Zklady biochemie KBC/BCH, ZS 20011/12.

Prof. Pavel PE http://ibiochemie.upol.cz

Dal biochemick literaturaKodek Milan, Biochemick pojmy, vkladov slovnk http://vydavatelstvi.vscht.cz/knihy/uid_es-002_v1/

Berg, M. Jeremy, Tymoczko, L. John, Stryer Lubert: BIOCHEMISTRY (6th Edition), W.H. Freeman and Company, New York (2007); ISBN 0-7167-8724-5. Web: http://bcs.whfreeman.com/biochem6/

Knihkupectv Mal centrum, Brno, Kotlsk 2 (Arel PF MU) http://www.malecentrum.cz/

Biochemick literaturaPklad interaktivn elektronick uebnice:http://orion.chemi.muni.cz/e_learning/biochemie.htm

Proteiny, peptidy a aminokyseliny:

Pedmt biochemie. Aminokyseliny a peptidy. Sekvencovn peptid a problematika peptidovch syntz.Prodn peptidy: hormony, antibiotika, jedy, toxiny.Proteiny. Rozdlen protein. Purifikace protein. Elektroforza protein. Metody stanoven molekulov hmotnosti protein. Strukturn typy protein. Uren trozmrn struktury protein. Zklady imunologie.

vodBiochemie popisuje struktury, organizaci a funkci iv hmoty na molekulrn rovni.

Dlme na ti zkladn oblasti: Strukturn chemie sloek iv hmoty a vztah mezi biologickou funkc a chemickou strukturou.

Studium metabolismu sledy chemickch reakc probhajcch v iv hmot.

Molekulrn genetika uchovvn a penos informac.

Koeny biochemieF. Whler 1828 syntza mooviny z anorganickch ltekBrati Eduard a Hans Buchnerov 1897 bezbunn extrakt z kvasinek katalyzuje fermentaci (reakce in vitro.).J. B. Sumner -1926 krystaluje enzym ureasu, protein z lutniny Canavalia ensiformis Souasn rozvoj biologie bukyHistorick pohled na lohu deoxyribonukleov kyseliny (DNA) v buceObjev 1869 F. Miescher; 1953 James Watson a Francis Crick struktura DNA start molekulrn biologie.

Biochemie jako disciplina a interdisciplinrn vdaBiochemie vychz hlavn z poznatk organick chemie a ostatnch chemickch obor.

Dle z poznatk medicny, nauky o viv, mikrobiologie, fyziologie, bunn biologie, biofyziky a genetiky.

Co sama biochemie ? Zamuje se na strukturu biomolekul a jejich reakce, na enzymy a biologickou katalzu, na vysvtlen metabolickch cest a jejich regulaci a na principy ivotnch proces, kter mohou bt vysvtleny chemickmi zkony.

Chemick prvky iv hmoty:

Prvn rove: C, H, O, N

Druh rove: Na, K, Mg, Ca, Cl, S, P

Tet rove: Co, Cu, Fe, Mn, Zn

tvrt rove: Al, As, B, Br, Cr, F, Ga, I, Mo, Se, Si, V

Pro C a ne Si ??

Uhlkov ovinismus (nadazenost) Kemk m adu nevhod oproti uhlku: Atomy Si jsou mnohem vt, maj vy hmotnost a atomov polomr. Tko se tvo dvojn a trojn kovalentn vazby. Silany (sloueniny svodkem), analogie alkan, jsou siln reaktivn svodu - rozkldaj se. Silikony, polymery vc kemk pes kyslk, jsou velmi stabiln. Komplexn silikony sdlouhmi etzci jsou zase mn stabiln ne odpovdajc uhlkat sloueniny. Oxid kemiit je analogem oxidu uhliitho. Je to znm pevn ltka nerozpustn ve vod. Dovedete si pedstavit oxid kemiit jako produkt aerobn respirace ??

ovinismus

Cogniard je pjmen dvou bratr - francouzskch (paskch) dramatik: Hippolyta Cogniarda (18071882) a Thodora Cogniarda (18061872).

V jejich he La Cocarde Tricolore (Tbarevn kokarda) z roku 1831 vystupuje postava napoleonskho vojka Chauvina, jeho postoje jsou typick pro ovinismus.

Aminokyseliny, peptidy a proteiny. Aminokyseliny

Zkladn struktura a-aminokyselin. Proteinogenn aminokyseliny (20) dlme podle charakteru vedlejho etzce R do t skupin:

Tab. 1 1 Struktura, zkratky, vskyt vproteinech a pK hodnoty ionizovatelnch skupin proteinogennch aminokyselin

Tab. 1 1 Struktura, zkratky, vskyt vproteinech a pK hodnoty ionizovatelnch skupin proteinogennch aminokyselin

Tab. 1 1 Struktura, zkratky, vskyt vproteinech a pK hodnoty ionizovatelnch skupin proteinogennch aminokyselin

Tab. 1 1 Struktura, zkratky, vskyt vproteinech a pK hodnoty ionizovatelnch skupin proteinogennch aminokyselin

Tab. 1 1 Struktura, zkratky, vskyt vproteinech a pK hodnoty ionizovatelnch skupin proteinogennch aminokyselin

Tab. 1 1 Struktura, zkratky, vskyt vproteinech a pK hodnoty ionizovatelnch skupin proteinogennch aminokyselin

Tab. 1 1 Struktura, zkratky, vskyt vproteinech a pK hodnoty ionizovatelnch skupin proteinogennch aminokyselin

Selenocystein, zkratky Sec, U. UGA kodon, normln STOP. Soust napklad:glutathionperoxidas,tetraiodothyronine 5- deiodinas,thioredoxinreduktas,formtdehydrogenas,glycinreduktas, hydrogenas). Sec m ni hodnotu pK a vy redukn potencil soust selenoprotein antioxidant (na rozdl od Cys). Pro zaazen do etzce peptidu mus UGA kodon pedchzet SECIS element asi 60 nukleotid. (selenocysteineinsertionsequence ).

Tvorba disulfidovch vazeb oxidac SH skupinvedlejch etzc Cys.

