Inovace studia biochemie prostřednictvím e-learningu CZ.04.1.03/3.2.15.3/0407

Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

Základy biochemie KBC/BCH

Fotosyntéza

Osnova

• Úvod

• Chloroplasty

• Světlo absorbující pigmenty

• Světelná reakce

• Calvinův - Bensonův cyklus (RUBISCO)

• Fotorespirace

• Rostliny C4 a CAM

Fotosyntéza - úvod

• Fotosyntéza fixuje ročně asi 1011 tun uhlíku, což reprezentuje 1018 kJ energie.

• Fotosyntéza u rostlin je dvoustupňový proces, při kterém se světelná energie využívá k oxidaci H2O:

2 H2O O2 + 4 [ H·]

• Současně získané elektrony se využívají k redukci CO2:

4 [ H·] + CO2 (CH2O) + H2O

• Dva stupně fostosyntézy se tradičně uvádí jako světelná fáze a temnostní fáze.

• Místem fotosyntézy u eukaryot (vyšší rostliny a řasy) jsou chloroplasty. Buňky obsahují 1 až 1000 chloroplastů tvaru elipsoidu o rozměrech asi 5 m délky.

Chloroplast kukuřice

Vnì jšímembrána

Lamela

Vnitønímembrána

Mezimembránový prostor

Grana

Stroma Prostorthylakoidu

Fotosyntetizující cyanobakterie Anabaena (zvětšení 450 x). Předkové, kteří se evolučně přetvořili na současné

chloroplasty.

Světlo absorbující pigmenty

• Chlorofyl - cyklický tetrapyrrol s centrálním atomem Mg2+. Prekurzorem je stejně jako u hemu protoporfyrin IX.

• Hlavní formy chlorofylu u rostlin a cyanobakterií jsou: chlorofyl a (Chl a) a chlorofyl b (Chl b), u fotosyntetizujících bakterií jsou to bakteriochlorofyl a (BChl a) a bakteriochlorofyl b (BChl b).

• Chlorofyly jako vysoce konjugované sloučeniny silně absorbují viditelné světlo. Malé rozdíly v chemické struktuře silně ovlivňují jejich spektra.

• Fotosystémy I a II, obsahující mimo jiné chlorofyly, jsou lokalizovány v thylakoidní membráně chloroplastů.

• Fotosystém I (PS 700) je transmembránový multipodjednotkový komplex (10), absorbuje světlo kratší vlnové délky než 700 nm. Vytváří NADPH.

• Fotosystém II (PS 680), transmembránový komplex 20 podjednotek, přenos elektronů z vody na plastochinon (plastochinol). Absorbuje světlo vlnových délek kratších než 680 nm.

• Cytochrom bf (obdoba komplexu III mitochondrií!!!). Cytochrom bf generuje protonový gradient přes thylakoidní membránu, což vede ke tvorbě ATP.

Struktury chlorofylů

34I

Chlorofyl

- -

(Fe- protoporfyrin I X)

N

N+

N

N

+

CH2

CH2

COO

CH2

CH2

COO

CH3

CH CH2

CH3CH

CH2

CH3

CH3

Fe2+

I I

I I II V

V

N

N+

N

N

+

CH3

R3

R2R1

CH3

CH3

OC

O

CH3

O

C

O

CH2

CH2

O

R4

Mg2+

Chlorofyl a

Chlorofyl b

Bakteriochlorofyl b

Bakteriochlorofyl a

R1 R2 R3 R4

CH CH2

CH CH2

CH3 CH2 CH3

CH2 CH3C H

O

C CH3

O

C CH3

OCH3

CH3

a

a

CH2 CH3

CH CH3

a

a

P

P

P nebo G

P

znaèí, že mezi C3 a C4 se nevyskytuje dvojná vazba.a

CH2

CH2

P

G

Fytylový postranní øetì zec

Geranylový postranní øetì zec

=

=

Absorpční spektrum chlorofylu a

Absorpční spektra různých fotosyntetických pigmentů

400 500 600 700

Abso

rban

ce

Chlorofyl a

Chlorofyl b

Karotenoidy

Fykoerythrin

Fykocyanin

Sluneèní spektrum

Vlnová délka (nm)

Světlosběrné komplexy

• Světlosběrné komplexy obsahují fotosyntetická reakční centra – místa, kde se odehrává primární reakce světelné fáze fotosyntézy a anténní komplex obsahující další chlorofyly a přídavné pigmenty jako jsou karotenoidy, např. -karoten.

- Karoten

CH3 CH3CH3CH3

CH3

CH3CH3CH3 CH3

CH3

Fotosyntetický anténní komplex. Zachycené fotony náhodně migrují anténním komplexem až vstoupí do reakčního centra (tmavě

zelené).

Foton

Foton

Foton

Foton

Světelné reakce

• Elektrony excitovaná molekula může uvolnit excitační energii několika způsoby:

• a)Vnitřní konverze – na kinetickou energii, pohyb molekul, teplo. U molekul chlorofylu k těmto stavům nedochází.

• b)Fluorescence, je emitován foton o vyšší vlnové délce (nižší energie). U rostlin jen asi 3 až 6 % absorbované světelné energie.

• c)Excitační transfer, excitovaná molekula přenáší excitační energii na sousední molekuly chlorofylu s nižší excitační energií než anténní chlorofyly.

