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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
Aislamiento y caracterización de Yersinia enterocolitica patogénica de cerdos en la
empresa Pública Metropolitana de Rastro Quito
Trabajo de Investigación previo a la obtención del Título de Médico Veterinario y
Zootecnista
AUTORA: Ortiz Tapia Débora Samantha
TUTOR: Burgos Vinueza Christian Vinicio
Quito, 2019
ii
Yo, Débora Samantha Ortiz Tapia en calidad de autora y titular de los derechos
morales y patrimoniales del trabajo de titulación “Aislamiento y caracterización de
Yersinia enterocolitica patogénica de cerdos en la Empresa Pública Metropolitana
de Rastro Quito”, modalidad presencial, de conformidad con el Art.114 del Código
Orgánico de la Economía Social de los Conocimientos, Creatividad e Innovación,
concedo a favor de la Universidad Central del Ecuador una licencia, gratuita,
intransferible y no exclusiva para el uso no comercial de la obra, con fines
estrictamente académicos. Conservo a mi favor todos los derechos de autor sobre
la obra, establecidos en la normativa citada.
Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la
digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de
conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
El Autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su
forma de expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la
responsabilidad por cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa
y liberando a la Universidad de toda responsabilidad.
Firma:
Débora Samantha Ortiz Tapia
Cd. N° 1716567902
DERECHOS DE AUTOR
iii
APROBACIÓN DEL TUTOR
En mi calidad de tutor del trabajo de Titulación, presentado por DÉBORA
SAMANTHA ORTIZ TAPIA, para optar por el grado de Médico Veterinario y
Zootecnista; cuyo título es: AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE YERSINIA
ENTEROCOLITICA PATOGÉNICA DE CERDOS EN LA EMPRESA PÚBLICA
METROPOLITANA DE RASTRO QUITO, considero que dicho trabajo reúne los
requisitos y méritos necesarios en el campo metodológico y epistemológico, para
ser sometido a la evaluación por parte del tribunal examinador para continuar con
el proceso de titulación determinado por la Universidad Central del Ecuador.
En la ciudad de Quito, a los 5 días del mes de Agosto de 2019
Dr. Christian Vinicio Vinueza Burgos
Docente – Tutor
C.C. 1713266227
iv
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE YERSINIA ENTEROCOLITICA
PATOGÉNICA DE CERDOS EN LA EMPRESA PÚBLICA METROPOLITANA DE
RASTRO QUITO
El tribunal constituido por:
Presidente / Lector 1: Dra. María Belén Cevallos
Lector 2: Dr. Alfonso Molina
Luego de calificar el Informe Final de Investigación del trabajo de titulación
denominado “AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE Yersinia enterocolitica
PATOGÉNICA DE CERDOS EN LA EMPRESA PÚBLICA METROPOLITANA DE
RASTRO QUITO” previo a la obtención del título (o grado académico de Médico
Veterinario Zootecnista presentada por la señorita Débora Samantha Ortiz Tapia.
Emite el siguiente veredicto (aprobado/reprobado) / ordena que se haga las
siguientes correcciones:
Fecha:
Docente Calificación Firma
Presidente / Lector 1:
Dra. María Belén Cevallos
Lector 2:
Dr. Alfonso Molina
v
Dedicatoria
A Jesús gracias por ponerme en el lugar y tiempo adecuado, por la familia que me
has dado. Esto es para ti mami y papi ustedes han sido el pilar base para luchar sin
rendirme, instruyéndome en amor, paciencia y perseverancia.
Hermana me has servido de ejemplo de fortaleza en una mujer, por ser luz en mis
dudas, por tus consejos estamos hoy aquí.
Hermano por mostrarme lo importante de no dejarse consumir de las presiones y
estrés que puede tener la vida, ser positiva y relajada, por tus chistes y porque no
tus tonterías.
A mi novio por amarme como soy, motivarme tanto personal como espiritualmente,
ayudarme ampliar el panorama, gracias por apoyarme en mis fracasos,
frustraciones, mis logros y alegrías. Por darme de tu tiempo, a veces tu hombro y
siempre tu mano para levantarnos juntos.
A cada una de las personas que aportaron, sumaron en mi vida con palabras de
ánimo, sonrisas, con bajones y a veces llantos esto es para ustedes.
vi
INDICE GENERAL
CAPITULO I ............................................................................................................ 1
INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 1
CAPITULO II ........................................................................................................... 2
Objetivo General .................................................................................................. 2
Objetivos Específicos ........................................................................................... 2
CAPITULO III .......................................................................................................... 3
3. Marco Teórico ................................................................................................... 3
3.1 Historia ........................................................................................................ 3
3.2 Generalidades ............................................................................................ 4
3.3 Virulencia y vías de Transmisión ................................................................ 6
3.4 Yersinia enterocolitica en Animales de producción ..................................... 7
3.5 Yersinia en humanos .................................................................................. 8
3.6 Epidemiología ............................................................................................. 9
3.7 Métodos de aislamiento bacteriológico ..................................................... 10
3.8 Métodos de identificación molecular ......................................................... 11
CAPITULO IV ........................................................................................................ 12
4. Materiales Y Métodos ........................................................................................ 12
4.1 Diseño de investigación y Muestreo ......................................................... 12
4.2 Área de Muestreo ..................................................................................... 12
4.3 Características de la unidad observacional .............................................. 12
4.4. Tamaño de la Muestra ............................................................................. 12
4.5 Factores de Estudio .................................................................................. 12
4.6 Toma de Muestras .................................................................................... 12
4.6.1 Hisopado de Tonsilas ............................................................................ 12
4.6.2 Contenido Cecal .................................................................................... 13
4.7 Procesamiento de las Muestras en Laboratorio ........................................ 13
4.8 Determinación de Genes de Virulencia ..................................................... 15
vii
4.8.1 Preparación de la Master Mix ................................................................ 15
4.9 Identificación de serotipos O:3 y O:9 de Y. enterocolitica ......................... 16
4.9.1 Preparación de la Master mix ................................................................ 16
4.9.3 PCR ....................................................................................................... 17
4.10. Electroforesis ......................................................................................... 17
CAPITULO V ......................................................................................................... 18
5. Resultados Y Discusión ............................................................................... 18
5.1 Identificación y Fenotipificación de Yersinia spp. ...................................... 18
5.2 Resultados de genes de virulencia ........................................................... 19
5.3 Serotipificación mediante PCR ................................................................. 20
5.3 Discusión .................................................................................................. 21
CAPITULO VI ........................................................................................................ 25
6. Conclusiones .................................................................................................. 25
5. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................. 26
ANEXOS ............................................................................................................ 33
Anexo 1. .......................................................................................................... 33
2.1 Materiales de Laboratorio para toma de muestras ................................ 33
Anexo 2 ........................................................................................................... 34
2.8 Materiales para determinación de Genes de Virulencia ........................ 34
Anexo 3 ........................................................................................................... 35
2.9 Materiales para identificación de serotipos O:3 y O:9 ............................ 35
Anexo 4. .......................................................................................................... 36
Reactivos y cantidades necesarias para una reacción de PCR para
determinar genes de virulencia .................................................................... 36
Anexo 5. .......................................................................................................... 37
Reactivos y cantidades necesarias para una reacción de PCR para
determinar serotipos de Y. enterocolitica..................................................... 37
Anexo 6 ........................................................................................................... 38
Flujograma de Hisopado de Amígdalas ....................................................... 38
Anexo 7 ........................................................................................................... 39
viii
Flujograma de Contenido Cecal .................................................................. 39
Anexo 8 ........................................................................................................... 40
Índice de Tablas
Tabla 1. Clasificación de Cepas patógenas y no patógenas del Género Yersinia
spp .......................................................................................................................... 4
Tabla 2 Relación entre biotipos, serotipos, patogenicidad y virulencia de Y.