Trozmrn struktura aminokyseliny s chirlnm a-uhlkem.L a D izomer. Pedmt a jeho obraz v zrcadle.Proteinogenn aminokyseliny maj konfiguraci L.

Cahn-Ingold-Prelogv model absolutn konfigurace. Substituenty na a-uhlku se ad podle klesajc priority. Smr ipky proti smru hodinovch ruiek zna S konfiguraci (sinister = doleva)

Skupiny dle klesajc priority proCahn-Ingold-Prelogv model:

SH, OR, OH, NH-COCH3, NH2, COORCOOH, CHO, CH2OH, C6 H5, CH3, 3H, 2H, H

Absolutn konfigurace L-Asp a L-Cys:

Absolutn konfigurace proteinogennch L-aminokyselin:Gly (G) nen chirln Cys (C) je v absolutn konfiguraci RIle (I) a Thr (T) maj dv chirln centra.

L-Ile (2S,3S) ., existuji dva enantiomery diastereoizomern k alloisoleucinu (2R,3S)

L-Thr (2S,3R), existuj dva enenatiomery, kter jsou diastereoizomern k allothreoninu (2R,3R).

Vechny ostatn L-aminokyseliny jsou S !!

Optick otivost aminokyselinDalm dsledkem chirality aminokyselin je vlastnost jejich roztok otet rovinu polarizovanho svtla (kmit v jedn rovin).Otoen -ve smru hodinovch ruiek: Zname (d nebo +), proti smru hodinovch ruiek: Zname (l nebo -)Nezamovat l a L , d a D !!! Nkter L-aminokyseliny ot doprava (nap. L-Leu) !! M se polarimetrem.hel otoen zvis na:dlce optick drhy (1 dm), vlnov dlce polarizovanho svtla (lut D ra sodku 589,3 nm), koncentraci roztoku a teplot.

Ionizan stavy aminokyselin jako funkce pH:

Uren pK1, pK2 a pI alaninu. pI = pK1 + pK2 / 2 (izoelektrick bod, pI = 6, 11 )

Aromatick aminokyseliny absorbuj svtlo v UV oblasti:

Absorpn spektra a molrn absorpn koeficienty Trp, Phe a Tyr:

Posttranslan modifikovan aminokyseliny:

Nkter fyziologicky vznamn sloueniny odvozen od aminokyselin:

Peptidy

Peptidov vazba mezi karboxylem jedn aminokyseliny a aminoskupinou dal aminokyseliny. Peptidy do Mr = 5500, resp. 5, 5 kDa, ve proteiny. V biochemii se obvykle Mr udv v jednotkch oznaench jako dalton = hmotnosti vodku, zkratka Da po Johnu Daltonovi Proteiny 5 500 a 220 000 dalton, nebo 5, 5 kDa a 220 kDa. Prmrn molekulov hmotnost aminokyselin 110 Da John Dalton FRS (Fellow of the Royal Society)(6. September 1766 27. July 1844) was an English chemist, meteorologist and physicist. He is best known for his pioneering work in the development of modern atomic theory, and his research into colour blidness (sometimes referred to as Daltonism, in his honour).

Jednotka molekulov hmotnosti v biochemii

Da, zkratka jmna Dalton, jednotka molekulov hmotnosti, jedna dvanctina atomov hmotnosti uhlku 12C, 1 Da = 1,66.10-27 kg. Voda tedy m molekulovou hmotnost 18 Da (molrn hmotnost 18 g/mol a relativn molekulovou hmotnost 18). Jednotka Da (asto se uvaj nsobky kDa, kilodalton); a vbec nezapad do systmu jednotek SI, je bn pouvna pro vyjden molekulov hmotnosti biomakromolekul.

Pentapeptid TyrGlyGlyPheLeu s oznaenm N-konce Tyr a C konce Leu:

Nzvoslov peptidDv aminokyseliny-dipeptid, ti tripeptid. 1. Acylan od N konce AGK = alanylglycyllysin2. Triviln nap. insulin, glukagonV peptidech mohou bt i neproteinogenn aminokyseliny a konfiguran D.

Peptidy mohou bt linern nebo cyklick (cyklopeptidy).

Leu enkefalin opioidn peptid

Sekvence pentapeptidu od N-konce: Tyr-Gly-Gly-Phe-LeuYGGFL

Pentapeptid reverzn: LFGGY je neaktivn jako opioidn peptid vnmn bolesti.

Glutathion je tripeptid astnc se oxidan reduknch reakc v metabolismu. Redukovan glutathion odstrauje kyslkat radikly (ROS)

Peptidov etzec s vyznaenm umstn vedlejch etzc aminokyselin

Dlky vazeb peptidov vazby:Vazba C N (13, 2 nm) je del ne dvojn (12, 7 nm) a krat ne jednoduch (14, 9 nm). Peptidov vazba nem nboj. Hodnota jednoho ngstrmu je rovna 0,1nmneboli 10-10m.

Rezonann struktury peptidov vazby, kter jsou pnou jej planarity.

Peptidov vazby le v rovin. Vedlej etzce R (zelen) smuj nad nebo pod roviny peptidovch vazeb.

Stereochemie peptidov vazby. Forma trans vysoce pevauje nad cis. Forma cis je stericky nevhodn.

Prolin v peptidov vazb me existovat v obou formch cis i trans. Ob jsou prostorov shodn nevhodn.

Rotan (torzn, dihedrln = hly mezi rovinami !!) hly kolem vazeb v polypeptidu: f (f) je torzn hel kolem vazby mez duskem a a-uhlkem, y (ps) je torzn hel mezi a-uhlkem a uhlkem karbonylu

Jak se m torzn hly ? Pohled od dusku k a-uhlku (f), pohled od karbonylovho uhlku k a-uhlku (y)

Ramachandranv diagram znzorujc hodnoty torznch hl (f) a (y). Tmav zelen pole jsou ppustn konformace. Struktura vpravo dole je nereln ze sterickch dvod.

Stanoven primrn struktury sekvence peptid (sekvencovn)

Primrn strukturou peptid rozumme poad aminokyselin v peptidovm etzci. teme od N konce.

