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Scriptum zur Vorlesung Biochemie I auch Teile aus Biochemie II enthaltend (Kap. 3.) Herausgegeben von der Fachschaft Biologie Stand: 09.94 Durchgesehen: 01.08 (Trommer/Philipp) ohne Garantie für Fehlerfreiheit

Vorlesungsskript Biochemie I

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  • Scriptum zur Vorlesung

    Biochemie I

    auch Teile aus Biochemie II enthaltend (Kap. 3.)

    Herausgegeben von der Fachschaft Biologie Stand: 09.94

    Durchgesehen: 01.08 (Trommer/Philipp)

    ohne Garantie fr Fehlerfreiheit

  • Inhalt:

    1. Proteine 1 1.1. Hierarchie der Zellkomponenten.............................................................................................1 1.2. Allgemeiner Aufbau der Proteine ............................................................................................1 1.3. Analyse der Raumstruktur von Proteinen .............................................................................1 1.4. Die 20 Aminosuren ...................................................................................................................2 1.5. Struktur der Proteine ................................................................................................................3 1.6. Analyse von Proteingemischen.................................................................................................4

    1.6.1. Moleklgre........................................................................................................................... 5 1.6.2. Elektrische Ladung................................................................................................................. 6 1.6.3. Absorptionsverhalten.............................................................................................................. 6 1.6.4. Lslichkeit ............................................................................................................................... 7 1.6.5. Affinitt ................................................................................................................................... 8

    1.7. Nachweis mit Ninhydrin ...........................................................................................................9 1.8. Bestimmung der Aminosuresequenz .....................................................................................9

    2. Enzyme / Coenzyme 15 2.1. Enzyme........................................................................................................................................15

    2.1.1. Wirkungsweise von Enzymen............................................................................................... 15 2.1.2. Einheiten der Enzymaktivitt.............................................................................................. 16 2.1.3. Regulation der Enzymaktivitt ............................................................................................ 17 2.1.4. Hemmkinetik......................................................................................................................... 18 2.1.5. Das Michaelis-Menten Modell .............................................................................................. 19

    2.2. Coenzyme und prosthetische Gruppen..................................................................................21 2.2.1. Wasserstoffbertragende Coenzyme .................................................................................... 21 2.2.2. Gruppenbertragende Coenzyme......................................................................................... 23 2.2.3. Coenzyme fr C1-Transfer .................................................................................................... 24 2.2.4. Coenzyme fr C2-Transfer .................................................................................................... 25 2.2.5. Coenzym der Isomerasen und Lyasen.................................................................................. 25

    2.3. Hmoglobin / Myoglobin..........................................................................................................25

    3. Chemische Modifizierung von Proteinen 28 3.1. Unspezifische Reagenzien.......................................................................................................29 3.2. Gruppenspezifische Reagenzien ............................................................................................30 3.3. Reagenzien zur nderung der Ladung.................................................................................31 3.4. Hydrophobisierung von Enzymen..........................................................................................31 3.5. Reversible Reagenzien .............................................................................................................31 3.6. Active-Site Labeling .................................................................................................................32 3.7. Suizid - Substrate .....................................................................................................................32 3.8. Photoaffinity - Label ................................................................................................................32 3.9. Bifunktionelle Reagenzien......................................................................................................33 3.10. Semireversible Reagenzien .....................................................................................................34 3.11. Trgergebundene Enzyme.......................................................................................................34

    4. Lipide 36 4.1. Allgemeine bersicht ...............................................................................................................36 4.2. Fette ............................................................................................................................................36 4.3. Glykolipide.................................................................................................................................36 4.4. Phospholipide ...........................................................................................................................37 4.5. Isoprenoidlipide........................................................................................................................37 4.6. Biomembranen..........................................................................................................................38

    5. Monosaccharide 39 5.1. Nomenklatur .............................................................................................................................39 5.2. Zyklische Zucker.......................................................................................................................40 5.3. Nucleotide ..................................................................................................................................41

  • 6. Stoffwechsel 42

    7. Kohlenstoff-Stoffwechsel 44 7.1. Glykogen.....................................................................................................................................44

    7.1.1. Abbau des Glykogens durch Glykogen-Phosphorylase........................................................ 44 7.1.2. Synthese von Glykogen......................................................................................................... 45

    7.2. Glykolyse ....................................................................................................................................46 7.2.1. Ablauf der Glykolyse............................................................................................................. 46 7.2.2. Bildung von Fructose-1,6-bisphosphat aus Glucose ............................................................ 47 7.2.3. Bildung von Glycerinaldehyd-3-phosphat............................................................................ 48 7.2.4. Regulation der Glykolyse...................................................................................................... 49 7.2.5. Weiterverarbeitung des Pyruvats ........................................................................................ 50

    7.3. Oxidative Decarboxylierung...................................................................................................51 7.3.1. Regulation des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes........................................................... 53

    7.4. Hormonelle Steuerung.............................................................................................................53 7.4.1. bersicht zur Wirkung der Hormone................................................................................... 54 7.4.2. Stimulierung der Adenylat-Cyclase durch ein G-Protein ................................................... 54 7.4.3. Aktivierung der Protein-Kinase A und der Phosphorylase................................................. 55 7.4.4. Aktivierungskaskade zum Glykogenstoffwechsel................................................................ 56

    7.5. Gluconeogenese.........................................................................................................................56 7.5.1. Enzymatische Unterschiede zwischen Glykolyse und Gluconeogenese ............................. 57

    7.6. Der Citratzyklus .......................................................................................................................58 7.6.1. Citrat-Malat-Shuttle ............................................................................................................. 59

    7.7. Oxidative Phosphorylierung und Atmung ...........................................................................60 7.7.1. Elektronen-Carrier der Atmungskette................................................................................. 60 7.7.2. Glycerinphosphat-Shuttle..................................................................................................... 61 7.7.3. Chemiosmotische Hypothese von MITCHELL ....................................................................... 61 7.7.4. Oxidative Phosphorylierung (ATP-Synthese) ...................................................................... 61 7.7.5. Entkopplung der Atmung von der oxidativen Phosphorylierung ....................................... 62 7.7.6. Definition des Atmungsquotienten (respiratorischer Quotient) ......................................... 62 7.7.7. ATP-Bilanz fr Glucose ........................................................................................................ 62

    7.8. Der Pentosephosphatweg ........................................................................................................62 7.8.1. Verwertung von Glucose-6-phosphat ................................................................................... 63 7.8.2. Mechanismus der Transketolase.......................................................................................... 63 7.8.3. Mechanismus der Transaldolase .......................................................................................... 64

    8. Der Fettsurestoffwechsel 66 8.1. Fettsureabbau.........................................................................................................................66

    8.1.1. Hydrolyse von Triacylglycerinen durch cAMP-gesteuerte Lipasen: ................................... 66 8.1.2. Aktivierung der Fettsuren durch CoA: .............................................................................. 67 8.1.3. Transport in die Matrix der Mitochondrien durch Carnitin: .............................................. 67 8.1.4. -Oxidation ............................................................................................................................ 67 8.1.5. Oxidation ungesttigter Fettsuren..................................................................................... 68 8.1.6. Abbau ungeradzahliger Fettsuren ..................................................................................... 68

    8.2. Ketonkrper entstehen bei vorherrschendem Fettabbau...................................................68 8.3. Fettsure-Synthese ...................................................................................................................69

    9. Aminosureabbau und Harnstoffzyklus 70 9.1. Transaminierung .....................................................................................................................70 9.2. Oxidative Desaminierung .......................................................................................................71 9.3. Der Harnstoffzyklus .................................................................................................................71

    10. Biosynthese von Makromoleklen 72 10.1. Tetrahydrofolat als C1-bertrger ........................................................................................72 10.2. Zyklus der aktivierten Methylgruppe....................................................................................73 10.3. Purin-Biosynthese.....................................................................................................................73 10.4. Pyrimidin-Biosynthese.............................................................................................................75 10.5. Abbau der Purine .....................................................................................................................76 10.6. NAD-Biosynthese.......................................................................................................................77

  • 10.7. Synthese von Sphingolipiden und Gangliosiden ................................................................77 10.8. Biosynthese von Phospholipiden............................................................................................78 10.9. Cholesterin-Synthese................................................................................................................79

    11. Photosynthese 81 11.1. Lichtreaktion ............................................................................................................................81 11.2. Dunkelreaktion.........................................................................................................................84

  • Proteine Hierarchie der Zellkomponenten 1

    1. Proteine

    1.1. Hierarchie der Zellkomponenten

    Zelle Organellen z. B. Mitochondrien, Chloroplasten, Zellkern Supramolekulare Strukturen Multienzymkomplexe, Ribosomen, kontraktile Systeme Makromolekle Nucleinsuren, Proteine, Polysaccharide, Lipide Bildungsblcke Nucleotide, Aminosuren, Monosaccharide,

    Glycerin und Fettsuren metabolische Zwischenprodukte Pyruvat, Citrat, Malat Vorstufen aus der Umwelt CO2, N2, NH3, H2O

    1.2. Allgemeiner Aufbau der Proteine

    Proteine sind Heteropolymere der Aminosuren (d. h. aus verschiedenen Moleklen zusammengesetzt). Ein weiterer wichtiger Typ kovalenter Bindungen in Proteinen sind die Disulfidbrcken zwischen Cystein-Hlften (cross linkage). Die Bindungen knnen von Proteasen hydrolysiert werden.

    Nomenklatur: Auer beim Glycin ist das -C-Atom asymmetrisch substituiert, es tritt daher optische Aktivitt auf. Man unterscheidet zwei sterische Reihen, die L- und die D-Reihe, sowie zweierlei Konfigurationszuweisungen, die S- und die R-Konfiguration. Nur L-Aminosuren, die fast alle (Ausnahme L-Cystein) S-Konfiguration besitzen, sind Bausteine der Proteine. Der optische Drehungssinn ist unabhngig von der Zugehrigkeit zu einer sterischen Reihe.

    1.3. Analyse der Raumstruktur von Proteinen

    1.) Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie: (NMR = Kernmagnetische Resonanz) Das Protein wird in ein magnetisches Feld gebracht und die unterschiedliche Resonanz der Atomkerne gemessen. Vorteil: Es ergibt sich ein 3D-Bild, welches sich aus der Summe von Einzelmoleklen in Lsung ergibt.

    2.) Rntgenstrukturanalyse eines Kristalls der Verbindung: Bestrahlung des Molekls mit Rntgenstrahlen, wobei die Strahlen bei unterschiedlicher Elektronendichteverteilung unterschiedlich gebeugt werden. Durch die Mobilitt ergeben sich allerdings Unschrfen im Kristall. Die Struktur des Myoglobins (hnlich dem Hmoglobin) wurde durch diese Methode aufgeklrt. Vorteil: Auflsungsgrenze = 0,15 nm (bzw. 0,2-0,35 nm) (beim LM: 400 nm) Nachteil: eingeschrnkte Dynamik

  • Proteine Die 20 Aminosuren 2

    1.4. Die 20 Aminosuren

    Neutrale hydrophobe Aminosuren:

    Neutrale hydrophile Aminosuren:

    Saure Aminosuren:

    Basische Aminosuren:

  • Proteine Struktur der Proteine 3

    1.5. Struktur der Proteine

    Primrstruktur: Die Aminosuresequenz in der Polypeptidkette.

    Sekundrstruktur: Bei der -Helix-Struktur sind Wasserstoffbrcken intramolekular zwischen der NH- und der 4 AS-Reste entfernten CO-Gruppe ausgebildet. Dadurch entsteht die schraubenfrmige Anordnung der Aminosuren. Ganghhe (pitch): Lnge, die die -Helix bei voller Drehung zunimmt. Eine Aminosure bringt eine Drehung von 100, daher nach 3,6 AS eine volle Umdrehung. Bei der -Faltblattstruktur kommt es zu einer zur Kettenrichtung senkrechten Ausbildung der H-Brcken (bei -Helix: parallel zur Helixachse) zwischen verschiedenen Polypeptidketten oder gefalteten Kettenteilen. Seide: - reine Faltblattstruktur (fast nur Gly, Ser, Ala) - an jeder zweiten Position Gly - Ketten parallel zur Faserachse Kollagen: - hufigstes Protein in Wirbeltieren (Haut, Knochen, Knorpel) - spezielle Helixstruktur - mechanisch stark beanspruchbar - denaturiertes Kollagen Gelatine

    Tertirstruktur: 3D-Knuelung der -Helix und der Faltblattstruktur. Stabilisierung durch Disulfidbrcken:

    Besonders wichtig bei kleinen Polypeptiden, da Struktur stabilisierend (Insulin, Chymotrypsin, Trypsin, -Keratin (Haar)) Siehe auch Anfinsen-Experiment.