enterocolitica ........................................................................................................... 5
Tabla 3. Biotipos de Yersinia enterocolitica ........................................................... 14
Tabla 4 Primers para PCR de identificación de genes de virulencia de Yersinia
enterocolitica ......................................................................................................... 15
Tabla 5 Programa del Termociclador para los genes ail,virF y Yst ........................ 16
Tabla 6 Primers para la diferenciación de serotipos O:3 y O:9 de Y. enterocolitica
mediante PCR. ...................................................................................................... 16
Tabla 7 Programa del Termociclador para los genes rfbC y per. .......................... 17
Tabla 8 Resultados de la biotipificación de los aislados de Yersinia spp. originados
en cerdos positivos. ............................................................................................... 18
Índice de Figuras
Figura 1 Identificación genes de Virulencia mediante PCR. .................................. 19
Figura 2 Identificación de los serotipos O:3 y O:9 por PCR. ................................. 20
ix
TITULO: Aislamiento y caracterización de Yersinia enterocolitica patogénica
de cerdos en la empresa pública metropolitana de rastro Quito.
Autora: Débora Samantha Ortiz Tapia
Tutor: Dr. Christian Vinicio Vinueza Burgos
Resumen
El objetivo de este estudio fue, determinar la presencia de Yersinia enterocolitica
en hisopado de amígdalas y contenido cecal de cerdos que ingresan a la Empresa
Pública Metropolitana de Rastro Quito. Analizando mediante PCR la existencia de
genes de virulencia ail, virF, y yst, en cepas positivas a Yersinia enterocolitica.
Analizando 116 cerdos tomando 2 muestras por animal. Obteniendo 7 cerdos
positivos a Yersinia spp, de los que 4 fueron identificados como Y. enterocolitica.
Estas muestras positivas se analizaron mediante PCR, los resultados demostraron
ser negativos a todos genes de virulencia.
PALABRAS CLAVE: Y. ENTEROCOLITICA, GENES DE VIRULENCIA,
HISOPADO DE AMÍGDALAS, CONTENIDO CECAL, PATOGÉNICA.
x
TITTLE: Isolation and characterization of pathogenic Yersinia enterocolitica of
pigs in the Empresa Metropolitana De Rastro Quito.
Author: Débora Samantha Ortiz Tapia
Tutor: Dr. Christian Vinicio Vinueza Burgos
ABSTRACT
The objetive of this estudy was to determine the presence of Yersinia
enterocolitic in tonsil swabs and secum content of pigs that enter to the Empresa
Metropolitana De Rastro Quito. Analizyng through PCR the existence of
virulence genes ail, virF, and virF, and yst, in positive strains of Yersinia
enterocolitic. Materials and metodology : An analysis of 116 pigs was carried out
taking 2 samples per animal. Seven pigs were found to be positive for Yersinia
spp, of wich 4 were identified as Y. enterocolitica. These positive samples were
analyzed by PCR, the results proved to be negative to virulence genes.
KEYWORDS: Y. ENTEROCOLITICA, VIRULENCE GENES, TONSIL SWABS,
CECAL CONTENT, PATHOGENIC.
1
CAPITULO I
INTRODUCCIÓN
Las enfermedades transmitidas por los alimentos (ETAs) son causadas por diversos
organismos patógenos que pueden ser ingeridos a través de agua o alimentos
contaminados (Olea et al., 2012). Según la OMS, (2017) 1 de cada 10 personas
enferma por ETAs.
El género Yersinia está ampliamente distribuido en el medio ambiente y los
animales, el reservorio principal de cepas patógenas de Yersinia enterocolitica es el
cerdo (Bottone, 1997). La ingesta de carne contaminada, con insuficiente cocción o
verduras lavadas con agua contaminada por heces de cerdos infectados, producen
cuadros diarreicos en los humanos (Rusak et al., 2014).
En 2017 la Unión Europea reportó 1,77 casos de Yersiniosis en humanos por cada
100,000 habitantes (EFSA, 2018). En el Ecuador se reportan brotes de ETAs
causadas por varios agentes. En 2019, el Ministerio de Salud Pública reportó un
33.91% semanal de transgresiones alimentarias causada por agentes que no fueron
identificados como Salmonella spp., E. coli o Shigella spp. (MSP, 2019).
Debido al riesgo que ésta bacteria puede presentar y la poca información que se
tiene de la misma, se considera a la presencia de Yersinia spp en cerdos de
consumo en el Ecuador como una enfermedad transmitida por los alimentos de
importancia en la Salud Pública.
2
CAPITULO II
Objetivo General
Determinar la presencia de Yersinia enterocolitica a través de pruebas
microbiológicas en cerdos en la Empresa Pública Metropolitana de Rastro
Quito.
Objetivos Específicos
Evaluar la presencia de Yersinia enterocolitica en hisopado de amígdalas y
contenido cecal de cerdos que ingresan a la Empresa Pública Metropolitana
de Rastro Quito.
Determinar mediante PCR la existencia de genes de virulencia ail, virF, yst,
en cepas positivas a Yersinia enterocolitica y conocer su patogenicidad por
la presencia de dos de tres genes en cada una de las muestras.
3
CAPITULO III
3. Marco Teórico
3.1 Historia
En sus inicios el Género Yersinia fue descrito como, una bacteria Gram negativa,
cocobacilar, e integrada como parte de la familia Pasteurellaceae (Bottone, E.,
1977). Yersinia pseudotuberculosis y Yersinia pestis fueron las primeras especies
de importancia veterinaria declarada, al causar enfermedades epizoóticas
especialmente en roedores. En 1953 varios brotes asociados a Y.
pseudotuberculosis fueron reportados en Estados Unidos (Bottone, E., 1977).
Además, patógenos denominados por entonces como “aislados tipo Yersinia”
fueron encontrados en personas, confirmando su importancia en medicina humana
(Bottone, E., 1977)
Van Loghem propone la creación del Género Yersinia en 1894, esto en honor a E.
Yersin quien fue el primero en aislar Bacillus pestis (ahora denominada Yersinia
Pestis). En 1954 utilizando análisis computarizado se determinó relaciones
cercanas, lo que le permitió integrarse a la familia de las Enterobacteriaceae
(Bottone, E., 1977).
Se propone el nombre de Yersinia X para unir Y. pseudotuberculosis y Y. pestis, sin
embargo, existían otro tipo de aislados no identificados de origen entérico, que
tuvieron similitud entre cepas europeas, americanas de origen animal y humano.
Frederiksen en 1964 propone el nombre de Yersinia enterocolitica para todos los
aislados, sin embargo existía diferencias en la prueba bioquímica del indol, que no
quedaba clara para el nuevo género (Bottone, E., 1997).
