Embed Size (px)
Citation preview
Inovace studia biochemie prostřednictvím e-learningu
CZ.04.1.03/3.2.15.3/0407
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem
a státním rozpočtem České republiky.
Základy biochemie KBC/BCH
Metabolismus nukleotidů
Metabolismus nukleotidů
• Osnova • Syntéza purinových ribonukleotidů • a. Syntéza adeninových a guaninových ribonukleotidů • b. Kontrola biosyntézy purinových nukleotidů • c. Recyklace purinů • Syntéza pyrimidinových nukleotidů • a. Syntéza uridinmonofosfátu • b. Syntéza uridintrifosfátu a cytidintrifosfáttu • c. Regulace biosyntézy pyrimidinových nukleotidů • Tvorba deoxyribonukleotidů • Tvorba thyminu • Odbourávání nukleotidů • a. Katabolismus purinů • b. Dráha močové kyseliny • c. Katabolismus pyrimidinů 2
Struktura purinu a pyrimidinu
N
N
N
N
H
N
N
Purin Pyrimidin
1
23
4
56
78
9
5
61
2
34
3
Ribosa a 2-deoxyribosa
OH HO
OH
H
OH
H
OH
CH2
H
D-Ribosa
123
4
5
OH HO
OH
H
H
H
OH
CH2
H
2-D-Deoxyribosa
123
4
5
4
b-N-glykosidová vazba. Vazby se účastní uhlík C1´
N
N
N
N
NH2
OH O
HH
OH
CH2
H H
b-N-Glykosidová
vazba
5
Ribonukleotid a deoxyribonukleotid Nukleosid = báze + pentosa
Nukleotid = báze + pentosa + fosfát
O
Báze
O
OH
H
OH
H
OH
CH2
H
O3P
5´-Ribonukleotid
1´2´3´
4´
5´
OH
Báze
O
OH
H
H
H
O
CH2
H
O3P
3´-Deoxyribonukleotid
1´2´3´
4´
5´2-
2-
6
Názvy a zkratky bází nukleových kyselin, nukleosidů a nukleotidů
7
Biosyntéza purinových ribonukleotidů
• Nukleotidy jsou fosforečné estery pentos (ribosy nebo deoxyribosy), ve kterých je purinová nebo pyrimidinová báze vázána na uhlík C1´sacharidu.
• V roce 1948 John Buchanan dělal pokusy s holuby, které krmil různými sloučeninami - značené izotopy a zjišťoval pozici značených atomů ve vylučované močové kyselině.
• Buchananovy závěry:
N
H
C
N
NC
CC N
C
Amidoskupina
glutaminu
1
23
4
56
78
9Formiát
Aminoskupina
aspartátu Formiát
Glycin
HCO3
-
8
Schéma biosyntézy IMP, ATP, GTP, dATP a dGTP
9
Inosinmonofosfát (IMP) – prekurzor AMP a GMP
O
N
O
H
H
OH
H
OH
H
NH
N
N
O
PO-
O
O-
Hypoxanthin
Inosinmonofosfát (IMP)
10
Jednotlivé kroky biosyntézy inosinmonofosfátu
• 1.Výchozím materiálem je produkt pentosafosfátové dráhy a-D-ribosa-5-fosfát, která se aktivuje ATP na 5-fosforibosyl-a-pyrofosfát (PRPP).
• 2.Vstup atomu N9 purinu reakcí PRPP s Gln. Dochází k inverzi konfigurace na b. Kontrolní krok biosyntézy – současná hydrolýza PPi!! Vznik b-5-fosforibosylaminu (PRA).
• 3.Vstup purinových atomů C4, C5 a N7. Atomy vstupují ve formě Gly na PRA za tvorby glycinamidribotidu (GAR).
• 4.Vstup purinového atomu C8. Volná aminoskupina GAR je formylována N 10-formyl-THF za tvorby formylglycinamidribotidu (FGAR).
• 5.Vstup purinového atomu N3. Vstupuje ve formě Gln za účasti ATP ADP + Pi.
• 6.Tvorba imidazolového kruhu purinu. Intramolekulární kondenzace za účasti ATP tvoří 5-aminoimidazolribotidu (AIR).
• 7.Vstup C6 atomu purinu. Vstupuje jako HCO3- za katalýzy AIR
karboxylasy a vzniku karboxyaminoimidazolribotidu (CAIR).
11
Jednotlivé kroky biosyntézy inosinmonofosfátu (IMP)
• 8.Vstup N1 atomu purinu. Vstupuje formou aminoskupiny Asp za účasti ATP ADP + Pi a tvorby 5-aminoimidazol-4-(N-sukcinylokarboxamid)- ribotidu (SAICAR).
• 9.Odštěpení fumarátu z SAICAR. Podobná reakce reakci močovinového cyklu. Tvoří se 5-aminoimidazol-4-karboxamidribotid (AICAR).