Taktika sekvencovn (linern peptidy): A) Oddlen etzc nap. odstrann disulfidovch vazeb. B) tpen peptid chemickmi a enzymovmi metodami na krat etzce a jejich rozdlen. C) Vlastn sekvencovn. D) Rekonstrukce peptidu z pesahujcch fragment.

Redukce disulfidov vazby mezi polypeptidovmi etzci nebo uvnit etzce 2-merkaptoethanolem:

Reakc jodacettu s volnou SH skupinou na polypetidovm etzci se zabrn jej reoxidaci:

Pro stanoven pesn pozice disulfidov vazby se pouv diagonln elektroforza pi kter se oxiduje disulfidov vazba permraven kyselinou:

Diagonln elektroforza (ELFO). Po oxidaci peptid se v druhm smru elektroforzy pvodn peptidy zastav na diagonle, kdeto peptidy obsahujc disulfidov vazby (jsou kyselej) se objev mimo diagonlu.

Enzymov tpen polypeptid endopeptidasami:Endopeptidasy, proteinasy, jsou hydrolytick enzymy tpc specificky urit peptidov vazby. Trypsin tp na mst karboxylu Arg a Lys.Chymotrypsin tp na mst karboxylu hydrofobnch aminokyselin Phe, Tyr a Trp. Elastasa tp na mst karboxylu malch neutrlnch aminokyselin Ala, Gly, Ser a Val.Ve vech ppadech se vazba netp, pokud je nsledujc aminokyselinou Pro.Vechny pedchoz enzymy jsou z hovzho pankreatu. Endopeptisa V8 ze S. aureus je specifick na Glu. tpenm polypeptidu rznmi enzymy zskme adu peptidovch fragment

Enzymov tpen polypeptidovho etzce trypsinem na mst karboxylu Arg nebo Lys:

Vznik rznch fragment z polypeptidu enzymovm achemickm tpenm peptidovch vazeb. V tomto pkladu se zskalo est pekrvajcch se fragment.

Pklad chemickho tpen peptidov vazby. Bromkyan tp specificky na mst karboxylu Met.

Pvodn Sangerova metoda zaloen na sekvenaci polypeptidu (insulin) od N-konce 2,4-dinitrofluorbenzenem. Nevhodou bylo, e se pi stanoven jedn aminokyseliny se hydrolyzoval cel peptid.

Pi pouit dansyl chloridu (fluorescence) dolo k vraznmu zven citlivosti Sangerovy metody. Stanovuje se 1 nM.L-1 aminokyseliny.

Edmanova metoda sekvenace peptidu od N-konce:Polypeptid je navzn C-koncem na polymern nosi. Postupn se oddluj fenylthiohydantoinov (PTH) derivty aminokyselin.inidlem je fenylisothiokyant (PITC).

Sestaven pvodnho polypeptidu z fragment zskanch enzymovou hydrolzou:

Pro sekvencujeme peptidy a proteiny ?1. Sekvence se porovnv se znmmi sekvencemi. Z analogie je mon usoudit nap. na katalytick mechanismus enzymu nebo pslunost nov zskanho peptidu do urit rodiny peptid.

2. Srovnvaj se sekvence stejnho polypeptidu z rznch zdroj a sleduje se evolun mapa.

3. Sekvenn data se vyuvaj jako podklad k syntze protiltek a peptid nebo protein s vznamnm inkem.

4. Aminokyselinov sekvence je podstatn pro tvorbu DNA sond specifickch pro geny kdujc odpovdajc proteiny.

5. Mnoh proteiny obsahuj signln aminokyselinov sekvence slouc k ke kontrole uritho procesu. Sekvence mohou nap. obsahovat signl pro umstn proteinu v membrn.

Vyuit technologie rekombinantn DNA k sekvenaci velkch protein. etzce DNA jsou klonovny a pot sekvencovny. Sekvence nukleotid udvaj sekvenci aminokyselin v proteinu. Nevhodou je, e nepostihuje posttranslan pravy polypeptid.

Pro syntetizovat peptidy ?1. Syntetick peptidy slou jako antigeny stimulujc tvorbu specifickch protiltek.

2. Syntetick peptidy mohou bt vyuity k izolaci receptor hormon a jinch signlnch molekul. Tak jako afinanty pi afinitn chromatografii.

3. Syntetick peptidy mohou bt vyuity jako lky. Nap. analog vasopresinu, hormonu stimulujccm reabsorpci vody, 1-desamino-8-D-argininvasopresin se odbourv pomaleji a slou jako nhrada vasopresinu.

4. Peptidy mohou slouit jako pomocn strukturu pi studiu sloitjch protein (trozmrn struktura).

Porovnn struktur prodnho a syntetickho vasopresinu:

Taktika peptidovch syntz:1. Aktivace karboxylu2. Chrnn skupin, kter nevstupuj do peptidov vazby

Syntzy peptid jsou zautomatizovny. Prvn chrnn skupina se nave C koncem na makromolekulrn pryskyici a postupn se pidvaj na N - konec dal chrnn aminokyseliny. Reakc karboxylu a aminoskupiny s N, N dicyklohexylkarbodiimidem (DCC) za odtpen vody a uvolnn N, N dicyklohexylmooviny, se tvo peptidov vazba.

Skupiny, kter nemaj vstoupit do peptidov vazby se chrn inidly jako nap. t butyloxykarbonyl, t Boc nebo benzyloxakarbonyl (dve karbobenzoxy nebo karbobenzyloxy) symbol Z nebo Cbz. Ob skupiny se po skonen syntzy lehce odtpuj.

Vstup chrnn aminokyseliny (t-Boc) do peptidov vazbyza asti DCC:

Celkov postup syntzy peptidu na polymernm nosii. Syntza peptid v pevn fzi Merrifieldova metoda (SPPS).