En 1984 se incluía el género Yersinia con una especie más, Y. enterocolitica. en la
8ª edición del Manual Bergey (Reinés, 2012).
4
3.2 Generalidades
Actualmente el Género Yersinia posee 18 especies, pertenecientes a la familia
Enterobacteriaceae de la clase Gammaproteobacteria del Filum Proteobacteria
(Van Damme, 2013), 3 de ellas son caracterizadas como patógenas para el ser
humano (Tabla 1) (Fredriksson-Ahomaa et al., 2018).
El género Yersinia spp. según el CDC (Centers for Disease Control and Prevention)
es responsable de gran parte de los trastornos intestinales en humanos (CDC,
2016). Además es una importante infección alimentaria según la Unión Europea en
2015 (EFSA, 2007; Morka et al., 2018).
Las bacterias del género Yersinia son Gram negativas, de forma cocobacilar, no
formadora de esporas, anaerobias facultativas, oxidasa negativa y catalasa
positivas (Chlebicz & Slizewska, 2018; Van Damme, 2013). Son psicrófilas pudiendo
crecer entre 0°C a 45 °C, con una temperatura óptima de 22°C a 30°C donde son
móviles (Van Damme, 2013).
Tabla 1. Clasificación de Cepas patógenas y no patógenas del género Yersinia spp.
Cepas no patógenas o Ambientales Cepas Patógenas
Y. aldovae, Y. aleksiciae, Y. pestis,
Y. kristensenii, Y. bercovieri, Y. pseudotuberculosis
Y. massiliensis, Y. frederiksenii, Y. enterocolitica
Y. mollaretii, Y. intermedia,
Y. nurmii, Y. similis,
Y. pekkanenii,
Y. ruckeri a
Y. entomophaga b
Y. wautersii,
Y. rohdei,
a Patógeno para peces. b patógeno específico de los insectos. (Fredriksson-
Ahomaa et al., 2018; Van Damme, 2013).
Estudios genéticos han determinado todo el genoma de este patógeno (Hall et al.,
2015), información que ha permitido subdividir a Y. enterocolitica, en Y.
5
enterocolitica subespecie enterocolitica que comprende cepas altamente patógenas
del biotipo 1B y Y. enterocolitica subespecie paleartica que comprende cepas poco
patógenas o apatógenas, dando lugar a 6 grupos filogenéticos (Fredriksson-
Ahomaa et al., 2018; Hall et al., 2015).
Se han identificado 6 biotipos y alrededor de 30 serotipos. Los biotipos se identifican
mediante sus propiedades bioquímicas, con al menos cinco pruebas que diferencian
cada uno. Las cepas pertenecientes al biotipo 1A no son patógenas, los biotipos 1B,
2, 3, 4 y 5 se consideran patógenos para los humanos (Joutsen & Fredriksson-
Ahomaa, 2016; Mastrodonato et al., 2018; Wannet et al., 2001; Zadernowska et al.,
2013).
La serotipificación de Y. enterocolitica se realiza con el antígeno de superficie (O)
clasificándose en más de 30 serotipos (Joutsen & Fredriksson-Ahomaa, 2016).
Según Van Damme, (2013) los biotipos a su vez se pueden subdividir en 3 patotipos
basados en su potencial patógeno (Tabla 2).
Tabla 2 Relación entre biotipos, serotipos, patogenicidad y virulencia de Y. enterocolitica
Biotipo Serotipo(s) Patogenicidad apYV bHPI
1A O:4; O:5; O:6,30; O:6,31; O:7,13;
O:10; O:14; O:16; O:21; O:22; O:25;
O:37; O:41,42; O:46; O:47; O:57
Ninguna a baja - -
1B O:9; O:4; O:3; O:32; O:8;
O:13a,13b; O:16; O:18; O:20; O:21;
O:25; O:41,42
Elevada + +
2 O:5,27; O:9 ; O:27 Baja a
moderada
+ -
3 O:1,2,3; O:3; O:5,27 Baja a
moderada
+ -
4 O:3 Baja a
moderada
+ -
6
5 O:2,3 Baja a
moderada
+ -
a pYV: Plásmido de Virulencia para Yersinia, b HPI: Isla de alta patogenicidad.
(Adaptada de Van Dame 2013 y 2010)
La actividad de la ureasa diferencia a Yersinia spp de otras especies, determinando
el nivel patógeno de Y. enterocolitica. Las cepas patogénicas de esta bacteria son
urea positiva (Hilbert et al., 2003; Joutsen & Fredriksson-Ahomaa, 2016).
Este patógeno posee una resistencia natural a las penicilinas por su actividad de la
B-lactamasa (Fredriksson-Ahomaa, 2017). Es ampliamente tolerante a tratamientos
alcalinos, en especial con hidróxido de potasio el cual es usado para reducir
bacterias contaminantes en los aislamientos de Y. enterocolitica (Iso, 2017).
3.3 Virulencia y vías de Transmisión
El cerdo es considerado como el principal reservorio de cepas patógenas de Y.
enterocolitica (Zadernowska et al., 2013). Se estima que el consumo de esta carne
es responsable hasta del 71.6 % de infecciones de Y. enterocolitica en Europa (Van
Damme, 2013). El contacto directo con estos animales también se ha vinculado a
infecciones por esta bacteria, además se reporta un aumento de anticuerpos contra
la misma en trabajadores relacionados con la manipulación de cerdos como
criadores y empleados en matadero (Van Damme, 2013).
La vía de transmisión de este patógeno es principalmente fecal oral (Fredriksson-
Ahomaa, 2017). Afecta al ser humano cuando este ingiere agua o alimentos
contaminados (Petsios et al., 2016; Van Damme, 2013; Zadernowska et al., 2013).
Las cepas patógenas ingresan al estómago, pasan al intestino, atraviesan a la
mucosa intestinal e infectan los tejidos adyacentes, son altamente invasivas y
resistentes contra la respuesta inmune del hospedador (Fredriksson-Ahomaa et al.,
2006; Petsios et al., 2016).
La patogenicidad de Y. enterocolitica es multifactorial y porta varios genes de
virulencia que pueden estar codificados en el plásmido de virulencia o en el
cromosoma bacteriano (Dube, 2009; Fredriksson-Ahomaa et al., 2006). Los genes
7
codificados en el plásmido son virF y YadA, estos se encuentran en el pYV
(plásmido de Virulencia de Yersinia). Los genes de virulencia cromosómica más
importantes son yst, inv, ail (Fredriksson-ahomaa et al., 2006; Mazzette et al., 2015;
Zadernowska et al., 2013).
El pYV con aproximadamente 70kb, permite la replicación dentro de los tejidos
linfoides de los huéspedes (Petsios et al., 2016). También codifica a una proteína
de membrana externa el YadA, que impulsa la unión de las células, a los
componentes de la matriz extracelular como el colágeno (Van Damme, 2013;
Zadernowska et al., 2013).
El gen yst codifica una enterotoxina estable al calor, factor que es asociado a
cuadros de diarrea durante la infección (Harnett et al., 1996; Mazzette et al., 2015).