    Wasserstoffbrcken: Elektrostatische Wechselwirkungen zwischen schwach acidem Donor und schwach basischem Akzeptor im Inneren des Proteins: a) zwischen Peptidbindungen (-Helix, -Faltblatt) b) zwischen Seitenketten der einzelnen AS und an der Oberflche mit Wasser. Wechselwirkung mit Wasser ist energetisch gnstiger.

    Ionische Wechselwirkungen: Relativ geringe Bedeutung fr die Struktur, da meist an Enzymoberflche hauptschlich Wechselwirkungen mit dem Lsungsmittel

    Hydrophobe Wechselwirkungen: AS mit unpolaren Seitenketten: Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro

    Versuch den Kontakt mit H2O zu vermeiden intramolekulare Gruppierung / Ausschlu von H2O hydrophobe AS innen, hydrophile auen (dadurch gute H2O-Lslichkeit)

  • Proteine Analyse von Proteingemischen 4

    Anfinsen-Experiment: Untersuchung der Grnde fr die Ausbildung einer Tertirstruktur globulrer Proteine. Ausgangsmaterial: RNase: 124 AS, 4 S-S-Brcken Denaturierung in 8 M Harnstoff und Reduktionsmittel Spaltung der Disulfidbrcken 1.) Erst oxidiert und dann Harnstoff entfernt falsche zufllige Renaturierung (keine Enzymaktivitt) 2.) Erst Entfernung des Harnstoffs (partielle Renaturierung) richtige Faltung und richtige Disulfidbrcken (Enzymaktivitt) Ergebnis: Die Aminosuresequenz spezifiziert die Tertirstruktur globulrer Proteine.

    Domnen: Proteine bestehen oft aus mehreren Faltungseinheiten, die als Domnen bezeichnet werden.

    Quartrstruktur: Anlagerung mehrerer Polypeptidketten (Untereinheiten) aneinander polymere Proteine Bindungen wie bei der Tertirstruktur. z. B. Virenhllen, Hmoglobin, Multienzymkomplexe

    1.6. Analyse von Proteingemischen

    Probleme: Vorkommen oft in sehr kleinen Mengen (1% vom Trockengewicht)

    (Peptidhormone wie z. B. Insulin in noch kleineren Mengen) Stabilitt: labil gegen pH (Bsp.: LDH dissoziiert bei pH < 6 Denaturierung) Temperatur:

    kltelabil (z. B. F1-ATPase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase einiger Spezies) wrmelabil: die meisten Enzyme

  • Proteine Analyse von Proteingemischen 5

    Um Substanzgemische aufzutrennen, kann man 5 Eigenschaften der Molekle benutzen: 1. Moleklgre 2. Elektrische Ladung 3. Absorptionsverhalten 4. Lslichkeit 5. Affinitt

    Chromatographie: Physikalisch-chemisches Verfahren zur analytischen und prparativen Trennung gelster oder gasfrmiger Verbindungen. Die chromatographische Trennung beruht darauf, da eine mobile Phase ber eine stationre Phase wandert und dabei die zu trennende Substanz mit unterschiedlicher Geschwindigkeit transportiert. An der stationren Phase, dem Trgermaterial (z. B. Aluminiumoxid, Kieselgel, Strke, Zellulose, Silikonl, Ionenaustauschern) tritt eine unterschiedliche Verteilung der zu trennenden Substanzen mit der mobilen Phase (meist organische Lsungsmittel) auf.

    HPLC: (High Pressure Liquid Chromatography) Sulenchromatographie unter hohem Druck. Dadurch kann ein feineres Trennmaterial verwendet werden, bei dem die Durchlaufzeit ohne Druck zu hoch wre.

    1.6.1. Moleklgre

    Zentrifugation (differentielle bzw. fraktionierte Zentrifugation): Voraussetzung: Molekulargewichtsunterschiede. Der Faktor S entspricht dabei der Sedimentationskonstante, ist also ein Ma fr das Gewicht (ist aber auch abhngig von der Form der Molekle).

    Ultrazentrifugation (Dichtezentrifugation): Sedimentierung der Proteine durch extreme Zentrifugation (bis 300 000 g). Trger: Sucrosegradient

    Dialyse: Durch Osmose werden mit Hilfe einer semipermeablen Membran kleine Molekle aus der Lsung entfernt. Zurck bleiben nur die groen Molekle (z. B. Proteine).

    Ultrafiltration: Durch Druck oder Zentrifugationskraft werden kleine Molekle und Wasser durch eine semipermeable Membran gepret.

    Gelfiltration (Gelchromatographie): Das Substanzgemisch luft ber eine Sule aus stark hydratisiertem, polymeren Material wie z. B. Sephadex (Polysaccharid-Derivat), BioGel (Polyacrylamid-Derivat) oder Agarose (Polysaccharid). Die Gelpartikel werden mit verschieden groen Poren hergestellt. Die Substanzen mit unterschiedlicher Gre dringen mit unterschiedlichem Mae in die Gelpartikel ein. Groe Substanzen laufen daher schneller durch die Sule als kleine Substanzen.

  • Proteine Analyse von Proteingemischen 6

    1.6.2. Elektrische Ladung

    Ionenaustauschchromatographie (Ionenaustauscher): Das in der Sule befindliche Trgermaterial ist in der Lage, einen Teil der an austauschaktiven Gruppen gebundenen Ionen gegen andere Ionen reversibel zu tauschen. Trgermaterial:

    Sulfoniertes Polystyrol Polyacrylamid Zellulose andere Zucker (Dextrane "Sephadex")

    Kationenaustauscher: CM (Carboxymethyl / schwach sauer): R-CH2-COO- Sulfonyl: RSO3H + NaCl RSO3Na + HCl Anionenaustauscher: DEAE (Diethylaminoethyl / schwach basisch): R-CH2-CH2-NH-(CH2-CH3)2]+OH- + NaCl R-CH2-CH2-NH-(CH2-CH3)2]+Cl- + NaOH Das im Austauscher verbleibende Substanzion kann durch Elution (Lsen) mit geeigneten Ionen je nach Dissoziationskonstante abgelst werden (z. B. durch pH-Gradienten / Ionenstrkegradienten).

    Elektrophorese: Bewegung elektrisch geladener Teilchen im elektrischen Feld. Die negativ geladenen Teilchen wandern dabei zur Anode und die positiv geladenen zur Kathode. Die Wanderungsgeschwindigkeit hngt vom Verhltnis Masse/Ladung ab. Hochspannung - Trgermaterial:

    (1) Papier (2) Kieselgelplatte

    Niederspannung:

    (1) Polyacylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) (2) Zelluloseacetat-Folien

    Isoelektrische Fokussierung: Durch den isoelektrischen Punkt (IEP) lassen sich Proteingemische auftrennen (s. a. isoelektrische Fllung). In Verbindung mit einer Elektrophorese wandern die Proteine im elektrischen Feld. Dabei ist der pH-Gradient im Gel von Bedeutung: Die Proteine wandern bis zu der Stelle, wo der pH-Wert ihrem IEP entspricht. Da sie an diesem Punkt keine Ladung mehr tragen, knnen sie nicht weiterwandern.

    1.6.3. Absorptionsverhalten

    Adsorptionschromatographie: Die Trennung erfolgt ber eine Sule, auf die die Substanzmenge gegeben wird. Der obere Teil der Sule adsorbiert nun die Substanzmenge. Durch Zugabe von Lsungsmittel wird die Substanz wieder gelst und fliet in der Sule ein kleines Stck weiter, bis sie erneut adsorbiert wird. Dieser Vorgang wiederholt sich kontinuierlich, wodurch es durch die unterschiedlichen Adsorptionsverhalten der verschiedenen Stoffe zu einer klaren Trennung der Substanzmenge kommt. Durch die Zugabe entsprechender Mengen an Lsungsmittel knnen die einzelnen Fraktionen des Eluats in einem Fraktionssammler entnommen werden.

  • Proteine Analyse von Proteingemischen 7

    1.6.4. Lslichkeit

    Aussalzen: z. B. Fllung (fraktioniert) mit Ammoniumsulfat (bis 3 M lslich in Wasser)

    zunchst Anstieg der Lslichkeit des Proteins bei Zugabe von Salz Einsalz-Effekt bei hoher Salzkonzentration Aussalz-Effekt

    (Lsungsmittel reicht nicht mehr aus, Proteine fallen nacheinander aus und werden abzentrifugiert)

    Fllung: Aceton-Fllung und Ethanol-Fllung; durch niedrige Dielektrizittskonstante wird die Solvatationskraft des Wassers herabgesetzt, die Proteine fallen aus. Aber: Fllung normalerweise bei niedrigen Temperaturen

    Limitierung bei kltelabilen Proteinen

    Isoelektrische Fllung: Am isoelektrischen Punkt (IEP) ist die Zahl der positiven Ladungen im Protein gleich der Zahl der negativen Ladungen. Bei diesem pH-Wert ist die Lslichkeit des Proteins minimal. Durch die Vernderung des pH-Wertes knnen Proteine mit unterschiedlicher Ladungsverteilung nacheinander abgetrennt werden.

    Verteilungschromatographie: Wie bei der Adsorptionschromatographie wird auch hier in einer Sule gearbeitet. Als Adsorptionsmittel dienen Kieselgur, Zellulosepulver, Strke oder Glaspulver, die mit Wasser befeuchtet werden. Das zu trennende Substanzgemisch wird gelst und auf die Sule gegeben. Mit einem organischen Lsungsmittel wird das Substanzgemisch langsam durch die Sule gesplt. Eine Trennwirkung kommt dabei nicht durch die Adsorption der Substanzen an dem Trgermaterial zustande, sondern durch das Eindringen der Stoffe in den Wasserfilm auf der Oberflche des Trgers. Dabei verteilen sich die Substanzen zu einem bestimmten Verhltnis in den beiden Phasen. Substanzen, die in organischen Lsungsmitteln leichter lslich sind als in Wasser, wandern schneller durch die Sule als leicht wasserlsliche Substanzen.

    Gas-Chromatographie: Das Substanzgemisch wird verdampft und mit einem inerten Trgergas (Helium, Argon oder Stickstoff) durch ein langes, dnnes Rohr geleitet. Die einzelnen Komponenten des Gasgemisches lsen sich mehr oder weniger gut in der stationren Phase (Flssigkeitsfilm auf der Innenseite des Rohrs) und knnen somit am Ende der Kolonne nach krzerer oder lngerer Strmungszeit nachgewiesen werden.

    Papierchromatographie: Sie ist eine Verteilungschromatographie, die Trennwirkung beruht auf unterschiedlicher Lslichkeit der Substanzmenge in dem Lsungsmittel. Das Lsungsmittel-Substanzgemisch steigt durch Kapillarkrfte auf. Whrend des Vorgangs kommt es zur Bildung zweier Laufmittelphasen (eine hydrophile und eine hydrophobe Schicht). Durch die Wechselwirkung zwischen hydrophilem Trgermaterial und hydrophilem Laufmittel wandert der hydrophobe Teil des Substanzgemisches schneller und weiter an der Sule hinauf. Als stationre Phase dient dabei mit Wasser getrnktes Filterpapier. Die Auftrennung (Entwicklung) erfolgt in einer gut verschlossenen Chromatographieapparatur.

    Dnnschichtchromatographie: Als Trennschicht verwendet man oft Kieselgel, Kieselgur und Aluminiumoxid, das mit Wasser unter Zusatz von Gips als dnnflssige Suspension auf eine rechteckige Glas- oder Kunststoffplatte aufgetragen wird.

  • Proteine Analyse von Proteingemischen 8

    Das Trennverfahren luft wie bei der Papierchromatographie ab, jedoch sind die Zeitersparnis und eine empfindlichere Auftrennung Vorteile der Dnnschichtchromatographie. Bei der 2D-Dnnschichtchromatographie wird nach Abschlu des ersten Laufes (a.) die Platte um 90 gedreht und ein zweiter Lauf (b.) in einem anderen Fliemittel durchgefhrt.

    a.) b.)