• 10.Vstup C2 atomu purinu. Druhá formylace za účasti N 10-formyl-THF a tvorby 5-formaminoimidazol-4-karboxamidribotidu (FAICAR). Tato reakce a reakce 4 jsou inhibovány sulfonamidy, strukturními analogy p-aminobenzoové kyseliny!!!
• 11.Cyklizace za tvorby IMP. Eliminace vody. Na rozdíl od reakce 4 není nutné ATP.
• Poznámka: U živočichů jsou reakce 10 a 11 katalyzovány bifunkčními enzymy, stejně jako reakce 7 a 8. Reakce 3, 4 a 6 probíhají na jednoduchém proteinu. Meziprodukty multifunkčních enzymů nejsou uvolňovány do prostředí, ale posouvány tunely k dalšímu enzymu.
• Podobná situace je u pyruvátdehydrogenasového komplexu, synthasy mastných kyselin, synthasy glutamátu a tryptofansynthasy. 12
1. Výchozí sloučeninou je produkt pentosafosfátové dráhy a-D-ribosa-5-fosfát, který se aktivuje ATP
na 5-fosforibosyl-a-pyrofosfát (PRPP).
ATP
O O
OH
H
OH
H
OH
CH2
H
O3P H
a-D-Ribosa-5-fosfát
(R5P)
2-
a
AMP
1 Ribosafosfátpyrofosfátkinasa
O O
O
H
OH
H
OH
CH2
H
O3P H
P
O
O-
O-
P O
O
O-
5-Fosforibosyl-a-pyrofosfát
(PRPP)
2-
a
13
2. Vstup atomu N9 purinu reakcí PRPP s Gln. Dochází k inverzi konfigurace v poloze 1´na b.
Kontrolní krok biosyntézy – současná hydrolýza PPi!!! Vznik b-5-fosforibosylaminu (PRA).
Glutamin + H2O
Glutamát + PPi
2 Amidofosforibosyltransferasa
O O
H
H
OH
H
OH
CH2
H
O3P NH2
b-5-Fosforibosylamin
(PRA)
2-
b
O O
O
H
OH
H
OH
CH2
H
O3P H
P
O
O-
O-
P O
O
O-
5-Fosforibosyl-a-pyrofosfát
(PRPP)
2-
a
14
3. Vstup purinových atomů C4, C5 a N7. Atomy vstupují ve formě Gly na PRA za tvorby glycinamidribotidu (GAR).
GAR synthetasa
Glycin + ATP
ADP + Pi
3
O O
H
H
OH
H
OH
CH2
H
O3P NH
O C
CH2 NH2
Glycinamidribotid
(GAR)
2-
b
O O
H
H
OH
H
OH
CH2
H
O3P NH2
b-5-Fosforibosylamin
(PRA)
2-
b
15
4. Vstup purinového atomu C8. Volná aminoskupina GAR je formylována N 10-formyl-THF za tvorby
formylglycinamidribotidu (FGAR).
GAR transformylasa
N 10-Formyl-THF
THF
4
Formylglycinamidribotid
(FGAR)
O O
H
H
OH
H
OH
CH2
H
O3P NH
O C
CH2 NH2
Glycinamidribotid
(GAR)
2-
b
C
CH2
NH
CHN
H
OO
ribosa-5-fosfát
16
5. Vstup purinového atomu N3. Vstupuje ve formě Gln za účasti ATP ADP + Pi.
FGAM synthetasa
ATP + Glutamin + H2O
ADP + Glutamát + Pi
5
Formylglycinamidinribotid
(FGAM)
C
CH2
NH
CHN
H
ONH
ribosa-5-fosfát
Formylglycinamidribotid
(FGAR)
C
CH2
NH
CHN
H
OO
ribosa-5-fosfát
17
6. Tvorba imidazolového kruhu purinu. Intramolekulární kondenzace za účasti ATP tvoří 5-aminoimidazolribotid
(AIR).
AIR synthetasa
ATP
ADP + Pi
6
5-Aminoimidazolribotid
(AIR)
N
ribosa-5-fosfát
C
CHN
CH
NH2
Formylglycinamidinribotid
(FGAM)
C
CH2
NH
CHN
H
ONH
ribosa-5-fosfát
5
18
7. Vstup C6 atomu purinu. Vstupuje jako HCO3
- za katalýzy AIR karboxylasy a vzniku 4-karboxy-5-aminoimidazolribotidu (CAIR).
N
ribosa-5-fosfát
C
CN
CH
NH2
OOC
AIR karboxylasa
ATP + HCO3
-
ADP + Pi
7
4-Karboxy-5-aminoimidazolribotid
(CAIR)
5-Aminoimidazolribotid
(AIR)
N
ribosa-5-fosfát
C
CHN
CH
NH2
5
5
4
-
19
8. Vstup N1 atomu purinu. Vstupuje formou aminoskupiny Asp za účasti ATP ADP + Pi a tvorby
5-aminoimidazol-4-(N-sukcinylokarboxamid)-ribotidu (SAICAR).