El gen inv codifica a proteínas de membrana, que se une a receptores de las células
epiteliales en las células M del intestino, permitiendo la absorción de las bacterias
en la etapa primaria de la infección (Petsios et al., 2016; Van Damme, 2013). El gen
ail codifica a proteínas que se relaciona con la unión e invasión en la célula huésped,
permite la propagación bacteriana a la linfa mesentérica y es característica de cepas
patógenas, también defiende a las bacterias del sistema inmunitario del hospedador
(Petsios et al., 2016; Zadernowska, A., et al. 2013).
Las cepas 1B de Y. enterocolitica son altamente patógenas, ya que expresan una
isla de alta patogenicidad (HPI) en el cromosoma. Este grupo de genes está
encargado de la absorción de hierro y de la propagación sistémica de éstas
bacterias en el hospedador (Joutsen et al., 2016; Van Damme, 2013)
3.4 Yersinia enterocolitica en Animales de producción
Este patógeno ha sido detectado en una amplia variedad de animales, incluyendo
perros, ovejas, vacas, cabras, pollos y jabalíes. El cerdo es el único animal en el
que se puede encontrar biotipos patógenos de Y. enterocolitica por lo que se
considera como reservorio primario de esta (Fredriksson-Ahomaa, 2017; Van
Damme et al., 2013). La yersiniosis tiene una mayor presentación en animales
8
jóvenes o que han sido sometidos a situaciones de estrés (Fredriksson-Ahomaa,
2017).
Algunos estudios señalan que animales que han adquirido Y. enterocolitica son
asintomáticos (Bottone, E., 2015; Fredriksson-Ahomaa, 2017). Esta bacteria ha sido
aislada en tonsilas, así como en el intestino y heces de cerdos saludables. Estudios
en cerdos de matadero demostraron una relación de 6 veces a 1 de los aislamientos
obtenidos de tonsilas frente a los aislados de heces y contenido intestinal de Y.
enterocolitica patógena (Nesbakken et al., 2006). Estos hechos resaltan la
importancia para la recuperación de este patógeno tomando las muestras en
tonsilas de cerdos (Nesbakken et al., 2006).
Los cerdos de engorde a la edad de sacrificio que son portadores de Y.
enterocolitica en sus amígdalas, pueden representar un factor de riesgo para
contaminar la canal durante el sacrificio y la evisceración (Fredriksson-Ahomaa et
al., 2001; Virtanen et al., 2011).
3.5 Yersinia en humanos
La Yersiniosis causada por Y. enterocolitica se presenta en humanos con síndromes
gastrointestinales, como enteritis aguda, ileítis terminal, linfadenitis mesentérica
(Falcão & Falcão, 2006; Rusak et al., 2014), puede producir infecciones en sitios
extra intestinales, abscesos en hígado o el riñón, faringitis, neumonía, encefalitis,
entre otras (Van Damme, 2013).
La presentación clínica de la enfermedad está dada por el hospedador, la edad,
enfermedades presentes o características propias de la cepa, su serotipo o biotipo
(Van Damme, 2013). Niños menores a 5 años presentan diarrea aguda, mientras
que niños mayores y adolescentes presentan linfadenitis mesentérica simulando
síntomas de una falsa apendicitis. En adultos se produce una leve diarrea, sin
embargo, presentan secuelas post infección como eritema nodoso y artritis reactiva.
Estas secuelas pueden ser más agresivas si los pacientes poseen enfermedades
inmunosupresoras o están cursando con enfermedades secundarias (Fredriksson-
Ahomaa, 2017; Petsios et al., 2016).
9
3.6 Epidemiología
Países desarrollados monitorean cuidadosamente las infecciones por Y.
enterocolitica mientras que, países en vías de desarrollo no disponen de técnicas
diagnósticas ideales (Chlebicz & Slizewska, 2018; Falcão & Falcão, 2006).
El Centro de Control y Prevención de Enfermedades (CDC), reportó que en los
Estados Unidos en 2016, la Yersiniosis afectó a 117.000 habitantes (Chlebicz &
Slizewska, 2018). Se estima que las infecciones por este patógeno producen un
34.4% de hospitalizaciones con un 2% de mortalidad (Scallan et al,. 2011). Estudios
realizados entre 2006 y 2008 a 31 patógenos demostraron que 950 casos fueron
positivos a Y. enterocolitica comprobadas en laboratorio, de estas un 90% fueron
adquiridas por una ETA, también se determinó que 122.8 casos no obtuvieron un
diagnóstico definitivo. Se considera que por cada caso confirmado de infección por
Y. enterocolitica existen 123 casos de Yersiniosis que no se confirman (Scallan et
al., 2011).
Según la EFSA (2018) la Unión Europea en 2017 reportó para humanos 6.823 casos
de Yersiniosis, lo que significa 1.77 casos por cada 100.000 habitantes. En 529
muestras de cerdos se encontró 4.4% casos positivos. La EFSA reporta también
una disminución de casos de Yersiniosis en humanos comparada con el 2016, de
2.8%, sin embargo esta enfermedad sigue siendo de constante reporte de la Unión
Europea en casos humanos (EFSA, 2018).
En América Latina existen pocos estudios de la presencia de este patógeno. Así, en
Argentina se obtuvieron aislados de Y. enterocolitica que no provinieron de brotes
por ETAs, sino de aislados obtenidos en alimentos (Mastrodonato et al., 2018). Chile
realizó un estudio por tres años de Y. enterocolitica en niños, demostrando una
incidencia de 1.4% y aislamientos en alimentos del 2% (Mastrodonato et al., 2018;
Prado et al., 1992).
Brasil no reporta frecuentemente casos de aislamientos de este patógeno por la
baja ocurrencia y la ausencia de técnicas ideales para el aislamiento (Falcão &
Falcão, 2006).
10
Ecuador no posee estudios específicos de Y. enterocolitica, los datos que se pueden
obtener son a través de la gaceta Nacional Epidemiológica y el Ministerio de Salud
Pública reportado como brotes ETA, en el 2019 se presentaron en un 33.91% en
3.235 casos (MSP, 2019).
3.7 Métodos de aislamiento bacteriológico
Existe diversas formas de aislar cepas patógenas de Y. enterocolitica. Los medios
de enriquecimiento líquidos se recomiendan para incrementar el número de células
de este patógeno antes de ser inoculados en medios sólidos siguiendo los
protocolos de aislamiento de esta bacteria (Iso, 2017; Petsios et al., 2016).
Por la naturaleza psicrófila de las cepas de esta bacteria, se utiliza bajas
temperaturas para alcanzar una mayor densidad de población (Petsios et al., 2016;
Zadernowska et al., 2013).
Después de un enriquecimiento con Tripticasa Agar caldo (TSB) se recomienda el
tratamiento alcalino, para reducir el nivel de contaminantes que se pueden
desarrollar durante el mismo (Iso, 2017; Petsios et al., 2016). El medio de mayor
uso es Cefsulodin–irgasan–novobiocin (CIN) para el aislamiento de Y.
enterocolitica. Este medio contiene antimicrobianos selectivos como cefsulodina,
irgasan y novobiocina, que inhibe el crecimiento de algunos miembros bacterianos
de la familia Enterobacteriaceae (Petsios et al., 2016; Van Damme, 2013;
Zadernowska et al., 2013).