• d)Fotooxidace, světlem excitovaná donorová molekula je oxidována přenosem elektronu na akceptorovou molekulu. Takovým donorem je excitovaný chlorofyl. Fotooxidovaný chlorofyl, kationtový radikál, se vrací do původního stavu oxidací jiné molekuly.

Reakční centrum

• Fotoindukované oddělení nábojů probíhá v reakčním centru.

• Elektrony extrahované z počáteční sloučeniny jsou excitované a představují redukční sílu – mohou redukovat další sloučeniny a skladovat tak světelnou energii ve formě chemických sloučenin.

Dutina thylakoidu

Stroma

Specifický párchlorofylů

Manganové centrum

D1D2

Struktura fostosystému II. D1 a D2 podjednotky (32kd) navázány dva chlorofyly (speciální, také P680)-přenos elektronů na feofytin, poté na plastochinony. Feofytin–

chlorofyl se dvěma H+ namísto centrálního Mg2+. Celková reakce: 2 Q + 2 H2O O2 + 2 QH2

Struktura fotosystému I. Dvě podjednotky psaA a psaB jsou žlutě a části obdobné PS II jsou červeně a modře, chlorofyly

včetně speciálního páru zeleně, vyznačeny klastry Fe-S.

Dutina thylakoidu

Stroma

4Fe-4Sklastry

Specifický párchlorofylů

Pohled shora

Dva fotosystémy

CYTOCHROM

b6f

PS I I PS I

NADP+ +NADPH

e-

H2O O

2

SVÌ TLO (<680 nm)

SVÌ TLO (<700 nm)

Fotolýza vody – tvorba kyslíku

• Součástí PS II (P680, fotosystém II) je centrum uvolňující kyslík (oxygen evolving center - OEC).

• V tomto komplexním útvaru dochází působením světelných kvant (fotonů) k rozkladu molekul vody na kyslík, čtyři protony a čtyři elektrony.

2 H2O O2 + 4 H+ + 4 e-

• Elektrony uvolněné z vody vstupují do PSII, kde jsou světelnými kvanty uvedeny excitací do vyšších energetických hladin označený P680* a posléze putují řetězcem přes QH2.

Pravděpodobné schéma uvolnění kyslíku ze dvou molekul vody v Mn centru

Hlavní roli hrají 4 ionty Mn v různém oxidačním stavu, vážící silně kyslíkaté sloučeniny, jeden Ca2+ a Cl-.

S0 až S4 – vždy jednoelektronová oxidace – elektrony vstupují do PSII. .

OO

Mn2+

Mn3+O

+

H

Cl+

O+

H

H

Ca

O+

H

H

O

O

Mn4+

Mn4+

OO

S0

OO

Mn3+

Mn3+O

Cl+

O+

H

H

Ca

O+

H

H

O

O

Mn4+

Mn4+

OO

S1

e- , H+

Pravděpodobné schéma uvolnění kyslíku v Mn centru

OO

Mn3+

Mn4+O

Cl+

O+

H

H

Ca

O+

H

H

O

O

Mn4+

Mn4+

OO

S2

e-

OO

Mn3+

Mn3+O

Cl+

O+

H

H

Ca

O+

H

H

O

O

Mn4+

Mn4+

OO

S1

Pravděpodobné schéma uvolnění kyslíku v Mn centru

OO

Mn3+

Mn4+O

Cl+

O+

H

Ca

O+

H

H

O

O

Mn4+

Mn4+

OO

H

S2

OO

Mn4+

Mn4+O

Cl+

O

H

Ca

O+

H

H

O

O

Mn4+

Mn4+

OO

S3

e- , H+

Pravděpodobné schéma uvolnění kyslíku v Mn centru

OO

Mn4+

Mn4+O

Cl+

O

H

Ca

O H

H

O

O

Mn4+

Mn4+

OO

S3

OO

Mn5+

Mn4+O

+

Cl+

OCa

O+

H

H

O

O

Mn4+

Mn4+

OO

S4

e- , H+

Pravděpodobné schéma uvolnění kyslíku v Mn centru

H+

S4

OO

Mn5+

Mn4+O

+

Cl+

OCa

O+

H

H

O

O

Mn4+

Mn4+

OO

S4

OO

Mn5+

Mn4+O

+

Cl+

OCa

H

O

O

Mn4+

Mn4+

OO

O

Pravděpodobné schéma uvolnění kyslíku v Mn centru K uvolnění O2 je nutná oxidace 2 H20.

02

S4

OO

Mn5+

Mn4+O

+

Cl+

OCa

H

O

O

Mn4+

Mn4+

OO

O

OO

Mn2+

Mn3+O

+

H

Cl+

O+

H

H

Ca

O+

H

H

O

O

Mn4+

Mn4+

OO

S0

2 H20

Plastochinon (Q) – plastochinol (QH2) (n = 6-10)

Plastochinon

CH3

CH3

O

H

CH2

O

CH C CH2 H

CH3

n

Plastochinol

CH3

CH3

OH

H

CH2

OH

CH C CH2 H

CH3

n

2[H ]

Z-schéma světelné fáze fotosyntézy • Elektrony mohou dosáhnout na ferredoxin-NADP+reduktasu (FNR),

která katalyzuje redukci NADP+.

• Oxidace vody a tok elektronů přes Q cyklus generuje transmembránový protonový gradient s vyšší koncentrací protonů na straně thylakoidní dutiny (lumen - uvnitř). Energie gradientu se uplatňuje při tvorbě ATP.

• Různé prosthetické skupiny fotosyntetického aparátu rostlin mohou být seřazeny podle redukčního potenciálu v diagramu zvaném Z-schéma.

