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ZELLATMUNG

Die Aktivität der mitochondrialen ATP-Synthase ist von der Arbeit der mitochondrialen

Atmungskette abhängig und damit auch vom Sauerstoffverbrauch der Atmungskette.

Gegenstand der Experimente zur Zellatmung ist die Abhängigkeit des mitochondrialen

Sauerstoffverbrauchs von der Oxidation verschiedener Stoffwechselprodukte.

A. BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN

ATP ist in allen Organismen der wichtigste Energieträger. Zur Freisetzung der Energie wird

das ATP im Stoffwechsel in der Regel zu ADP abgebaut, mitunter auch zu AMP. Das ATP

kann dann auf verschiedenen Wegen regeneriert werden, das meiste ATP wird ausgehend

von ADP und freien Phosphat-Ionen durch oxidative Phosphorylierung im Rahmen der

Zellatmung in den Mitochondrien gebildet: Phosphoryliert wird dabei ADP zu ATP, die

Diphosphatgruppe des ADP wird zu einer Triphosphatgruppe verlängert. Ein Bezug zu

Oxidationen ist dabei nur indirekt gegeben:

Die Bildung des ATP wird – ausgehend von ADP und Phosphat-Ionen - von der

mitochondrialen ATP-Synthase katalysiert. Diese ist in der mitochondrialen

Innenmembran verankert, die drei katalytischen Zentren befinden sich im F1-Teil des

Enzyms, der in die mitochondriale Matrix ragt.

Die ATP-Synthase wird (vergleichbar einer Wassermühle) durch einen Einstrom von

Protonen (H+-Ionen) in die mitochondriale Matrix in Gang gesetzt. Die Protonen

fließen an einer bestimmten Stelle durch den membranständigen FO-Teil des Enzyms

hindurch. Der FO-Teil enthält einen Rotor, der dabei in Drehungen versetzt wird.

Die Protonen fließen nur in die Matrix, wenn ihre Konzentration im Intermembranraum

höher ist als in der Matrix, erforderlich ist also ein Protonengradient. Dieser wird von

einer Reihe an Proteinen der Innenmembran aufgebaut, die gemeinsam als

Atmungskette bezeichnet werden (Abb.

Abb. 1

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Die Atmungskette ist eine Protonenpumpe. Für ihre Aktivität benötigt sie Energie. Die

Energie bezieht sie aus elektrischem Strom, also aus einem Fluss von Elektronen.

Die Elektronen werden in der Atmungskette letztlich auf molekularen Sauerstoff (O2)

übertragen, dabei entsteht in der Atmungskette letztlich (durch Reaktionen mit

zusätzlichen Protonen) Wasser:

O2 + 4 Elektronen + 4 Protonen → 2 H2O

Im Lauf eines Tages wird in den Mitochondrien eines Menschen auf diese Weise etwa ein

halber Liter Wasser synthetisiert. Das dazu verwendete O2 stammt aus der Atemluft.

Der Verbrauch an Sauerstoff (O2) in der Atmungskette wird im Praktikum mit Hilfe

einer Sauerstoffelektrode gemessen.

Anmerkung: Im biochemischen Sinne ist das Entscheidende an der Zellatmung allerdings nicht

der Sauerstoffverbrauch, sondern die Arbeit der Elektronentransportkette in einer Membran,

die einen Protonengradienten aufrechterhält, der an eine Energiegewinnung durch eine ATP-

Synthase gekoppelt ist. In vielen Bakterien wird ähnlich wie in den Mitochondrien ein

Protonengradient aufgebaut, der für eine ATP-Synthese genutzt wird. In einigen Bakterien

werden die Elektronen aber nicht auf O2, sondern z.B. auf Schwefel (S) übertragen. In

derartigen Fällen wird nicht H2O sondern (unangenehm riechendes) H2S gebildet, etwa in

sauerstoffarmen Gewässern, und es liegt nicht Sauerstoff-Atmung vor, sondern Schwefel-

Atmung.