Dentro de las ventajas que proporcionada el agar CIN tenemos: mayor recuperación
de cepas clínicas, mejor visualización de la morfología de las colonias, en relación
a otros medios de cultivo como Salmonella-Shigella Modificado (SSDC) y
MacConkey (MAC), propiedades que le permiten diferenciar Y. enterocolitica de
otras bacterias Gram negativas (Fredriksson-Ahomaa, 2017; Petsios et al., 2016).
Esta bacteria forma colonias características menores a 2mm, con centro rojo
profundo por la fermentación del manitol, con un borde translucido denominado
como “ojo de buey” (Iso, 2017; Zadernowska et al., 2013). La apariencia de la
colonia varía con el serotipo, puede ser irregular o con un centro rojo elevado como
11
“huevo frito” cuando son observadas a través de un estereosmicroscopio. Se
recomienda una incubación a 30°C para evitar la pérdida de plásmidos de virulencia
(Van Damme, 2013; Zadernowska et al., 2013)
Aunque el medio CIN se recomienda para el aislamiento de Y. enterocolitica posee
ciertas restricciones como permitir el crecimiento de ciertas especies de
enterobacterias que producen colonias similares en apariencia a Y. enterocolitica.
También inhibe el crecimiento de algunas cepas serotipo O:3, no posee una
diferenciación entre cepas patógenas, apatógenas u otro tipo de Yersinia spp
(Petsios et al., 2016).
3.8 Métodos de identificación molecular
Los métodos de detección molecular se basan en secuenciación genómica y
detección de genes de virulencia. Para la identificación de Y. enterocolitica se utiliza
métodos como: PCR (simple, multiplex y en tiempo real), enzimas de digestión
enzimática y electroforesis de campo pulsado (PFGE) (Fredriksson-Ahomaa M., et
al 2001; Petsios et al., 2016). En aislados de muestras de alimentos que no son
completamente puras se usa Hibridación de Colonias, Microarrays y métodos de
amplificación isotérmica (Petsios et al., 2016). Estudios basados en ADN pueden
detectar el patógeno con mayor sensibilidad y rapidez que usando métodos de
cultivo (Petsios et al., 2016).
12
CAPITULO IV
4. Materiales Y Métodos
4.1 Diseño de investigación y Muestreo
Tipo de investigación Observacional – Transversal
4.2 Área de Muestreo
El presente proyecto se realizó en cerdos faenados en la Empresa Pública
Metropolitana de Rastro Quito.
4.3 Características de la unidad observacional
La unidad epidemiológica se considera a un animal por productor con dos muestras
por cerdo (hisopado de amígdalas y contenido cecal), sean machos o hembras que
lleguen a la Empresa Metropolitana de Rastro Quito.
4.4. Tamaño de la Muestra
Por conveniencia del investigador basado en el tiempo que se tiene para concluir
los estudios de pregrado en este estudio se obtuvieron 116 muestras de cerdos en
5 meses.
4.5 Factores de Estudio
Variable Independiente: Número de cerdos muestreados durante el estudio.
Variable Dependiente: Número de cerdos positivos al aislamiento de Y.
enterocolitica.
4.6 Toma de Muestras
Dos tipos de muestras:
4.6.1 Hisopado de Tonsilas
Se tomó una torunda de algodón estéril realizando un barrido en las amígdalas
de cerdo, con precaución de no contaminar la muestra con otras áreas de la
13
boca. La torunda fue colocada en un frasco estéril, previamente rotulado y
almacenado para su transportación en refrigeración.
En el frasco con la torunda se colocó 5 ml de agua estéril, más 15 ml de PBS
para su enriquecimiento.
4.6.2 Contenido Cecal
Con una torunda de algodón con alcohol al 96% se limpió el ciego, para luego
con un bisturí estéril cortar 3 cm aproximadamente.
Fueron tomados 50 gr de contenido cecal en un frasco estéril previamente
etiquetado, rotulado y almacenado para su transportación en refrigeración.
En una funda estéril rotulada se pesó 5 gr de contenido cecal, más 15 ml de
PBS para su enriquecimiento.
Los materiales y elaboración de medios se pueden ver en el anexo 1.
4.7 Procesamiento de las Muestras en Laboratorio
El flujograma del procesamiento de las muestras se puede ver en el Anexos 6 y 7.
De manera resumida los pasos para el aislamiento de Y. enterocolitica fueron:
Se incubó las muestras a 30° C por 48 horas.
Post enriquecimiento, fue preparada solución salina al 9% más 0,5g KOH y se
dispensó en tubos estériles 4,5ml por tubo.
Se tomó 0.5 ml de cada muestra enriquecida en PSB y se añadió al tubo con
4,5ml de solución KOH al 5%.
Se homogenizó la muestra a través de Vortex por 20 segundos,
inmediatamente se tomó del tubo 1ul de muestra, se estrió por agotamiento en
Agar CIN. Las muestras fueron incubadas por 24 horas a 30°C.
Se comprobó la morfología macroscópica de las colonias mediante el
estereomicroscopio. Para esto se utilizó un espejo, con un haz de luz
proyectado a 45 grados desde la parte trasera de la caja Petri.
Las colonias típicas de Y. enterocolitica presentaron el centro rojo y borde
transparente (ojo de buey) con diámetro no mayor a 2 mm como positivos.
14
Colonias características en CIN se sometieron a cinco pruebas bioquímicas
divididas en dos fases. La primera fase las muestras se sembraron en agar
Kliger, caldo urea a 30°C por 24h siendo positivas cuando se obtiene un
resultado negativo a fermentación de lactosa, positivo a fermentación de
glucosa, (K/A) y urea positiva. En la segunda fase de identificación, las
muestras fueron biotipificadas mediante las pruebas bioquímicas de esculina,
xilosa e indol. La interpretación de estos resultados se realizó con los criterios
que se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3. Biotipos de Yersinia enterocolitica
Reacción Biotipos Descripción
1ª* 1b 2 3 4 5
Esculina + - - - - - Esculina positiva: Colonias café
oscuro.
Esculina negativo: colonias
transparentes o blancas.
Xilosa + + + + - **Dd Xilosa Positiva: forma un color
amarillo.
Xilosa Negativo: forma un color
rosado
Indol + + + - - - Indol positivo: formación de un halo
rosado.
Indol negativo: formación de un halo
café.
*Cepas de biotipos no patógenos. **Dd: reacción débil o retrasada.
Fuente: Tabla modificada de normal ISO 10273:2017.
Lisado celular
● Con el aza de 1μl se tomó una colonia típica del cultivo bacteriano, llenando el
orificio del aza.
● En un microtubo con 300μl de buffer TE 1X se suspendió y homogenizó el
material tomado.
● Se colocó el microtubo por 20 minutos en el termobloque a temperatura de 95C°.
15
● Se recuperó el sobrenadante en otro microtubo cuidando de no topar el pellet
que se formó en el fondo del envase con la punta de la micropipeta.
● Luego se almacenó a -20C°.
4.8 Determinación de Genes de Virulencia
4.8.1 Preparación de la Master Mix
Para una reacción de PCR la mezcla se preparó con:
● Agua ultrapura (Nuclease-Free Water ® de Promega)
● Primers forward y reverse para cada uno de los 3 genes (Tabla 4).
● Kit Go Taq(R) Flexi DNA Polymerase de Promega, que incluye: GoTaq® Flexi
Buffer 5X, MgCl2 Solution 25Mm PCR, GoTaq® DNA Polymerase (5U/μl)
● dNTP (Nucleotide Mix® 10mM de Promega).