SAICAR synthetasa
Aspartát + ATP
ADP + Pi
8
5-Aminoimidazol-4-(sukcinylokarboxamid)-ribotid
(SAICAR)
N
ribosa-5-fosfát
C
CN
CH
NH2
C
OCOO
CH NH
CH2
COO
5
4
-
4-Karboxy-5-aminoimidazolribotid
(CAIR)
N
ribosa-5-fosfát
C
CN
CH
NH2
OOC
5
4
-
-
20
9. Odštěpení fumarátu z SAICAIR. Reakce podobná reakci močovinového cyklu. Tvoří se 5-aminoimidazol-4-
karboxamidribotid (AICAR).
AdenylosukcinátlyasaFumarát
9
5-Aminoimidazol-4-karboxamidribotid
(AICAR)
N
ribosa-5-fosfát
C
CN
CH
NH2
C
O
NH2
5
4
5-Aminoimidazol-4-(sukcinylokarboxamid)-ribotid
(SAICAR)
N
ribosa-5-fosfát
C
CN
CH
NH2
C
OCOO
CH NH
CH2
COO
5
4
-
-
21
10. Vstup C2 atomu purinu. Druhá formylace za účasti N 10-formyl-THF a tvorby 5-formaminoimidazol-
4-karboxamidribotidu (FAICAR). Tato reakce a reakce 4 jsou inhibovány sulfonamidy, strukturními analogy p-aminobenzoové kyseliny!!!
AICAR Transformylasa10
5-Formaminoimidazol-4-karboxamidribotid
(FAICAR)
N
ribosa-5-fosfát
C
CN
CH
N
H
C
O
NH2
CHO 5
4
N 10-Formyl-THF
THF
5-Aminoimidazol-4-karboxamidribotid
(AICAR)
N
ribosa-5-fosfát
C
CN
CH
NH2
C
O
NH2
5
4
22
11. Cyklizace za tvorby IMP. Eliminace vody. Na rozdíl od reakce 4 není nutné ATP.
IMP cyklohydrolasa11
Inosin-5´-monofosfát
(IMP)
NC
CN
CH
N
C
O
NH
CH
O O
OH
H
OH
H
OH
H
O3P
5
4
H2O
5-Formaminoimidazol-4-karboxamidribotid
(FAICAR)
N
ribosa-5-fosfát
C
CN
CH
N
H
C
O
NH2
CHO 5
4
2-
23
Biosyntéza adeninového a guaninového ribonukleotidu
• IMP se v buňkách neakumuluje a ihned se převádí na AMP a GMP.
• AMP se syntetizuje z IMP ve dvou krocích. Na IMP se nejprve naváže Asp, což je spojeno s hydrolýzou GTP GDP a Pi. V další reakci se eliminuje fumarát z adenylosukcinátu za tvorby AMP.
• GMP se syntetizuje z IMP také ve dvou krocích. IMP se dehydrogenuje za účasti NAD+ NADH za tvorby xanthinmonofosfátu (XMP). Druhým krokem je vstup amidového dusíku Gln za účasti ATP AMP + PPi a tvorby GMP.
O
OHO
CH3
OCH3
CH3
OH
O
Mykofenolová kyselina
Poznámka: V B aT lymfocytech, odpovídajících za imunitní odpověď organismu, je vysoká aktivita IMP dehydrogenasy vedoucí ke zvýšené tvorbě GMP nutných pro proliferaci. Produkt plísně, mykofenolová kyselina, tento enzym inhibuje a využívá se jako imunosupresivum po transplantacích!! 24
Adenylosukcinátsynthetasa
Inosin-5´-monofosfát
(IMP)
N
N
N
O
N
ribosa-5-fosfát
H
Aspartát + GTP
Adenylosukcinát
N
N
N
NH
N
ribosa-5-fosfát
OOC CH2 CH COO
Xantosin-5´-monofosfát
(XMP)
N
N
N
O
N
ribosa-5-fosfát
H
O
H
GDP + Pi
NAD+ + H2O
NADH + H+
IMP dehydrogenasa
- -
První krok biosyntézy AMP a GMP
25
Druhý rok biosyntézy AMP a GMP
Adenylosukcinátlyasa
Adenylosukcinát
N
N
N
NH
N
ribosa-5-fosfát
OOC CH2 CH COO
Xantosin-5´-monofosfát
(XMP)
N
N
N
O
N
ribosa-5-fosfát
H
O
H
Glutamin + ATP + H2O
Glutamát + AMP + PPi
- -
GMP synthetasa
Guanosin-5´-monofosfát
(GMP)
N
N
N
O
N
ribosa-5-fosfát
H
NH2
H
Adenosin-5´-monofosfát
(AMP)
N
N
N
NH2
N
ribosa-5-fosfát
Fumarát
26
Biosyntéza nuklosiddifosfátů a nukleosidtrifosfátů
• Aby byl umožněn vstup nukleotidů do nukleových kyselin, musí být nejprve nukleosidmonofosfáty převedeny na odpovídající trifosfáty.