    1.6.5. Affinitt

    Affinittschromatographie: Die Proteine knnen gezielt aus einem Proteingemisch isoliert werden. Das Prinzip basiert auf der Fhigkeit der Proteine, bestimmte Molekle (Liganden) spezifisch zu binden. Dabei dient als Sulenmaterial z. B. das Polysaccharid Agarose, an dessen Oberflche die Liganden chemisch gebunden werden. Wird die Proteinmischung nun auf die Sule gegeben, so bleibt nur das dem Liganden entsprechende Protein hngen, der Rest fliet nach Zugabe von Pufferlsung durch die Sule hindurch. Das gewnschte Protein kann dann durch Zugabe einer hohen Konzentration des Liganden in lslicher Form von dem Trgermaterial eluiert werden. Dadurch besteht mit dieser Methode die Mglichkeit, bestimmte Proteine extrem hoch zu reinigen.

    gruppenspezifische Affinittschromatographie:

    z. B. AMP-Sulen zur Reinigung von NAD-abhngigen Proteinen

    hochspezifische Affinittschromatographie: z. B. Reinigung von Antikrpern, Substratsulen (Zur Aktivierung der Agarose siehe Kap. 3.11!)

  • Proteine Nachweis mit Ninhydrin 9

    1.7. Nachweis mit Ninhydrin

    1.8. Bestimmung der Aminosuresequenz

    Erste vollstndige AS-Sequenz 1953 am Rinder-Insulin durch FREDERICK SANGER. Warum ist das Wissen ber die AS-Sequenz wichtig? Aufklrung der Kristallstruktur Verstndnis molekularer Mechanismen Vergleich anderer Proteine Hinweise auf Funktion / evolutionre Zusammenhnge

    Versuchsplan:

    1. Bruttozusammensetzung der AS (Aminosureanalyse) 2. Bestimmung der Endgruppen (Hinweis auf verschiedene Polypeptidketten) 3. Trennung in Einzelketten 4. Spaltung der Polypeptidketten in kleine Fragmente 5. Sequenzierung der kleinen Fragmente 6. Wiederholung von 4. unter Bildung anderer Fragmente

    berlappungsfragmente 7. Zuordnung der Disulfid-Gruppen innerhalb oder zwischen Untereinheiten

    1.) Aminosureanalyse Zur Analyse wird eine Totalhydrolyse unter sauren und/oder basischen Bedingungen durchgefhrt.

    a.) sauer: Erhitzen der Polypeptide in Gegenwart eines berschusses an 6 N HCl bei 100-120C fr 10-100 Stunden in einem evakuierten, unter Vakuum zugeschmolzenen Rhrchen ist die normale Methode der Totalhydrolyse. Unter diesen Bedingungen findet keine Racemisierung und keine O2-Oxidation statt. Fr die Freisetzung von Val, Leu, Ile sind lange Zeiten erforderlich.

  • Proteine Bestimmung der Aminosuresequenz 10

    Nachteil: - teilweise Zerstrung von Ser, Thr, Tyr

    - weitgehende Zerstrung von Trp - aus den Amid-Gruppen von Asn und Gln entstehen Carboxylgruppen und

    Ammoniumionen, die in die Messung von Glu und Asp mit eingehen b.) basisch:

    Durch Kochen der Peptide in 2-4 M NaOH bei 100C fr 4-8 h kann Trp getrennt bestimmt werden. Nachteil: - Zerstrung von Cys, Ser, Thr, Arg

    - andere AS werden teilweise desaminiert und racemisiert Vorteil: - liefert die Trp-Werte

    2.) Endgruppenbestimmung Die Endgruppen geben Hinweise auf unterschiedliche Polypeptidketten. So besteht z. B. Insulin aus zwei AS-Ketten, die ber zwei Disulfid-Brcken verbunden sind. Es ergeben sich also zwei Aminosuren vom C-Terminus und zwei vom N-Terminus.

    N-Terminus

    Prinzipien:

    Sanger / Dansylierung a) AS-Kette b) Markierung c) Hydrolyse einzelne AS

    Edman-Abbau

    a) AS-Kette Markierung Hydrolyse AS-Kette + 1 AS b) Erneuter Ablauf

    a.) Sanger-Reaktion (1945)

    Reaktion der freien -Amino-Gruppe der Proteine mit 2,4-Dinitrofluorbenzol (DNFB) unter Bildung von gelben 2,4-Dinitrophenyl-Derivaten. Durch die Hydrolyse der so entstandenen Peptide mit 6 N HCl werden alle Peptidbindungen gespalten. Es bleibt also als einzige farbige Verbindung das 2,4-Dinitrophenyl-Derivat mit der N-terminalen Aminosure brig, welches abgetrennt und durch chromatographischen Vergleich (2D-Dnnschichtchromatographie) mit bekannten 2,4-Dinitrophenyl-Derivaten der einzelnen AS identifiziert werden kann. Problem: Nucleophile AS-Seitenketten knnen ebenfalls reagieren.

  • Proteine Bestimmung der Aminosuresequenz 11

    b.) Dansylierung

    Statt dem DNFB wird Dansylchlorid (5-Dimethylamino-1-naphthalinsulfonylchlorid) als Markie-rungsreagenz verwendet. Nach der Hydrolyse knnen die Dansyl-Derivate durch deren fluoreszieren-den Charakter bestimmt werden. Diese Methode ist 100mal empfindlicher als die Methode von SANGER.

    c.) Edman-Abbau

    Groer Vorteil des Edman-Abbaus: Der Rest der AS-Kette bleibt nach der Abtrennung der terminalen AS intakt und kann daher weiter untersucht werden. Somit kann das Protein Schritt fr Schritt abgebaut werden. Das entstandene Phenylthiohydantoin (PTH) wird ber die Gas-Chromatographie (oder HPLC) getrennt und bestimmt. Dieser Vorteil wurde benutzt, um einen "Sequenator" (Solid-Phase) zu bauen. Dieses Gert fhrt die AS-Bestimmung automatisch durch und bestimmt die entstehenden PTH-Derivate im Anschlu durch Chromatographie.

    C-Terminus:

    a.) Hydrazinolyse (Akabori-Reaktion)

    Alle Peptidbindungen werden durch Umwandlung der AS in Hydrazide gespalten. Es liegen daher nur noch Aminosure-Hydrazide vor. Einzige Ausnahme dazu ist die AS des C-terminalen Endes der ursprnglichen Proteinkette. Sie besitzt als einzige noch eine Carboxylgruppe und kann als freie Sure leicht chromatographisch identifiziert werden.

    H+

    Phenylthiohydantoin

    -Peptid

    -Peptid

  • Proteine Bestimmung der Aminosuresequenz 12

    b.) Reduktion der AS durch Lithiumborhydrid zum entsprechenden -Aminoalkohol. Nach der Hydrolyse kann dieser Alkohol chromatographisch identifiziert werden.

    c.) Abspaltung der C-terminalen AS durch Carboxypeptidase (eine Exopeptidase). Nachteil: das Enzym spaltet schnell die nchste AS ab.

    3.) Trennung in Einzelketten (falls erforderlich) a) Entfaltung der AS-Kette durch Harnstoff Aufhebung der Tertir- und Quartrstruktur. b) Spaltung der S-S-Bindungen durch - Reduktion (z. B. NaBH4) - Umsetzung mit Jodacetat: Bildung von stabilen Derivaten (Carboxymethylcystein) R-SH + I-CH2-COOH R-S-CH2-COOH + HI

    4.) Spaltung in Fragmente (Partialhydrolyse) Zur spteren Identifizierung der Fragmente ist es wichtig, spezifische Spaltstellen zu erhalten.

    a.) Bromcvan-Spaltung: Spaltung der Peptidbindungen an denen ein Methionin beteiligt ist.

    b.) Enzvmatische Spaltung durch Proteasen (Hydrolyse der Peptidbindungen) Peptidasen (= Exopeptidasen) spalten AS vom Ende ab

    1.) Carboxypeptidase (C-Terminus) 2.) Aminopeptidase (N-Terminus)

    Proteinasen (= Endopeptidasen) spalten an spezifischer Spaltstelle innerhalb der AS-Kette

    spaltet am C-terminalen Ende von: Trypsin Lys, Arg Chymotrypsin Phe, Trp, Tyr Pepsin Phe, Trp, Tyr und verschiedene andere

    Thermolysin spaltet am N-terminalen Ende von Leu, Ile, Val

    Viele Proteasen werden als inaktive Vorstufen (Zymogene, Proenzyme) sezerniert und dann proteolytisch aktiviert.

  • Proteine Bestimmung der Aminosuresequenz 13

    Beispiele: Bildung von Chymotrypsinogen als inaktive Vorstufe im Pankreas, Aktivierung zu Chymotrypsin

    im Dnndarm durch Spaltung einer ArgIle-Bindung mittels Trypsin. Bildung von Trypsinogen als inaktive Vorstufe im Pankreas, Aktivierung zu Trypsin im Darm

    durch Enteropeptidase oder Trypsin selbst (autokatalytische Aktivierung).

    5.) Sequenzierung der Fragmente a) chemisch:

    Edman-Abbau b) physikalisch:

    FAB (fast atom bombardment) + Variante der Massenspektroskopie, bis 25 AS + bombardiert in Glycerin gelste Peptide mit Ar- oder Xe-Atomen. + Fragmentieren in verschieden groe Teilstcke + Vergleich zwischen Massen und Fragmenten Sequenz Vorteil:

    - mehrere Peptide (Gemisch, Verunreinigungen) mglich - Untersuchung posttranslational vernderter Proteine

    (z. B. blockierter N-Terminus) - sehr hohe Empfindlichkeit

    Nachteil: - hohe Gertekosten

    c) enzymatisch: Exopeptidasen

    6.) berlappungsfragmente Durch die Bildung weiterer, mit den bisherigen berlappender Fragmente kann auf die Sequenz des ganzen Proteins zurckgeschlossen werden. Um andere Fragmente zu erhalten, wird die Spezifitt der entsprechenden Enzyme gendert. Dadurch kommt es zu einer anderen Spaltung und zu anderen berlappungsfragmenten.

    Spaltung am Beispiel von Trypsin: a.) normale Spaltstellen: Spaltung nach Lys und Arg b.) weniger Spaltstellen: Blockierung von Lys nur noch Spaltung bei Arg Reaktion mit Bernsteinsureanhydrid:

    Lys-(CH2)4-NH2 + Lys-(CH2)4-NH-CO-CH2-CH2-COOH

    Reaktion mit Jodessigsure: Lys-(CH2)4-NH2 + I-CH2COOH Lys-(CH2)4-NH-CH2-COOH + HI

    c.) mehr Spaltstellen: Umwandlung von Cystein in Pseudolysin,

    dadurch Spaltung nach Cystein, Lys und Arg:

    Cys-CH2-SH + Cys-CH2-S-CH2-CH2-NH2

  • Proteine Bestimmung der Aminosuresequenz 14

    7.) Zuordnung der Disulfid-Brcken 1.) Carboxylierung der SH-Gruppen (mit Jodessigsure) 2.) Tryptische Verdauung ohne Reduktion der S-S-Brcken 3.) Isolierung der vernetzten Peptide 4.) Reduktion der S-S-Brcken (NaBH4 / pH 3) 5.) Trennung der Oligopeptidketten in Gegenwart von Mercaptoethanol

    (Schutz der freien SH-Gruppen) 6.) Sequenzierung der Einzelketten

    Carboxymethylierte Cysteine = frhere freie SH-Gruppen freie SH-Gruppen = frhere S-S-Brcken

  • Enzyme / Coenzyme Enzyme 15

    2. Enzyme / Coenzyme

    2.1. Enzyme

    2.1.1. Wirkungsweise von Enzymen

    Enzyme sind meist Proteine (seltener Ribonucleinsuren). Wirken als Katalysator Verndern nicht die Lage des Gleichgewichts Erhhen die Geschwindigkeit der Gleichgewichtseinstellung durch

    Erniedrigung der Aktivierungsenergie G Ermglichen milde Reaktionsbedingungen Fhigkeit zur Regulation Groe Reaktionsspezifitt

    Die Bindung der Substrate erfolgt am aktiven Zentrum durch ionische oder hydrophobe

    Wechselwirkungen kovalente Zwischenstufen

    Isoenzyme: Enzyme gleicher Funktion, die sich aber in ihrer Struktur und infolgedessen in manchen Eigen-schaften voneinander unterscheiden.