Die Aufgabe der mitochondrialen Atmungskette besteht darin, Protonen aus der Matrix in den

mitochondrialen Intermembranraum zu pumpen. Dabei werden, gleichsam nebenbei, zudem

Protonen zur Synthese von Wasser verbraucht. Die Atmungskette transportiert also

Protonen, und sie verbraucht Protonen (Abb. 2).

Abb. 2

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Woher kommt der elektrische Strom, der von der Atmungskette benötigt wird? Woher

stammen also die Elektronen, die letztlich auf den Sauerstoff übertragen werden?

Im Stoffwechsel werden verschiedene chemische Verbindungen (= „Metabolite“) oxidiert, d.h.

ihnen werden Elektronen entnommen:

So wird etwa im Citratzyklus Succinat zu Fumarat oxidiert, dabei werden dem Succinat

2 Elektronen entnommen. Diese werden direkt auf den Komplex II der Atmungskette

übertragen.

Nach längerem Fasten entsteht im Stoffwechsel der Leber durch Abbau von Fettsäuren

sehr viel -Hydroxybutyrat. Dieses zählt zu den sogen. „Ketonkörpern“, die beim

längeren Hungern oder Fasten an das Blut abgegeben werden. -Hydroxybutyrat wird

von verschiedenen Geweben aufgenommen und dann in den Mitochondrien oxidiert.

Es trägt dazu bei, dass der Organismus auch bei Nahrungsmangel längere Zeit

überleben kann. Bei der Oxidation des -Hydroxybutyrats wird NAD+ zu NADH

reduziert, welches 2 Elektronen zum Komplex I der Atmungskette transportieren kann.

Aus dem -Hydroxybutyrat entsteht dabei Acetoacetat.

Die Aktivität der Atmungskette ist somit davon abhängig, dass Metabolite im

Stoffwechsel oxidiert werden und die dabei anfallenden Elektronen der Atmungskette zur

Verfügung gestellt werden. Die Atmungskette baut dann den Protonengradienten auf, der

von der ATP-Synthase zur Phosphorylierung von ADP zu ATP genutzt wird. In diesem

Sinne kann dann von einer oxidativen Phosphorylierung gesprochen werden.

Die Abhängigkeit des Sauerstoffverbrauchs der mitochondrialen Atmungskette von der

Verfügbarkeit von Stoffen wie Succinat oder -Hydroxybutyrat soll im Praktikum

demonstriert werden.

Dazu werden isolierte Mitochondrien der Leber einer Ratte in einer wässrigen Lösung bei

neutralem pH-Wert suspendiert, und in einem Probengefäß wird dann mit Hilfe einer

Sauerstoffelektrode der Verbrauch an O2 in der Suspension nachgewiesen. Es wird dann

jeweils eine kleine Menge der jeweiligen Metabolite zugegeben und über den Verbrauch an

O2 die Aktivität der Atmungskette gemessen.

Die Metabolite werden in der Matrix der Mitochondrien oxidiert. Wie aber gelangen die

Metabolite in die Mitochondrien hinein?

Die mitochondriale Außenmembran enthält kleine Poren, die hinreichend groß sind um eine

freie Diffusion der Metabolite zu ermöglichen. Die mitochondriale Innenmembran enthält

hingegen keine porenbildenden Proteine. Ein Transport von Metaboliten ist nur durch

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bestimmte integrale Membranproteine möglich, die jeweils für bestimmte Metabolite spezifisch

sind:

Succinat ist eine Dicarbonsäure, sie enthält also zwei Carboxylgruppen:

Succinat: -OOC-CH2-CH2-COO-

Succinat kann mit Hilfe des mitochondrialen Dicarboxylat-Translokators (Dicarboxylate carrier)

im Austausch gegen anorganische Anionen wie z.B. Phosphat in die Matrix transportiert

werden. Der Dicarboxylat-Translokator gehört zu einer großen Familie von 53 ähnlich

aufgebauten mitochondrialen Proteinen, die – jeweils spezifisch für bestimmte Metabolite –

deren Transport über die Innenmembran vermitteln.