• Elektrony uvolněné z P680 po absorpci fotonů jsou nahrazovány elektrony z fotolýzy vody. Každý elektron prochází řetězcem přenašečů do hotovosti plastochinonových molekul. Vytvořený redukovaný plastochinol redukuje cytochrom b6f komplex za současného transportu protonů do thylakoidů. Cytochrom b6f přenáší elektrony na plastocyanin (PC) a ten regeneruje fotooxidovaný P700 v PSI. Elektrony emitované z PSI redukují přes řetězec přenašečů NADP+ na NADPH. Necyklický proces. V cyklickém procesu se elektrony vrací zpět na cytochrom b6f a přitom se přenášejí další protony do thylakoidu.

- 1.2

- 0.8

- 0.4

0

+0.4

+1.2

+0.8

°´(V)

- 1.4

- 1.0

- 0.6

- 0.2

+0.2

+1.0

+0.62 H

2O

O2 + 4 H+

P680

(thylakoid)

P680*

S0

S4

Z

Manganový komplex

e-

h

cyt b6

cyt f

Q

[4Fe- 4S]

Cytochrom b6f

PSI I

8 H+

(thylakoid)

8 H+

(stroma)

QPOOL

Chl a

Pheo a

QA

QB

PSI

PCP700

P700*A

0A

1

FX

FA

FB

Fd

e-

h

Cyklická cesta

Necyklická cesta

2 NADP+ + 2 H+

2 NADPH

FNR(stroma)

Diagram Z-schéma

Cytochrom b6f komplex a plastocyanin (PC)

• Cytochrom b6f komplex je integrální membránový proteinový komplex obsahující řadu složek analogicky jako např. mitochondriální komplex III a cytochrom bc1. Elektrony z cytochrom b6f komplexu putují Q cyklem (viz mitochondrie!!). Při transportu jednoho elektronu se translokují dva protony do thylakoidu. Tedy čtyři elektrony z 2 H2O vedou k translokaci 8 protonů.

• Plastocyanin (PC) – periferní membránový protein (99 aminokyselin) - člen skupiny modrých měďnatých proteinů lokalizovaný na vnitřní straně thylakoidů. Oxidační stavy redoxních center cyklují mezi Cu2+ a Cu+ stavy.

Lokalizace systémů PSII, PSI, cytochromu b6f a ATP-synthasy

na thylakoidech

ATP- synthasa

Cytochrom b6f

Fotosystém PSI

Fotosystém PSI I

Pøevrstvená membrána (granum)

Volná membrána (stromatální lamela)

Lokalizace systémů PSII, PSI, cytochromu b6f a ATP-synthasy

• PSI se nachází na neuzavřených stromatálních lamelách v dotyku se stromatem, kde je k dosažení NADP+.

• PSII je lokalizován většinou mezi uzavřenými složenými grany, mimo přímý kontakt se stromatem.

• Cytochrom b6f je rovnoměrně distribuován v celé membráně.

• ATPasa je lokalizována na vnější straně membrány.

Směr protonového gradientu fotosystému II

2 Q2

Stroma (vysoké pH)

2 QH2

4 H+

2 H2O O

2 + 4 H+

Lumen thylakoidu (nízké pH)

Cytochrom bf V každém Q cyklu jsou přes cytochrom bf transportovány 4 protony. 1. část: QH2 + 2 Pc(Cu2+) = Q + 2 Pc (Cu+) + 2 H+ (v thylakoidu)2. část: Cyt.bf (redukuje) + Q (z poolu) = QH2 (protony ze stromatu) Po reoxidaci QH2 se protony uvolní do thylakoidu.

Q2

QH2

4 H+

2 Pcox

2 Pcred

2 H+

Jagedorfův pokus. Syntéza ATP jako důsledek pH gradientu.

Náhlá zmì na externího pH

a pøídavek ADP a Pi

pH 7

pH 4

Membrána thylakoidu

pH 4

pH 4

pH 4 H+

pH 8

Inkubace po dobu nì kolika hodin

ATP

ADP + Pi

Srovnání fotosyntézy a oxidativní fosforylaceFOTOSYNTÉZA

Q2

QH2

Q2

H+ H+

2 H2O O

2Pc

ox Pc

redPc

ox H+

ADP + Pi

NADP+ NADPH

ATP + H2O

H+

SVÌ TLO (<700 nm)

Q2

Q2

H+ H+

H+

ADP

+ Pi

OXIDATIVNÍ FOSFORYLACE

ATP

+ H2O

O2 2 H

2O

H+

Cyt cox

Cyt cred

Cyt cox

QH2

NADH NAD+

Fotosystém I využívá světelnou energii k tvorbě redukovaného ferredoxinu – silného redukčního činidla

(obsahuje 2Fe-2S).Elektrony jsou přenášeny na ferredoxin-NADP

reduktasu.