    Lactat-Dehvdrogenase: Tetramer aus 4 identischen Untereinheiten pro "Typ". Der H-Typ dominiert im Herzmuskel, der M-Typ im Skelettmuskel und in der Leber. Diese Untereinheiten setzen sich zu verschiedenen Tetrameren (multiplen Formen) zusammen:

    H4, H3M, H2M2, HM3, M4 Der H4-Typ besitzt eine hhere Affinitt zu Pyruvat als der M4-Typ. Deshalb wird der H4-Typ durch hohe Pyruvatkonzentrationen gehemmt (Substrathemmung). Diese homologen Enzyme sind durch Genduplikation entstanden:

    LDH-H4 (Mensch) LDH-H4 (Schwein): hhere Homologie als: LDH-H4 (Mensch) LDH-M4 (Mensch)

    Unterschiede bei Chymotrypsin und Trypsin Substratbindungszentrum: Chymotrypsin bentigt eine aromatische oder eine sperrige unpolare Seitenkette auf der Aminoseite der abzuspaltenden Peptidkette. Die Nische (eine unpolare Tasche) ist dagegen bei Trypsin verndert (Aspartat statt Serin). Das Aspartat kann eine starke elektrostatische Bindung mit einer positiv geladenen Lysin- oder Argininseitenkette des Substrats eingehen.

  • Enzyme / Coenzyme Enzyme 16

    Katalytische Triade von Trypsin Beispiel fr kovalente Katalyse, Sure-Base-Katalyse, Deformation des Substrats. Beim Trypsin (und Chymotrypsin) bilden Histidin 57, Aspartat 102 und Serin 195 eine katalytische Triade, wodurch die Reaktionsfhigkeit von Serin gesteigert wird. Wirkungsweise: Nach Zugabe eines Substrats wird ein Proton vom Serin 195 auf das Histidin 57 bertragen und der Imidazolring durch Aspartat 102 stabilisiert.

    2.1.2. Einheiten der Enzymaktivitt

    Definition der Enzymaktivitt: 1 mol Substratumsatz

    1 Unit (U) = min (absolute Enzymaktivitt)

    U / ml: Volumenaktivitt U / mg Enzym: spezifische Aktivitt

    SI-Einheiten: 1 mol Substratumsatz

    1 Katal (kat) = s (absolute Enzymaktivitt)

    kat / kg: spezifische Aktivitt

    1 U = 16,67 nkat

  • Enzyme / Coenzyme Enzyme 17

    2.1.3. Regulation der Enzymaktivitt

    1.) Aktivierung von Vorstufen Viele proteolytische Enzyme liegen in einer inaktiven Form vor. Man bezeichnet sie als Zymogene oder Proenzyme. Die Aktivierung erfolgt durch die Hydrolyse einer oder mehrerer Peptidbindungen. In diese Gruppe fallen viele Verdauungs- und Blutgerinnungsenzyme. Beispiel: Zymogen des Trypsins = Trypsinogen N-terminales Hexapeptid wird abgespalten Spaltstelle = Lys Ile

    Lys = natrliche Spaltstelle des Trypsins Die Protease Enteropeptidase braucht nur wenig aktives Trypsin herzustellen, dann: autokatalytische Aktivierung (Trypsin ist sein eigener Katalysator)

    2.) Allosterische Regulation (z. B. Feedback-Inhibition) Allosterie ist die Erscheinung, da Makromolekle (insbesondere Proteine) ihre Konformation und Aktivitt ndern, wenn ein bestimmtes Molekl (ein Effektor - kann auch gleichzeitig Substrat oder Produkt sein) an das Makromolekl gebunden wird. Die Bindung erfolgt an einer separaten Effektorbindungsstelle auerhalb des aktiven Zentrums (AZ), was eine Konformationsnderung im AZ bewirkt und somit einen hemmenden (Effektor ist ein Inhibitor) oder aktivierenden (Effektor ist Aktivator) Einflu ausbt. Die allosterische Hemmung unterscheidet sich dabei von der kompetitiven Hemmung, bei der der Inhibitor im AZ selbst bindet, durch ihre Kinetik. Bei der Feedback-Hemmung treten Endprodukte einer Reaktionskette als Inhibitoren frherer Reaktionsschritte auf, um den Reaktionsweg abzuschalten. Beispiel: Regelung der ACTase bei der Pyrimidinbiosynthese, Hmoglobin etc.

    Umsatzdiagramme (Substratproduktion ber Zeit):

    a) heterotrop: Effektor Substrat b) homotrop: Effektor = Substrat

    1: Substrat = Aktivator / 2: Substrat = Inhibitor

    Modelle zur Erklrung der Kooperativitt bei oligomeren Proteinen:

    a.) MONOD, WYMAN, CHANGEUX: "Symmetriemodell" "Alles-oder-Nichts"-Umwandlung, kann aber nicht negative Kooperativitt erklren!

    Voraussetzungen: - Es gibt fr jede Untereinheit zwei mgliche Konformationszustnde (T bzw. R) - Die Untereinheiten knnen immer nur in einer Form vorliegen, d. h. nur RR oder TT-Dimere, keine RT-Dimere! (T = "inaktiv" R = "aktiv")

    b.) KOSHLAND, NMETHY, FILMER: "Sequenzmodell" Voraussetzungen: - Es gibt fr jede Untereinheit zwei mgliche Konformationszustnde (T bzw. R)

    - Diese Konformationsnderung kann die Substratbindungsaffinitt der anderen Untereinheiten erhhen oder erniedrigen

  • Enzyme / Coenzyme Enzyme 18

    bindet S leichter positive Kooperativitt

    bindet S schwerer negative Kooperativitt

    3.) Kovalente Modifikation Die Aktivitt wird durch eine Phosphorylierung oder Dephosphorylierung eines speziellen Serinrestes festgelegt. Beispiel: Phosphorylase-Kinase

    4.) Assoziation - Dissoziation Es findet eine Regulation durch andere Proteine statt. Manche Enzyme werden aktiv, wenn der Ca2+-Spiegel in der Zelle steigt. Das entsprechende Regulatorprotein ist das Calmodulin; es bindet im Calcium-beladenen Zustand an die Proteine und aktiviert sie dadurch.

    5.) Regulation in Form von Abbau (Proteolyse) durch spezielle Proteasen

    6.) Regulation durch "de novo"-Synthese

    2.1.4. Hemmkinetik

    a.) kompetitive Hemmung Bei der kompetitiven Hemmung konkurriert ein Inhibitor mit dem Substrat um die Bindung an das aktive Zentrum. Dies verluft nach dem Massenwirkungsgesetz, wodurch die Hemmung durch eine hohe Substratkonzentration ausgeglichen werden kann.

    b.) unkompetitive Hemmung Hier bindet der Inhibitor an den Enzym-Substrat-Komplex, nicht aber an das freie Enzym. Der ternre Komplex ESI ist nicht produktiv.

    mit unkompetitivem Inhibitor

    I I

    ESI

    I I

  • Enzyme / Coenzyme Enzyme 19

    c.) nicht-kompetitive Hemmung Die Bindung des Inhibitors erfolgt allosterisch, d. h. an einem anderen Zentrum (nicht dem aktiven Zentrum) des Enzyms. Der Inhibitor verndert das aktive Zentrum, daher ergibt sich eine kleinere oder keine Aktivitt. Der ternre Komplex ESI ist nicht produktiv.

    d.) partiell nicht-kompetitive Hemmung Wie c.), aber auch aus ESI Produktbildung mglich. Die Substrat- und allosterische Bindungsstelle berlappen teilweise.

    2.1.5. Das Michaelis-Menten Modell

    Darstellung der Reaktionsgeschwindigkeit als Funktion der Substratkonzentration: Herleitung der Michaelis-Menten-Gleichung:

    E + S ES E + P k = Geschwindigkeitskonstante

    Fr die Anfangsgeschwindigkeit spielt k4 keine Rolle und wird vernachlssigt. Weitere Annahme:

    [S] >> [E] Stotal Sfrei Dann gilt:

    ES-Bildungsrate = k1 [E] [S] ES-Zerfallsrate = k2 [ES] + k3 [ES]

    Im steady state (Fliegleichgewicht):

    -I +I -I +I

    k1 k3

    k2 k4

    Definition der Michaelis-Konstanten: KM

    -I +I -I +I

    -I

  • Enzyme / Coenzyme Enzyme 20

    Bestimmung der Konstanten KM und vmax 1.) Lineweaver/Burk: 1/v ber 1/[S] Kehrwert der Michaelis-Menten-Gleichung:

    lineare Darstellung mglich

    2.) Hanes: [S] / v0 ber [S] 3.) Eadie/Hofstee: v0 ber v0 / [S] 4.) Cornish-Bowden

    Kinetik bei allosterischen Enzymen Allosterische Enzyme halten sich nicht an das Michaelis-Menten-Modell und zeigen oft eine sigmoide (S-frmige) Abhngigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration.

  • Enzyme / Coenzyme Coenzyme und prosthetische Gruppen 21

    Zwei- (oder Mehr-)Substrat-Reaktionen

    1.) Single Displacement a.) random order

    b.) compulsory order

    2.) Double Displacement Ping-Pong-Mechanismus (siehe Fettsure-Synthese)

    2.2. Coenzyme und prosthetische Gruppen

    Coenzyme sind Nicht-Eiweiverbindungen. Fast alle hier aufgefhrten Substanzen enthalten ADP als Baustein! Die klassische Definition des Katalysators trifft auf Coenzyme nicht zu, da sie aktiv verndert werden und erst in einem zweiten (ebenfalls enzymatischen) Schritt wieder ihre ursprngliche Form erhalten. Die prosthetische Gruppe ist eine Nicht-Eiweiverbindung, die fest (kovalent oder ionisch) an das Enzym gebunden ist. Sie kann eventuell nur ein einfaches Ion sein, was jedoch bentigt wird, um die volle Kapazitt des Enzyms herzustellen.

    2.2.1. Wasserstoffbertragende Coenzyme

    1.) Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD) und Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (NADP)

    Oxidierte Formen (NAD+ bzw. NADP+):

    Wasserstoffaufnahme reduzierte Formen (NADH bzw. NADPH):

    + 2 e

  • Enzyme / Coenzyme Coenzyme und prosthetische Gruppen 22

    2.) Flavin-Adenin-Dinucleotid (FAD)

    FAD kann auch durch bertragung einzelner Elektronen ber eine radikalische Zwischenstufe reduziert werden.

    3.) Flavinmononucleotid (FMN) - Wasserstoffaufnahme wie bei FAD (FMN FMNH2) - prosthetische Gruppe bei der Elektronentransportkette Auch FMN kann (wie FAD) durch bertragung einzelner Elektronen ber eine radikalische Zwischenstufe reduziert werden.

    4.) Ubichinon (Coenzym Q) - 2 Ein-Elektronen-bergnge mit radikalischer Zwischenstufe - Redoxsystem in der Atmungskette - n = 6 - 10

    5.) Plastochinon - Redoxsystem in der Atmungskette - Wasserstoffaufnahme wie bei Ubichinon - n = 9

    + 2 e+ 2 H

    FAD

    FADH2

    O

    H3CO

    H3CO

    H3CO

    H3CO

  • Enzyme / Coenzyme Coenzyme und prosthetische Gruppen 23

    6.) Liponsure - Wasserstoff-bertragung bei der oxidativen

    Decarboxylierung in Form von Liponamid (enzymgebunden):

    2.2.2. Gruppenbertragende Coenzyme

    1.) Adenosintriphosphat (ATP) - Energietrger biochemischer Reaktionen - Liegt normalerweise in Metallkomplexen (Mg2+) vor - Freisetzung von Energie durch Hydrolyse der Anhydrid-Bindungen

    Vergleich der Standardreaktionsenthalpien der Hydrolyse:

    kJ/mol kcal/mol Phosphoenolpyruvat (PEP) -61,9 -14,8 Carbamoylphosphat -51,5 -12,3 1,3-Bisphosphoglycerat -49,4 -11,8 Acetylphosphat -43,1 -10,3 Creatinphosphat -43,1 -10,3 Pyrophosphat -33,5 -8,0 ATP ADP, Pi -30,5 -7,3 Glucose-l-P -20,9 -5,0 Glucose-6-P -13,8 -3,3 Glycerin-3-P -9,2 -2,2

    Durch seine Mittelstellung ist ATP als Phosphatgruppenbertrger geeignet. PEP kann wiederum eine Phosphorylgruppe unter Bildung von ATP auf ADP bertragen.

