Inovace studia biochemie prostřednictvím e-learningu

CZ.04.1.03/3.2.15.3/0407

Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem

a státním rozpočtem České republiky.

Základy biochemie KBC/BCH

Metabolismus nukleotidů

Metabolismus nukleotidů

• Osnova • Syntéza purinových ribonukleotidů • a. Syntéza adeninových a guaninových ribonukleotidů • b. Kontrola biosyntézy purinových nukleotidů • c. Recyklace purinů • Syntéza pyrimidinových nukleotidů • a. Syntéza uridinmonofosfátu • b. Syntéza uridintrifosfátu a cytidintrifosfáttu • c. Regulace biosyntézy pyrimidinových nukleotidů • Tvorba deoxyribonukleotidů • Tvorba thyminu • Odbourávání nukleotidů • a. Katabolismus purinů • b. Dráha močové kyseliny • c. Katabolismus pyrimidinů 2

Struktura purinu a pyrimidinu

N

N

N

N

H

N

N

Purin Pyrimidin

1

23

4

56

78

9

5

61

2

34

3

Ribosa a 2-deoxyribosa

OH HO

OH

H

OH

H

OH

CH2

H

D-Ribosa

123

4

5

OH HO

OH

H

H

H

OH

CH2

H

2-D-Deoxyribosa

123

4

5

4

b-N-glykosidová vazba. Vazby se účastní uhlík C1´

N

N

N

N

NH2

OH O

HH

OH

CH2

H H

b-N-Glykosidová

vazba

5

Ribonukleotid a deoxyribonukleotid Nukleosid = báze + pentosa

Nukleotid = báze + pentosa + fosfát

O

Báze

O

OH

H

OH

H

OH

CH2

H

O3P

5´-Ribonukleotid

1´2´3´

4´

5´

OH

Báze

O

OH

H

H

H

O

CH2

H

O3P

3´-Deoxyribonukleotid

1´2´3´

4´

5´2-

2-

6

Názvy a zkratky bází nukleových kyselin, nukleosidů a nukleotidů

7

Biosyntéza purinových ribonukleotidů

• Nukleotidy jsou fosforečné estery pentos (ribosy nebo deoxyribosy), ve kterých je purinová nebo pyrimidinová báze vázána na uhlík C1´sacharidu.

• V roce 1948 John Buchanan dělal pokusy s holuby, které krmil různými sloučeninami - značené izotopy a zjišťoval pozici značených atomů ve vylučované močové kyselině.

• Buchananovy závěry:

N

H

C

N

NC

CC N

C

Amidoskupina

glutaminu

1

23

4

56

78

9Formiát

Aminoskupina

aspartátu Formiát

Glycin

HCO3

-

8

Schéma biosyntézy IMP, ATP, GTP, dATP a dGTP

9

Inosinmonofosfát (IMP) – prekurzor AMP a GMP

O

N

O

H

H

OH

H

OH

H

NH

N

N

O

PO-

O

O-

Hypoxanthin

Inosinmonofosfát (IMP)

10

Jednotlivé kroky biosyntézy inosinmonofosfátu

• 1.Výchozím materiálem je produkt pentosafosfátové dráhy a-D-ribosa-5-fosfát, která se aktivuje ATP na 5-fosforibosyl-a-pyrofosfát (PRPP).

• 2.Vstup atomu N9 purinu reakcí PRPP s Gln. Dochází k inverzi konfigurace na b. Kontrolní krok biosyntézy – současná hydrolýza PPi!! Vznik b-5-fosforibosylaminu (PRA).

• 3.Vstup purinových atomů C4, C5 a N7. Atomy vstupují ve formě Gly na PRA za tvorby glycinamidribotidu (GAR).

• 4.Vstup purinového atomu C8. Volná aminoskupina GAR je formylována N 10-formyl-THF za tvorby formylglycinamidribotidu (FGAR).

• 5.Vstup purinového atomu N3. Vstupuje ve formě Gln za účasti ATP ADP + Pi.

• 6.Tvorba imidazolového kruhu purinu. Intramolekulární kondenzace za účasti ATP tvoří 5-aminoimidazolribotidu (AIR).

• 7.Vstup C6 atomu purinu. Vstupuje jako HCO3- za katalýzy AIR

karboxylasy a vzniku karboxyaminoimidazolribotidu (CAIR).

11

Jednotlivé kroky biosyntézy inosinmonofosfátu (IMP)

• 8.Vstup N1 atomu purinu. Vstupuje formou aminoskupiny Asp za účasti ATP ADP + Pi a tvorby 5-aminoimidazol-4-(N-sukcinylokarboxamid)- ribotidu (SAICAR).

• 9.Odštěpení fumarátu z SAICAR. Podobná reakce reakci močovinového cyklu. Tvoří se 5-aminoimidazol-4-karboxamidribotid (AICAR).