Prodn peptidy Zvltnosti struktury prodnch peptid: - obsahuj i neproteinogenn aminokyseliny - obsahuj i D-aminokyseliny- isopetidov vazby (nap. g-karboxyl Glu)- cyklick struktury (laktamy, disulfidov vazby)- vtven struktury - blokovn koncovch aminokyselin (pyroglutamt, glycinamid)

Skupiny prodnch peptid - di- a tripeptidy (glutathion, sladidlo aspartam)- peptidov hormony (oxytocin, vasopresin, pechod k proteohormonm, insulin)- neuromodultory (endorfiny, 15 a 32 aminokyselin, enkefaliny, pentapeptidy)- peptidov zoo- a fytotoxiny ( hadi, ti, vely apamin; falloidiny a amanitiny Amanitia phalloides )- protaminy krtk linern peptidy, ml ryb- polyaminokyseliny (bunn stny baktri, poly g-L-Glu a poly-g-D-Glu)

Insulin je skladovn v tle jako hexamer. Jen monomer je funkn. Monomery spojuj atomy Zn2+ pes His. Insulin Lispro m nzkou tendenci tvoit dimery a hexamery.

Metabolick funkce insulinu

PROTEINY BLKOVINY Proteiny z eckho proteos (prvotn, nejpodstatnj), blkoviny z nmeckho eiweisse vajen blek.

Proteiny jsou univerzln makromolekuly ivch systm majc klov funkce v tm vech biologickch procesech.

Klov vlastnosti protein: - Proteiny jsou linern polymery sestaven z monomernch jednotek aminokyselin. - Proteiny obsahuj adu funknch skupin. - Proteiny mohou reagovat spolu vzjemn nebo s jinmi biologickmi makromolekulami za tvorby vych komplexnch celk. - Nkter proteiny jsou siln rigidn, zatmco jin vykazuj omezenou flexibilitu.

Klasifikace a rozdlen protein Klasifikace protein podle funkce (specifick a obecn), chemickho sloen a tvaru.

Obecn funkce protein: Zdroj energie a dusku, inn stoje (krev, cytosol), vznamn pspvek k udren osmotickho tlaku vn i uvnit bunk.

Specifick funkce protein (zvltn tabulka).

Chemick sloen: A) Jednoduch pouze polypeptidov etzecB) Sloen (polypeptidov st + neproteinov st)- Metaloproteiny obsahujc kovov iont. - Fosfoproteiny obsahujc fosfty.- Glykoproteiny obsahujc sacharidovou sloku- Lipoproteiny obsahujc lipidovou sloku- Nukleoproteiny obsahujc nukleov kyseliny

Specifick funkce protein

Typ proteinuPkladVskyt a funkce

Katalytick (enzymy)TrypsinHydrolza peptidov vazbyRegulan (hormony)InsulinStimulace metab. glukosy OchrannProtiltkyVazba na cizorod ltky SkladovacKaseinMln proteinTransportnHemoglobin Transport O2 krvStrukturnKolagenVlknit pojivov tknKontraktilnMyosin, aktinSvalov vlkna Genetick funkn HistonyAsociace s DNA (chromosomy)Toxick RicinToxick protein z Ricinus communis (skoec obecn)

Pokraovn rozdlen protein

Rozdlen protein podle tvaru molekul:- Globulrn tvar koule, obvykle ve vod rozpustn- Fibrilrn ve tvaru vlken, ve vod nerozpustn - Membrnov soust biologickch membrn

Dal monosti dlen protein podle lokalizace nebo dj, ve kterch psob:- Krevn proteiny - Membrnov receptory- Elektrontransportn systmy (vnitn membrna mitochondri)

Purifikace proteinPro vechny studie protein mus bt k dispozici ist protein. Proto, abychom ho zskali, musme mt zdroj, kde je proteinu dostaten mnostv a metodu pro jeho sledovn bhem purifikace (itn). Metody sledovn purifikovanho proteinu jsou rzn. Uvdm metodu, kdy m protein katalytickou funkci (enzym) a jeho koenzymem je nikotinamidadenindinukleotid (NAD+), kter po redukci na NADH pechz na produkt identifikovateln ve spektru UV vlnov dlky 340nm. Dle rostouc hodnoty absorbance posuzujeme aktivitu enzymu. Dalm dleitm dajem je obsah protein, kter se bhem purifikace mn. Rozhodujc pro spn prbh purifikace je rostouc hodnota specifick aktivity ( aktivita enzymu / obsah protein). Abychom zskali proteiny z bunk v roztoku musme biologick materil homogenizovat rozdrtit bunn membrny. Po homogenizaci obvykle nsleduje oddlen rznch frakc diferenciln centrifugac. Zskme sediment (u dna) a nad sedimentem supernatant.

Diferenn centrifugace po homogenizaci. Zvyujc se centrifugan sla (nsobky g) umouje oddlen tho materilu od lehho, ppadn se oddl pevn stice od rozputnch v roztoku.

Dal metody purifikace proteinVysolovn a dialza. Mnoh proteiny jsou mn rozpustn v roztocch s vy koncentraci sol. Vysolovn lze provdt frakn nap. sranem amonnm rzn koncentrace. Dialza je proces pi kterm se oddluj velk molekuly protein od malch molekul (nap. sol) pes semipermeabiln membrnu.

Gelov chromatografie. Metoda slou k oddlovn velkch molekul od malch. Pouvaj se kolony obsahujc porzn kuliky o rozmrech 100 mm (0, 1 mm). Obvykle nerozpustn, ale vysoce hydratovan polysacharidy dextran, agarosa nebo polyakrylamid. Nap. Sephadex, Sepharosa nebo Biogel. Mal molekuly vnikaj do hydratovanch gel a tm se zpouj, kdeto velk molekuly prochz rychleji (nezpouj se). Poad eluce molekul z gelu je : prvn velk, pot stedn a nakonec mal molekuly. Pouv se tak k odsolovn.

Chromatografie na iontomnich. Proteiny se oddluj na zklad nboje na jejich povrchu. Kdy m protein na povrchu kladn nboj pi pH 7, ve se na kolonu polymeru obsahujcho karboxyltov skupiny, zatmco protein s negativnm nbojem se neve. Navzan protein s kladnm nbojem se uvoln pidnm chloridu sodnho do stoje, protoe sodn iont kompetuje s kladnm nbojem proteinu. Proteiny s kladnm nbojem se v na negativn nboj kolony (nap. karboxymethylcelulosa). Naopak proteiny se zpornm nbojem se v na pozitivn nboj nap. diethylaminoethylcelulosu DEAE.