Tok elektronů fotosystémem I na ferredoxin. Pozitivní náboj P700 se doplňuje elektrony z plastocyaninu

Ferredoxin

4Fe- 4S

Chinon (A1)

Chlorofyl (A0)

P700

Plastocyanin

Dráha elektronů z vody na NADP+ při fotosyntéze

- 1.0

+1.0

RED

UKÈN

Í PO

TEN

CIÁ

L (V

)

0

H2O

P680

P680*

FOTOSYSTÉM I I

P700

P700*

A0

Manganový komplex

Foton 1

QB

QA

Ph

PC

Cytochrom b6f

Foton 2

A1

Fd

4Fe- 4S

NADPH

FOTOSYSTÉM I

Fd- NADP+

reduktasa

Struktura ferredoxin-NADP+reduktasy

Vazebné místo NADP+

Flavin

Ferredoxin

Ferredoxin NADP+reduktasa - mechanismus

FADHFAD

Fdox

H+ + Fdred

FADH2

Fdox

H+ + Fdred

Semichinonová forma

NADPH + H+ NADP+

Energetický výtěžek světelné (primární) fáze fotosyntézy

• Absorpce 4 fotonů PSII generuje 1 molekulu O2 a uvolní se 4 protony do dutiny thylakoidu.

• Dvě molekuly plastochinolu jsou oxidovány komplexem bf za uvolnění 8 protonů do dutiny thylakoidu (lumen).

• Elektrony ze 4 molekul redukovaného plastocyaninu jsou za účasti dalších 4 absorbovaných fotonů předány na ferredoxin.

• Čtyři molekuly redukovaného ferredoxinu generují 2 molekuly NADPH.

• Celková reakce tvorby NADPH:

• 2 H2O + 12 NADP+ + 10 H+stroma = O2 + 12 NADPH + 12 H+

lumen

• Dvanáct protonů v lumen vstupuje do cATPsynthasy (chloroplastová). Tvoří se celkem 3 molekuly ATP.

• Celková reakce fotofosforylace:

• 2 H2O + 12 NADP+ + 10 H+stroma = O2 + 12 NADPH + 12 H+

lumen

• 3 ADP3- + 3 Pi2- + 3 H+ + 12 H+

lumen = 3 ATP4- + 3 H2O + 12 H+stroma

• 2 NADP+ + 3 ADP + 3 Pi + H+ = O2 + 2 NADPH + 3 ATP + H2O

Cyklická fotofosforylace

• Cyklická fotofosforylace je alternativní drahou fotosyntézy.• Elektrony redukovaného ferredoxinu mohou být převedeny

na cytochrom bf komplex namísto na NADP+. • Elektrony prochází zpět bf komplexem, redukují plastocyanin,

který je posléze reoxidován P700+. Cyklus se uzavírá. • Výsledkem je pumpování protonů komplexem bf. Vzniklý

protonový gradient pohání syntézu ATP. • Tvoří se jen ATP a ne NADPH! Proces je aktivní za situace,

kdy je nadbytek NADPH, prakticky nedostatek NADP+. • Cyklická fotofosforylace je ve smyslu zisku ATP produktivnější

než necyklická. Dva absorbované fotony poskytují 1 molekulu ATP, kdežto při necyklické je třeba na 3 ATP 8 fotonů.

• Na procesu se nepodílí fotosystém II, netvoří se kyslík fotolýzou vody.

Temnostní (sekundární) fáze fotosyntézy Calvin – Bensonův cyklus

• Metabolická dráha, ve které rostliny inkorporují CO2 a tvoří sacharidy, byla objasněna mezi léty 1946 až 1953 M. Calvinem a A. Bensonem.

• Pracovali s buňkami řas a zkoumali produkty vstupu značeného 14CO2. Analýzou buněk řas po 5 s po expozici značeným 14CO2 zjistili, že jediným produktem je 3-fosfoglycerát (3PG) s označeným karboxylem.

• Dále zjistili, že akceptorem CO2 je pentosa – ribulosa-1,5-bisfosfát a enzymem podílejícím se na reakci je ribulosa-1,5-bisfosfátkarboxylasa (RUBISCO).

• Calvin-Bensonův cyklus probíhá ve stromatu chloroplastů a lze ho rozdělit na dvě části:

• Produkční – ve které tři molekuly ribulosa-1,5-bisfosfát reagují se třemi molekulami CO2 za tvorby šesti molekul glyceraldehyd-3-fosfátu (GAP) za spotřeby 9 molekul ATP a 6 molekul NADPH. Cyklický charakter procesu činí dráhu ekvivalentní tvorbě jedné molekuly GAP ze tří molekul CO2. GAP se může využít k biosyntéze.

• Regenerační – ve které uhlíkové atomy zbylých pěti GAP jsou přeměněny v procesu podobném pentosafosfátové dráze na tři ribulosa-5-fosfáty, které proces zahajovaly.

Dráha elektronů z vody na NADP+ při fotosyntéze

- 1.0

+1.0

RED

UKÈN

Í PO

TEN

CIÁ

L (V

)

0

H2O

P680

P680*

FOTOSYSTÉM I I

P700

P700*

A0

Manganový komplex

Foton 1

QB

QA

Ph

PC

Cytochrom b6f

Foton 2

A1

Fd

4Fe- 4S

NADPH

FOTOSYSTÉM I

Fd- NADP+

reduktasa

Fosforylce tří ribulosa-5-fosfátů, vstup tří CO2-karboxylace (RUBISCO), tvorba šesti 3-fosfoglycerátů a šesti 1,3 -

bisfosfoglycerátů

OHCH

C

CH2

OHH

C O

CH2OH

OPO32-

Ribulosa- 5- fosfát(Ru- 5- P)

OHCH

C

CH2

OHH

C O

CH2OH

OPO32-

Ribulosa- 5- fosfát(Ru- 5- P)

OHCH

C

CH2

OHH

C O

CH2OPO3

OPO32-

Ribulosa- 1,5- bisfosfát(Ru- 1,5- BP)