● Lisados de las enterobacterias en estudio.
● Como control de calidad se utilizó un control positivo, que corresponde al ADN
para los genes ail, virF y yst. Como control negativo se usó agua ultrapura (Atlas,
1991).
Tabla 4 Primers para PCR de identificación de genes de virulencia de Yersinia enterocolitica
Primer Secuencia Oligonucleótidos 5´- 3´ Pares de Bases
Ail-a TGGTTATGCGCAAAGCCATGT 356 Ail-b TGGAAGTGGGTTGAATTGCA
VirF-a GCTTTTGCTTGCCTTTAGCTCG 231 VirF-b AGAATACGTCGCTCGCTTATCC
Yst-a GTCTTCATTTGGAGGATTCGGC 134 Yst-b AATCACTACTGACTTCGGCTGG
Fuente: (Harnett et al., 1996) Elaborado por: La autora
Se realizó la master mix en un microtubo de 2ml y se repartió esta mezcla en
microtubos de 200μl o tubos para PCR. Las cantidades necesarias de reactivos para
una reacción se describen en el Anexo 4.
16
Tabla 5 Programa del Termociclador para los genes ail,virF y Yst.
Etapa Temperatura Cº
Tiempo Ciclos
Desnaturalización inicial del ADN 95 5:00 1
Desnaturalización del ADN 95 0:30 30
Hibridación de los primers 55 0:30
Extensión de la cadena 72 1:00
Elongación Final 72 7:00 1
Conservación de los amplicones 4 ∞ 1
Fuente: investigación directa Elaboración: La autora
4.9 Identificación de serotipos O:3 y O:9 de Y. enterocolitica
4.9.1 Preparación de la Master mix
Para una reacción de PCR la mezcla se preparó con:
Agua ultrapura (Nuclease-Free Water ® de Promega)
Primers forward y reverse para cada uno de los 2 genes (Tabla 6).
Kit Go Taq(R) Flexi DNA Polymerase de Promega, que incluye: GoTaq® Flexi
Buffer 5X, MgCl2 Solution 25Mm PCR, GoTaq® DNA Polymerase (5U/μl)
dNTP (Nucleotide Mix® 10mM de Promega).
Lisados de las Enterobacterias en estudio.
Como control de calidad se utilizó un control positivo, que corresponde al ADN
para los genes rfbC y per. Como control negativo se usó agua ultrapura (Atlas,
1991).
Tabla 6 Primers para la diferenciación de serotipos O:3 y O:9 de Y. enterocolitica mediante PCR.
Primer Secuencia Pares de Bases
rfbC CGC ATC TGG GAC ACT AAT TCG 405
per TGTGCTGAAGCTTTTGGATCT 181
Fuente: (Jacobsen et al., 2005) Elaborado por: la autora
Se realizó la master mix en un microtubo de 2ml y se repartió esta mezcla en
microtubos de 200μl o tubos para PCR. Las cantidades necesarias de reactivos para
una reacción se describen en el Anexo 5.
17
Tabla 7 Programa del Termociclador para los genes rfbC y per.
Etapa Temperatura Cº
Tiempo Ciclos
Desnaturalización inicial del ADN 95 5:00 1
Desnaturalización del ADN 95 0:30 30
Hibridación de los primers 55 0:30
Extensión de la cadena 72 1:00
Elongación Final 72 7:00 1
Conservación de los amplicones 4 ∞ 1
Fuente: investigación directa Elaboración: La autora
4.9.3 PCR
Se colocó los tubos para PCR en el termociclador con el programa correspondiente
al gen a identificarse. Los programas que se utilizaron para la identificación de estos
genes se indican en las tablas 5 y 7.
4.10. Electroforesis
Todos los productos de PCR se visualizaron realizando una electroforesis con las
siguientes condiciones:
Se preparó un gel de agarosa al 1,5 %, colocando 1.5 g de agarosa (Ultra Pure
Agarose Invitrogen (™) en 100ml de TAE 0,5X o TBE 1X (según el buffer que se
utilice en la cámara de electroforesis).
Se disolvió la mezcla calentándola en un microondas hasta llegar a ebullición.
Cuando esta llegó aproximadamente a los 50 C°, se agregó 0,8μl de Syber Safe
(SYBER®Safe, DNA gel Stain, Invitrogen™) por cada 10 ml de mezcla y fue
vertida en un molde anteriormente provisto con un peine que separa cada
reacción de PCR.
Se dejó solidificar por 15 minutos, retirando el peine y colocando el gel en la
cámara de electroforesis.
Se colocó 2,5μl de Ladder (Bench Top 100bp DNA Ladder de Promega) unido
con 2 μl de buffer de carga en el primer pocillo. En los siguientes pocillos, 5μl de
cada amplicón a ser identificado junto con los controles positivo y negativo.
Se programó la cámara de electroforesis a 100 voltios, 400 mA y 30 minutos.
Terminada la electroforesis, se colocó el gel en un transiluminador; sistema
digital de fotodocumentación de geles y se tomó una foto del resultado.
18
CAPITULO V
5. Resultados Y Discusión
5.1 Identificación y Fenotipificación de Yersinia spp.
En el estudio se analizaron muestras de 116 cerdos, de cada uno de ellos se tomó
muestras en tonsilas y en contenido cecal. Las muestras que obtuvieron resultados
positivos para la primera fase bioquímica Kliger y urea fueron 7, de las cuales 3
muestras se aislaron en ambos órganos. Tres muestras solo se aislaron en
contenido cecal y una muestra se aisló solamente en tonsilas.
Tabla 8 Resultados de la biotipificación de los aislados de Yersinia spp. originados en cerdos positivos.
#
Cerdo
Código Origen Esculina Indol Xilosa Resultado
1 U2068C Contenido cecal - - - Biotipo 4
2 U2080C Contenido cecal - - - Biotipo 4
U2080T Hisopado de tonsilas - - - Biotipo 4
3 U2086T(a) Hisopado de tonsilas - - - Biotipo 4
U2086T(b) Hisopado de tonsilas - + - Yersinia
spp.
4 U2089C Contenido cecal - + - Yersinia
spp.
5 U2127C Contenido cecal - - - Biotipo 4
U2127T Hisopado de tonsilas - + - Yersinia
spp.
6 U2132C Contenido cecal - + - Yersinia
spp.
7 U2133C Contenido cecal - + - Yersinia
spp.
U2133T Hisopado de tonsilas - + - Yersinia
spp.
19
De los 7 cerdos positivos 4 fueron identificados como Y. enterocolitica. Los aislados
de los otros 3 cerdos no pudieron ser identificados con las pruebas bioquímicas
utilizadas en este estudio (Tabla 3).
De los 4 cerdos positivos a Y. enterocolitica, se obtuvieron diferentes aislados. De
esta manera, dos cerdos fueron positivos en contenido cecal, 1 cerdo fue positivo
en tonsilas y 1 cerdo presentó aislamiento del mismo biotipo en ambos órganos.
La presencia encontrada en este estudio de Yersinia spp. fue de 6 % (n=116),
mientras que Y. enterocolitica se identificó en 3,44 % (n=116).