-Hydroxybutyrat ist eine Monocarbonsäure:

-Hydroxybutyrat: H3C-CH2-CHOH-COO-

Auch dieser Metabolit wird vermutlich ähnlich wie die Dicarboxylate in die Mitochondrien

importiert, das Transportprotein ist aber bis heute nicht identifiziert worden.

Das berühmteste Mitglied der Familie der mitochondrialen Metabolit-Translokatoren ist der

ADP/ATP-Translokator (AAC). Dieser vermittelt den Transport von ADP in die Mitochondrien,

welches von der ATP-Synthese als Substrat benötigt wird. Gleichzeitig vermittelt der gleiche

Translokator aber auch den Export des neu synthetisierten ATP aus den Mitochondrien in das

Zytosol. Der Import der ebenfalls zur ATP-Synthese benötigten Phosphat-Ionen wird von

einem Phosphat-Translokator vermittelt.

Der P/O-Quotient

Wieviel ADP kann zu ATP phosphoryliert werden, wenn bei intakter Atmungskette und

intakter ATP-Synthase ausgehend von molekularem Sauerstoff ein H2O synthetisiert

wird?

Das Verhältnis von Phosphorylierung zu O2-Verbrauch wird traditionell als P/O-Quotient

bezeichnet. Unter optimalen experimentellen Bedingungen lässt sich ein P/O-Quotient von ca.

2.5 nachweisen.

→ Im Rahmen des Praktikums soll der P/O-Quotient experimentell bestimmt werden.

Der Wert des P/O-Quotienten ist grundsätzlich davon abhängig, (1.) wie viele Protonen von

der Atmungskette in den Intermembranraum gepumpt werden und (2.) wie viele Protonen

erforderlich sind, damit von der ATP-Synthase 1 ATP synthetisiert werden kann. Aus

umfangreichen Forschungsarbeiten sind die folgenden Daten verfügbar:

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- Wenn 1 NADH seine beiden Elektronen an den Komplex I der Atmungskette abgibt,

kann vom Komplex IV der Atmungskette ein Sauerstoffatom eines O2 zu 1 H2O

umgesetzt werden. Dabei werden 10 Protonen in den Intermembranraum gepumpt. →

Die Atmungskette pumpt 10 H+ wenn sie 1 H2O synthetisiert

- 8 Protonen sind erforderlich, damit sich der Rotor der ATP-Synthase einmal um 360°

drehen kann, dabei werden in den drei katalytischen Zentren des Enzyms 3 ATP

synthetisiert. → Die ATP-Synthase benötigt 8 H+ für 3 ATP, also 2.67 H+ für 1 ATP

- Wenn – vermittelt von ADP/ATP-Translokator - 1 ATP im Austausch gegen ADP von

den Mitochondrien an das Cytosol abgegeben wird, geht dem mitochondrialen

Membranpotential eine weitere Ladung verloren, denn die Triphosphatgruppe des ATP

trägt 4 negative Ladungen, die Diphosphatgruppe des ADP trägt hingegen nur drei

Ladungen: → Jeder ATP-Export benötigt ein weiteres Proton zum Ladungs-

ausgleich

Mit diesen Zahlen ergibt sich ein P/O-Quotient von 10

(2,67+1) = 2,725

Tatsächlich können dem mitochondrialen Protonengradienten allerdings auch durch andere

Transportprozesse Protonen verloren gehen, weshalb die experimentell bestimmten Werte in

der Regel niedriger liegen.

Sofern Succinat oxidiert wird, kann die Atmungskette pro 1 O nur 6 H+ translozieren und der

maximale P/O-Quotient liegt bei 1.6.

Bei Experimenten zur oxidativen Phosphorylierung kann in die Effizienz der oxidativen

Phosphorylierung durch Zusatz verschiedener Reagenzien eingegriffen werden:

Adenosindiphosphat (ADP)

Die ATP-Synthase benötigt als Ausgangsstoffe der ATP-Synthese ADP und Phosphat-Ionen.