• 10.Vstup C2 atomu purinu. Druhá formylace za účasti N 10-formyl-THF a tvorby 5-formaminoimidazol-4-karboxamidribotidu (FAICAR). Tato reakce a reakce 4 jsou inhibovány sulfonamidy, strukturními analogy p-aminobenzoové kyseliny!!!

• 11.Cyklizace za tvorby IMP. Eliminace vody. Na rozdíl od reakce 4 není nutné ATP.

• Poznámka: U živočichů jsou reakce 10 a 11 katalyzovány bifunkčními enzymy, stejně jako reakce 7 a 8. Reakce 3, 4 a 6 probíhají na jednoduchém proteinu. Meziprodukty multifunkčních enzymů nejsou uvolňovány do prostředí, ale posouvány tunely k dalšímu enzymu.

• Podobná situace je u pyruvátdehydrogenasového komplexu, synthasy mastných kyselin, synthasy glutamátu a tryptofansynthasy. 12

1. Výchozí sloučeninou je produkt pentosafosfátové dráhy a-D-ribosa-5-fosfát, který se aktivuje ATP

na 5-fosforibosyl-a-pyrofosfát (PRPP).

ATP

O O

OH

H

OH

H

OH

CH2

H

O3P H

a-D-Ribosa-5-fosfát

(R5P)

2-

a

AMP

1 Ribosafosfátpyrofosfátkinasa

O O

O

H

OH

H

OH

CH2

H

O3P H

P

O

O-

O-

P O

O

O-

5-Fosforibosyl-a-pyrofosfát

(PRPP)

2-

a

13

2. Vstup atomu N9 purinu reakcí PRPP s Gln. Dochází k inverzi konfigurace v poloze 1´na b.

Kontrolní krok biosyntézy – současná hydrolýza PPi!!! Vznik b-5-fosforibosylaminu (PRA).

Glutamin + H2O

Glutamát + PPi

2 Amidofosforibosyltransferasa

O O

H

H

OH

H

OH

CH2

H

O3P NH2

b-5-Fosforibosylamin

(PRA)

2-

b

O O

O

H

OH

H

OH

CH2

H

O3P H

P

O

O-

O-

P O

O

O-

5-Fosforibosyl-a-pyrofosfát

(PRPP)

2-

a

14

3. Vstup purinových atomů C4, C5 a N7. Atomy vstupují ve formě Gly na PRA za tvorby glycinamidribotidu (GAR).

GAR synthetasa

Glycin + ATP

ADP + Pi

3

O O

H

H

OH

H

OH

CH2

H

O3P NH

O C

CH2 NH2

Glycinamidribotid

(GAR)

2-

b

O O

H

H

OH

H

OH

CH2

H

O3P NH2

b-5-Fosforibosylamin

(PRA)

2-

b

15

4. Vstup purinového atomu C8. Volná aminoskupina GAR je formylována N 10-formyl-THF za tvorby

formylglycinamidribotidu (FGAR).

GAR transformylasa

N 10-Formyl-THF

THF

4

Formylglycinamidribotid

(FGAR)

O O

H

H

OH

H

OH

CH2

H

O3P NH

O C

CH2 NH2

Glycinamidribotid

(GAR)

2-

b

C

CH2

NH

CHN

H

OO

ribosa-5-fosfát

16

5. Vstup purinového atomu N3. Vstupuje ve formě Gln za účasti ATP ADP + Pi.

FGAM synthetasa

ATP + Glutamin + H2O

ADP + Glutamát + Pi

5

Formylglycinamidinribotid

(FGAM)

C

CH2

NH

CHN

H

ONH

ribosa-5-fosfát

Formylglycinamidribotid

(FGAR)

C

CH2

NH

CHN

H

OO

ribosa-5-fosfát

17

6. Tvorba imidazolového kruhu purinu. Intramolekulární kondenzace za účasti ATP tvoří 5-aminoimidazolribotid

(AIR).

AIR synthetasa

ATP

ADP + Pi

6

5-Aminoimidazolribotid

(AIR)

N

ribosa-5-fosfát

C

CHN

CH

NH2

Formylglycinamidinribotid

(FGAM)

C

CH2

NH

CHN

H

ONH

ribosa-5-fosfát

5

18

7. Vstup C6 atomu purinu. Vstupuje jako HCO3

- za katalýzy AIR karboxylasy a vzniku 4-karboxy-5-aminoimidazolribotidu (CAIR).

N

ribosa-5-fosfát

C

CN

CH

NH2

OOC

AIR karboxylasa

ATP + HCO3

-

ADP + Pi

7

4-Karboxy-5-aminoimidazolribotid

(CAIR)

5-Aminoimidazolribotid

(AIR)

N

ribosa-5-fosfát

C

CHN

CH

NH2

5

5

4

-

19

8. Vstup N1 atomu purinu. Vstupuje formou aminoskupiny Asp za účasti ATP ADP + Pi a tvorby

5-aminoimidazol-4-(N-sukcinylokarboxamid)-ribotidu (SAICAR).