Dialza

Gelov chromatografie na Sephadexu (polysacharid)

Chromatografie na iontomnich katex karboxymethylcelulosa

Afinitn chromatografie

Afinitn chromatografie spov ve vazb protein na specifick chemick skupiny (afinanty).Nap. enzym se me vzat na afinitn kolonu s navzanm kompetitivnm inhibitorem.Sms protein se nanese na kolonu.Hledan enzym se nave pevn na inhibitor.Vechny ostatn proteiny se vymyj.Enzym se uvoln pidnm substrtu.

Oven spnosti purifikace. Elektroforza. Gelov elektroforza.

Molekuly nesouc nboj putuj stejnosmrnm elektrickm polem. Proces se nazv elektroforza. V biochemie meme takto dlit peptidy, proteiny i nukleov kyseliny. Rychlost pohybu molekul v elektrickm poli zvis na sle el. pole (E), celkovm nboji molekuly (z) a friknm koeficientu (f):v = E.z / f Proti elektrick sle E.z nesouc molekulu s nbojem proti elektrod s opanm nbojem psob viskozita jako projev interakce mezi putujc molekulou a prostedm. Frikn koeficient f zvis na hmotnosti a tvaru molekuly a viskozit prosted (h ). Pro molekulu ve tvaru koule o polomru r, plat: f = 6 p. h . rElektroforza se provd na nosii o konzistenci gelu nebo na pape. Gel slou souasn jako molekulov sto.

Polyakrylamidov gelov elektroforza (PAGE).Zesovn akrylamidu (toxick).

Proveden PAGE. Vertikln (shora dol), molekuly se pohybuj smremk anod (+). Velk molekuly se zpouj, mal putuj v ele.

Modifikac je elektroforza za podmnek denaturace SDS-PAGE. Denaturanm inidlem je obvykle dodecylsran sodn (SDS) aniontov detergent. SDS tp tm vechny nekovalentn vazby v proteinech. Aniont SDS se ve na hlavn etzec polypeptidu (jedna molekula SDS na dv aminokyseliny). Komplex denaturovanho proteinu s SDS zsk zporn nboj, kter je mrn molekulov hmotnosti proteinu. Krom SDS se pidv merkaptoethanol nebo dithiothreitol k redukci disulfidovch vazeb. Po probhnut elektroforzy se proteinov psy vizualizuj. Nejastji se pouv trifenylmethanov barvivo Coomasie blue nebo barven stbrem. Pohyblivost vtiny polypeptid je za tchto podmnek je pmo mrn logaritmu jejich molekulov hmotnosti.

Kvantifikace purifikanho protokolu fiktivn proteinStupe Celkov Celkov Specifick Vtek Stupe proteiny aktivita aktivita purifikace (mg) (jednotky) (jednotky/mg) (%)

Homogenizace 20000 200000 10 100 1

Vysolovn 5000 150000 30 75 3

Chromatografiena iontomnii 1000 120000120 60 12

Gelov filtrace 100 80 000800 40 80

Afinitn chrom.2 60000 30000 30 3 000

Idealizovan PAGE purifikace fiktivnho proteinu

Stanoven relativn molekulov hmotnosti protein

1. Pomoc SDS-PAGE elektroforzy (objasnno)

2. Ultracentrifugace

3. Hmotnostn spektrometrie

UltracentrifugaceCentrifugace se pouv k oddlen hrubch sms bunnch komponent.

Pi kvantifikaci rychlosti pohybu molekul v roztoku v centrifuganm poli pouvme sedimentan koeficient (s) dle rovnice:s = m(1 nr)/fkde m je hmotnost stice, n je parciln specifick objem (reciprok hodnota hustoty stice), r je hustota mdia, f frikn koeficient (zvis na tvaru molekuly)(1 nr) vyjaduje schopnost prosted nadnet stice

Sedimentan koeficient se obvykle vyjaduje v jednotkch: Svedberg (S); S = 10-13 s. m je hodnota S ni, tm pomaleji stice sedimentuje.

Na tomto principu je zaloena gradientov nebo jinak zonln centrifugace vedouc k oddlen stic na zklad hodnoty jejich sedimentanch koeficient.

Hmotnost protein me bt stanovena pmo z tzv. sedimentan rovnovhy pi kter se stice centrifuguj nzkou rychlost, tak, e sedimentace je v rovnovze s difz.

Metoda je pomrn pesn a na rozdl od SDS-PAGE nedenaturan pi zachovn kvartrn struktury.

Hodnoty S (Svedberg = 10-13 s) a molekulov hmotnosti nkterch protein Protein Hodnota SMolekulov hmotnostCytochrom c 1, 8312310Myoglobin 1, 9717800Trypsin2, 5023200Maltdehydrogenasa5, 7674 900Lakttdehydrogenasa 7, 54 146 200

MALDI-TOF MS(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time-of Flight-Mass Spectrometry) Princip metody: Proteinov vzorek je smchn s matric - tvorba krystal Krystaly vystaveny laserovmu paprsku vznik nabitch iont proteinu Ionty analyzovny v analyztoru doby letu (t (m/z)1/2)

MATRICE PRO MALDI organick ltky zajiujc ionizaci ltek

MALDI-TOF MS(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time-of Flight-Mass Spectrometry)Mr=66350Hovz srov albumin

Strukturn typy protein

1. Primrn struktura = sekvence aminokyselin (shodn s peptidy).2. Periodick sekundrn struktury: a-helix a beta skldan list, otoky a smyky. 3. Tercirn struktura.4. Kvartrn struktura.

Ad 2.Pauling Linus a Corey Robert postulovali v roce 1951 dv periodick struktury a-helix a beta skldan list. Pozdji byly objeveny dal, sice neperiodick, ale veobecn se vyskytujc beta otoka a omega smyka.