5.2 Resultados de genes de virulencia
Figura 1. Identificación genes de Virulencia mediante PCR. El primer carril
corresponde a un marcador de peso molecular (100pb a 1000pb), del segundo al
doceavo carril se encuentran las muestras clínicas. El control positivo está en el
carril trece con los genes ail (356pb), virF (231pb), yst (134pb) y en el carril catorce
el control negativo (agua ultrapura).
En el análisis de PCR realizado la muestra U2133c amplicó para el gen ail, pero
para ser considerada una cepa patógena, debe ser positiva a dos de los tres genes
20
analizados (Van Damme, 2013). Por lo tanto no se obtuvieron muestras positivas a
genes de virulencia (ail, virF y yst) analizados en este estudio (Figura 1).
5.3 Serotipificación mediante PCR
Figura 2 Identificación de los serotipos O:3 y O:9 por PCR.
El primer carril corresponde a un marcador de peso molecular (100pb a 1000pb),
del segundo al doceavo carril se encuentran las muestras clínicas. El control
positivo se encuentra en el carril trece con los genes rfbC O:3 (405pb) y per O:9
(181pb). El control negativo se encuentra en el carril catorce con (agua ultrapura).
En el análisis de PCR realizado, no se obtuvieron muestras positivas a los serotipos
O:3 y O:9 analizados en este estudio (Figura 2).
21
5.3 Discusión
El presente estudio se realizó en base a la norma ISO 10273:2017 para el
aislamiento de Yersinia enterocolitica patogénica. El agar CIN utilizado para el
aislamiento de Y. enterocolitica permite además el crecimiento de Enterobacterias
como Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella y Serratia; sin embargo, las colonias
presentan tamaños superiores a los 3 mm (Zadernowska et al., 2013). Este fue el
caso de muchos aislamientos primarios realizados en este estudio, en los cuales se
observaron colonias típicas, pero con un diámetro mayor al esperado.
En Europa, esta bacteria ocupa el tercer lugar entre los patógenos entéricos
causantes de ETAs en humanos (Mazzette et al., 2015). Además, se ha asociado
al cerdo como el principal reservorio de cepas patógenas (Bottone, 2015;
Nesbakken et al.2003; Van Damme et al., 2013). Estudios realizados en Europa
reportaron prevalencias de Y. enterocolitica entre el 37.4% y 58% en cerdos de
consumo (EFSA, 2007; Van Damme et al., 2015). Por su lado Estados Unidos
presentó prevalencias del 5% y 25% (Bowman et al., 2007; Funk et al.,1998).
Latinoamérica presenta pocos estudios de este patógeno en cerdos. Así, un estudio
realizado en México encontró una prevalencia del 22% (n=100) (Elizalde et al.,
2001). En Brasil una investigación realizada en tonsilas de cerdo durante el 2017,
reportó el 25.2% (n=400) de muestras positivas a Y. enterocolitica. Sin embargo,
solo una muestra presentó genes de virulencia (Wildemann et al., 2017).
Los niveles de Y. enterocolitica reportados en Ecuador han sido los más bajos
dentro en el contexto latinoamericano. Así, un estudio realizado en una comunidad
rural Otón de Vélez en Yaruquí encontró 1 cerdo positivo (2.8%) de 36 animales
muestreados (Vasco et al., 2016). No obstante, los resultados que se encontraron
en el presente estudio mostraron la presencia de Yersinia spp. en aislados
originados en 7 cerdos (6%), de los cuales 4 fueron identificados como Y.
enterocolitica.
22
Los bajos porcentajes de aislamiento de Y. enterocolitica en nuestro estudio pueden
estar influenciados por el tipo de faenamiento que se realiza en Ecuador. Un estudio
de Fredriksson-Ahomaa et al., (2001) determinó que se provocaba una mayor
diseminación de este patógeno durante el faenamiento al cortar la cabeza de los
cerdos. Sin embargo, el proceso de faenamiento en el Ecuador es diferente al
europeo, manteniendo la cabeza del cerdo intacta en la línea de faenamiento. Otro
factor que hay que mencionar es la cantidad limitada de animales muestreados en
este estudio. Para futuros estudios, se sugiere aumentar el número de muestra a fin
de reducir el potencial sesgo de la estimación de esta bacteria en cerdos.
La importancia de Y. enterocolitica como ETA ha sido valorada en distintas matrices
alimenticias y casos clínicos humanos. Así, en Argentina se ha podido aislar Y.
enterocolitica en huevos, leche, salchichas y productos cárnicos. Sin embargo,
ninguno de estos ha sido asociado a brotes por contaminación de alimentos (Favier
et al., 2005; Lucero Estrada et al., 2011). Por otro lado, en Chile se reportó la
presencia de esta bacteria en cuadros diarreicos en niños (Prado et al., 1992). En
Colombia también se investigó este patógeno en diarreas humanas como posible
causante de ETAs, pero se obtuvieron resultados negativos del aislamiento
(Hernández et al., 2017).
Pese a que varios estudios han reportado un mayor número de aislamientos en
tonsilas que en contenido cecal (Nesbakken et al., 2003; Rahikainen et al, 2016;
Van Damme et al., 2014), el presente estudio obtuvo más aislamientos en contenido
cecal. Se ha argumentado que la presencia del patógeno en diferentes órganos
puede estar asociada a factores estacionales, transporte de los animales o estrés
(Rahikainen et al., 2016). Estas variables podrían explicar en parte nuestros
resultados, pero estudios complementarios son necesarios para verificar esta
hipótesis.
Los serotipos de mayor prevalencia en cerdos de origen europeo son O:3 y O:9
(Zadernowska et al., 2013). Mientras que el serotipo O:8 predomina en EE.UU
23
seguido en menor cantidad del O:3 (Bottone, 2015; Petsios et al., 2016;
Zadernowska et al., 2013). En América del Sur solo algunos países presentan
identificación de serotipos. Así, Rusak et al., (2014) determinó al serotipo O:3 en
cepas brasileñas y en México se encontraron los serotipos O:9 y O:3 (Elizalde
Castañeda et al., 2001).
De los cerdos positivos a Y. enterocolitica, 4 aislados fueron tipificados como biotipo
4, concordando con estudios realizados en Brasil y Estados Unidos donde este
biotipo es el prevalente (Bottone, 2015; Rusak et al., 2014). Sin embargo, otros
estudios realizados en Argentina y Europa reportan además del biotipo 4 como
ocasional, los biotipos 1A, 1B, 2, y 3 como los más prevalentes (Bottone, 2015;
Favier et al., 2005; Fredriksson-Ahomaa et al., 2001; Fredriksson-Ahomaa et al.,
2018; Estrada et al., 2011; Nesbakken et al., 2006; Laukkanen et al., 2010; Van
Damme et al., 2015; Vanantwerpenet al., 2015).
A pesar de que en el presente estudio se obtuvo el biotipo 4 que es considerado
patógeno (Van Damme, 2013), los estudios moleculares utilizados no identificaron
serotipos ni genes vinculados a cepas patógenas. Algunos estudios sugieren que
los subcultivos y el almacenamiento de cepas en diferentes medios de cultivo
ocasionan pérdida de plásmidos (Nesbakken et al., 2006; Vanantwerpen et al.,
2015), pudiendo explicar en cierta medida nuestros resultados. De igual forma la
literatura menciona que en cultivos repetitivos el pYV (plásmido de Virulencia de
Yersinia) se puede comportar de forma inestable. (Fredriksson-Ahomaa, 2017;
Laukkanen et al., 2010; Vanantwerpen et al., 2015; Zadernowska et al., 2013).