• Převedení na nukleosiddifosfáty: nukleosidmonofosfátkinasy.
• Např. adenylátkinasa – AMP + ATP 2 ADP
• Podobně guanylátkinasa – GMP + ATP GDP + ADP
• Nukleosiddifosfáty jsou převáděny na nukleosidtrifosfáty –nukleosiddifosfátkinasou.
GDP + ATP GTP + ADP
27
Regulace biosyntézy purinových nukleotidů
• Dvě hladiny regulace.
• A) Rychlost tvorby IMP je nezávislá, ale synergicky kontrolována hladinou adeninových a guaninových nukleotidů. Vysoká hladina nukleotidů inhibuje syntézu IMP.
• B) Místo regulace je krok následující po syntéze IMP. Rychlost syntézy GTP se zvyšuje s koncentrací [ATP], zatímco rychlost syntézy AMP
s rostoucí koncentrací [GTP].
28
Schéma regulace biosyntézy purinových nukleotidů Ribosa-5-fosfát
PRPP
5-Fosforibosylamin
IMP
Adenylosukcinát
AMP
ADP
ATP
XMP
GMP
GDP
GTP
AKTIVACEINHIBICE
29
Recyklace purinových nukleotidů
• Při obměně nukleových kyselin se nejprve uvolňují báze adenin, guanin a hypoxanthin, a ty jsou dále recyklovány cestou odlišnou od biosyntézy.
• U savců jsou puriny recyklovány dvěma enzymy:
• Adeninfosforibosyltransferasa (APRT) katalyzující reakci:
Adenin + PRPP AMP + PPi
• Hypoxanthin-guaninfosforibosyltransferasa (HGPRT) katalyzující reakci:
Hypoxanthin + PRPP IMP + PPi
Guanin + PRPP GMP + PPi
• Lesch-Nyhamův syndrom – deficit HGPRT u chlapců, akumuluje se PRPP, vysoká hladina močové kyseliny v moči, spojeno s neurologickými potížemi, agresívní a destruktivní chování.
30
Biosyntéza pyrimidinových nukleotidů
• Biosyntéza pyrimidinů je podstatně jednodušší než biosyntéza purinů.
Čtyři atomy pyrimidinu jsou z Asp, jeden C2, má původ v CO2 a dusíkový atom N3 je z amidové skupiny Gln. Produktem biosyntézy je uridinmonofosfát (UMP), který je prekurzorem cytidinmonofosfátu (CMP).
C
N
NC
CC
5
61
2
34
Amidoskupina
glutaminu
HCO3
-
Aspartát
31
Biosyntéza uridinmonofosfátu (UMP)
• Syntéza UMP je šestistupňová. Na rozdíl od biosyntézy purinů je pyrimidinový kruh syntetizován samostatně a teprve poté je připojen k ribosa-5-fosfátu.
• 1.Syntéza karbamoylfosfátu. Cytosolární enzym karbamoylfosfát-synthetasa II. Karbamoylfosfát je syntetizován z HCO3
- a amidového dusíku Gln za spotřeby dvou ATP. Srovnej s močovinovým cyklem.
• 2.Syntéza karbamoylaspartátu. Kondenzace karbamoylfosfátu s Asp za katalýzy aspartáttranskarbamoylasy. Bez spotřeby ATP!!!
• 3.Uzavření kruhu za tvorby dihydroorotátu.
• 4.Oxidace dihydroorotátu na orotát. Reakce je ireversibilní, enzym dihydroorotátdehydrogenasa. Enzym obsahuje FMN a nehemové Fe, je lokalizován na vnější straně vnitřní mitochondriální membrány, kde je reoxidován chinony. Ostatní enzymy jsou cytosolární.
• Inhibice dihydroorotátdehydrogenasy blokuje syntézu pyrimidinů v T lymfocytech a tak potlačuje autoimunitní onemocnění rheumatoidní arthritidu.
32
Biosyntéza uridinmonofosfátu
• 5.Vstup ribosa-5-fosfátu. Orotát reaguje s PRPP za tvorby orotidin-5´-monofosfátu (OMP). Reakce je poháněna hydrolýzou PPi. Enzym: orotátfosforibosyltransferasa se také podílí na recyklaci ostatních pyrimidinových bází jako jsou uracil a cytosin.