Charakteristika a-helixuHelikln struktura roubovice udrovan vodkovmi vazbami. Jeden zvit tvo 3, 6 aminokyselinovch zbytk a obsahuje 13 atom, ponaje kyslkem po vodk vodkov vazby. Proto oznaen: 3,613 helix. Kad aminokyselinov zbytek reprezentuje 0,15 nm. Celkov dlka zvitu je 0,15 x 3, 6 = 0,54 nm. Vedlej skupiny aminokyselin (R) smuj ven ze roubovice. Kad peptidov karbonyl je vzn vodkovou vazbou na vzdlenou NH skupinu etzce (i + 4). Vechny vodkov vazby jsou paraleln s osou roubovice. a-helix takto definovan m: f = - 60y v rozmez 45 a 50

Peptidov vazba je vzhledem k polarizaci skupin NH a CO dipl. Diplem je tak cel peptid s pozitivnm nbojem na N konci a negativnm na C konci. Pi pohledu shora na roubovici je smr vinut shodn se smrem chodu hodinovch ruiek a-helix pravotoiv.

Schematick znzornn a-helixu

Vodkov vazby v a-helixu. Skupina CO n-t aminokyseliny tvo vodkovou vazbu s NH skupinou aminokyseliny n + 4.

A)Stukov znzornn s a-uhlky a vedlejmi skupinami aminokyselin. B) Bon kulikov model znzoruje vodkov vazby. C) Pohled shora. D) Kalotov model.

Znzornn a-helikln struktury.Konkrtn protein je tvoen svazkem a-helix.

Charakteristika b-skldanho listu Struktura dostala nzev podle poad ve kterm byla popsna.

Stricky jsou ob formy beta listu daleko volnj. Vzdlenost mezi sousednmi aminokyselinami je 3,5 , zatmco u helixu jen 1,5.

Vedlej etzce sousednch aminokyselin smuj na opan strany.

Beta list je tvoen spojenm dvou nebo vce beta etzc vodkovmi vazbami. Sousedn etzce mohou jt proti sob antiparaleln, nebo soubn paraleln.

V ppad antiparalelnho beta listu jsou NH a CO skupiny kad aminokyseliny spojeny vodkovou vazbou s CO a NH skupinami partnerskho etzce pmo.

V paraleln struktue je vazba NH skupiny aminokyseliny jednoho etzce na CO skupinu aminokyseliny sousednho etzce posunuta.

Struktura beta listu.Vedlej skupiny (zelen) sousednch aminokyselin smuj na opanou stranu.

Antiparaleln beta list

Paraleln beta list

Schematick model beta listu

Proteiny obsahuj zptn kliky (beta kliky nebo vlsenkov ohyby). Obvykle je CO skupina i-t aminokyseliny vzna vodkovou vazbou s aminokyselinou i + 3. Nazvaj se tak omega smyka.

Tercirn strukturaTrozmrn struktura, obvykle funknho proteinu. Sloena z domn - a-helikln, beta listu a smyek. Nap. myoglobin obsahuje neproteinovou sloku hem (prosthetick skupina). Vce ne 70 % hlavnho etzce myoglobinu je sloeno z 8 a-helix a zbytek tvo smyky mezi helixy.

Kvartern strukturaKvartern struktura vznik sdruenm polypeptidovch etzc (obvykle kvarternch struktur) do multipodjednotkov struktury.

Mohou tak vznikat dimery, tetramery atd. Podjednotky mohou bt shodn homomery nebo rzn heteromery.

Pkladem je hemoglobin, kter m kvartern strukturu sloenou ze ty podjednotek. Dvou a a dvou b. Hemoglobin existuje jako a2b2 teramer.

Tvorba kvartern struktury hemoglobinu m vznam a funkci pi penosu kyslku z plic do tkn. Pozdji porovnme rozdl mezi penosovou schopnost svalovho myoglobinu a krevnho hemoglobinu.

Tetramer a2b2 lidskho hemoglobinu. Dv identick podjednotky a (erven) a dv identick podjednotky b (lut). Molekula obsahu tyi skupiny hemu.

Principy uren trozmrn struktury protein pomocNMR spektroskopie a rentgenov krystalografie. Nuklern magnetick resonann spektroskopie uruje strukturu protein v roztoku. Nutn jsou koncentrovan roztoky protein (nap. 1 mM, nebo 15 mg.mL-1 pro 15 kd protein).

Princip: Technika je zaloena na skutenosti, e jdra uritch atom vykazuj magnetick vlastnosti, spin. Obvykle se m protonov spektra nebo spektra 13C. Spiny tchto atomovch jader jsou ovlivovny okolm. Proveden a interpretace vsledk je velmi sloit a pstrojov nron. (1 = 10-8 m) Rentgenostrukturn analza (krystalografie) vyaduje protein v podob monokrystalu, zdroj rentgenovch paprsk a detektor.A) Krystalovat proteiny je velmi nron a sloit zleitost. Nap. myoglobin krystaluje z roztoku 3 M sranu amonnho. B) Zdroj rentgenovho paprsku o vlnov dlce 1,54 se zsk psobenm rychlch elektron na mdnou destiku. C) Paprsek prochzejc rotujcm krystalem vytv difrakn obrazec, kter se zachyt detektorem.Z hustoty a intenzity difraknch stop se sestavuje obrazec trozmrn struktury proteinu.

Do souasnosti je znma struktura vce jak 10 000 protein. Koordinty struktur se shromauj v Protein Data Bank (www.rcsb.org/pdb).

Krystaly myoglobinu

Rentgenov difrakn snmek myoglobinu

st mapy elektronov hustoty myoglobinu hem

Chaotropn ltky chaotropy. Chaotropn ltky ru trozmrnou (3D) strukturu protein a nukleovch kyselin. Destabilizac a ruenm vodkovch vazeb dochz k denaturaci makromolekul.