2-

ATP ADP

Fosforibulosakinasa Ribulosabisfosfát karboxylasa

RUBI SCO OHCH

C

CH2

OO-

OPO32-

3- Fosfoglycerát(3- PG)

CO2

OC

O-

C

CH2OPO3

OHH

2-

+Fosfoglycerátkinasa

2-

1,3- Bisfosfoglycerát(1,3- BPG)

2-

OHCH

C

CH2

OPO3O

OPO3

ATP ADP

Redukce šesti 1,3-bisfosfoglycerátů na glyceraldehyd-3-fosfát a start regenerační

fázeGlyceraldehyd- 3- fosfát

dehydrogenasa2-

Glyceraldehyd- 3- fosfát(GAP)

OHCH

C

CH2

OH

OPO3

NADPH NADP+ + H+

2-

1,3- Bisfosfoglycerát(1,3- BPG)

2-

OHCH

C

CH2

OPO3O

OPO3

2-

Dihydroxyacetonfosfát(DHAP)

OC

CH2

CH2

OH

OPO3 PRODUKTY

Triosafosfátisomerasa

Aldolasa

OHCH

C

CH2

OHH

C H

C

OPO3

O

CH2OPO3

OH

2-

Fruktosa- 1,6- bisfosfát(F- 1,6- BP)

2-

2-

Erythrosa- 4- fosfát(E- 4- P)

C

C

CH2OPO3

OHH

OHH

C OH

OHCH

C

CH2

OHH

C OH

C

OPO3

OH

C

H

O

CH2OPO3

OH

2-

Sedoheptulosa- 1,7- bisfosfát(S- 1,7- BP)

2-

Aldolasa

Pokračování regenerační fáze

OHCH

C

CH2

OHH

C H

C

OPO3

O

CH2OPO3

OH

2-

Fruktosa- 1,6- bisfosfát(F- 1,6- BP)

2-

OHCH

C

CH2

OHH

C OH

C

OPO3

OH

C

H

O

CH2OPO3

OH

2-

Sedoheptulosa- 1,7- bisfosfát(S- 1,7- BP)

2-

Pi

Fruktosabisfosfatasa

OHCH

C

CH2

OHH

C H

C

OPO3

O

CH2

OH

OH

2-

Fruktosa- 6- fosfát(F- 6- P)

Pi

Sedoheptulosa-bisfosfatasa

OHCH

C

CH2

OHH

C OH

C

OPO3

OH

C

H

O

CH2

OH

OH

2-

Sedoheptulosa- 7- fosfát(S- 7- P)

CH2

C OHH

C H

C O

CH2

OH

OH

OPO3

Xylulosa- 5- fosfát(Xu- 5- P)

2-CH2

C OHH

C OH

C

C

H

OH

OPO3

HOH

Ribosa- 5- fosfát(R- 5- P)

2-

Transketolasa

Transketolasa

Závěr regenerační fáze - tvorba ribulosa-1,5-bisfosfátu

Ribosafosfátisomerasa

CH2

C OHH

C H

C O

CH2

OH

OH

OPO3

Xylulosa- 5- fosfát(Xu- 5- P)

2-CH2

C OHH

C OH

C

C

H

OH

OPO3

HOH

Ribosa- 5- fosfát(R- 5- P)

2-

Fosfopentosaepimerasa

CH2

C OHH

C OH

C

CH2

H

OH

OPO3

HOH

Ribulosa- 5- fosfát(Ru- 5- P)

2-CH2

C OHH

C OH

C

CH2

H

OH

OPO3

HOH

Ribulosa- 5- fosfát(Ru- 5- P)

2-

OHCH

C

CH2

OHH

C O

CH2OPO3

OPO32-

Ribulosa- 1,5- bisfosfát(Ru- 1,5- BP)

2-

ATP ADP

Fosforibulokinasa

Jednotlivé reakce Calvin – Bensonova cyklu

• Osm, z celkového počtu jedenácti reakcí Calvin-Bensonova cyklu, je zvratem glykolýzy nebo reakcí glukoneogeneze známé z

biochemie živočichů.

• Jediné tři reakce z jedenácti jsou katalyzovány enzymy, které se v živočišné říši nevyskytují:

• Fosforibulosakinasa katalyzující tvorbu ribulosa-1,5-bisfosfátu z ribulosa-5-fosfátu.

• Ribulosabisfosfátkarboxylasa katalyzující vstup CO2 do sacharidu.

• Sedoheptulosabisfosfatasa (SBPasa) katalyzující odštěpení fosfátu ze sedoheptulosa-1,7-bisfosfátu na sedoheptulosa-7-fosfát.

Ribulosabisfosfátkarboxylasa (RuBP karboxylasa)

• RuBP karboxylasa je nejdůležitější enzym na Zemi. Vyznačuje se nízkou aktivitou (kcat = 3 s-1), ale jeho obsah v zeleném listu přesahuje 50 % všech proteinů. Je tedy i nejrozšířenějším proteinem biosféry.

• RuBPkarboxylasa z vyšších rostlin a většiny fotosyntetických mikroorganismů je složena z osmi velkých podjednotek kódovaných chloroplastovou DNA (L je složena ze 477 aminokyselin) a osmi malých podjednotek (S složených z 123 aminokyselin) kódovaných jadernou DNA.

• K aktivitě RuBP karboxylasa je nutný Mg2+ vázaný na katalyticky významnou karbamátovou skupinu (-NH-COO-), která se vytváří reakcí nesubstrátového CO2 s -aminoskupinou Lys 201.