SAICAR synthetasa

Aspartát + ATP

ADP + Pi

8

5-Aminoimidazol-4-(sukcinylokarboxamid)-ribotid

(SAICAR)

N

ribosa-5-fosfát

C

CN

CH

NH2

C

OCOO

CH NH

CH2

COO

5

4

-

4-Karboxy-5-aminoimidazolribotid

(CAIR)

N

ribosa-5-fosfát

C

CN

CH

NH2

OOC

5

4

-

-

20

9. Odštěpení fumarátu z SAICAIR. Reakce podobná reakci močovinového cyklu. Tvoří se 5-aminoimidazol-4-

karboxamidribotid (AICAR).

AdenylosukcinátlyasaFumarát

9

5-Aminoimidazol-4-karboxamidribotid

(AICAR)

N

ribosa-5-fosfát

C

CN

CH

NH2

C

O

NH2

5

4

5-Aminoimidazol-4-(sukcinylokarboxamid)-ribotid

(SAICAR)

N

ribosa-5-fosfát

C

CN

CH

NH2

C

OCOO

CH NH

CH2

COO

5

4

-

-

21

10. Vstup C2 atomu purinu. Druhá formylace za účasti N 10-formyl-THF a tvorby 5-formaminoimidazol-

4-karboxamidribotidu (FAICAR). Tato reakce a reakce 4 jsou inhibovány sulfonamidy, strukturními analogy p-aminobenzoové kyseliny!!!

AICAR Transformylasa10

5-Formaminoimidazol-4-karboxamidribotid

(FAICAR)

N

ribosa-5-fosfát

C

CN

CH

N

H

C

O

NH2

CHO 5

4

N 10-Formyl-THF

THF

5-Aminoimidazol-4-karboxamidribotid

(AICAR)

N

ribosa-5-fosfát

C

CN

CH

NH2

C

O

NH2

5

4

22

11. Cyklizace za tvorby IMP. Eliminace vody. Na rozdíl od reakce 4 není nutné ATP.

IMP cyklohydrolasa11

Inosin-5´-monofosfát

(IMP)

NC

CN

CH

N

C

O

NH

CH

O O

OH

H

OH

H

OH

H

O3P

5

4

H2O

5-Formaminoimidazol-4-karboxamidribotid

(FAICAR)

N

ribosa-5-fosfát

C

CN

CH

N

H

C

O

NH2

CHO 5

4

2-

23

Biosyntéza adeninového a guaninového ribonukleotidu

• IMP se v buňkách neakumuluje a ihned se převádí na AMP a GMP.

• AMP se syntetizuje z IMP ve dvou krocích. Na IMP se nejprve naváže Asp, což je spojeno s hydrolýzou GTP GDP a Pi. V další reakci se eliminuje fumarát z adenylosukcinátu za tvorby AMP.

• GMP se syntetizuje z IMP také ve dvou krocích. IMP se dehydrogenuje za účasti NAD+ NADH za tvorby xanthinmonofosfátu (XMP). Druhým krokem je vstup amidového dusíku Gln za účasti ATP AMP + PPi a tvorby GMP.

O

OHO

CH3

OCH3

CH3

OH

O

Mykofenolová kyselina

Poznámka: V B aT lymfocytech, odpovídajících za imunitní odpověď organismu, je vysoká aktivita IMP dehydrogenasy vedoucí ke zvýšené tvorbě GMP nutných pro proliferaci. Produkt plísně, mykofenolová kyselina, tento enzym inhibuje a využívá se jako imunosupresivum po transplantacích!! 24

Adenylosukcinátsynthetasa

Inosin-5´-monofosfát

(IMP)

N

N

N

O

N

ribosa-5-fosfát

H

Aspartát + GTP

Adenylosukcinát

N

N

N

NH

N

ribosa-5-fosfát

OOC CH2 CH COO

Xantosin-5´-monofosfát

(XMP)

N

N

N

O

N

ribosa-5-fosfát

H

O

H

GDP + Pi

NAD+ + H2O

NADH + H+

IMP dehydrogenasa

- -

První krok biosyntézy AMP a GMP

25

Druhý rok biosyntézy AMP a GMP

Adenylosukcinátlyasa

Adenylosukcinát

N

N

N

NH

N

ribosa-5-fosfát

OOC CH2 CH COO

Xantosin-5´-monofosfát

(XMP)

N

N

N

O

N

ribosa-5-fosfát

H

O

H

Glutamin + ATP + H2O

Glutamát + AMP + PPi

- -

GMP synthetasa

Guanosin-5´-monofosfát

(GMP)

N

N

N

O

N

ribosa-5-fosfát

H

NH2

H

Adenosin-5´-monofosfát

(AMP)

N

N

N

NH2

N

ribosa-5-fosfát

Fumarát

26

Biosyntéza nuklosiddifosfátů a nukleosidtrifosfátů

• Aby byl umožněn vstup nukleotidů do nukleových kyselin, musí být nejprve nukleosidmonofosfáty převedeny na odpovídající trifosfáty.