• 6.Dekarboxylace OMP za tvorby UMP. Enzym OMP dekarboxylasa (ODCasa) urychluje tvorbu UMP faktorem 2 x 1023 – jeden z nejúčinnějších enzymů vůbec!!
• Poznámka: Biosyntéza pyrimidinů je cílem antiparasitických léčiv. Např. parazit Toxoplasma gondii (toxoplasmosa) způsobuje oslepnutí, neurologické dysfunkce a u lidí se sníženou imunitou i smrt. Místem zásahu je karbamoylfosfátsynthetasa II, enzym, který se strukturou i kinetikou liší od savčího. Parazit není schopen využít pyrimidinové báze hostitele a proto je musí syntetizovat de novo.
33
1. Syntéza karbamoylfosfátu. Cytosolární enzym karbamoylfosfátsynthetasa II. Karbamoylfosfát je syntetizován z HCO3
- a amidového dusíku Gln za spotřeby dvou ATP.
Karbamoylfosfátsynthetasa II1
Karbamoylfosfát
NH2
C
O PO3
O
2-
2 ATP + HCO3
- + Glutamin + H2O
2 ADP + Glutamát + Pi
34
2. Syntéza karbamoylaspartátu. Kondenzace karbamoylfosfátu s Asp za katalýzy aspartáttranskarbamoylasy. Bez spotřeby ATP!!!
Aspartáttranskarbamoylasa (ATCasa)2
Pi
Karbamoylfosfát
NH2
C
O PO3
O
2-
Aspartát
CH
CH2
N
H
C
O
OH
CO COO
NH2
-
Karbamoylaspartát
35
3. Uzavření kruhu za tvorby dihydroorotátu.
Dihydroorotasa3
H2O
CH
CH2
N
H
C
O
CO COO
NH
-
Dihydroorotát
CH
CH2
N
H
C
O
OH
CO COO
NH2
-
Karbamoylaspartát
36
4. Oxidace dihydroorotátu na orotát. Reakce je ireversibilní, enzym dihydroorotátdehydrogenasa. Enzym obsahuje FMN a nehemové Fe, je lokalizován na vnější straně vnitřní mitochondriální membrány, kde je
reoxidován chinony.
Dihydroorotátdehydrogenasa4
Chinol
C
CH
N
H
C
O
CO COO
NH
-
Orotát
CH
CH2
N
H
C
O
CO COO
NH
-
Dihydroorotát
Chinon
37
5. Vstup ribosa-5-fosfátu. Orotát reaguje s PRPP za tvorby orotidin-5´-monofosfátu (OMP). Reakce je poháněna hydrolýzou PPi. Enzym:
orotátfosforibosyltransferasa se také podílí na recyklaci ostatních pyrimidinových bází jako jsou uracil a cytosin.
Orotátfosforibosyltransferasa5
PPi
C
CH
N
C
O
CO COO
NH
O O
H
H
OH
H
OH
CH2
H
O3P
-
PPRP
C
CH
N
H
C
O
CO COO
NH
-
Orotidin-5´-monofosfát
(OMP)
b
2-
Orotát
38
6. Dekarboxylace OMP za tvorby UMP. Enzym OMP dekarboxylasa (ODCasa) urychluje tvorbu UMP faktorem 2 x 1023 – jeden z nejúčinnějších
enzymů vůbec!!!
OMP dekarboxylasa6
CO2
CH
CH
N
C
O
CO
NH
O O
H
H
OH
H
OH
CH2
H
O3P
Uridin-5´-monofosfát
(UMP)
b
2-
C
CH
N
C
O
CO COO
NH
O O
H
H
OH
H
OH
CH2
H
O3P
-
Orotidin-5´-monofosfát
(OMP)
b
2-
39
Syntéza uridintrifosfátu (UTP) a cytidintrifosfátu (CTP)
• Enzymy: nukleosidmonofosfátkinasa a nukleosiddifosfátkinasa analogie syntézy purinových nukleotidtrifosfátů.
UMP + ATP UDP + ADP
UDP + ATP UTP + ADP
• CTP se tvoří aminací UTP enzymem CTP synthasa. U živočichů je donorem aminoskupiny Gln, u baktérií přímo NH3.