Moovina v koncentraci od 6 8 Mol/LThiomoovina 2 Mol/LChloristan lithn 4,5 Mol/L Guanidinium chlorid (GndCl)6 Mol/L

Zkladn pojmy imunologieImunologick metody slou k purifikaci protein, jejich lokalizaci v buce a kvantifikaci. Imunologie je zaloena na tvorb protiltky proti specifickmu proteinu. Protiltka (tak imunoglobulin, Ig) je protein syntetizovan ivoichy jako odezva na ptomnost ciz ltky zvan antigen. Tento proces slou jako obrana ivoich ped infekc. Protiltky vyvolvaj tvorbu specifickch antigen. Antigeny mohou bt proteiny, polysacharidy a nukleov kyseliny. Protiltka rozpoznv specifick skupiny aminokyselin na velk molekule antigenu. Toto msto se nazv antigenn determinant nebo epitop.Mal ciz molekuly jako syntetick peptidy mohou tak vyvolvat tvorbu protiltek. Nazvaj se hapteny.

Struktura protiltkyIgG se skld ze ty etzc. Dvou tkch (heavy, H) a dvou lehkch (light, L) spojench disulfidovmi vazbami. Tk a lehk etzce tvo domnu, kter m na koncch vazebn msta pro antigen.

Polyklonln a monoklonln protiltky.Vtina antigen m vce epitop. Polyklonln protiltky jsou proto heterogenn sms protiltek, kde je kad specifick na rzn epitopy antigenu. Monoklonln protiltky jsou vechny identick produkovan klony jednotnch protiltky produkujcch bunk. Rozpoznvaj jeden epitop.

Vyuit tvorby protiltek ke kvantifikaci protein na bzi test ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)A) Nepm ELISA se vyuv k detekci ptomnosti protiltek (nap. k detekci infekce HIV).

Princip: Antigen (virov protein) se nave na stny zkumavky. Pacientovo srum obsahujc protiltky se nech navzat na antigen. Pidaj se specifick protiltky (ivoin) proti lidskm protiltkm obsahujc navzan enzym (kenov peroxidasa). Nakonec se pid substrt enzymu a vyvol se barevn reakce.

B) Sendviov ELISA umouje jak detekci, tak kvantifikaci antigenu.

Princip: Na stny zkumavky se nave protiltka. Po pdavku krevnho sra obsahujcho antigen. Antigen se nave na protiltku. Pidme druhou protiltku proti antigenu na kter je navzn enzym (obvykle kenov peroxidasa). Po pdavku substrtu se objev zbarven mrn mnostv ptomnho antigenu.

Metoda Western blotting umouje detekovat mal mnostv protein gelovou elektroforzou. Po elektroforze se zkopruj proteiny na list polymeru, kde reaguj s radioaktivn protiltkou. Ps odpovdajc proteinu na kter se navzala protiltka se objev na autoradiogramu.

Pedmt a obor biochemie Definice: Biochemie studuje biologick objekty chemickmi metodami. Molekulrn rove. Etapy vvoje biochemie: A) Biochemie statick een struktur biologickch objekt (proteiny, sacharidy, lipidy,.)B ) Biochemie dynamick metabolismus (intermedirn metabolismus). Studium reakc a vzjemnch vztah slouenin v rmci buky a celho organismu (bazln metabolismus). Pevratn role enzym. C) Penos informace, regulace metabolickch pochod. Odtpen Molekulrn biochemie, molekulrn genetiky.

Vztah a souvislost biochemie s ostatnmi chemickmi, biologickmi a medicnskmi obory. ChemieAnorganick chemie (Bioanorganick chemie)Organick chemieFyzikln chemieAnalytick chemieBiologieBiologie bukyFyziologie (bakteriln, sav, rostlinn, obecn ivoin, atd.) Genetika Biochemie podle pedmtu zkoumn: Lkask, klinick, potravinsk, atd.

Koeny biochemieF. Whler 1828 syntza mooviny z anorganickch ltekBrati Eduard a Hans Buchnerov 1897 bezbunn extrakt z kvasinek katalyzuje fermentaci (reakce in vitro.).J. B. Sumner -1926 krystaluje enzym ureasu, protein z lutniny Canavalia ensiformis Souasn rozvoj biologie bukyHistorick pohled na lohu deoxyribonukleov kyseliny (DNA) v buceObjev 1869 F. Miescher; 1953 James Watson a Francis Crick struktura DNA start molekulrn biologie.

Friedrich Whler (31. ervenec 1800 Eschersheim u Frankfurtu 23. z 1882 Gttingen)

Friedrich WhlerFriedrich Whler (31. ervenec 1800 Eschersheim u Frankfurtu 23. z 1882 Gttingen) byl vznamn nmeck chemik, znm hlavn svou syntzou mooviny.V roce 1823 dokonil sv studia medicny v Heildebergu a dky Leopoldu Gmelinovi (tamnm profesor chemie, biologie a objevitel kyanoelezitanu draselnho) potom psobil pod Jnsem Jacobem Berzeliem (vdsk anorganick chemik, pedstavitel vitalistick teorie) ve Stockholmu. Nsledn pracoval a vyuoval chemii na polytechnice v Berln (konkrtn od 1825 do 1831). Potom byl a do roku 1836 umstn na vy polytechnickou kolu v Casselu a pozdji se stal profesorem chemie na Univerzit v Gttingenu (Georgia Augusta University of Gttingen), kde pracoval a do sv smrti.Nejvt vznam m Whlerova prce v oblasti organick chemie, roku 1828 se mu podailo syntetizovat zahvnm kyanatanu amonnho moovinu, ltku pomoc n vyluuj savci ze svho tla nepotebn dusk, co je dnes povaovno za milnk konce vitalistickch pedstav. V tehdej dob pevldal nzor oznaovan jako vitalismus, kter tvrdil, e ke vzniku organickch ltek je teba jaksi vitln sla (lat. vis vitalis, fran. lan vital) a nelze je z tohoto dvodu umle pipravit v laboratoi. Mezi zastnce tto teorie patili Jns Jacob Berzelius a francouzsk chemik Gerhardt. Berzelius tento nzor vyslovil ve svm dle z roku 1807 a jako prvn se pokusil shrnout tehdej poznatky a vysvtlit odlinosti ltek izolovanch z iv prody. Vitalistick teorie byla v souladu s tehdejm pevldajcm nzorem, v nm dominovala crkevn ideologie a lidskmu poznn nedostupn sly. Ale ji v roce 1783 se Scheelemu podailo pipravit kyanovodk a Gay-lussacovi dikyan, z nho pak Whler pipravil roku 1824 kyselinu avelovou v podstat lze ct, e