Im Praktikum wird gezeigt werden, wie sich ein Mangel an ADP auf den Sauerstoffverbrauch

der Mitochondrien auswirkt: Sobald den Mitochondrien kein ADP zur Verfügung steht, wird die

ATP-Synthase inaktiv und auch die Atmungskette reduziert ihre Aktivität. Entsprechend

reduziert sich auch der Sauerstoffverbrauch: ADP reguliert die Zellatmung.

Entkoppler

Als Entkoppler bezeichnet man Stoffe, die sich in die mitochondriale Innenmembran einlagern

und dann einen Verlust des mitochondrialen Membranpotentials verursachen. Berühmte

Entkoppler sind das CCCP (Carbonylcyanide-3-chlorophenylhydrazone) und das 2,4-

Dinitrophenol. Beide Verbindungen können Protonen transportieren und verursachen so den

Verlust des Membranpotentials, das von der Atmungskette aufgebaut wurde. Dabei bleibt

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die Aktivität der Atmungskette und somit auch der Sauerstoffverbrauch der

Atmungskette in vollem Umfang erhalten! Von der Aktivität der Atmungskette ist die

Aktivität der ATP-Synthase unter diesen Bedingungen jedoch abgekoppelt: Die ATP-

Synthase ist gänzlich inaktiv, denn ein Membranpotential ist nicht mehr vorhanden.

Rotenon, ein Inhibitor des Komplex I

Rotenon ist eine giftige organische Verbindung, die von bestimmten Pflanzen gebildet wird.

Rotenon lagert sich in den Komplex I der Atmungskette ein und blockiert dort den Transport

der Elektronen. Diese können dann nicht mehr zum O2 der Atmungskette gelangen.

Malonat, ein Inhibitor des Komplex II

Malonat ist ein Hemmstoff des Komplex II der Atmungskette. Ähnlich dem Succinat ist auch

Malonat eine Dicarbonsäure:

Succinat: -OOC-CH2-CH2-COO-

Malonat: -OOC-CH2-COO-

Aufgrund der Ähnlichkeit seiner Struktur kann sich Malonat in die Succinat-Bindestelle des

Komplexes II einlagern, dort kann es dann aber nicht oxidiert werden. Es agiert somit als

kompetitiver Inhibitor. Succinat kann dann keine Elektronen an die Atmungskette abgeben.

Die Atmungskette kann gleichwohl aktiv sein, sofern Elektronen von NADH auf den Komplex

I der Atmungskette übertragen werden.

Antimycin A, ein Inhibitor des Komplex III

Das Antimycin A ist eine giftige organische Verbindung, die von bestimmten Bakterien gebildet

wird. Es lagert sich spezifisch in den Komplex III der Atmungskette ein und blockiert dort die

Weiterleitung der Elektronen. In Gegenwart von Antimycin A können Elektronen weder von -

Hydroxybutyrat, noch von Succinat zum O2 gelangen, die Aktivität der Atmungskette ist damit

vollständig blockiert.

Cyanid-Ionen: Blockade der Sauerstoff-Bindestelle im Komplex IV

Cyanidionen, CN-, lagern sich mit hoher Affinität in die O2-Bindestelle des Komplex IV ein, sie

sind deshalb außerordentlich giftig.

Oligomycin: Blockade des FO-Teils der ATP-Synthase

Auch Oligomycin ist eine organische Verbindung, die von bestimmten Bakterien synthetisiert

wird. Es blockiert jedoch nicht die Atmungskette, vielmehr lagert es sich in den FO-Teil der

ATP-Synthase ein und blockiert damit die Aktivität des Enzyms. In der traditionellen

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Bezeichnung „FO-Teil“ bezieht sich der tiefgestellte Buchstabe O auf das Oligomycin, dessen

Bindestelle sich in diesen Teil des Enzyms befindet.