• Převedení na nukleosiddifosfáty: nukleosidmonofosfátkinasy.

• Např. adenylátkinasa – AMP + ATP 2 ADP

• Podobně guanylátkinasa – GMP + ATP GDP + ADP

• Nukleosiddifosfáty jsou převáděny na nukleosidtrifosfáty –nukleosiddifosfátkinasou.

GDP + ATP GTP + ADP

27

Regulace biosyntézy purinových nukleotidů

• Dvě hladiny regulace.

• A) Rychlost tvorby IMP je nezávislá, ale synergicky kontrolována hladinou adeninových a guaninových nukleotidů. Vysoká hladina nukleotidů inhibuje syntézu IMP.

• B) Místo regulace je krok následující po syntéze IMP. Rychlost syntézy GTP se zvyšuje s koncentrací [ATP], zatímco rychlost syntézy AMP

s rostoucí koncentrací [GTP].

28

Schéma regulace biosyntézy purinových nukleotidů Ribosa-5-fosfát

PRPP

5-Fosforibosylamin

IMP

Adenylosukcinát

AMP

ADP

ATP

XMP

GMP

GDP

GTP

AKTIVACEINHIBICE

29

Recyklace purinových nukleotidů

• Při obměně nukleových kyselin se nejprve uvolňují báze adenin, guanin a hypoxanthin, a ty jsou dále recyklovány cestou odlišnou od biosyntézy.

• U savců jsou puriny recyklovány dvěma enzymy:

• Adeninfosforibosyltransferasa (APRT) katalyzující reakci:

Adenin + PRPP AMP + PPi

• Hypoxanthin-guaninfosforibosyltransferasa (HGPRT) katalyzující reakci:

Hypoxanthin + PRPP IMP + PPi

Guanin + PRPP GMP + PPi • Lesch-Nyhamův syndrom – deficit HGPRT u chlapců, akumuluje se PRPP,

vysoká hladina močové kyseliny v moči, spojeno s neurologickými potížemi, agresívní a destruktivní chování.

30

Biosyntéza pyrimidinových nukleotidů

• Biosyntéza pyrimidinů je podstatně jednodušší než biosyntéza purinů.

Čtyři atomy pyrimidinu jsou z Asp, jeden C2, má původ v CO2 a dusíkový atom N3 je z amidové skupiny Gln. Produktem biosyntézy je uridinmonofosfát (UMP), který je prekurzorem cytidinmonofosfátu (CMP).

C

N

NC

CC

5

61

2

34

Amidoskupina

glutaminu

HCO3

-

Aspartát

31

Biosyntéza uridinmonofosfátu (UMP)

• Syntéza UMP je šestistupňová. Na rozdíl od biosyntézy purinů je pyrimidinový kruh syntetizován samostatně a teprve poté je připojen k ribosa-5-fosfátu.

• 1.Syntéza karbamoylfosfátu. Cytosolární enzym karbamoylfosfát-synthetasa II. Karbamoylfosfát je syntetizován z HCO3

- a amidového dusíku Gln za spotřeby dvou ATP. Srovnej s močovinovým cyklem.

• 2.Syntéza karbamoylaspartátu. Kondenzace karbamoylfosfátu s Asp za katalýzy aspartáttranskarbamoylasy. Bez spotřeby ATP!!!

• 3.Uzavření kruhu za tvorby dihydroorotátu.

• 4.Oxidace dihydroorotátu na orotát. Reakce je ireversibilní, enzym dihydroorotátdehydrogenasa. Enzym obsahuje FMN a nehemové Fe, je lokalizován na vnější straně vnitřní mitochondriální membrány, kde je reoxidován chinony. Ostatní enzymy jsou cytosolární.

• Inhibice dihydroorotátdehydrogenasy blokuje syntézu pyrimidinů v T lymfocytech a tak potlačuje autoimunitní onemocnění rheumatoidní arthritidu.

32

Biosyntéza uridinmonofosfátu

• 5.Vstup ribosa-5-fosfátu. Orotát reaguje s PRPP za tvorby orotidin-5´-monofosfátu (OMP). Reakce je poháněna hydrolýzou PPi. Enzym: orotátfosforibosyltransferasa se také podílí na recyklaci ostatních pyrimidinových bází jako jsou uracil a cytosin.