    H H

    Dihydrolipoylrest

  • Enzyme / Coenzyme Coenzyme und prosthetische Gruppen 24

    2.) Pyridoxalphosphat (PLP) - Derivat des Pyridoxins (Vitamin B6) - Die Aldehydgruppe dieses Coenzyms bildet eine Schiff'sche Base

    mit einer spezifischen Lysin-Seitenkette des Enzyms. - Bei Phosphorylase fungiert PLP wahrscheinlich als Sure-Base-

    Katalysator (Protonenakzeptor und -donator). Hauptfunktion ist die Aktivierung der verschiedenen Bindungen am C von Aminosuren (z. B. bei Transaminierung).

    2.2.3. Coenzyme fr C1-Transfer

    1.) Tetrahydrofolat (THF) (siehe "Biosynthese von Makromoleklen")

    2.) S-Adenosyl-Methionin (siehe "Biosynthese von Makromoleklen")

    3.) Biotin - Beteiligung am Carboxyltransfer - Isolierung als Vitamin H aus Leberextrakten - Inaktivierung durch Bindung an Avidin (Protein des Eiklars) - peptidartige Bindung an Lysinrest prosthetische Gruppe

  • Enzyme / Coenzyme Hmoglobin / Myoglobin 25

    N

    Phosphopantethein

    2.2.4. Coenzyme fr C2-Transfer

    1.) Coenzym A - bertragung von Resten der Carbonsuren - bei Acetyl-CoA: R = CH3

    2.) Thiaminpyrophosphat (TPP) - Decarboxylierung von Pyruvat - Enthlt Vitamin B1 (Thiamin)

    2.2.5. Coenzym der Isomerasen und Lyasen

    Cobalamin - Radikalische Umlagerungen von Funktionellen Gruppen (-COO , -NH3 Methylgruppenbertragung

    2.3. Hmoglobin / Myoglobin

    Kooperativitt Die Vernderung (Erhhung/Erniedrigung) der Bindungsaffinitten der Untereinheiten eines oligomeren Proteins zu kleinen Moleklen (wie hier zum Sauerstoffmolekl) durch die Bindung dieser Molekle an benachbarte Untereinheiten bezeichnet man als (positive/negative) Kooperativitt.

  • Enzyme / Coenzyme Hmoglobin / Myoglobin 26

    Hmoglobin (Hb) Das Hmoglobin kommt in den Erythrocyten vor und bernimmt den Sauerstofftransport im Blut. Es besteht aus dem Protein Globin und der prosthetischen Gruppe Hm. Das Hm ist der Eisenkomplex eines Porphyrins (des Protoporphyrins IX). Das Fe(II) im Molekl wird durch die hydrophobe Umgebung gegen Oxidation geschtzt.

    Aufnahme von Sauerstoff durch das Hm Im Hm kann das Eisen unter Ausbildung einer sechsten (koordinativen) Bindung Sauerstoff reversibel binden. Das Eisen verndert dabei nicht seine Ladungszahl, sondern Salzbrcken zwischen den Untereinheiten 1 und 1 brechen auf. Dadurch knnen die nachfolgenden Sauerstoff-Molekle leichter gebunden werden (positive Kooperativitt). Es entsteht Oxyhmoglobin. Jedes Hmoglobin kann daher 4 Sauerstoff-Molekle aufnehmen. Im Desoxyhmoglobin liegt das Eisenatom etwa 0,04 nm auerhalb der Hmebene. Bei der Oxygenierung bewegt sich das Eisenatom in die Hm-Ebene hinein (d. h. das proximale His verschiebt sich), um mit dem Sauerstoff eine feste Bindung einzugehen.

    Durch diese Verschiebung wird eine H-Brcke zwischen Asp-94 und His-146 aufgebrochen, und Protonen werden frei (s. weiter unten Bohr-Effekt).

    Wirkung von Bisphosphoglycerat 2,3-Bisphosphoglycerat (BPG) hat eine wichtige Rolle bei der Regulation der Sauerstoffaufnahme. Das Desoxyhmoglobin kann ein Molekl BPG binden; die negativ geladenen Phosphatgruppen treten mit positiv geladenen Gruppen von Histidin und Lysin in Wechselwirkung, wodurch die Raumstruktur so stark verndert wird, da die Sauerstoffaffinitt stark sinkt. Bei der Sauerstoffbeladung wird das BPG wieder abgegeben. Befindet sich im Blut nur eine geringe Menge an BPG, so enthlt ein Teil des Desoxyhmoglobins kein BPG und bindet den Sauerstoff entsprechend fester. Daher kann der Sauerstoff dann nicht in den zu versorgenden Geweben abgegeben werden und das Hmoglobin erfllt seine Transportfunktion nicht.

    Abhngigkeit der Sttiqung vom O2-Partialdruck Bei der Beladung des Hmoglobins wird der hohe Sauerstoffpartialdruck der Lunge ausgenutzt, um Sauerstoff zu binden und in die Bereiche mit geringerem Sauerstoffpartialdruck zu transportieren.

    Bohr-Effekt Der Bohr-Effekt ist die nach dem dnischen Physiologen benannte Sauerstoffaustreibung aus dem Oxyhmoglobin durch Kohlendioxid, d. h. das Vorliegen einer hheren Konzentration an CO2 und H+-Ionen in einem stoffwechselaktivem Gewebe erleichtert die Freisetzung von O2.

    H H

    proximales His proximales HisHN

    N

    distales His

    Hm

    - Ebene

    N

    Hm b

    CH3

  • Enzyme / Coenzyme Hmoglobin / Myoglobin 27

    Die Aufnahme von O2 in der Lunge, durch die Protonen freigesetzt werden, hat dabei die Austreibung von CO2 zur Folge. Auf molekularer Ebene kommt es beim bergang von Oxy- zu Desoxyhmoglobin zu einer Verschiebung des Aspartat 94 in die Nhe des Histidins 146. Durch die Erhhung der lokalen negativen Ladung wird der pK-Wert von Histidin 146 erhht, d. h. die Wasserstoffaffinitt nimmt zu: Es kommt leichter zur Aufnahme von H+.

    Ftales Hmoglobin Der Ftus besitzt einen eigenen Hmoglobin-Typ, das Hmoglobin F (22) welches sich von dem der Erwachsenen unterscheidet. Hmoglobin F bindet BPG schwcher und besitzt daher eine hhere Sauerstoffaffinitt als Hmo-globin A. Daher kann O2 vom mtterlichen Hmoglobin A auf das Hmoglobin F des Ftus bertragen werden.

    Myoglobin (Mb) Das Myoglobin bindet ebenfalls den Sauerstoff durch das Hm. Es transportiert und speichert ihn jedoch in der Muskelzelle und zeigt als Monomer keine Kooperativitt.

  • Chemische Modifizierung von Proteinen Hmoglobin / Myoglobin 28

    3. Chemische Modifizierung von Proteinen

    Zweck: Bestimmung katalytisch relevanter AS Vernderung der Proteineigenschaften (durch Vernderung der Oberflche)

    a) Ladungsvernderung b) hydrophobe Oberflche

    Quervernetzung mit bifunktionellen Gruppen a) Abstandsmessungen im AZ (zwischen katalytisch relevanten AS) b) Verknpfung von Untereinheiten

    .) zur Stabilisierung des Proteins .) Bestimmung der Geometrie des Aufbaus aus der Verteilung der

    Quervernetzungsprodukte c) Lokalisierung relativ zu anderen Proteinen

    (in der Membran, in Multienzymkomplexen, im Aufbau des Ribosoms)

    Welche AS-Seitenreste knnen reagieren?

    In allen Fllen werden elektrophile Reagenzien bentigt, (bei -COOH nur, wenn , sonst

    eventuell Nucleophile)

    Probleme: - Kann berhaupt eine Seitenkette selektiv modifiziert werden?

    (z. B. bei LDH eine von 5 SH-Gruppen oder oft eine von mehr als 20 Lys-NH2-Gruppen) - Sterische Zugnglichkeit:

    Besondere Reaktivitt durch spezifischen pK-Wert durch Nachbargruppen kinetische Kontrolle (z. B. Lys-NH2 normal pK = 11; im AZ Teile mit pK = 8)

    Wahl des Reagenz: - Spezifitt - reversible Reaktion? - milde Reaktionsbedingungen

  • Chemische Modifizierung von Proteinen Unspezifische Reagenzien 29

    Bestimmung des Einbaus: - Farbige Reagenzien - Radioaktive Markierung (3H, 14C, 35S ...)

    1.) Bestimmung katalytisch relevanter AS: Korrelation der Aktivitt mit dem Einbau:

    Probleme: Trotz 1:1-Relation kann es zu allosterischen Effekten kommen. Bsp.: Bei der Modifizierung der "essentiellen SH-Gruppe" bei der LDH wird eine Seitenkette verschoben, an die ein "essentielles His" geknpft ist Verlust der Aktivitt!

    2.) Identifizierung der Art der modifizierten AS: z. B. durch die pH-Abhngigkeit (der pK-Wert von 6,5 deutet eventuell auf His)

    3.1. Unspezifische Reagenzien

    - Jodessigsure:

    - Jodacetamid:

    - Acet(yl)imidazol:

    (bei His, Cys Produkte instabil)

    I CH2 CO

    NH2analog wie oben

    I CH2 CO

    ONH2 CH2 C

    O

    ONH

    SH S CH2 C O

    O

    NH

    N

    N

    N

    CH2 CO

    O

    N

    N

    C CH3

    O

    NH2 NH C CH3

    O

    OH O C CH3

    O

  • Chemische Modifizierung von Proteinen Gruppenspezifische Reagenzien 30

    3.2. Gruppenspezifische Reagenzien

    Lys-NH2: Imidoester: (entsteht aus: R-CN + MeOH/HCl)

    Tyr-OH: Tetranitromethan:

    Alternativ: Umsetzung mit Diazoniumsalzen Azofarbstoffe

    Cys-SH: Male(in)imide, z. B. N-Ethylmaleimid:

    Umsetzung auch mit Lys bei pH = 6,5 - 7, Geschwindigkeit aber 1000mal langsamer.

    Serin-OH: Diisopropylfluorophosphat:

    Parathion (E 605) wirkt analog:

    Tryptophan: Sulfenylchlorid (Koshland-Reagenz): Reaktion auch mit Cys-SH, das "reversibel" geschtzt werden mu.

    Arginin: Butandion (Diacetyl):

    S OH

    NO2

    NH

    SerOPO

    O

    O

  • Chemische Modifizierung von Proteinen Reagenzien zur nderung der Ladung 31

    Aspartat, Glutamat: - Dicyclohexylcarbodimid (DCCD)

    3.3. Reagenzien zur nderung der Ladung

    3.4. Hydrophobisierung von Enzymen

    3.5. Reversible Reagenzien

    Histidin:

    Urethan (zerfllt hydrolytisch)

  • Chemische Modifizierung von Proteinen Active-Site Labeling 32

    Cystein:

    a.) HgCl2 Cl-Hg-S-Cys HS-Cys

    b.) p-Chlormercuribenzoat reagiert analog

    c.) Ellman's Reagenz:

    analog:

    3.6. Active-Site Labeling

    3.7. Suizid - Substrate

    Werden am aktiven Zentrum reaktiv

    3.8. Photoaffinity - Label

    analog: Diazoketone N2 Carben

    DiazirinoNAD+:

    Carben

    R-SH Cys-SH

    gute, stabile Austrittsgruppe groerExtinktionskoeffizient(~11000 cm-1 M-1)

  • Chemische Modifizierung von Proteinen Bifunktionelle Reagenzien 33

    3.9. Bifunktionelle Reagenzien

    Kriterien fr die Anwendung: a.) Abstandsmessungen (im AZ) starr

    - spezifisch fr bestimmte Aminosuren - fr Reste eventuell unterschiedlich spezifisch

    b.) Lokalisierung von ''Nachbarn"; kovalente Verbindungen von Untereinheiten - flexibel - unspezifisch

    Reagenz von ZAHN:

    o,p- aktiviert fr nucleophile Substitution des F

    HUGO FASOLD:

    spaltbare Reagenzien

    mit Lys: Harnstoffderivate mit OH: Urethane

    speziell zur Vernetzung von UE via Lys

    Bei Verwendung von statt Spaltung mit IO4- mglich

    Probleme: - viele Produkte

    - Reaktion nur an Rest A oder nur an Rest B - Quervernetzung zwischen A und B - weitere Reste knnen entsprechend reagieren - bei asymmetrische Reagenzien kann u. U. die eine oder die andere Seite mit Rest A

    reagieren Beispiel:

    Stufenweise Reaktion:

    Belichtung nach Entfernung des nicht umgesetzten berschusses durch z. B. Dialyse oder Gelchromatographie. Aktivierung einfach durch pH > 8,5 nach Reaktion mit -SH und Dialyse

  • Chemische Modifizierung von Proteinen Semireversible Reagenzien 34

    3.10. Semireversible Reagenzien

    ProteinSH + RSeCR ProteinSCR (spter wieder spaltbar) + RSeH ( RSeSeR)

    3.11. Trgergebundene Enzyme

    Vorteile:

    Erhhte Stabilitt (z. B. Proteasen, Schutz vor Selbstverdauung) Wiedergewinnung

    Probleme:

    Zugnglichkeit des AZ Kinetik: Diffusionsprobleme:

    Spezifische Aktivitt kleiner als im lslichen Enzym, auch wenn Zugang zum AZ frei, denn nach Teilverdau des Trgers steigt die spezifische Aktivitt bis zum Normalwert

    Reaktion an der richtigen UE

    Arten der Verknpfung:

    kovalent Adsorption Einschluverbindungen Aggregation

    a.) Kovalente Bindung an welche AS?