B. ZIELSETZUNG DER EXPERIMENTE

Mitochondrien, die auf schonende Weise aus frischer Rattenleber isoliert wurden, besitzen die

Fähigkeit zur ATP-Synthese. Diese läuft unter Verbrauch von Sauerstoff ab und ist abhängig

vom Vorhandensein von ADP und Phosphat. In den folgenden Versuchen sollen

- das ADP/O-Verhältnis und der Atmungskontrollkoeffizient unter Verwendung der

beiden Substrate 3-Hydroxybutyrat und Succinat ermittelt werden;

- der Einfluss von Oligomycin (des Inhibitors der ATP-Synthase) und des Entkopplers

2,4-Dinitrophenol auf die oxidative Phosphorylierung untersucht werden;

- der Elektronenfluss der Atmungskette durch selektive Inhibitoren der Komplexe I bis IV

gehemmt werden.

C. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG UND VERSUCHSPROTOKOLL

Mitbringliste: Kittel, Lineal, Taschenrechner

Für den Versuch werden folgende Lösungen benötigt:

Mitochondriensuspension (20 mg Protein/ml) in isotonischer Pufferlösung

- Testpuffer "H" (10 mM K-Phosphat pH = 7.4; 5 mM MgCl2; 20 mM KCl; 0,25 M

Mannit) mit 20 mM 3-Hydroxybutyrat

- Testpuffer "S" (10 mM K-Phosphat pH = 7.4; 5 mM MgCl2; 20 mM KCl; 0,25 M

Mannit) mit 20 mM Succinat

- 0,25 M ADP ( auf pH = 7.4)

- 0,1 M Succinat

- 0,5 M 3-Hydroxybutyrat

- 10 mM 2,4-Dinitrophenol (auf pH = 7.4)

- 0,5 mM CCCP*) in Ethanol

- Oligomycin*) (1 mg/ml in Ethanol)

- Rotenon*) (1 mg/ml in Ethanol)

- 1,0 M Malonat

- Antimycin A*) (2 mg/ml in Ethanol) Formel s. Anlage

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Versuchsanordnung:

Als Messzelle für alle Versuche dient ein thermostatisierbares Glasgefäß, das eine

Sauerstoffelektrode enthält (Abb. 3). Diese besteht aus einem Silber/Platin-Elektrodenpaar,

das sich in einer Elektrolytlösung befindet und durch eine gasdurchlässige Teflonmembran

umschlossen wird. Ein Verstärker versorgt die Elektroden mit einer Polarisationspannung,

wobei Sauerstoff, der sich zwischen den Elektrodenflächen befindet vollständig reduziert wird.

Dadurch fließt zwischen den Elektroden ein Strom, der in einem direkten stöchiometrischen

Verhältnis zum verbrauchten Sauerstoff steht. Bei ausreichender Durchmischung des

Probevolumens (Magnetrührer!) erfolgt über die gasdurchlässige Teflonmembran ein rascher

Sauerstoffaustausch zwischen der Probe in der Messzelle und der Elektrolytlösung der

Elektrode, so dass der zwischen den Elektroden fließende Strom der jeweiligen

Sauerstoffkonzentration in der Probe proportional ist. Dieser Strom wird vom Verstärker in eine

Spannung umgewandelt und so verstärkt, dass sich eine Messgröße im Voltbereich ergibt, die

mit Hilfe eines A/D-Wandlers und eines PCs in ihrem zeitlichen Verlauf dargestellt werden

kann. Auf diese Weise können zeitliche Änderungen der Sauerstoffkonzentration registriert

werden; die Steigung einer aufgezeichneten Linie entspricht der Geschwindigkeit des

Sauerstoffverbrauchs.

Abb. 3: Versuchsanordnung zur Messung des Sauerstoffverbrauchs von Mitochondrien

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1. Messung der Atmungskontrolle und des ADP/O-Verhältnisses mit den

Substraten 3-Hydroxybutyrat und Succinat

1.1. Eichung der Sauerstoffelektrode

Das Reaktionsgefäß wird mit Wasser gefüllt, das bei Raumtemperatur mit Luft gesättigt ist und

daher etwa 250 nmol O2 /ml enthält. Das Gefäß wird sofort mit einem Glasstopfen

verschlossen und der Magnetrührer wird eingeschaltet. Durch Betätigen des Start-Buttons im