• 6.Dekarboxylace OMP za tvorby UMP. Enzym OMP dekarboxylasa (ODCasa) urychluje tvorbu UMP faktorem 2 x 1023 – jeden z nejúčinnějších enzymů vůbec!!

• Poznámka: Biosyntéza pyrimidinů je cílem antiparasitických léčiv. Např. parazit Toxoplasma gondii (toxoplasmosa) způsobuje oslepnutí, neurologické dysfunkce a u lidí se sníženou imunitou i smrt. Místem zásahu je karbamoylfosfátsynthetasa II, enzym, který se strukturou i kinetikou liší od savčího. Parazit není schopen využít pyrimidinové báze hostitele a proto je musí syntetizovat de novo.

33

1. Syntéza karbamoylfosfátu. Cytosolární enzym karbamoylfosfátsynthetasa II. Karbamoylfosfát je syntetizován z HCO3

- a amidového dusíku Gln za spotřeby dvou ATP.

Karbamoylfosfátsynthetasa II1

Karbamoylfosfát

NH2

C

O PO3

O

2-

2 ATP + HCO3

- + Glutamin + H2O

2 ADP + Glutamát + Pi

34

2. Syntéza karbamoylaspartátu. Kondenzace karbamoylfosfátu s Asp za katalýzy aspartáttranskarbamoylasy. Bez spotřeby ATP!!!

Aspartáttranskarbamoylasa (ATCasa)2

Pi

Karbamoylfosfát

NH2

C

O PO3

O

2-

Aspartát

CH

CH2

N

H

C

O

OH

CO COO

NH2

-

Karbamoylaspartát

35

3. Uzavření kruhu za tvorby dihydroorotátu.

Dihydroorotasa3

H2O

CH

CH2

N

H

C

O

CO COO

NH

-

Dihydroorotát

CH

CH2

N

H

C

O

OH

CO COO

NH2

-

Karbamoylaspartát

36

4. Oxidace dihydroorotátu na orotát. Reakce je ireversibilní, enzym dihydroorotátdehydrogenasa. Enzym obsahuje FMN a nehemové Fe, je lokalizován na vnější straně vnitřní mitochondriální membrány, kde je

reoxidován chinony.

Dihydroorotátdehydrogenasa4

Chinol

C

CH

N

H

C

O

CO COO

NH

-

Orotát

CH

CH2

N

H

C

O

CO COO

NH

-

Dihydroorotát

Chinon

37

5. Vstup ribosa-5-fosfátu. Orotát reaguje s PRPP za tvorby orotidin-5´-monofosfátu (OMP). Reakce je poháněna hydrolýzou PPi. Enzym:

orotátfosforibosyltransferasa se také podílí na recyklaci ostatních pyrimidinových bází jako jsou uracil a cytosin.

Orotátfosforibosyltransferasa5

PPi

C

CH

N

C

O

CO COO

NH

O O

H

H

OH

H

OH

CH2

H

O3P

-

PPRP

C

CH

N

H

C

O

CO COO

NH

-

Orotidin-5´-monofosfát

(OMP)

b

2-

Orotát

38

6. Dekarboxylace OMP za tvorby UMP. Enzym OMP dekarboxylasa (ODCasa) urychluje tvorbu UMP faktorem 2 x 1023 – jeden z nejúčinnějších

enzymů vůbec!!!

OMP dekarboxylasa6

CO2

CH

CH

N

C

O

CO

NH

O O

H

H

OH

H

OH

CH2

H

O3P

Uridin-5´-monofosfát

(UMP)

b

2-

C

CH

N

C

O

CO COO

NH

O O

H

H

OH

H

OH

CH2

H

O3P

-

Orotidin-5´-monofosfát

(OMP)

b

2-

39

Syntéza uridintrifosfátu (UTP) a cytidintrifosfátu (CTP)

• Enzymy: nukleosidmonofosfátkinasa a nukleosiddifosfátkinasa analogie syntézy purinových nukleotidtrifosfátů.

UMP + ATP UDP + ADP

UDP + ATP UTP + ADP

• CTP se tvoří aminací UTP enzymem CTP synthasa. U živočichů je donorem aminoskupiny Gln, u baktérií přímo NH3.