• Reakci in vivo katalyzuje RuBP karboxylasaaktivasa za spotřeby ATP.

Mechanismus katalýzy ribulosabisfosfátkarboxylasy Reakce je silně exergonní ( Go´= - 35, 1 kJ.mol-1), dáno štěpením 2-oxokyseliny na dva

stabilní 3-fosfoglyceráty.

OHCH

C

CH2

OHH

CO

CH2OPO3

OPO32-

Ribulosa- 1,5- bisfosfát

2-

BENZYM

OHCH

C

CH2

O

CO-

CH2OPO3

OPO3

H

2-

Endiolátová forma

2-

OHCH

C

CH2

O

COH

CH2OPO3

OPO3

COO

2-

2- Oxokyselina

2-

O

C

O

-

H+

OH

H

OHCH

C

CH2

O-

COH

CH2OPO3

OPO3

COO

OH

2-

Hydratovaný meziprodukt

2-

-

OHCH

C

CH2

O

OPO3

O-

2-

+

COH

CH2OPO3

COO

2-

-

3- Fosfoglycerát

H+

COH

CH2OPO3

COO

H

2-

-

3- Fosfoglycerát

Biosyntéza sacharidů

• Celková stechiometrie Calvin-Bensonova cyklu (GAP = glyceraldehyd-3-fosfát)

3 CO2 + 9 ATP + 6 NADPH GAP + 9 ADP + 8 Pi + 6 NADP+

• Vytvořený GAP může být využit k řadě biosyntéz, buď vně nebo uvnitř chloroplastu. Může být převeden na fruktosa-6-fosfát dalším postupem cyklu a poté na glukosa-1-fosfát (G1P) (fosfoglukosaisomerasa a fosfoglukosamutasa).

• G1P je prekurzor všech dalších sacharidů rostlin.

• Hlavní složka škrobu, -amylosa, je syntetizována ve stromatu chloroplastu jako dočasná skladovatelná forma glukosy.

• -Amylosa je také syntetizována jako dlouhodobá skladovatelná forma v jiných částech rostlin jako jsou listy, semena a kořeny.

• Celulosa tvořena dlouhými řetězci (14)-vázanými glukosovými jednotkami je hlavním polysacharidem rostlin. Je syntetizována z UDP-glukos v rostlinné plasmové membráně a vylučována do extracelulárního prostoru.

Syntéza škrobu. Škrob je méně větvený než glykogen. Celkově je reakce poháněna hydrolýzou PPi. Škrob je

syntetizován a skladován v chloroplastech. Aktivní glukosa = ADP-glukosa.

O-

P

O

O-

O P

O

O-

O P

O

O-

ADENOSIN

ATP

O

OOH

OHOH

HOH2C

P

O

O-

O-

Glukosa- 1- fosfát

PPi

2 Pi

Anorganickáfosfatasa

ADP- glukosafosforylasa

O

OOH

OHOH

HOH2C

P

O

O-

O P

O

O-

ADENOSIN

ADP- Glukosa

O

OOH

OHOH

HOH2C

- Amylosa (n jednotek)

O

OOH

OHO

HOH2C

O

OH

OHOH

HOH2C

- Amylosa (n + 1 jednotek)

ADP +Synthasa škrobu

První část syntézy -amylosy Aktivace (fosforylace) glukosa-1-fosfátu.

O-

P

O

O-

O P

O

O-

O P

O

O-

ADENOSIN

ATP

O

OOH

OHOH

HOH2C

P

O

O-

O-

Glukosa- 1- fosfát

PPi

2 Pi

Anorganickáfosfatasa

ADP- glukosafosforylasa

O

OOH

OHOH

HOH2C

P

O

O-

O P

O

O-

ADENOSIN

ADP- Glukosa

Druhá část syntézy -amylosy. Prodlužování řetězce na neredukujícím konci molekuly -

amylasy. Enzym: Synthasa škrobu

O

OOH

OHOH

HOH2C

P

O

O-

O P

O

O-

ADENOSIN

ADP- Glukosa

O

OOH

OHOH

HOH2C

- Amylosa (n jednotek)

O

OOH

OHO

HOH2C

O

OH

OHOH

HOH2C

- Amylosa (n + 1 jednotek)

ADP +Synthasa škrobu

Sacharosa – hlavní transportní sacharid pro nefotosyntetizující buňky - nejdůležitější produkt fotosyntézy

• Sacharosa je syntetizována v cytosolu a proto musí být její dvě komponenty (G3P a DHA) transportovány z chloroplastu systémem antiporter s fosfátem.

• Dvě triosy se kombinují za tvorby fruktosa-6-fosfátu, která se následně převede na glukosa-1-fosfát.

• G1P je aktivován UTP (uridintrifosfát) na UDP-glukosu. Sacharosa-6-fosfát se tvoří za katalýzy enzymem sacharosafosfátsynthasa. Odštěpení fosfátu se uskutečňuje sacharosafosfátfosfatasou.

UDP- Glukosa + Fruktosa- 6- fosfát

UDPSacharosafosfátsynthasa

Sacharosa- 6- fosfát

Pi

Sacharosafosfátfosfatasa

Sacharosa

H2O

Regulace Calvin – Bensonova cyklu

• Kontrolní body každé metabolické dráhy jsou na enzymových stupních vzdálených od rovnováhy (velká negativní hodnota G).