    Keine seltenen, da diese oft katalytisch relevant Schutz des AZ durch Komplexe (LDH: NAD+ / Oxalat) z. B. direkt an BrCN-aktivierte Agarose: (dargestellte Reaktion verluft ber Spacer + R-COOH, es geht auch mit Lys-NH2)

    O O

  • Chemische Modifizierung von Proteinen Trgergebundene Enzyme 35

    Bifunktionelle Reagenzien:

    Mssen erst mit Enzym reagieren und nur das "aktive", modifizierte an Trger

    binden!

    b.) Adsorption an:

    porses Glas / Ti02 / Collagen

    c.) Einschluverbindungen:

    z. B. Copolymerisation (Acrylamid mit Bisacrylamid)

    d.) Chemische Aggregation:

    z. B. durch bifunktionelle Reagenzien

    H

    H H

  • Lipide Allgemeine bersicht 36

    4. Lipide

    4.1. Allgemeine bersicht

    4.2. Fette

    Fette bestehen in der Regel aus Glycerin und 3 Fettsuren, z. B. die nebenstehenden. Fr die Bezeichnung der Fettsuren verwendet man eine Kurzschreibweise, bei der die Zahl der C-Atome und die Zahl der Doppelbindungen angegeben werden.

    4.3. Glykolipide

    Sie enthalten kein Phosphat, sondern stattdessen einen Mono- oder Oligosaccharidrest, der meist mit Sphingosin (oder Glycerin) verknpft ist und den hydrophilen Anteil bildet.

    Glyceringlykolipide: 1.2-Diacylglycerin und ein Mono- oder Oligosaccharid in 3-Stellung des Glycerins glykosidisch gebunden.

    Sphingosinglykolipide: Als Sphingolipide enthalten sie als zentralen Baustein statt des dreiwertigen Alkohols Glycerin einen Amino-dialkohol, das Sphingosin, welches ein C18-Molekl mit einer trans-Doppelbindung ist. Durch Amidbildung mit einer Fettsure kommt es zu Ceramiden, deren Glykoside die neutralen Glykosphingolipide sind.

    Glycerin-phospholipide

    Sphingosin-phospholipide

    Glycerin-glykolipide

    Sphingosin-glykolipide

    Glykolipide

    ein Ceramid

    Sphingosin

  • Lipide Phospholipide 37

    Einfachste Vertreter: Cerebroside. Bei den Cerebrosiden des Gehirns meist Galaktose, bei Leber und Milz meist Glucose.

    4.4. Phospholipide

    Glycerinphospholipide Phosphodiester; die Phosphorsure ist einerseits mit einem Sphingosin- oder Glycerinderivat (meist Diacylglycerin), andererseits mit Cholin Ethanolamin, Serin, Inosit oder Glycerin verestert.

    Sphingosinphospholipide Sphingomyeline: In den Myelinscheiden vorkommende Sphingosinphospholipide, bei denen die endstndige Hydroxygruppe des Ceramids (s. o.) mit Phosphorylcholin verestert ist.

    4.5. Isoprenoidlipide

    Die Steroide und Terpene gehren zu dieser Stoffklasse und werden wegen ihrem hnlichen Lsungsverhalten zu den Lipiden gerechnet.

    Steroide Cholesterin: Das Cholesterin leitet sich vom Cyclopentano-perhydrophenanthren ab, welches

    auch als Steran bezeichnet wird. Durch die OH-Komponente liegt Cholesterin als Alkohol vor (engl.: Cholesterol). Cholesterin verleiht der Membran Starrheit und schliet auftretende Lcher.

    Sphingosin

    ein Sphingomyelin

    O

    o

    ein Cerebrosid o o

  • Lipide Biomembranen 38

    Terpene Zu dieser Stoffklasse gehren die Carotine und die Xanthophylle, die hier aber nicht weiter besprochen werden.

    4.6. Biomembranen

    Membranfunktion Geben den Zellen Individualitt durch Abtrennung der Umwelt Bei Eukaryonten: Strukturierung von Zellorganellen durch interne Membranen

    Eukaryonten: Einzellige oder mehrzellige Organismen, die einen vom Cytoplasma durch eine Membran abgegrenzten Zellkern besitzen.

    Prokaryonten: Kein Zellkern. Kompartimentierung bestimmter Prozesse Extrem spezifische Permeabilittsbarrieren Bewirken geordnete rumliche Anordnung bestimmter Enzyme zueinander (Reaktionsketten

    mglich) Enthalten Pumpen (molekulare), Rezeptoren (Hormone) zur Steuerung interner Prozesse

    Bau der Membranen Keine kovalenten oder festen Strukturen, sondern eine Flssigkeitsschicht, die durch

    Wechselwirkungen mit dem Lsungsmittel entsteht. Bestehen aus: Lipiden (v. a. Phospholipide, Glykolipide und Cholesterin)

    Proteinen Bau der Phospholipide: polarer, hydrophiler Kopf

    unpolarer, hydrophober Schwanz Micellen: (z. B. freie Fettsuren und viel Wasser) Doppelschichten: a.) periphere Proteine

    b.) membranintegrale Proteine (z. B. Hormonrezeptoren) c.) membranintegrale Proteine (membrandurchspannend, z. B. Ionen-Pumpen)

    Die Flchen knnen Vesikel (kugelfrmige Doppelschichten) bilden. Die Doppelschicht liegt nicht starr vor, sondern befindet sich stndig im Flu, wobei die Proteine ihre Positionen verndern knnen. Laterale Diffusion einfach, hochmobile Schicht. Transversale Diffusion (flip-flop) energetisch ungnstig.

  • Monosaccharide Nomenklatur 39

    5. Monosaccharide

    5.1. Nomenklatur

    Carbonylfunktion: Ketosen / Aldosen Anzahl der C-Atome: 3: Triosen 4: Tetrosen 5: Pentosen 6: Hexosen 7: Heptosen

    Aldose mit n C-Atomen: 2n-2 stereoisomere Formen Pentosen: n = 5 23 = 8 Isomere (4 L-Formen und 4 D-Formen) Hexosen: n = 6 24 = 16 Isomere

    Fischer-Projektion: - D-Zucker haben an ihrem Carbonyl-fernsten Asymmetriezentrum die gleiche absolute Konfiguration wie D-Glycerinaldehyd - L-Zucker sind Spiegelbilder der D-Zucker

    Epimere: Zucker, die sich in der Konfiguration nur an einem C-Atom unterscheiden. (z. B. Glucose / Mannose)

    Acetale und Ketale Acetale entstehen bei der Reaktion von Aldehydgruppen mit Alkoholen:

    Aldehyd Halb-Acetal Voll-Acetal

    (z. B. offene Aldose) (z. B. ringfrmige Aldose) (z. B. Glucose im Strkemolekl)

  • Monosaccharide Zyklische Zucker 40

    Ketale: Entstehen bei der Reaktion von Ketogruppen mit Alkoholen.

    Ketogruppe Halb-Ketal Voll-Ketal (z. B. offene Ketose) (z. B. ringfrmige Ketose) (z. B. Fructose in der Saccharose)

    Saccharose:

    5.2. Zyklische Zucker

    5-Ring-Zucker

    6-Ring-Zucker

    -D-Ribofuranose

    O

  • Monosaccharide Nucleotide 41

    5.3. Nucleotide

    Nucleoside: Zucker und eine Base Nucleotide: Zucker, Base und ein oder mehr Phosphatreste

    Purinbasen:

    Pyrimidinbasen:

    H

    H H

  • Stoffwechsel Nucleotide 42

    6. Stoffwechsel

    Die grundlegenden Stoffwechselwege sind in den meisten Organismen identisch!

    Aufklrung durch Ftterungsversuche mit durch Isotope markierten Substanzen Verwendung von Stoffwechselinhibitoren (Hemmstoffe) Verwendung von auxotrophen Mutanten (bentigen bestimmten Nhrstoff fr ihr Wachstum)

    Mutanten durch mutagene Substanzen Strahlung, z. B. Rntgenstrahlung molekularbiologische Methoden

    Ein Beispiel fr die Wirkung von Mutanten ist die Arginin-Biosynthese im Harnstoff-Zyklus mit folgenden Enzymdefekten:

    Mutante 1 wchst auf: Ornithin oder Citrullin oder Arginin Mutante 2 wchst auf: Citrullin oder Arginin Mutante 3 wchst auf: Arginin Cross-feeding: Mutante 2 reichert Ornithin an und wchst mit Filtrat von Mutante 3 (da in diesem Citrullin angereichert ist), aber nicht umgekehrt Metabolismus: Stoffwechsel; Bedeutung i. a. Anabolismus und Katabolismus Anabolismus: Aufbau von Krpersubstanzen Katabolismus: Abbau von Krpersubstanzen und Nahrungsbestandteilen Speicherung der Energie als: ATP / hochreduzierte Verbindungen (z. B. Glucose)

    reduzierte Elektronenbertrger (NADH, FADH2, NADPH) Verwendung der Energie fr: Biosynthesen (Anabolismus) / Muskelarbeit (ATP) /

    Transportprozesse

  • Stoffwechsel Nucleotide 43

    Unterscheidung der Lebewesen: 1.) Nach der Kohlenstoffquelle: autotroph: "sich selbst ernhrend";

    C-Quelle ist CO2 heterotroph: C-Quelle sind andere Zellen bzw. deren

    Bestandteile 2.) Nach der Energiequelle: phototroph: Licht

    chemotroph: Redoxprozesse 3.) Nach den Elektronendonatoren: lithotroph: anorganische Verbindungen:

    (H2S, NH3, S, Co, Fe2+, H2O) organotroph: organische Verbindungen

    Organismen C-Quelle E-Quelle e--Donatoren Bsp. Photolithotroph CO2 Licht anorg. Verb. Bakterien Photoorganotroph org. Verb./CO2 Licht org. Verb. Purpurbakterien Chemolithotroph CO2 Redoxprozesse anorg. Verb. Archaebakterien Chemoorganotroph org. Verb. Redoxprozesse org. Verb. alle hheren Tiere

  • Kohlenstoff-Stoffwechsel Glykogen 44

    7. Kohlenstoff-Stoffwechsel

    7.1. Glykogen

    Glykogen ist eine leicht mobilisierbare Speicherform der Glucose. Es ist ein groes, verzweigtes Polymer aus Glucoseeinheiten in -1,4-glykosidischer Bindung.

    Die Synthese und der Abbau von Glykogen sind aus mehreren Grnden von Bedeutung: Regulation des Blutzuckerspiegels Glucosereservoir fr anstrengende Muskelaktivitt Synthese und Abbau laufen auf unterschiedlichen Reaktionswegen, dies verdeutlicht ein

    wichtiges Prinzip der Biochemie generelle Bedeutung der Regulationsmechanismen auf hormoneller Ebene Reversible Phosphorylierung der Enzyme

    7.1.1. Abbau des Glykogens durch Glykogen-Phosphorylase

    Phosphorolyse bedeutet die Spaltung einer Bindung durch Einbau von Orthophosphat (im Gegensatz zur Hydrolyse, einer Spaltung durch Wasser).

    Fr den Ablauf der Spaltung ist als Coenzym das Pvridoxal-5-phosphat (PLP), ein Derivat des Pyridoxins (Vitamin B6) erforderlich. Die Aldehydgruppe dieses Coenzyms bildet eine Schiff'sche Base mit einer spezifischen Lysin-Seitenkette des Enzyms. PLP spaltet mit seiner Phosphatgruppe zunchst die glykosidische Bindung und wird durch anorganisches Phosphat wieder freigesetzt (doppelte Inversion am C1).