O

N

O

H

H

OH

H

OH

CH2

H

P

O

O-

O P

O

O-

P OO-

O

O-

NH

O

O

UTP

Glutamin

+ ATP + H2O

Glutamát

+ ADP + Pi

O

N

O

H

H

OH

H

OH

CH2

H

P

O

O-

O P

O

O-

P OO-

O

O-

NH

NH2

O

CTP40

Regulace biosyntézy pyrimidinových nukleotidů - inhibice zpětnou vazbou

AKTIVACE

BIOSYNTÉZA PYRIMIDINŮ U BAKTERIÍ

(E. coli)BIOSYNTÉZA PYRIMIDINŮ U ŽIVOČICHŮ

HCO3

- + Glutamin + ATP

Karbamoylfosfát

Karbamoylaspartát

Dihydroorotát

Orotát

OMPINHIBICE

UMP

UDP

UTP

CTP

PRPP

HCO3

- + Glutamin + ATP

Karbamoylfosfát

Karbamoylaspartát

Dihydroorotát

Orotát

OMP

INHIBICE

UMP

UDP

UTP

CTP

PRPP

AKTIVACE

41

Biosyntéza deoxyribonukleotidů

• Deoxyribonukleotidy jsou syntetizovány z odpovídajících ribonukleotidů redukcí pozice 2´. Katalyzují allosterické enzymy ribonukleotidreduktasy (RNR). Substrátem je nukleosiddifosfát, reakce je radikálová a RNR je udržována v redukovaném stavu thioredoxinem. Po redukci je dNDP fosforylován ATP na dNTP.

O

Báze

O

H

H

OH

H

OH

H

P

O

O-

O P

O

O-

O-

NDP

O

Báze

O

H

H

H

H

OH

H

P

O

O-

O P

O

O-

O-

dNDP

42

Biosyntéza deoxythymidinmonofosfátu

• Deoxythymidinmonofosfát (dTMP), součást DNA, je syntetizován methylací dUMP. dUMP je generován hydrolýzou dUTP:

dUTP + H2O dUMP + PPi

• Vytvořený dTMP je ihned fosforylován na dTTP!!! Tyto dvě reakce spotřebovávající energii jsou nutné jako prevence vstupu dUTP do DNA. Enzymový systém katalyzující syntézu DNA z dNTP efektivně nerozlišuje mezi dUTP a dTTP.

• Vlastní methylace dUMP: enzym thymidylátsynthasa a nositel methylu N 5, N 10 –methylentetrahydrofolát (N 5, N 10 –methylen-THF).

• Poznámka:přenášená methylenová skupina, mající oxidační stav formaldehydu, je redukována na methyl (oxidační stav methanol) na úkor oxidace THF na dihydrofolát (DHF).

43

Schéma methylace dUMP na dTMP

C

C

N

C

CO

N

O

H

H

H

D-ribosa-5-fosfát

dUMP

6

5

CH2

N

N

H

N

N

N

CH2

CH2O

H

NH2

R

H7

65

8

9

10

N 5,N 10-Methylentetrahydrofolát

+

C

C

N

C

CO

N

O

H CH3

H

D-ribosa-5-fosfát

dTMP

CH2

N

N

H

N

N

NH

CH2

O

H

NH2

RDihydrofolát

+

C N

H

CH CH2 CH2 C O-

O COO O-

nR = ; n = 1-6

44

Regenerace N 5, N 10 –methylentetrahydrofolátu Dihydrofolátreduktasa (DHFR) (FdUMP = fluordeoxyuridinmonofosfát)

DHF

THF

N 5,N 10-Methylen-THF

Methotrexát

Aminopterin

Trimethoprim

dUMP dTMPFdUMP

Thymidylátsynthasa

NADPH + H+

NADP+

Dihydrofolátreduktasa

NH3+

CH COO

CH2OH

-

Serin

NH3+

CH2 COO-

Glycin

Serinhydroxymethyltransferasa

45

Inhibice thymidylátsynthasy nebo dihydrofolátreduktasy – terapie rakoviny

• Tvorba dTTP je kritický proces pro rychle proliferující buňky - rakovinné. Přerušení syntézy dTTP vede k jejich zániku. Normální buňky, kromě buněk kostní dřeně, imunitního systému, kartáčového lemu střev a vlasových uzlíků, jsou na tyto zásahy méně citlivé.

• 5-Fluordeoxyuridylát (FdUMP) je ireversibilní inhibitor thymidylátsynthasy. FdUMP se váže na thymidylátsynthasu jako dUMP. Při vlastní methylaci nelze odštěpit F (F+) stejně jako H+ a enzym je tak svázán v inaktivním kovalentním ternárním komplexu enzym-FdUMP-THF. Takové inhibitory nazýváme mechanism-based inhibitors nebo také suicide substrates (sebevražedné substráty).

O

N

O

OH

H

H

H

OH

H

P

O

O-

O-

C

CC

CO

N

O

H F

H

5-Fluorodeoxyuridylát

(FdUMP)

46

Inhibice dihydrofolátreduktasy. Blokuje se regenerace THF. Antifoláty, DHF analoga, se váží na DHFR 1 000 x pevněji než DHF.