O
N
O
H
H
OH
H
OH
CH2
H
P
O
O-
O P
O
O-
P OO-
O
O-
NH
O
O
UTP
Glutamin
+ ATP + H2O
Glutamát
+ ADP + Pi
O
N
O
H
H
OH
H
OH
CH2
H
P
O
O-
O P
O
O-
P OO-
O
O-
NH
NH2
O
CTP40
Regulace biosyntézy pyrimidinových nukleotidů - inhibice zpětnou vazbou
AKTIVACE
BIOSYNTÉZA PYRIMIDINŮ U BAKTERIÍ
(E. coli)BIOSYNTÉZA PYRIMIDINŮ U ŽIVOČICHŮ
HCO3
- + Glutamin + ATP
Karbamoylfosfát
Karbamoylaspartát
Dihydroorotát
Orotát
OMPINHIBICE
UMP
UDP
UTP
CTP
PRPP
HCO3
- + Glutamin + ATP
Karbamoylfosfát
Karbamoylaspartát
Dihydroorotát
Orotát
OMP
INHIBICE
UMP
UDP
UTP
CTP
PRPP
AKTIVACE
41
Biosyntéza deoxyribonukleotidů
• Deoxyribonukleotidy jsou syntetizovány z odpovídajících ribonukleotidů redukcí pozice 2´. Katalyzují allosterické enzymy ribonukleotidreduktasy (RNR). Substrátem je nukleosiddifosfát, reakce je radikálová a RNR je udržována v redukovaném stavu thioredoxinem. Po redukci je dNDP fosforylován ATP na dNTP.
O
Báze
O
H
H
OH
H
OH
H
P
O
O-
O P
O
O-
O-
NDP
O
Báze
O
H
H
H
H
OH
H
P
O
O-
O P
O
O-
O-
dNDP
42
Biosyntéza deoxythymidinmonofosfátu
• Deoxythymidinmonofosfát (dTMP), součást DNA, je syntetizován methylací dUMP. dUMP je generován hydrolýzou dUTP:
dUTP + H2O dUMP + PPi
• Vytvořený dTMP je ihned fosforylován na dTTP!!! Tyto dvě reakce spotřebovávající energii jsou nutné jako prevence vstupu dUTP do DNA. Enzymový systém katalyzující syntézu DNA z dNTP efektivně nerozlišuje mezi dUTP a dTTP.
• Vlastní methylace dUMP: enzym thymidylátsynthasa a nositel methylu N 5, N 10 –methylentetrahydrofolát (N 5, N 10 –methylen-THF).
• Poznámka:přenášená methylenová skupina, mající oxidační stav formaldehydu, je redukována na methyl (oxidační stav methanol) na úkor oxidace THF na dihydrofolát (DHF).
43
Schéma methylace dUMP na dTMP
C
C
N
C
CO
N
O
H
H
H
D-ribosa-5-fosfát
dUMP
6
5
CH2
N
N
H
N
N
N
CH2
CH2O
H
NH2
R
H7
65
8
9
10
N 5,N 10-Methylentetrahydrofolát
+
C
C
N
C
CO
N
O
H CH3
H
D-ribosa-5-fosfát
dTMP
CH2
N
N
H
N
N
NH
CH2
O
H
NH2
RDihydrofolát
+
C N
H
CH CH2 CH2 C O-
O COO O-
nR = ; n = 1-6
44
Regenerace N 5, N 10 –methylentetrahydrofolátu Dihydrofolátreduktasa (DHFR) (FdUMP = fluordeoxyuridinmonofosfát)
DHF
THF
N 5,N 10-Methylen-THF
Methotrexát
Aminopterin
Trimethoprim
dUMP dTMPFdUMP
Thymidylátsynthasa
NADPH + H+
NADP+
Dihydrofolátreduktasa
NH3+
CH COO
CH2OH
-
Serin
NH3+
CH2 COO-
Glycin
Serinhydroxymethyltransferasa
45
Inhibice thymidylátsynthasy nebo dihydrofolátreduktasy – terapie rakoviny
• Tvorba dTTP je kritický proces pro rychle proliferující buňky - rakovinné. Přerušení syntézy dTTP vede k jejich zániku. Normální buňky, kromě buněk kostní dřeně, imunitního systému, kartáčového lemu střev a vlasových uzlíků, jsou na tyto zásahy méně citlivé.
• 5-Fluordeoxyuridylát (FdUMP) je ireversibilní inhibitor thymidylátsynthasy. FdUMP se váže na thymidylátsynthasu jako dUMP. Při vlastní methylaci nelze odštěpit F (F+) stejně jako H+ a enzym je tak svázán v inaktivním kovalentním ternárním komplexu enzym-FdUMP-THF. Takové inhibitory nazýváme mechanism-based inhibitors nebo také suicide substrates (sebevražedné substráty).
O
N
O
OH
H
H
H
OH
H
P
O
O-
O-
C
CC
CO
N
O
H F
H
5-Fluorodeoxyuridylát
(FdUMP)
46
Inhibice dihydrofolátreduktasy. Blokuje se regenerace THF. Antifoláty, DHF analoga, se váží na DHFR 1 000 x pevněji než DHF.