syntetizovat organick ltky bylo mon ji ped Whlerovou syntzou mooviny, a tak se vitalist museli brnit proti kadmu experimentu, kter prokazoval nesprvnost jejich teorie. Po Whlerov spchu se dokonce uchlili k tvrzen, e moovinu nelze povaovat za pravou organickou sloueninu, jeliko jde jen o odpadn produkt ivho organismu. Nicmn ani sm Whler, kter sice pipisoval syntze mooviny znan vznam, ale sp dky skutenosti, e lo o syntzu organick sloueniny z anorganick ltky, ji nepovaoval za dostaten argument vyvracejc platnost vitalistick teorie. Ke konenmu odmtnut vitalistick teorie tak dolo pozdji v dsledku syntz dalch organickch slouenin jako byla nap. syntza kyseliny octov proveden Kolbem roku 1845 nebo Berthelotovy syntzy methanu, kyseliny mraven, ethynu a benzenu bhem let 1855 a 1867.Zjitnm, e kyanatan amonn se me pemnit na moovinu vnitn zmnou struktury atom bez zmny hmotnosti, Whler prokzal jeden z prvnch a nejlepch pklad izomerie. Dva roky po syntze mooviny, v roce 1830, Whler publikuje spolen s Justem von Liebigem vsledky vzkumu o kyselin kyanurov, kyanat a moovin. Berzelius ji ve sv zprv pro Krlovskou vdskou akademii vd shledal nejvznamnjm vzkumem toho roku. Vsledky byly na tehdej dobu trochu neekan a podaly dal dkazy ve prospch izomerie.Whler spolu s Liebigem zkoumal tak benzoylov sloueniny. Jejich prce objasnily teorii radikl a substituce v chemickch sloueninch.Whler byl tak spoluobjevitelem beryllia, kemku, karbidu vpnku a mnoha dalch prvk. Za zmnku stoj jeho objev hlinku. Whler ho zskal z oxidu hlinitho, pestoe se ped nm o to sam bez spchu pokoueli Davy, Oerstedt a Berzelius. Dle se mu podailo izolovat yttrium, beryllium a zjistil, e kemk me bt z zskn ve form krystal. V dalch letech pispl svmi pokusy k objevu titanu, vanadu, niobu, tantalu i uranu. Dle uspl pi pokusu zskat ist nikl a se dvma svmi pteli zaloil v Casselu tovrnu na jeho vrobu. Studoval tak chinony, alkaloidy i acetylen.Whler se navc zabval vzkumem meteorit. Provedl analzu mnoha z nich a zjistil, e nkolik z nich obsahuje organick ltky. Vlastnil velmi rozshlou soukromou sbrku meteorit a mnoho let psal o meteoritech pro Jahresbericht der Chemie.

Friedrich WhlerBhem ste u Berzelia ve Stockholmu se Whlerovi podailo pipravit sloueninu kyanatan stbrn. V te dob jeho krajan a pozdji nejlep ptel Liebig pipravil bhem ste v Pai taskavou sloueninu, kterou phodn nazval fulminan stbrn (fulminare je latinsky blskati se). Analzou pak zjistil, e jeho molekula obsahuje stejn poet stejnch atom jako Whlerv kyanatan! Dnes vme, e kyanatan a fulminan (izokyanatan) jsou chemick izomery, tedy sloueniny ze stejnho mnostv a druhu atom, ale jinak uspodanch (prvn m vzorec AgOCN, druh AgNCO). Tehdy to byla zhada.

Friedrich WhlerWhler, v tu dobu ji uitel berlnsk prmyslov koly, se tedy pout do dalho vzkumu svch kyanatan stbrnch a sna se z nich velijak vyrobit Liebigv taskav izomer. Kdy se potkem roku 1828 pokou z kyanatanu stbrnho a chloridu amonnho zskat kyanatan amonn, zskv zcela mu nepodobn tpytiv bl krystalky, ve kterch identifikuje svou starou znmou z dob studi - moovinu... Vida, ze sloueniny anorganick vznikla ltka organick !

Souasnost a budoucnost Konstrukce prvn knihy ivota.V noru 2008 americk biochemik Craig Venter oznmil, e se jeho tmu (pti stovkm pikovch odbornk) podailo syntetizovat genom, tedy kompletn ddinou informaci bakterie Mycoplasma genitalium. Genom tohoto jednoduchho organismu obsahuje asi 580 000 psmen genetickho kdu, kad z tchto psmen (nukleotid) sestv ze esti molekul (ty organickch a dvou anorganickch). Jak to venterovci dokzali? Samo sebou naped ten genom dkladn peetli. Pak syntetizovali z jednotlivch nukleotid lnky dlouh asi 6 000 psmen. Ty potom spojovali ve stle del etzce, a dostali tyi u dlouh seky DNA. Ty vnesli do tla kvasinky, kter je zkompletovala v pln, ale uml genom mykoplazmy. Dalm Venterovm clem - prozatm - zejm bude vytvoit v prod se nevyskytujc mikroorganismy. S lovku uitenmi vlastnostmi - tyto uml bakterie budou teba rozkldat vodu na vodk a kyslk nebo zkvaovat biologick odpad na butylalkohol k pohonu spalovacch motor.

J. Craig Venter (born John Craig Venter October 14, 1946, Salt Lake City, Utah) Venter is currently the president of the J. Craig Venter Institute, which conducts research in synthetic biology. In June 2005, he co-founded Synthetic Genomics, a firm dedicated to using modified microorganisms to produce clean fuels and biochemicals. In July 2009, ExxonMobil announced a $600 million collaboration with Synthetic Genomics to research and develop next-generation biofuels. Venter used his sloop (lun arodj II), Sorcerer II, in the Global Ocean Sampling Expedition to help assess genetic diversity in marine microbial communities.