der Wendetangenten mit der x-Achse (Zeitachse).

wb = 4!

Peakbreite in halber Hhe w1/2: Breite bei 50% der Peakhhe.

w1/ 2 = 2! 2 ln2 " 2.354!

... Standardabweichung der Gauss-Funktion

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Trenneffizienz, Peakbreite & theoretische Bden

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Theoretische Bden & Trenneffizienz

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Je mehr theoretische Bden, umso hher die Effizienz der Trennung

N = tR!

" # $

% & ' 2

= 16 ( tRwb

"

# $

%

& ' 2

= 5.54 ( tRw1/ 2

"

# $

%

& ' 2

H = LN

Anzahl der theoretischen Bden N:

Bodenhhe H:

Je grsser N bzw. je kleiner H, umso effizienter die Trennung

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Trenneffizienz & van-Deemter-Gleichng

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A: Eddy-Diffusion B: Longitudinal-Diffusion C: Massentransport-Effekte

H = A+ Bu

+Cu

vanDeemter.xls

Je kleiner H, umso mehr theoretische Bden und umso effizienter die Tren- nung ( schmalere Peaks) Je hher A, B und C, umso ineffizienter die Trennung

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Asymmetrische Peaks (berladungseffekte)

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Asymmetrie verstehen: Wie sind die Molekle in der Sule verteilt? Grund fr Asymmetrien: berladungseffekte

Abweichungen von der idealen Peakform

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Zeit t

Idealer Gauss- Peak

Tailing Fronting

Asymmetriefaktor oder

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Abweichungen von der idealen Peakform

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Unsymmetrische Peaks sind meist auf berladungseffekte bei hohen Analytkonzentrationen zurckzufhren. berladung der mobilen Phase: Der Analyt kondensiert auf der stationren Phase und wird erst nach und nach von der mobilen Phase abtransportiert. Es kommt also in der Form zu einer unsymmetrischen Verteilung, dass ein grosser Anteil der Molekle spter als im Idealfall die Sule verlsst. berladung der stationren Phase: Die Bindungsstellen auf der stationren Phase sind mit Analyt belegt. Analytmolekle aus der mobilen Phase knnen nicht mehr binden und werden schlechter retendiert. Ein wesentlicher Anteil der Analytmolekle verlsst die Sule also frher als bei idealer Retention.

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Auflsung & Optimierung einer Trennung

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Auflsung

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RS =! "1!

# $ %

& ' (

k21+ k2

#

$ %

&

' (

N4

#

$ %

&

' (

! = f k,KC( )k = f ),KC( )N = f L,H( )

Gauss.xls

RS =tR 2 ! tR1wb1 + wb2

2" # $

% & '

=2 tR 2 ! tR1( )wb1 + wb2

= Differenz der RetentionszeitenMittelwert der Basisbreiten

Auflsung RS zweier benachbarter Peaks: Koelution: RS < 0.75

2 Peaks erkennbar: RS > 0.75

Basisliniengetrennte Peaks: RS > 1.5

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Optimierung

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RS =!"1!

# $ %

& ' (

k21+ k2

#

$ %

&

' (

N4

#

$ %

&

' (

: Trennfaktor k: Retentionsfaktor N: Anzahl theoretischer Bden

k ! tR

N ! 1" 2

! = " t R 2" t R1

Ziel der Optimierung ist, eine effektive Peakauflsung (RS > 1.5)

in mglichst kurzer Analysenzeit zu erreichen.

Je hher , k und N, umso besser die Auflsung RS

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Quantifizierung & Kalibrierung

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Mittelwert :

Ein kleiner Ausflug in die Statistik

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Genauigkeit = Przision + Richtigkeit

Hu

figke

it ei

nes

Mes

swer

tes

x

Messwerte xi

x

x = 1n

xii =1

n

!

!x =1

n "1xi " x ( )

2

i =1

n

#

Standard- abweichung :

rel. Standard- abweichung:

!rel, x =!xx

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Kalibrierung

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AAnalyt = a + b cAnalyt

b =AAnalyt ! acAnalyt

Empfindlichkeit b (Steigung der Kalibriergeraden):

NG =A0 + 3!A0( ) " a

b

Nachweisgrenze NG: (limit of detection = LOD):

BG =A0 + 6!A0( ) " a

b

Bestimmungsgrenze BG: (limit of quantification = LOQ):

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Kalibriermethoden

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Kalibrierung mit externem Standard: einfachstes Kalibrierverfahren

Kalibrierung mit internem Standard: Kompensation systematischer Fehler Interner Standard kann z.B. vor der Probenaufarbeitung oder bei der Probenahme zugegeben werden Einschrnkung: Interner Standard hat nicht exakt die gleichen Eigenschaften wie der Analyt Matrixeffekte werden nicht kompensiert

Kalibrierung mittels Standardaddition Kalibrierung in der Probe mit dem Analyten als Standard Matrixeffekte knnen kompensiert werden

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Zusammenfassung LC

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LC: Analyten

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GC: Analyten mssen unzerstrt verdampfbar sein. LC: Auch geeignet fr grosse und thermolabile Molekle

kleine ungeladene (polare und unpolare) Molekle anorganische und organische Ionen Polymere Grosse (Bio-)Molekle Einschrnkung: Analyt muss ausreichend in mobiler Phase lslich sein.

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