Programm wird der Messvorgang gestartet. Sobald die auf dem Monitor dargestellte

Spannungslinie einen waagerechten oder nur geringfügig abfallenden, linearen Verlauf

anzeigt wird dem Wasser etwas Natrium-Dithionit (Reduktionsmittel) zugesetzt: dadurch wird

der im Wasser gelöste Sauerstoff verbraucht, und die registrierte Spannung fällt rasch ab, um

sich nach kurzer Zeit bei einem niedrigen Wert zu stabilisieren. Die Messung wird durch

Anklicken des Stopp-Buttons beendet. Die graphische Darstellung der Messwerte wird dann

ausgedruckt. Die Differenz der Spannung vor und nach Zugabe von Dithionit entspricht einer

Sauerstoffkonzentration von 250 nmol/ml.

1.2. Bestimmung des Atmungskontrollkoeffizienten und des ADP/O-Quotienten

Vor Versuchsbeginn wird die Zelle mit Hilfe einer Vakuumvorrichtung (Pipettenspitze) entleert

und dreimal mit Wasser nachgespült. Dabei ist drauf zu achten, dass das Wasser der letzten

Spülung möglichst vollständig entfernt wird. Entsprechend dem folgenden Versuchsplan

werden dann die Suspension von Rattenlebermitochondrien sowie der jeweils erforderliche

Testpuffer in die Messzelle pipettiert. Diese wird sofort mit einem Glasstopfen verschlossen,

der mit einer kapillaren Öffnung versehen ist, und der Magnetrührer wird eingeschaltet. Durch

Betätigen der Start-Taste im Programm wird der Messvorgang gestartet, und die

Sauerstoffkonzentration in der Messzelle kann am Monitor unmittelbar verfolgt werden. Nach

Erreichen einer konstanten Geschwindigkeit der Sauerstoffabnahme wird mit Hilfe einer

Mikroliterspritze durch die Kapillare des Glasstopfens ADP-Lösung, entsprechend dem

Versuchsplan, zugegeben. Nun wird der aktive Zustand der Mitochondrien erreicht und eine

erhöhte Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs beobachtet, die so lange anhält, bis das

zugegebene ADP nahezu vollständig in ATP umgewandelt ist. Der Sauerstoffverbrauch nimmt

wieder ab, die Mitochondrien befinden sich im Ruhezustand. Die erneute Zugabe einer

größeren Menge von ADP ergibt das gleiche Bild. Lediglich die Dauer des aktiven Zustandes

und damit die Höhe des Sauerstoffverbrauches verändern sich entsprechend der größeren

Menge an zugegebenem ADP. Nach Erreichen des Ruhezustandes wird die Messung durch

Drücken des Stop-Buttons beendet.

Der Quotient aus den Geschwindigkeiten im aktiven und im Ruhezustand wird als

Atmungskontrollkoeffizient bezeichnet. Aus der zugegebenen ADP-Menge und der im

aktiven Zustand verbrauchten Sauerstoffmenge lässt sich der ADP/O-Quotient errechnen

(siehe Rechenbeispiel).

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Versuchsplan

Versuchsnummer 1.2.1 1.2.2

Benutztes Substrat 3-Hydroxybutyrat Succinat

Testpuffer "H" 1,7 ml -

Testpuffer "S" - 1,75 ml

Mitochondriensuspension 100 µl 50 µl

Warten bis eine konstante Abnahme des Sauerstoffverbrauchs erreicht ist!

ADP 0,25 M 1 µl 0.5 µl

Warten bis der Sauerstoffverbrauch wieder abnimmt und der Ruhezustand erreicht ist!

ADP 0,25 M 2 µl 1 µl

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Hemmung der ATP-Bildung durch Inhibitoren und Entkoppler

2.1 Hemmung der ATP-Synthese und des ADP/ATP-Austausches / Entkopplung

durch 2,4-Dinitrophenol

Wie in den vorherigen Versuchen (1.2.1 und 1.2.2) wird einer Suspension von

Rattenlebermitochondrien in Testpuffer, der 20 mmol/l 3-Hydroxybutyrat enthält, zunächst

ADP-Lösung zugesetzt. Nach Erreichen der Ruhephase wird der Inhibitor Oligomycin und

etwa 1 min später weiteres ADP zugegeben, das nun keinen Effekt mehr zeigt. Erst die Zugabe

des Entkopplers 2,4-Dinitrophenol stimuliert den Sauerstoffverbrauch.