R = H Aminopterin

R = CH3 Methotrexát (amethopterin)

N

N

NH2

CH2 OCH3

OCH3

OCH3

NH2

CH2

N

N

H

N

NNCH2

NH2

H

NH2

R

C N

H

CH CH2 CH2 COO

O COO-

-

Trimethoprim

47

Odbourávání (katabolismus) nukleotidů • Většina potravy obsahuje nukleové kyseliny. Nukleové kyseliny jsou

intaktní ke kyselému prostředí žaludku a jsou odbourávány až v tenkém střevě pankreatickými nukleasami a střevními fosfodiesterasami. Iontová povaha nukleotidů jim nedovoluje procházet přes buněčné membrány a proto jsou hydrolyzovány na nukleosidy. Nukleosidy jsou ve střevní stěně hydrolyzovány nukleosidasami a nukleosidfosforylasami:

Nukleosidasa: Nukleosid + H2O báze + ribosa

Nukleosidfosforylasa: Nukleosid + Pi báze + ribosa-5-fosfát

• Z potravy je recyklováno jen velmi malé množství bází nukleových kyselin – musí probíhat biosyntéza de novo.

• Ribosa-1-fosfát jako produkt purinnukleosidfosforylasy (PNP) je prekurzorem PRPP.

• Adenosin a deoxyadenosin nejsou štěpeny savčí PNP. Jsou deaminovány adenosindeaminasou (ADA) a AMP deaminasou na odpovídající deriváty inosinu, které jsou dále degradovány. 48

Schéma katabolismu purinových nukleotidů 1. část

Purinnukleosidfosforylasa

(PNP)

N

N

N

N

NH2

Ribosa-5-fosfát

N

N

N

N

O

Ribosa-5-fosfát

H

N

N

N

N

O

Ribosa-5-fosfát

O

H

H

N

N

N

H

N

O

Ribosa-5-fosfát

NH2

H

AMP IMP XMP GMP

H2O

Pi

Nukleotidasa

AMP deaminasa

H2O NH

4

+

AdenosinAdenosindeaminasa

H2O NH

4

+

H2O

Pi

Nukleotidasa

Inosin

Ribosa-1-P

Purinnukleosidfosforylasa

(PNP)

Hypoxanthin

Pi

H2O

Pi

Nukleotidasa

Xanthosin

Ribosa-1-P

Purinnukleosidfosforylasa

(PNP)

Xanthin

Pi

H2O

Pi

Nukleotidasa

Guanosin

Ribosa-1-P

Guanin

Pi

Xanthinoxidasa Guanindeaminasa

O2 + H

2O H

2O

2NH

4

+ H2O

49

Schéma katabolismu purinových nukleotidů 2. část

O2 + H

2O H

2O

2

Hypoxanthin

H2O

2

Xanthin

O2 + H

2O

GuaninXanthinoxidasa Guanindeaminasa

NH4

+ H2O

Xanthinoxidasa

N

N

N

N

O

O

H

H

O

H

H

Močová kyselina

50

Cyklus purinových nukleotidů

• Cyklus hraje důležitou roli v kosterním svalstvu. Zvyšuje se svalová aktivita zvyšováním aktivity citrátového cyklu. Svaly nemají dostatečné množství enzymů, které by doplňovaly meziprodukty citrátového cyklu – anaplerotické reakce. Cyklus purinových nukleotidů je dodavatelem fumarátu pro svalový citrátový cyklus!!!

IMP

Adenylosukcinát

AMP

H2O NH

4

+

AMP deaminasa

Aspartát + GTP

GDP + Pi

AdenylosukcinátsynthetasaAdenylosukcinátlyasa

Fumarát

H2O + Aspartát + GTP NH

4+ + GDP + P

i + Fumarát51

N

N

N

N

NH COO

OOC

H

D-ribosa-5-fosfát

-

-

Adenylosukcinát

Xanthinoxidasa (XO) Převádí hypoxanthin (báze IMP) na xanthin a močovou kyselinu.

• U savců je XO v játrech a v lemu tenkého střeva. XO je homodimer obsahující FAD a Mo komplex cyklující mezi Mo6+ a Mo4+. Koncovým akceptorem elektronů je O2 přecházející na H2O2 (nebezpečný – velmi silné oxidační činidlo), který je okamžitě štěpen katalasou na H2O a O2.

Hypoxanthin Xanthin

N

H

NH

N

N

O

N

H

NH

N

H

N

O

O

Močová kyselina

(enol forma)

N

H

NH

N

H

N

O

O

O H7

89

Močová kyselina

(keto forma)

N

H

NH

N

H

N

O

O

O

H

Ureát

N

H

NH

N

H

N

O

O

O-

H++

pK = 5.4

52

Osud močové kyseliny

• Konečným produktem degradace purinů u člověka a primátů je močová kyselina vylučovaná močí.

• Totéž platí pro ptáky, suchozemské plazy a většinu hmyzu. Smyslem je zadržovat vodu, protože močová kyselina je jen omezeně rozpustná ve vodě a proto její vylučování ve formě krystalů nebo pasty šetří pro organismus vodu.