    Abbau des Glykogens durch Phosphorylase: Phosphorylase kann die Kette nur solange abbauen, bis sie einen endstndigen Glucoserest erreicht, der nur 4 Einheiten bis zu einer Verzweigung entfernt ist.

    bertragung durch eine Transferase: Die Transferase bertrgt einen Block von 3 Glucoseeinheiten von einem ueren Zweig auf einen anderen.

  • Kohlenstoff-Stoffwechsel Glykogen 45

    Abbau durch ein debranching enzyme: (= Aufhebung der Verzweigung) Das dritte Abbauenzym, die -1,6-Glucosidase (unter dem Namen debranching enzyme bekannt), hydrolysiert die Bindung des einzelstehenden Glucosemolekls, es entsteht ein Molekl Glucose.

    Somit liegt das Glykogen wieder in einer linearen Form vor und kann weiter von der Phosphorylase abgebaut werden.

    7.1.2. Synthese von Glykogen

    Die Synthese hat als erste Vorstufe die UDP-Glucose. Glucose-1-P + UTP UDP-Glucose + PPi Glykogen(n) + UDP-Glucose Glykogen(n+1) + UDP

    UDP-Glucose: Die Verzweigungen (-1,6-Bindungen) werden durch ein branching enzyme gebildet.

  • Kohlenstoff-Stoffwechsel Glykolyse 46

    7.2. Glykolyse

    7.2.1. Ablauf der Glykolyse

  • Kohlenstoff-Stoffwechsel Glykolyse 47

    Die Glykolyse ist eine Folge von Reaktionen in denen im Cytosol (Cytoplasma) Glucose in Pyruvat umgewandelt wird und gleichzeitig ATP entsteht. In aeroben Organismen geht sie dem Citratzyklus und der Atmungskette voraus. Unter anaeroben Bedingungen tritt das Pyruvat in die Mitochondrien ber und wird hier vollstndig zu CO2 und H2O oxidiert. Bei ungengendem Sauerstoffangebot, etwa in einem Muskel, wird das Pyruvat in Lactat berfhrt. Bei einigen anaeroben wird das Pyruvat in Ethanol umgewandelt. Die Bildung von Lactat oder Ethanol aus Glucose sind Beispiele fr Grungen.

    Netto-Stoffbilanz der Glykolyse: Glucose + 2 ADP + 2 Pi + 2 NAD+ 2 Pyruvat + 2 ATP + 2 NADH/H+ + 2 H2O

    7.2.2. Bildung von Fructose-1,6-bisphosphat aus Glucose

    Die Umwandlung besteht aus drei Reaktionen: einer Phosphorylierung, einer Isomerisierung und einer zweiten Phosphorylierung. Der Sinn dieser Reaktionen ist die berfhrung der Glucose in eine reaktionsfhige Form, welche sich in zwei C3-Einheiten spalten lt. Gesamtreaktion:

    Phosphorylierung der Glucose durch Hexokinase:

    Isomerisierung von Glucose-6-phosphat zu Fructose-6-phosphat durch Glucosephosphat-Isomerase: (Umwandlung einer Aldose in eine Ketose)

    Phosphorylierung zu Fructose-l,6-bisphosphat durch Phosphofructokinase:

    Glucose

  • Kohlenstoff-Stoffwechsel Glykolyse 48

    7.2.3. Bildung von Glycerinaldehyd-3-phosphat

    Spaltung von Fructose-1,6-bisphosphat in Glycerinaldehyd-3-phosphat (GAP) und Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) durch Aldolase:

    Mechanismus der Aldolase:

    Aldolase fhrt die umgekehrte Reaktion einer Aldolkondensation (z. B. Aldehyd+Keton) durch. Die Reaktion luft nur mit GAP weiter, da DHAP wird durch Triosephosphatisomerase in GAP berfhrt.

    1. energiegewinnender Schritt: Phosphorylierung und Oxidation des GAP (keine ATP-Bildung!) Umwandlung von Glycerinaldehyd-3-phosphat in 1,3-Bisphosphoglycerat durch Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase:

  • Kohlenstoff-Stoffwechsel Glykolyse 49

    Mechanismus der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase:

    2. enerqieqewinnender Schritt:

    Dies ist die erste ATP-bildende Reaktion, katalysiert durch Phosphoglycerat-Kinase:

    Bildung von Pyruvat und eines zweiten Molekls ATP:

    7.2.4. Regulation der Glykolyse

    Glykolyse und Gluconeogenese sind so koordiniert, da beide Vorgnge nicht gemeinsam anlaufen. Bei dieser Kontrolle spielt ein Signalmolekl, das Fructose-2,6-bisphosphat eine wichtige Rolle.

    energiereiche Anhydrid-Bindung

    - : F-2,6-BP - : AMP + : Citrat

    Thioester

    Thiohalbacetal

    gemischtes Anhydrid

    + : AMP + : F-2,6-BP - : ATP - : NADH - : Citrat

    6-Phosphofructo-1-Kinase Fructose-1,6-bisphosphatase

  • Kohlenstoff-Stoffwechsel Glykolyse 50

    1. Regulation der Glykolyse / Gluconeogenese durch F-2,6-BP: F-2,6-BP aktiviert die 6-Phosphofructo-1-Kinase der Leber, indem sie deren Affinitt zu Fructose-6-Phosphat steigert und die Hemmwirkung von ATP herabsetzt. Dies hat die Synthese von F-1.6-BP durch die Phosphorylierung von Fructose-6-phosphat zur Folge. Gleichzeitig wird Fructose-1,6-bisphosphatase durch F-2,6-BP gehemmt.

    2. Regulation der Konzentration von F-2,6-BP: F-2,6-BP wird durch Phosphorylierung (durch 6-Phosphofructo-2-Kinase) synthetisiert und kann von der Fructose-2,6-bisphosphatase zu Fructose-6-phosphat hydrolysiert werden. Beide Enzyme befinden sich auf einer einzigen Peptidkette, die man auch als Tandem-Enzvm bezeichnet.

    3. Regulation des Tandem-Enzyms: Die Aktivitten von 6-Phosphofructo-2-Kinase und Fructose-2,6-bisphosphatase werden durch die Phosphorylierung eines Serinrestes kontrolliert. Bei Glucosemangel lst ein Konzentrationsanstieg des Hormons Glucagon eine Reaktionskaskade aus, die zur Phosphorylierung dieses bifunktionellen Enzyms fhrt (> Fructose-6-phosphat Gluconeogenese). Ist dagegen Glucose im berschu vorhanden, verliert das Enzym seine Phosphorylgruppe, wodurch der F-2,6-BP-Spiegel ansteigt ( Glykolyse). unphosphoryliert: aktiviert Kinase, hemmt Bisphosphatase Aufbau von F-2,6-BP phosphoryliert: aktiviert Bisphosphatase, hemmt Kinase Abbau von F-2,6-BP

    7.2.5. Weiterverarbeitung des Pyruvats

    Aerobier: Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex Acetyl-CoA Citronensure-Zyklus oxidative Phosphorylierung CO2 + H2O

  • Kohlenstoff-Stoffwechsel Oxidative Decarboxylierung 51

    hhere Organismen und Bakterien bei O2-Mangel (anaerob): homolaktische Fermentation Lactat (Muskel) (Glucose + 2 ADP + 2 Pi 2 Lactat + 2 ATP + 2 H2O)

    Hefe und Mikroorganismen (anaerob) alkoholische Grung > Ethanol (Glucose + 2 ADP + 2 P, + 2 FT 2 Ethanol + 2 ATP + 2 CO2 + 2 H2O) Decarboxylierung durch Pyruvat-Decarboxylase Reduktion durch Alkohol-Dehydrogenase mit NADH

    7.3. Oxidative Decarboxylierung

    Die Funktion dieses Reaktionsweges ist die Bildung von Acetyl-CoA aus Pyruvat in den Mitochondrien, welches anschlieend im Citratzyklus vollstndig zu CO2 oxidiert wird. Die Reaktion wird durch den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex katalysiert. Es handelt sich dabei um einen sehr groen Multienzymkomplex aus drei eng zusammenwirkenden Enzymen. (Vorteil Multienzymkomplex: Hhere Geschwindigkeit, kaum Nebenreaktionen)

    Komponente Abk. Ketten Coenzyme Reaktion Pyruvat-Dehydrogenase El 24 TPP oxidative Decarboxylierung von Pyruvat Dihydrolipoyl-Transacetylase E2 24 Liponamid Transfer der Acetylgruppe auf CoA Dihydrolipoyl-Dehydrogenase E3 12 FAD

    NAD+ Regenerierung der oxidierten Form des Liponamids

    1. Decarboxylierung des Pyruvats nach Bindung an das TPP Gesamt: Pyruvat + TPP Hydroxyethyl-TPP + CO2

    Durch die Ionisierung des TPP kommt es zur Bildung eines Carbanions, das nucleophil mit Pyruvat reagiert:

    H

  • Kohlenstoff-Stoffwechsel Oxidative Decarboxylierung 52

    2. Oxidation der Hydroxyethylgruppe und bertragung auf Liponamid Genaue Struktur des Liponamids siehe Kap. Coenzyme!

    3. bertragung der Acetylgruppe auf Coenzym A:

    4. Regenerierung der oxidierten Form des Liponamids:

    FADH2 FAD

    NADH + H+ NAD+

  • Kohlenstoff-Stoffwechsel Hormonelle Steuerung 53

    7.3.1. Regulation des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes

    1. Produkthemmung: Die Produkte der Pyruvatoxidation, Acetyl-CoA und NADH, hemmen den Enzymkomplex. Acetyl-CoA hemmt die Transacetylase-Komponente, NADH die Dihydrolipoyl-Dehydrogenase.

    2. Feedback-Regulation durch Nucleotide (Rckkopplungshemmung): Die Aktivitt des Enzymkomplexes wird durch die Energieladung kontrolliert. AMP aktiviert den Komplex, GTP hemmt ihn, d. h. der Komplex wird gehemmt, wenn unmittelbar verfgbare Energie vorhanden ist.

    3. Regulation durch reversible Phosphorylierung: Der Komplex wird enzymatisch inaktiv, wenn ein spezifischer Serinrest durch eine Kinase phosphoryliert wird. Dabei hemmt AMP und Pyruvat die Kinase. Die Phosphorylierung kann durch eine Phosphatase rckgngig gemacht werden. Es liegt also ein reversibler Regulationsmechanismus vor.

    7.4. Hormonelle Steuerung

    Der Glykogenstoffwechsel wird von bestimmten Hormonen stark beeinflut. Insulin: Ein Polypeptidhormon, welches die Fhigkeit der Leber steigert, Glykogen zu

    synthetisieren. Insulin wird in den B-Zellen der Langerhansschen Inseln im Pankreas gebildet und ins Blut abgegeben. Ein hoher Insulinspiegel im Blut signalisiert Sttigung, ein geringer einen Hungerzustand.

    Adrenalin: (Epinephrin) Entgegengesetzte Wirkung von Insulin, bewirkt also den Abbau von Glykogen in der Muskulatur. Freisetzung aus dem Nebennierenmark.

    Glucagon: Stimulierung des Glykogenabbaus in der Leber. Wird von den -Zellen des Pankreas abgegeben, wenn der Blutzucker niedrig ist. Durch den Abbau des Glykogens wird der Blutzuckerspiegel wieder angehoben.

    EARL SUTHERLAND entdeckte, da die Wirkung von Adrenalin und Glucagon auf den Stoffwechsel durch cAMP vermittelt wird. Diese und andere Hormone wirken fast augenblicklich, indem sie mit an den Membranen der Zellen des Erfolgsorgans lokalisierten Rezeptoren reagieren und dadurch eine Aktivierung der membrangebundenen Adenylat-Cyclase hervorrufen. Unter der Wirkung der Adenylat-Cyclase kommt es zu einem Anstieg der cAMP-Konzentration in der Zelle (durch Umwandlung von ATP in cAMP), welches als allosterischer Aktivator auf Enzyme wirkt (second messenger).

    Durch die erhhte Konzentration kommt es z. B. zur Aktivierung der Phosphorylase und zur Hem-mung der Glykogen-Synthase im Glykogenstoffwechsel.