R = H Aminopterin
R = CH3 Methotrexát (amethopterin)
N
N
NH2
CH2 OCH3
OCH3
OCH3
NH2
CH2
N
N
H
N
NNCH2
NH2
H
NH2
R
C N
H
CH CH2 CH2 COO
O COO-
-
Trimethoprim
47
Odbourávání (katabolismus) nukleotidů • Většina potravy obsahuje nukleové kyseliny. Nukleové kyseliny jsou
intaktní ke kyselému prostředí žaludku a jsou odbourávány až v tenkém střevě pankreatickými nukleasami a střevními fosfodiesterasami. Iontová povaha nukleotidů jim nedovoluje procházet přes buněčné membrány a proto jsou hydrolyzovány na nukleosidy. Nukleosidy jsou ve střevní stěně hydrolyzovány nukleosidasami a nukleosidfosforylasami:
Nukleosidasa: Nukleosid + H2O báze + ribosa
Nukleosidfosforylasa: Nukleosid + Pi báze + ribosa-5-fosfát
• Z potravy je recyklováno jen velmi malé množství bází nukleových kyselin – musí probíhat biosyntéza de novo.
• Ribosa-1-fosfát jako produkt purinnukleosidfosforylasy (PNP) je prekurzorem PRPP.
• Adenosin a deoxyadenosin nejsou štěpeny savčí PNP. Jsou deaminovány adenosindeaminasou (ADA) a AMP deaminasou na odpovídající deriváty inosinu, které jsou dále degradovány. 48
Schéma katabolismu purinových nukleotidů 1. část
Purinnukleosidfosforylasa
(PNP)
N
N
N
N
NH2
Ribosa-5-fosfát
N
N
N
N
O
Ribosa-5-fosfát
H
N
N
N
N
O
Ribosa-5-fosfát
O
H
H
N
N
N
H
N
O
Ribosa-5-fosfát
NH2
H
AMP IMP XMP GMP
H2O
Pi
Nukleotidasa
AMP deaminasa
H2O NH
4
+
AdenosinAdenosindeaminasa
H2O NH
4
+
H2O
Pi
Nukleotidasa
Inosin
Ribosa-1-P
Purinnukleosidfosforylasa
(PNP)
Hypoxanthin
Pi
H2O
Pi
Nukleotidasa
Xanthosin
Ribosa-1-P
Purinnukleosidfosforylasa
(PNP)
Xanthin
Pi
H2O
Pi
Nukleotidasa
Guanosin
Ribosa-1-P
Guanin
Pi
Xanthinoxidasa Guanindeaminasa
O2 + H
2O H
2O
2NH
4
+ H2O
49
Schéma katabolismu purinových nukleotidů 2. část
O2 + H
2O H
2O
2
Hypoxanthin
H2O
2
Xanthin
O2 + H
2O
GuaninXanthinoxidasa Guanindeaminasa
NH4
+ H2O
Xanthinoxidasa
N
N
N
N
O
O
H
H
O
H
H
Močová kyselina
50
Cyklus purinových nukleotidů
• Cyklus hraje důležitou roli v kosterním svalstvu. Zvyšuje se svalová aktivita zvyšováním aktivity citrátového cyklu. Svaly nemají dostatečné množství enzymů, které by doplňovaly meziprodukty citrátového cyklu – anaplerotické reakce. Cyklus purinových nukleotidů je dodavatelem fumarátu pro svalový citrátový cyklus!!!
IMP
Adenylosukcinát
AMP
H2O NH
4
+
AMP deaminasa
Aspartát + GTP
GDP + Pi
AdenylosukcinátsynthetasaAdenylosukcinátlyasa
Fumarát
H2O + Aspartát + GTP NH
4+ + GDP + P
i + Fumarát51
N
N
N
N
NH COO
OOC
H
D-ribosa-5-fosfát
-
-
Adenylosukcinát
Xanthinoxidasa (XO) Převádí hypoxanthin (báze IMP) na xanthin a močovou kyselinu.
• U savců je XO v játrech a v lemu tenkého střeva. XO je homodimer obsahující FAD a Mo komplex cyklující mezi Mo6+ a Mo4+. Koncovým akceptorem elektronů je O2 přecházející na H2O2 (nebezpečný – velmi silné oxidační činidlo), který je okamžitě štěpen katalasou na H2O a O2.
Hypoxanthin Xanthin
N
H
NH
N
N
O
N
H
NH
N
H
N
O
O
Močová kyselina
(enol forma)
N
H
NH
N
H
N
O
O
O H7
89
Močová kyselina
(keto forma)
N
H
NH
N
H
N
O
O
O
H
Ureát
N
H
NH
N
H
N
O
O
O-
H++
pK = 5.4
52
Osud močové kyseliny
• Konečným produktem degradace purinů u člověka a primátů je močová kyselina vylučovaná močí.
• Totéž platí pro ptáky, suchozemské plazy a většinu hmyzu. Smyslem je zadržovat vodu, protože močová kyselina je jen omezeně rozpustná ve vodě a proto její vylučování ve formě krystalů nebo pasty šetří pro organismus vodu.