Sería recomendable realizar pruebas moleculares minimizando el número de
pasajes en medios de cultivo para corroborar esta hipótesis.
Si las cepas halladas en este estudio son verdaderamente apatógenas, podríamos
asumir que la patogenicidad de Y. enterocolitica en las muestras estudiadas es
limitada. De ser este el caso, la importancia de esta bacteria como patógeno
alimentario sería limitada.
24
La ausencia de datos sobre Y. enterocolitica en Latinoamérica dificulta tener una
idea epidemiológica regional sobre esta bacteria. Estudios futuros se hacen
necesarios para entender la dinámica de este patógeno en alimentos. Un mayor
número de animales analizados, muestreo en diferentes zonas geográficas y un
panel más amplio de pruebas para identificar varios serotipos podrían ser factores
que deben ser considerados.
El cerdo está entre los principales alimentos de consumo del país, por lo que se
requiere establecer procesos de investigación que profundicen los conocimientos
sobre este patógeno alimentario para ayudar a establecer políticas sanitarias
basadas en hechos científicos.
25
CAPITULO VI
6. Conclusiones
En este estudio se obtuvo una prevalencia baja de Y. enterocolitica en tonsilas
y en heces en comparación con estudios previos.
Los aislados de Y. enterocolitica no fueron positivos a la identificación de los
serotipos 0:3 y O:9, por lo que se debería investigar la presencia de otros
serotipos
A pesar de obtener un biotipo patógeno en nuestros aislados, no se
identificaron genes de virulencia, por lo que es probable que Y. enterocolitica
biotipo 4 en las muestras analizadas no sea patógena.
26
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33
Anexo 1.
ANEXOS Caldo TSB
Buffer TE 1X
2.1 Materiales de Laboratorio para
toma de muestras
Materiales
Frascos estériles
Fundas estériles
Muestra de contenido cecal
Algodón
Lámina de bisturí
Asas plásticas de 1μl para
siembra y estriaciones
Espejo
Lámpara de luz blanca
Reloj análogo
Gradilla
Aguja de inoculación
Reactivos
Agar Yersinia Selectivo (CIN)
Complemento de Agar Yersinia
(CIN)
Caldo PBS
Agar Urea
Agar Kliger
Agar Esculina
Agar Triptona / Indol
Agar Xilosa
Reactivo de Kovacks
Alcohol al 96%
Equipos
Mechero de bunsen o cámara
de seguridad
Estereoscopio
Incubadoras 30 ºC
Micropipeta 100 – 1000 μl
Vortex
34
Anexo 2
2.8 Materiales para determinación
de Genes de Virulencia
Materiales
Asas desechables de 1 μl
Cultivo bacteriano
Guantes desechables
Microtubos de 2ml
Microtubos de 200μl o tubos
para PCR
Gradilla para microtubos de 2ml
Gradilla fría para microtubos de
200μl
Puntas para micropipeta de 10
μl, 100 μl y 1000 μl
Frasco pyrex con tapa
Molde para colocar el gel de
agarosa
Reactivos
TE1X
Agua de grado Molecular
Buffer
Cloruro de magnesio (MgCl2)
Desoxirribonucleótidos
trifosfatados (dNTP)
Primers forward y reverse para
los genes ail, virF, yst.
Enzima ADN polimerasa (Taq)
Templado o molde de ADN
Agarosa
Cyber safe
TBE 1 X o TAE 0,5X
Equipos
Mechero de bunsen o cámara
de seguridad
Termobloque
Microcentrífuga
Micropipeta de 10μl, 100μl y
1000μl
Termociclador
Balanza analítica
Cámara de electroforesis
Transiluminador
Cámara fotográfica
35
Anexo 3
2.9 Materiales para identificación de
serotipos O:3 y O:9
Materiales
Asas desechables de 1 μl
Cultivo bacteriano
Guantes desechables
Microtubos de 2ml
Microtubos de 200μl o tubos
para PCR
Gradilla para microtubos de 2ml
Gradilla fría para microtubos de
200μl
Puntas para micropipeta de 10
μl, 100 μl y 1000 μl
Frasco pyrex con tapa
Molde para colocar el gel de
agarosa
Reactivos
TE1X
Agua de grado Molecular
Buffer
Cloruro de magnesio (MgCl2)
Desoxirribonucleótidos
trifosfatados (dNTP)
Primers forward y reverse para
los genes rfbC y per
Enzima ADN polimerasa (Taq)
Templado o molde de ADN
Agarosa
Cyber safe
TBE 1 X o TAE 0,5X
Equipos
Mechero de bunsen o cámara
de seguridad
Termobloque
Microcentrífuga
Micropipeta de 10μl, 100μl y de
1000μl
Termociclador
Balanza analítica
Cámara de electroforesis
Transiluminador
Cámara fotográfica
36
Anexo 4.
Reactivos y cantidades necesarias para una reacción de PCR para determinar
genes de virulencia
Reactivo C. Final Volumen para una
reacción
Cantidad Unidad Cantidad Unidad
Agua 4,28 μl
Template 1 μl
Buffer 1 X 3 μl
dNTP
Mix
0,2 mM 0,3 μl
MgCl2 2 mM 1,2 μl
ail-a 0,6 μM 0,9 μl
ail-b 0,6 μM 0,9 μl
virF-a 0,6 μM 0,9 μl
virF-b 0,6 μM 0,9 μl
Yst-a 0,5 μM 0,75 μl
Yst-b 0,5 μM 0,75 μl
Taq 0,04 U/μl 0,12 μl
Total 15 μl
Fuente: investigación directa (Harnett 1996) Elaboración: La autora
37
Anexo 5.
Reactivos y cantidades necesarias para una reacción de PCR para determinar
serotipos de Y. enterocolitica.
Reactivo C. Final Volumen para una
reacción
Cantidad Unidad Cantidad Unidad
Agua 6,38 μl
Template 1 μl
Buffer 1 X 3 μl
dNTP
Mix
0,2 mM 0,3 μl
MgCl2 2 mM 1,2 μl
rfbC-a 0,5 μM 0,75 μl
rfbC-b 0,5 μM 0,75 μl
per-a 0,5 μM 0,75 μl
per-b 0,5 μM 0,75 μl
Taq 0,04 U/μl 0,12 μl
Total 15 μl
Fuente: investigación directa (Jacobsen et al., 2005) Elaboración: La autora
38
Anexo 6
Flujograma de Hisopado de Amígdalas
39
Anexo 7
Flujograma de Contenido Cecal
40
Anexo 8
Buscar el órgano de estudio Limpieza con alcohol al 96%
Corte de 3cm de ciego Colocar en frasco estéril
Buscar el órgano de estudio Realizar barrido de órgano en estudio
41
Observación de colonias en agar CIN Colonia sospechosa
Crecimiento de algunas colonias Morfología similar a la buscada
Contaminación de otras colonias Siembra por duplicado
42
Colonias y tamaño específicas Siembra en agar esculina
Siembra en agar Kliger Siembra en xilosa, indol y urea