    O

  • Kohlenstoff-Stoffwechsel Hormonelle Steuerung 54

    7.4.1. bersicht zur Wirkung der Hormone

    Die Bindung des Hormons (hier Adrenalin) bewirkt eine Konformationsnderung am Rezeptor. Der Hormon-Rezeptor-Komplex (nicht aber der unbesetzte Rezeptor) bindet das G-Protein. Dieses veranlat den Austausch von GDP gegen GTP, die G-Untereinheit dissoziiert ab und

    stimuliert die Adenylat-Cyclase zur Bildung von cAMP, bis das GTP hydrolysiert wird. Der erhhte intrazellulre cAMP-Spiegel aktiviert nun eine Protein-Kinase, die ihrerseits

    Zellproteine phosphoryliert und damit von einer inaktiven in eine aktive Form berfhrt.

    Antagonist zu der Protein-Kinase ist eine Phosphatase, die durch Dephosphorylierung die Proteine wieder inaktiviert.

    Das cAMP kann von einer Phosphodiesterase wieder gespalten werden. Theophyllin (R = H) und Coffein (R = CH3) sind Inhibitoren der Phosphodiesterase, wirken daher wie Adrenalin anregend.

    7.4.2. Stimulierung der Adenylat-Cyclase durch ein G-Protein

    Der Hormon-Rezeptor-Komplex aktiviert aber nicht direkt die Adenylat-Cyclase, sondern stimuliert ein G-Protein (guanylnucleotidbindendes Protein), welches das Erregungssignal auf die Adenylat-Cyclase bertrgt. Das G-Protein besteht aus einer , einer - und einer -Untereinheit. Es kommt in der GDP- und der GTP-gebundenen Form vor. Die GTP-Form aktiviert die Adenylat-Cyclase, die GDP-Form jedoch nicht. Ohne Hormon liegt das G-Protein fast nur in der GDP-Form vor. Der Hormon-Rezeptor-Komplex bindet an das G-Protein, bewirkt den Austausch von GDP gegen GTP und die Freisetzung von GDP, d. h. ermglicht die Bindung von GTP (aktive Form). Die -Unter-einheit mit dem GTP (G-GTP) dissoziiert von der -Untereinheit ab. G-GTP aktiviert nun die Adenylat-Cyclase. Der Informationsflu luft also vom Hormon-Rezeptor-Komplex ber ein G-Protein zu der Adenylat-Cyclase. Dabei erzeugt jedes gebundene Hormonmolekl viele GTP-Molekle, was die Hormonwirkung verstrkt.

  • Kohlenstoff-Stoffwechsel Hormonelle Steuerung 55

    Die Aktivierung der Adenylat-Cyclase wird durch Hydrolyse der -Untereinheit des G-Proteins von der GTP-Form in die GDP-Form abgestellt. Das G-Protein ist also eine GTPase.

    7.4.3. Aktivierung der Protein-Kinase A und der Phosphorylase

    Protein-Kinase A ist ein allosterisches Enzym, welches cAMP an Phosphorylase koppelt. Seine inaktive Form enthlt zwei Sorten von Untereinheiten, einer katalytischen (C) und einer regulatorischen Untereinheit (R), die die katalytische hemmt. Bei der Aktivierung durch cAMP wird cAMP an eine spezifische Stelle der R-Untereinheit gebunden, wodurch der inaktive CR-Komplex zu R-cAMP und der freien C-Untereinheit dissoziiert, die nun katalytisch aktiv ist (cAMP hebt also die Hemmung auf) und Phosphorylase-Kinase durch Phosphorylierung aktiviert.

    Phosphorylase-Kinase ist ein sehr groes Protein und aktiviert durch Phosphorylierung des Serins 14 die Phosphorylase. Diese Kinase wird zweifach kontrolliert: 1.) Phosphorylierung: Aktivierung durch Protein-Kinase 2.) Regulation durch Ca2+-Ionen:

    Eine Untereinheit der Kinase, das Calmodulin (ein calciumbindendes Protein), verndert bei der Bindung mit Ca2+-Ionen seine Struktur. Diese Form der Kinaseaktivierung besitzt im Muskel Bedeutung, wo die Kontraktion durch Ca2+-Freisetzung ausgelst wird. Glykogenabbau und Muskelkontraktion werden also ber den Anstieg der Ca2+-Konzentration im Cytosol kontrolliert.

    Wirkung von Ca2+:

  • Kohlenstoff-Stoffwechsel Gluconeogenese 56

    7.4.4. Aktivierungskaskade zum Glykogenstoffwechsel

    Aktive Formen sind unterstrichen. Die Reaktionsfolge bis zur Aktivierung der Protein-Kinase ist in beiden Mechanismen gleich. Die Protein-Kinase inaktiviert auerdem die Glykogen-Synthase durch Phosphorylierung. Durch die Aktivierungskaskade kommt es zu einer gut 100fachen Verstrkung des Hormonsignals.

    1.) Hormone wie Adrenalin und Glucagon binden an Rezeptoren in der Plasmamembran der

    Zielzelle ( Konformationsnderung) und lsen die Aktivierung der Adenylat-Cyclase aus. 2.) Die Adenylat-Cyclase in der Plasmamembran katalysiert die Bildung von cAMP. 3.) Der erhhte intrazellulre cAMP-Spiegel aktiviert eine Protein-Kinase. 4.) Die Protein-Kinase phosphoryliert sowohl Phosphorylase-Kinase als auch die Glykogen-

    Synthase.

    7.5. Gluconeogenese

    Die Gluconeogenese ist die Glucosesynthese aus Nicht-Kohlenhydrat-Vorstufen. Dieser Vorgang ist bei einer Hungerperiode oder extremer krperlicher Belastung von Bedeutung, wenn bentigte Glucose nicht durch den Abbau von Glykogen bereitgestellt werden kann. In der Gluconeogenese entsteht Glucose aus Pyruvat. Der Ablauf entspricht dabei mit drei Ausnahmen dem umgekehrten Weg der Glykolyse:

  • Kohlenstoff-Stoffwechsel Gluconeogenese 57

    1.) Phosphoenolpyruvat wird aus Pyruvat ber Oxalacetat gebildet Glykolyse: PEP + ADP Pyruvat + ATP Gluconeogenese: Pyruvat + CO2 + ATP Oxalacetat + ADP + Pi

    (Pyruvat- Carboxylase) Oxalacetat + GTP PEP + GDP + CO2

    (PEP-Carboxykinase)

    2.) Fructose-6-phosphat entsteht durch Hydrolyse von Fructose-1,6-bisphosphat Glykolyse: Fructose-6-phosphat + ATP Fructose-1,6-bisphosphat + ADP Gluconeogenese: Fructose-1,6-bisphosphat + H2O Fructose-6-phosphat + Pi

    (Fructose-1,6-bisphosphatase) 3.) Glucose entsteht durch Hydrolyse von Glucose-6-phosphat Glykolyse: Glucose + ATP Glucose-6-phosphat Gluconeogenese: Glucose-6-phosphat + H2O Glucose + Pi

    (Glucose-6-phosphatase)

    7.5.1. Enzymatische Unterschiede zwischen Glykolyse und Gluconeogenese

    Glykolyse Gluconeogenese Hexokinase Glucose-6-phosphatase Phosphofructokinase Fructose-6-bisphosphatase Pyruvat-Kinase Pyruvat-Carboxylase Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase

    Pyruvat-Carboxylase (PC) enthlt eine kovalent gebundene prosthetische Gruppe, das Biotin (Struktur siehe Coenzyme), das als Carrier von aktiviertem CO2 dient. Biotin wird nicht carboxyliert, wenn kein Acetyl-CoA vorhanden ist, d. h. PC wird durch Acetyl-CoA allosterisch aktiviert. Glucose-6-phosphatase ermglicht den Austritt der Glucose aus der Zelle in die Blutbahn, da normalerweise Glucose-6-phosphat nicht aus den Zellen heraus diffundieren kann. Sie ist fr die Gluconeogenese essentiell.

  • Kohlenstoff-Stoffwechsel Der Citratzyklus 58

    7.6. Der Citratzyklus

    Kondensation von Oxalacetat und Acetyl-CoA: Der Kreislauf beginnt mit der Bildung von Citrat. Die Reaktion ist eine Aldolkondensation mit nachfolgender Hydrolyse.

    Isomerisierung von Citrat zu Isocitrat: Um eine oxidative Decarboxylierung zu ermglichen, mu Citrat zu Isocitrat isomerisiert werden. Dies wird durch eine Dehydratisierung und anschlieende Hydratisierung erreicht.

    oxidative Decarboxylierung von Isocitrat: Bei diesem Schritt wird NADH gebildet!

    HO H

    L-

    HC

  • Kohlenstoff-Stoffwechsel Der Citratzyklus 59

    2-Oxoglutarat zu Succinyl-CoA: analog Pyruvat zu Acetyl-CoA; weitere Schritte analog -Oxidation der Fettsuren

    7.6.1. Citrat-Malat-Shuttle

    Viele Stoffwechselvorgnge laufen im Cytosol ab, whrend andere - z. B. die -Oxidation oder der Citratzyklus - in den Mitochondrien stattfinden. Wichtigstes Substrat der Mitochondrien aus dem Kohlenhydrat-Stoffwechsel ist Pyruvat, das ohne Schwierigkeiten in die Mitochondrien gelangt und dort oxidativ zum Acetyl-CoA decarboxyliert wird. Diese oxidative Decarboxylierung ist gleichzeitig eine Schlsselreaktion bei der Umwandlung von Kohlenhydrat in Fett. Da aber die Fettsuresynthese extramitochondrial erfolgt, mu die "aktivierte Essigsure" (Acetyl-CoA) wieder herausgeschleust werden. Dies geschieht durch Kondensation mit Oxalacetat zu Citrat; Citrat verlt die Mitochondrien und wird im Cytosol durch ATP-Citrat-Lyase wieder in Acetyl-CoA und Oxalacetat gespalten. Das Oxalacetat wird wieder zu Malat reduziert, welches die Mitochondrienmembran passiert. Der Trans-port von Citrat ist mit dem von Malat gekoppelt: Pro Mol ausgeschleustes Citrat wird 1 mol Malat in die Mitochondrien hineintransportiert.

    ATP

    ADP + Pi

  • Kohlenstoff-Stoffwechsel Oxidative Phosphorylierung und Atmung 60

    7.7. Oxidative Phosphorylierung und Atmung

    Atmung: Ein ATP-erzeugender Proze, bei dem im Rahmen einer Elektronentransportkette eine anorganische Verbindung (etwa O2) als letzter Elektronenakzeptor fungiert. Der Donator kann sowohl eine organische als auch eine anorganische Verbindung sein.

    Die freie Energie der Oxidation: Die treibende Kraft der oxidativen Phosphorylierung ist das Elektronenbertragungspotential des NADH oder des FADH2 gegenber O2.

    Die relevanten Teilreaktionen lauten: O2 + 2 H+ + 2 e- H2O E'0 = +0,82 V NAD+ + H+ + 2 e- NADH E'0 = -0.32 V O2 + H+ + NADH H2O + NAD+ E'0 = +1,14 V

    G'0 = -53 kcal/mol

    7.7.1. Elektronen-Carrier der Atmungskette

    Die Pfeile bedeuten Elektronenbertragung:

    Komplex I: Komplex III: NADH-Q-Reduktase Cytochrom-c-Reduktase (NADH-Dehydrogenase, Flavoprotein N) (Cytochrom c1b) Blockierung durch Rotenon o. Amytal Blockierung durch

    Antimycin A

    Komplex II: Komplex IV: Succinat-Q-Reductase Cytochrom-c-Oxidase (Flavoprotein S) (Cytochrom a + a3)

    Blockierung durch Cyanid Die Elektronen werden von der NADH-Q-Reduktase auf Cytochrom-c-Reduktase durch Ubichinon (Coenzym Q) bertragen. Dieses Chinon bertrgt auch Elektronen vom FADH2. Von der Reduktase werden die Elektronen dann ber das Protein Cytochrom c zur Cytochrom-c-Oxidase bertragen.

    Lokalisation in der Membran:

    Die Komplexe der Atmungskette als Protonenpumpen: Die Koplexe I, III und IV bertragen Elektronen innerhalb der Membran und pumpen in gekoppelten Prozessen Protonen durch die Membran von innen nach auen.

  • Kohlenstoff-Stoffwechsel Oxidative Phosphorylierung und Atmung 61

    7.7.2. Glycerinphosphat-Shuttle

    Die innere Mitochondrienmembran ist fr NADH und NAD+ vollstndig undurchlssig. Das bei der G