• Enzymy katalyzující reakce s velkou změnou volné energie:

• Ribulosabisfosfátkarboxylasa; G (kJ.mol-1) = - 41, 0• Fruktosabisfosfatasa; G (kJ.mol-1) = - 27, 2• Sedoheptulosabisfosfatasa; G (kJ.mol-1) = - 29, 7

• Katalytická účinnost těchto enzymů je silně ovlivňována osvětlením!!

• Aktivita RUBISCA je ovlivňována těmito dvěma na světle závislými faktory:

• pH . Po osvětlení se zvyšuje pH ve stromatu z hodnoty ≈ 7, 0 na hodnotu ≈ 8, 0. Protony jsou pumpovány ze stromatu do dutin thylakoidů. RUBISCO má ostré pH optimum 8, 0!!

• [Mg2+] Vstup protonů do thylakoidů je kompenzován transportem Mg2+ do stromatu.

Standardní a fyziologické změny volné energie reakcí Calvin-Bensonova cyklu

• Stupeň Enzym Go´ (kJ.mol-1) G (kJ.mol-

1)

• 1. Fosforibulokinasa - 21, 8 - 15, 8• 2. Ribulosabisfosfátkarboxylasa - 35, 1 - 41,0• 3. + 4. Fosfoglycerátkinasa + • glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasa + 18, 0 - 6, 7 • 5. Triosafosfátisomerasa - 7, 5 - 0, 8• 6. Aldolasa - 21, 8 - 1, 7• 7. Fruktosabisfosfatasa - 14,2 - 27,2• 8. Transketolasa + 6, 3 - 3, 8• 9. Aldolasa - 23, 4 - 0, 8 • 10. Sedoheptulosabisfosfatasa - 14,2 - 29,7• 11. Transketolasa + 0, 4 - 5, 9• 12. Fosfopentosaepimerasa + 0, 8 - 0, 4• 13. Ribosafosfátisomerasa + 2, 1 - 0, 4 •

Regulace Calvin – Bensonova cyklu

• Analog přechodového stavu (katalytického mechanismu RUBISCa) 2-karboxyarabinitol-1-fosfát (CA1P). Tuto látku, která inhibuje RUBISCo, syntetizuje řada rostlin pouze za tmy. Blokuje se tak aktivita RUBISCA ve tmě.

• Oba další enzymy jsou také aktivovány zvýšením pH a [Mg2+] . Navíc jsou ovlivňovány NADPH. To je druhý regulační systém závislý na redoxním potenciálu stromatu.

• Thioredoxin, protein obsahující 105 aminokyselin, má redukovatelnou disulfidovou skupinu. Redukovaný thioredoxin aktivuje jak fruktosabisfosfatasu, tak sedoheptulosabisfosfatasu.

• Redoxní hladina thioredoxinu závisí na systému ferredoxin-thioredoxinreduktasy. Jeho redoxní stav závisí na osvětlení.

• Thioredoxin deaktivuje fosfofruktokinasu – klíčový enzym glykolýzy. • Závěr:• Světlo stimuluje Calvin-Bensonův cyklus a deaktivuje glykolýzu,

kdežto tma má opačný efekt.

CA-1-P – inhibitor ribulosabisfosfátkarboxylasy (tma)

2- Karboxyarabinitol- 1- fosfát(CA- 1- P)

OHCH

C

CH2

O

OH

C

CH2

OH COO

OPO32-

-

Thioredoxin je 12-kD oxidoreduktasa - enzym obsahující dithiol-disulfid v aktivním místě, antioxidant) Je přítomen

téměř ve všech organismech – pro život savců je esenciální.

Světlem indukovaná funkce ferredoxin-thioredoxinreduktasy. Redukovaný thioredoxin aktivuje

řadu enzymů Calvinova cyklu.

PSI PSIred*

ox

Ferredoxinox red

Ferredoxin

Ferredoxin- thioredoxin reduktasa

red

SH SH

Ferredoxin- thioredoxin reduktasa

ox

S S

Thioredoxinox red

Thioredoxin

S S SH SH

Bisfosfatasaaktivní

SH SH

inaktivní

S S

Bisfosfatasa

PSIred h

Fotorespirace• Od roku 1960 je známo, že osvětlené rostliny spotřebovávají kyslík

a uvolňují CO2 drahou odlišnou od oxidativní fosforylace.

• Při nízkých hladinách CO2 a vysokých O2 může proces fotorespirace převládnout nad fixací CO2.

• Překvapení: kyslík kompetuje s CO2 jako substrát RUBISCa.

• Přesnější název: ribulosabisfosfátkarboxylasa-oxygenasa (RUBISCO).

• Při oxygenasové reakci se vytváří z RuBP 3-fosfogylcerát a 2-fosfoglykolát. 2-Fosfoglykolát je hydrolyzován na glykolát a ten je oxidován za tvorby CO2 v sérii enzymových reakcí v peroxisomech a mitochondrii.

• Fotorespirace je devastující proces jehož výsledkem je neužitečná spotřeba světlem vytvořeného NADPH a ATP!!