• U všech dalších organismů je močová kyselina dále degradována.
• Savci, vyjma primátů, oxidují močovou kyselinu na ve vodě dobře rozpustný allantoin.
• Kostnaté ryby štěpí allantoin dále na allantoovou kyselinu.
• Chrupavčité ryby a obojživelníci degradují allantoovou kyselinu na močovinu a tu vyměšují.
• Mořští bezobratlí rozkládají močovinu na amoniak a amonné ionty.
53
Schéma další degradace močové kyseliny
N
NH
N
H
N
O
O
O
H
HMočová kyselina
VYLUČOVANO:
Primáti
Ptáci
Plazi
Hmyz
2 H2O + O
2
Urátoxidasa CO
2 + H
2O
2
N
NH2
N
H
N
O
O
H
H
O
Allantoin
Další savci
H2O
Allantoinasa
NH2
N
H
COOH
O
NH2
N
H
O
Allantoová kyselina
Kostnaté ryby
H2O
Allantoikasa
Močovina
Chrupavčité ryby
Obojživelníci
OHC-COOHGlyoxylová kyselina
O
CNH2 NH22
2 H2O
Ureasa
Mořští bezobratlí
2 CO2
4 NH4
+54
Dna je onemocnění provázené zvýšenou hladinou močové kyseliny v tělesných tekutinách.
• Jednou z nejvýznamnějších příčin dny je narušené vylučování močové kyseliny. Jedním z důvodů je nedostatečnost HGPRT (Hypoxanthin-guaninfosforibosyltransferasa - Lesch-Nyhamův syndrom) vedoucí k její nadměrné produkci z důvodů akumulace PRPP.
• Dna se léčí podáním inhibitoru xanthinoxidasy allopurinolu, což je strukturní analog hypoxanthinu. XO allopurinol hydroxyluje na alloxanthin, který se pevně naváže na redukovanou formu enzymu a tím ho ireversibilně inhibuje. Příklad „suicide inhibitor“ nebo mechanism-based substrate.
Hypoxanthin Alloxanthin
N
H
NH
N
N
O
N
H
NH
N
H
N
O
O
Allopurinol
N
H
NH
N
N
O
78
55
Odbourávání (katabolismus) pyrimidinových nukleotidů
• Živočišné buňky degradují pyrimidinové nukleotidy na jejich báze. Reakce probíhají přes defosforylace, deaminace a štěpení glykosidových vazeb. Vznikající uracil a thymin jsou dále štěpeny v játrech redukčně, na rozdíl od purinových bází (oxidace).
• Konečnými produkty jsou b-alanin a b-aminoisobutyrát.
• Obě sloučeniny jsou dále převáděny transaminací a aktivací na malonyl-CoA a methylmalonyl-CoA.
• Malonyl-CoA je prekurzor biosyntézy mastných kyselin a methylmalonyl-CoA je převeden na meziprodukt citrátového cyklu sukcinyl-CoA.
• Závěr:produkty degradace pyrimidinových nukleotidů přispívají k energetickému metabolismu buňky.
56
Degradace pyrimidinových nukleotidů I. část
N
N
NH2
Ribosa-5-fosfát
O H
H
CMP UMP (dTMP)
H2O
Pi
Nukleotidasa
CytidinCytidindeaminasa
H2O NH
4
+
H2O
Pi
Nukleotidasa
Uridin
(Deoxythymidin)
(d)Ribosa-1-P
Uridinfofsforylasa
Uracil
(Thymin)
Pi
Dihydrouracildehydrogenasa
N
N
O
Ribosa-5-fosfát
O
H CH3
H
Dihydrouracil
(Dihydrothymin)NADPH + H+ NADP+
N
N
H
O
O
H CH3
H
HH
57
Degradace pyrimidinových nukleotidů II. část
b-Ureidopropionasa
NH4
+ + CO2
H2O
H2O
Hydropyrimidinhydratasa
Dihydrouracil
(Dihydrothymin)
N
N
H
O
O
H CH3
H
HH
b-Ureidopropionát
(b-Ureidoisobutyrát)
N
H
CH2
CHC
O-
O
CH3
NH2
O
b-Alanin
(b-Aminoisobutyrát)
NH2
CH2
CHOOC CH3
-
58
Transaminace a aktivace b-alaninu a b-aminoisobutyrátu
NADH + H+
CoA + NAD+
Aminotransferasa
2-Oxoglutarát Malonát semialdehyd
(Methylmalonát semialdehyd)
b-Alanin
(b-Aminoisobutyrát)
NH2
CH2
CHOOC CH3
-
Glutamát
OCH
CH
COO
CH3
-
Malonyl-CoA
(Methylmalonyl-CoA)
OC
CH
COO
CH3
CoAS
-
59