• U všech dalších organismů je močová kyselina dále degradována.

• Savci, vyjma primátů, oxidují močovou kyselinu na ve vodě dobře rozpustný allantoin.

• Kostnaté ryby štěpí allantoin dále na allantoovou kyselinu.

• Chrupavčité ryby a obojživelníci degradují allantoovou kyselinu na močovinu a tu vyměšují.

• Mořští bezobratlí rozkládají močovinu na amoniak a amonné ionty.

53

Schéma další degradace močové kyseliny

N

NH

N

H

N

O

O

O

H

HMočová kyselina

VYLUČOVANO:

Primáti

Ptáci

Plazi

Hmyz

2 H2O + O

2

Urátoxidasa CO

2 + H

2O

2

N

NH2

N

H

N

O

O

H

H

O

Allantoin

Další savci

H2O

Allantoinasa

NH2

N

H

COOH

O

NH2

N

H

O

Allantoová kyselina

Kostnaté ryby

H2O

Allantoikasa

Močovina

Chrupavčité ryby

Obojživelníci

OHC-COOHGlyoxylová kyselina

O

CNH2 NH22

2 H2O

Ureasa

Mořští bezobratlí

2 CO2

4 NH4

+54

Dna je onemocnění provázené zvýšenou hladinou močové kyseliny v tělesných tekutinách.

• Jednou z nejvýznamnějších příčin dny je narušené vylučování močové kyseliny. Jedním z důvodů je nedostatečnost HGPRT (Hypoxanthin-guaninfosforibosyltransferasa - Lesch-Nyhamův syndrom) vedoucí k její nadměrné produkci z důvodů akumulace PRPP.

• Dna se léčí podáním inhibitoru xanthinoxidasy allopurinolu, což je strukturní analog hypoxanthinu. XO allopurinol hydroxyluje na alloxanthin, který se pevně naváže na redukovanou formu enzymu a tím ho ireversibilně inhibuje. Příklad „suicide inhibitor“ nebo mechanism-based substrate.

Hypoxanthin Alloxanthin

N

H

NH

N

N

O

N

H

NH

N

H

N

O

O

Allopurinol

N

H

NH

N

N

O

78

55

Odbourávání (katabolismus) pyrimidinových nukleotidů

• Živočišné buňky degradují pyrimidinové nukleotidy na jejich báze. Reakce probíhají přes defosforylace, deaminace a štěpení glykosidových vazeb. Vznikající uracil a thymin jsou dále štěpeny v játrech redukčně, na rozdíl od purinových bází (oxidace).

• Konečnými produkty jsou b-alanin a b-aminoisobutyrát.

• Obě sloučeniny jsou dále převáděny transaminací a aktivací na malonyl-CoA a methylmalonyl-CoA.

• Malonyl-CoA je prekurzor biosyntézy mastných kyselin a methylmalonyl-CoA je převeden na meziprodukt citrátového cyklu sukcinyl-CoA.

• Závěr:produkty degradace pyrimidinových nukleotidů přispívají k energetickému metabolismu buňky.

56

Degradace pyrimidinových nukleotidů I. část

N

N

NH2

Ribosa-5-fosfát

O H

H

CMP UMP (dTMP)

H2O

Pi

Nukleotidasa

CytidinCytidindeaminasa

H2O NH

4

+

H2O

Pi

Nukleotidasa

Uridin

(Deoxythymidin)

(d)Ribosa-1-P

Uridinfofsforylasa

Uracil

(Thymin)

Pi

Dihydrouracildehydrogenasa

N

N

O

Ribosa-5-fosfát

O

H CH3

H

Dihydrouracil

(Dihydrothymin)NADPH + H+ NADP+

N

N

H

O

O

H CH3

H

HH

57

Degradace pyrimidinových nukleotidů II. část

b-Ureidopropionasa

NH4

+ + CO2

H2O

H2O

Hydropyrimidinhydratasa

Dihydrouracil

(Dihydrothymin)

N

N

H

O

O

H CH3

H

HH

b-Ureidopropionát

(b-Ureidoisobutyrát)

N

H

CH2

CHC

O-

O

CH3

NH2

O

b-Alanin

(b-Aminoisobutyrát)

NH2

CH2

CHOOC CH3

-

58

Transaminace a aktivace b-alaninu a b-aminoisobutyrátu

NADH + H+

CoA + NAD+

Aminotransferasa

2-Oxoglutarát Malonát semialdehyd

(Methylmalonát semialdehyd)

b-Alanin

(b-Aminoisobutyrát)

NH2

CH2

CHOOC CH3

-

Glutamát

OCH

CH

COO

CH3

-

Malonyl-CoA

(Methylmalonyl-CoA)

OC

CH

COO

CH3

CoAS

-

59