Pravděpodobný mechanismus oxygenasové reakce RUBISCA

OHCH

C

CH2

OHH

CO

CH2OPO3

OPO32-

Ribulosa- 1,5- bisfosfát

2-

BENZYM

OHCH

C

CH2

O

CO-

CH2OPO3

OPO3

H

2-

Endiolátová forma

2-

OHCH

C

CH2

O

COH

CH2OPO3

OPO3

O OH

2-

2- Oxokyselina

2-

O

O

H+

OH

H

OHCH

C

CH2

O-

COH

CH2OPO3

OPO3

O

OH

OH

2-

Hydratovaný meziprodukt

2-

OHCH

C

CH2

O

OPO3

O-

2-

+CO

CH2OPO3

O

2-

3- Fosfoglycerát

H2O

-

2- Fosfoglykolát

Oxygenasová reakce RUBISCA. Chloroplast – peroxisom (glyoxysom)

OHCH

C

CH2

OHH

CO

CH2OPO3

OPO32-

Ribulosa- 1,5- bisfosfát

2-

OHCH

C

CH2

O

OPO3

O-

2-

+ CO

CH2OPO3

O

2-

3- Fosfoglycerát

-

2- Fosfoglykolát

O2

Pi

FosfoglykolátfosfatasaC

O

CH2OH

O-

Glykolát

OHCH

C

CH2

O

OPO3

O-

2-

3- FosfoglycerátCO2

Ribulosa- 1,5- bisfosfátkarboxylasa/oxygenasa

CHLOROPLAST

O2

GlykolátoxidasaC

O

C OH

O-

Glyoxylát

OC

C

CH2

O

OH

O-

Hydroxypyruvát

PEROXI SOM

H2O

21/2 O

2 + H

2O

2Katalasa

NAD+ NADH

HydroxypyruvátreduktasaOHCH

C

CH2

O

OH

O-

GlycerátADP ATP

Glycerátkinasa

Oxygenasová reakce RUBISCA. Peroxisom – mitochondrie

TRANSAMI NACE

CO

CH2 NH3+

O-

Glycin

OC

C

CH2

O

OH

O-

Hydroxypyruvát

PEROXI SOM

NH3

MI TOCHONDRI E

NH3+

CH

C

CH2

O

OH

O-

Serin

CO

C OH

O-

Glyoxylát

CO2

Rostliny C4 koncentrují na povrchu listu CO2.

• Řada rostlin se evolučně přizpůsobila kolísání koncentrace O2 a CO2 tak, že koncentrují ve fotosyntetických buňkách CO2 a zabraňují fotorespiraci. Např. cukrovka, cukrová třtina, kukuřice a mnoho plevelných rostlin. Typické pro tropické oblasti.

• List má charakteristickou anatomii – pod vrstvou buněk tzv. mesofylu jsou soustředěny žilky cévních svazků. V mesofylových buňkách není ribulosabisfosfátkarboxylasa!!

O2

CO2

Prùduch (stoma)

Spodní epidermis

Svrchní epidermis

Kutikula

Palisádový mezofyl

Houbový mezofyl

Xylem

Floem

Cévní svazek

Svì rací buòky

Cyklus C4 – M. Hatch a R. Slack (1960)

• V mesofylu reaguje vstupující CO2 ve formě HCO3- s

fosfoenolpyruvátem za tvorby oxaloacetátu (čtyři uhlíky, proto C4). Oxaloacetát je redukován NADPH na malát, který je transportován do buněk cévních svazků, kde je oxidativně dekarboxylován na CO2, pyruvát a NADPH. Takto koncentrovaný CO2 vstupuje do Calvinova cyklu.

• Pyruvát je transportován zpět do mesofylu, kde je fosforylován za katalýzy pyruvát-fosfátdikinasy za tvorby fosfoenolpyruvátu. Při aktivaci přechází ATP na AMP + PPi. PPi je posléze hydrolyzován všudepřítomnou pyrofosfatasou na 2 x Pi.

• Oxid uhličitý je koncentrován v buňkách cevních svazků na úkor spotřeby 2 ATP/CO2.

• Fotosyntéza C4 rostlin spotřebovává celkem 5 ATP na rozdíl od C3 rostlin, které spotřebují 3 ATP.

Metabolická dráha C4 rostlin. Mezofyl – buňky pochvy cévních svazků

CALVI NÙV CYKLUS

BUÒKA POCHVY CÉVNÍ HO SVAZKU

MEZOFYLOVÁ BUÒKA

VZDUCH

COO

C OPO3

CH2

-

Fosfoenolpyruvát(PEP)

2-

Pyruvátfosfátdikinasa

ATP + Pi

AMP + PPi

2 Pi

Pi

HCO3-

CO2

COO

C O

CH2

COO

-

Oxaloacetát

-

PEP karboxylasa Malátdehydrogenasa

NADP+NADPH

COO

C OH

CH2

COO

H

-

Malát

-

J ableèný enzym

COO

C O

CH3

-

Pyruvát NADP+CO2 + NADPH

3- Fosfoglycerát

Karbonátanhydrasa

CAM rostliny jako varianta rostlin C4

• Dráha byl poprvé popsána u tučnolistých rostlin a odtud název CAM – crassulacean acid metabolism.

• U CAM rostlin je časově oddělen záchyt CO2 a Calvin-Bensonův cyklus.

• CAM rostliny otevírají stomata (póry v listech) v noci a zachycují CO2

drahou C4 ve formě malátu.

• Pro zachycení CO2 je nutné velké množství fosfoenolpyruvátu. To se získává štěpením škrobu a glykolýzou.

• Během dne je malát štěpen za tvorby CO2 vstupujícího do Calvin – Bensonova cyklu a pyruvátu použitého na resyntézu škrobu.

• Celý tento proces je realizován také z důvodu zabránění ztrátě vody!!!

• Stejnou drahou probíhá fotosyntéza u sukulentů.