UNIVERSITA’ DEGLI STUDI La Sapienza di Roma FACOLTA’ DI MEDICINA E CHIRURGIA I

Dipartimento di Pediatria UOC Terapia Intensiva Neonatale

UOC Pediatria d’Urgenza e Terapia Intensiva Pediatrica --------------------------------------------------------------------------------------------------

Master Universitario di II livello in Terapia Intensiva Neonatale e Pediatrica

ALTERAZIONI DEL DIFFERENZIAMENTO SESSUALE:VIE METABOLICHE E

GENETICHE. CASI CLINICI PARADIGMATICI

Relatore: Chiar.mo Prof. Corrado MORETTI

Candidato

Dott.ssa Maria Gabriella BURATTINI

La determinazione sessuale, che dipende dall’assetto cromosomico dell’embrione, viene stabilito da molteplici eventi molecolari che dirigono lo sviluppo delle cellule germinali, la loro migrazione verso la plica urogenitale e la formazione di testicoli

(in presenza del cromosoma Y) o di ovaie (in presenza del cromosomaXX)

La determinazione sessuale pone le basi per la differenziazione sessuale e per la risposta sesso-specifica dei tessuti agli ormoni prodotti dalle gonadi che si

sono differenziate.

Sono stati scoperti numerosi geni che contribuiscono sia al processo precoce della determinazione e differenziazione sessuale sia al processo tardivo.

… Un po’ di storia I cromosomi sessuali dei mammiferi si sono evoluti da una

coppia di OMOLOGHI ANCESTRALI MONOMORFI per riduzione progressiva di uno degli omologhi che avrebbe poi

dato origine al CROMOSOMA Y

Molti dei geni inizialmente presenti sul cromosoma Y

sono stati trasferiti sul cromosoma X durante il

processo evolutivo che ha reso eteromorfa la coppia

dei cromosomi sessuali

Gene SRY (Sex Determining Region del braccio corto cromosoma Y)

indispensabile

la sua assenza determina la differenziazione in senso femminile

DETERMINAZIONE DEL SESSO MASCHILE

L’espressione di SRY deve raggiungere un determinato livello soglia in un periodo di tempo ben definito, nei precursori delle cellule di sostegno, altrimenti in tali cellule si avvia la formazione delle ovaie.

X Y

SRY (TDF) TESTICOLO

X X

OVAIO

• Sry codifica per una proteina che presenta un dominio di legame con il DNA di circa 70

amminoacidi. • Questo legame è caratteristico delle proteine High

Mobility Group e perciò chiamato HMG box.

• Si pensa che la proteina si leghi alle regioni regolatorie di altri geni che intervengono nel

differenziamento delle gonadi, a valle di Sry, e nei confronti dei quali Sry svolgerebbe dunque la

funzione di regolatore trascrizionale.

SRY: meccanismo d’azione

A valle della cascata enzimatica guidata da SRY esistono altri fattori quali SOX 9, SOX 8, DAX1, FGF9 importanti nella differenziazione e nella funzione delle cellule del Sertoli. Sox 9 agisce precocemente nella via di determinazione del sesso in senso maschile.

GENI DELLA DIFFERENZIAZIONE SESSUALE

• AZF(azoospermia factor) maturazione testicolare e spermatogenesi • GCY(growth control Y) crescita staturale non mediata da ormoni • GBY (gonadoblastoma) oncogene nella disgenesia gonadica

Altri geni sono stati individuati sul cromosoma Y che controllano aspetti diversi dello sviluppo sessuale:

La HMG box di Sry è altamente conservata in tutti i mammiferi in cui è stata sequenziata.

Sono state descritte molte mutazioni della HMG box della proteina SRY umana, in femmine XY (reversione del sesso).

Nessun polimorfismo è stato trovato nel dominio HMG di maschi normali.

La sequenza della HMG box, quindi, è determinante per lo sviluppo del sesso maschile,

in quanto ogni sua variazione produce alterazioni della proteina le quali, inficiandone la

funzione, risultano in reversione del sesso.