Versuchsplan

Versuchsnummer: 2.1

Testpuffer "H" 1,7 ml

Mitochondriensuspension 100 µl

Warten, bis eine konstante Abnahme des O2-Verbrauchs erreicht ist!

ADP 0,25 M 1 µl

Warten, bis der O2-Verbrauch wieder abnimmt und der Ruhezustand erreicht ist.

Oligomycin (1 mg/ml) 1 µl

ca. 1 min warten

ADP 0,25 M 1 µl

ca. 1 min warten

2,4-Dinitrophenol (10 mM) 2 µl

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2.2 Hemmung des Elektronentransports

Rattenlebermitochondrien werden in den jeweils angegebenen Substrat-Pufferlösungen

suspendiert. Sobald ein konstanter Sauerstoffverbrauch zu beobachten ist, wird die Atmung

durch Anwendung des Entkopplers CCCP aktiviert. Die Zugabe von Inhibitoren und weiteren

Substraten erfolgt entsprechend dem Versuchsplan.

Versuchsplan

Versuchsnummer: 2.2

Benutztes Substrat: 3-Hydroxybutyrat

Testpuffer "H" 1,7 ml

Mitochondriensuspension 100 µl

Warten bis eine konstante Abnahme des Sauerstoffverbrauchs erreicht ist!

CCCP 0,5 mM 1 µl

ca. 40 sec warten

Rotenon (1 mg/ml) 1 µl

ca. 2 min warten

Succinat 0,1 M 10 µl

ca. 40 sec warten

Antimycin A (2mg/ml) 1 µl

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Versuchsplan

Versuchsnummer 2.3

benutzte Substrate

benutzte Inhibitoren

Succinat

Malonat

Testpuffer “S” 1,75 ml

Mitochondriensuspension+ 50 µl

Warten bis eine konstante Abnahme des

Sauerstoffverbrauchs erreicht ist

CCCP 0,5 mM 1 µl

Ca. 40 sec warten

Malonat 1,0 M 10 µl

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D. AUSWERTUNG UND FEHLERDISKUSSION

1. Berechnung des ADP/O-Verhältnisses und des Atmungskontrollkoeffizienten

Die Auswertung der Versuche erfolgt entsprechend den Abbildungen 4a und 4b. Entnehmen

Sie die Resultate dem bei der Versuchsdurchführung ausgedruckten Diagramm und

übertragen Sie diese in die entsprechenden leeren Kästchen der Abb. 4 (Messdaten).

1) Berechnen Sie aus den Ergebnissen der Versuche 1.2.1 und 1.2.2 folgende Größen:

a) die ADP/O-Quotienten für die Substrate 3-Hydroxybutyrat und Succinat

b) die Reaktionsgeschwindigkeiten (nmol O/(min mg Protein)) für den aktiven Zustand

und den Ruhezustand mit beiden Substraten

c) die Atmungskontrollkoeffizienten für beide Substrate.

2) Vergleichen Sie die Geschwindigkeiten des Sauerstoffverbrauchs im aktiven Zustand,

die Atmungskontrollkoeffizienten und die ADP/O-Quotienten für die Substrate

3-Hydroxybutyrat und Succinat. Warum verwenden wir bei Mitochondrienversuchen

3-Hydroxybutyrat statt NADH?

2. Einfluss von Inhibitoren und Entkoppler auf den Sauerstoffverbrauch von

Rattenlebermitochondrien

1) zu Versuch 2.1:

a) Welches ist Angriffspunkt für den Inhibitor Oligomycin?

b) Warum lässt sich in Anwesenheit des Oligomycins die Aktivität der Atmung zwar durch

Entkoppler, nicht aber durch ADP steigern?

2) zu Versuch 2.2:

a) Worin unterscheidet sich die Wirkung der in dieser Versuchsgruppe benutzen

Inhibitoren von der Wirkung des Oligomycins des vorherigen Experiments?

b) Ordnen Sie die einzelnen Inhibitoren den entsprechenden Enzymen zu!

Inwieweit lässt sich diese Zuordnung durch das Versuchsergebnis bestätigen?

3) zu Versuch 2.3:

Malonat ist ein kompetitiver Inhibitor. Welche Eigenschaften sind für kompetitive

Inhibitoren charakteristisch?

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Rechenbeispiel

zu Aufgabe 1.1a)

Der ADP/O-Quotient gibt das Verhältnis von ADP-Einsatz und Sauerstoffverbrauch, bezogen

auf atomaren Sauerstoff, an.

Der Sauerstoffverbrauch wird aus dem ausgedruckten Diagramm ermittelt, wie in

Abb. 3.dargesellt. Dazu werden im Bereich des 2. und 3. Ruhezustandes der

Sauerstoffverbrauchskurve (Abb. 4b) Tangenten angelegt. Die Strecke x entspricht dem

Sauerstoffverbrauch für die vorgegebene Menge an ADP. Die Strecke y in Abb. 3a gibt die

Differenz der Sauerstoffkonzentration von Wasser, welches bei Raumtemperatur mit Luft

gesättigt wurde, und von praktisch sauerstofffreiem Wasser an und entspricht somit einer O2-

Konzentration von 250 nmol/ml.

Abb. 4a: Eichung der Sauerstoffelektrode

Abb. 4b: Berechnung des Sauerstoffverbrauchs

2O nmol2

ADP nmol ADP/O

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Für den Sauerstoffverbrauch gilt dann:

Im folgenden Beispiel beträgt das Volumen des Testansatzes (VT) 1,8 ml; y entspricht 7,2 cm

und x = 2,6 cm.

= 162 nmol O2

Die Aktivierung der mitochondrialen ATP-Synthese erfolgte durch Zugabe von 2 µl 0,25 M

ADP-Lösung, das entspricht 500 nmol ADP. Daraus ergibt sich:

zu Aufgabe 1b)

Ansatz im Protein mg

minverbrauch/Sauerstoff= keiteschwindigReaktionsg

Der Sauerstoffverbrauch pro Minute wird entsprechend dem Sauerstoffverbrauch in Beispiel

1a) berechnet. Dabei wird jedoch der Ausdruck x (= Sauerstoffverbrauch) durch x/min (=

Sauerstoffverbrauch pro Minute) ersetzt. (Beachten Sie bitte, dass die eingesetzten

Proteinmengen bei den einzelnen Versuchsansätzen differieren können!)

zu Aufgabe 1c)

xT

Vmly

nmol250 verbrauchSauerstoff

cm2,6 ml1,8 ml cm7,2

nmol250 verbrauchSauerstoff

1,54nmol162 2

nmol500 ADP/O

dRuhezustan im keiteschwindigReaktionsg

Zustand aktiven im keiteschwindigReaktionsgffizientAtmungskoe

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Ergebnisse

zu Versuch 1.2.1 und 1.2.2

Substrat 3-Hydroxybutyrat Succinat

Sauerstoffverbrauch

in der aktiven Phase

(nmol O2):

Eingesetzte Menge an

ADP (nmol):

ADP/O-Quotient:

Sauerstoffverbrauch/min

in der Ruhephase

(nmol O2/min):

Sauerstoffverbrauch/min

in der aktiven Phase

(nmol O2/min):

Eingesetzte Menge an

Protein (mg):

Reaktionsgeschwindigkeit

in der Ruhephase

(nmol O/(min · mg Protein)):

Reaktionsgeschwindigkeit

in der aktiven Phase

(nmol O/(min · mg Protein)):

Atmungskontrollkoeffizient:

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zu Versuch 2.1

zu Versuch 2.2

zu Versuch 2.3

25

E. SCHLUSSFOLGERUNGEN

26

F. ANHANG