… in letteratura

GONADE BIPOTENTE

(compare intorno alla V settimana)

CELLULE MESENCHIMALI

⇒ cell. Leydig

⇒ cell. Teca e stroma

CELLULE MESODERMICHE

⇒ cell. Sertoli

⇒ cell. Granulosa

TESTICOLO

CELLULE GERMINATIVE (sacco vitellino → creste)

⇒ spermatogoni

⇒ oociti

OVAIO

Stadio bipotenziale Alla sesta settimana gli organi

riproduttivi hanno la potenzialità di svilupparsi in strutture maschili o

femminili

L’assenza di MIFpermette alla gonade di trasformarsi nelle strutture femminili.

Il dotto di Wollf degenera

La proteina SRY indirizza la gonade a trasformarsi nei testicoli che producono

testesterone e MIFche provoca la degenerazione del dotto di Muller

Nel maschio

Cresta genitale

WT1 – SF1

Gonade bipotenziale

MASCHIO FEMMINA

SRY – SOX9

Testicolo

INSL3/LGR8

Discesa nello scroto

FOXL2

Ovaio

SRY SOX9

DAX1 WNT4

Nelle femmine non vi sono geni e fattori essenziali per la differenziazione del fenotipo F durante lo sviluppo fetale e prepuberale.

La iperespressione di alcuni geni, quale DAX1 e WNT4, ha un effetto anti-testicolare sopprimendo l’effetto di SRY e SOX9 e determinando lo sviluppo di una femmina XY sex-reversal.

WT1 – SF1

MIF T

Dotti di Muller:

tube

utero

III sup. vagina

Dotti di Wolff:

vasi deferenti

epididimo

vescicole seminali

DIFFERENZIAZIONE SECONDARIA

Classificazione delle ambiguità sessuali

Disturbi della differenziazione genitale

• Pseudoermafroditismo maschile Errori congeniti della biosintesi del testosterone Deficit 5-α-reduttasi Resistenza periferica agli androgeni

• Pseudoermafroditismo femminile Iperplasia surrenalica congenita Assunzione o produzione materna (tumori) ormoni a eff.virilizzante

Intersessualita DSD

Pseudoermafroditismo maschile Ridotta virilizzazione e

mascolinizzazione del maschio XY 46, XY DSD

Pseudoermafroditismo femminile Eccessiva virilizzazione e

mascolinizzazione della femmina XX 46, XX DSD

Maschio XX o XX sex reversal

Ermafroditismo vero

Femmine XY sex reversal

DSD ovotesticolare

DSD testicolare 46,XX

Disgenesia gonadica completa 46,XY

IERI OGGI

DSD dei Cromosomi sessuali 46,XY DSD 46,XX DSD

45,X(sindrome di Turner e varianti) Disordini nello sviluppo del testicolo: (1) disgenesia gonadica completa

(sindrome di Swyer); (2) disgenesia gonadica parziale; (3) regressione

gonadale; (4) DSD ovotestis

Disordini nello sviluppo dell’ovaio: (1)DSD ovotestis; (2)DSD

testicolare(es.SRY+,duplicazioni di SOX9); (3)disgenesia gonadica.

47,XXY (sindrome di Klinefelter e varianti)

Disordini nella sintesi o nell’azione degli androgeni:

(1) Difetti nella sintesi degli androgeni (es. 17-OH steroido

deidrogenasi, 5αRD2, mutazioni StAR);

(2) (2) Difetti nell’azione degli androgeni (es. CAIS, PAIS);

(3) Difetti del recettore dell’ormone luteinizzante (es. ipoplasia-aplasia

delle cellule di Leydig); (1) (4) Disordini dell’ormone

antimuleriano e del recettore antimuleriano (sindrome da

persistenza dei dotti di Müller)

Eccesso di androgeni: (1) fetali (es deficit di 21-

idrossilasi; (2) fetoplacentari (deficit di

aromatasi ,POR[P450 ossidoreduttasi])e

(3) materni (luteoma, farmaci ecc.)

45,X/46,XY (MGD, DSD ovotestis) Altri (es.estrofia della cloaca,atrofia vaginale,MURCS[anomalie dei

dotti di Muller,dei reni,delle vertebre cervicotoraciche],altre

sindromi.

46,XX/46,XY (chimere, DSD

DIFETTO SINTESI TESTOSTERONE

INSENSIBILITA’ PERIFERICA AGLI ANDROGENI

DEFICIT 5aR

46, XY DSD

46, XX DSD

IPERPLASIA SURRENALICA CONGENITA

FARMACI VIRILIZZANTI ASSUNTI DALLA MADRE

(medrossiprogesterone, danazolo)

TUMORI VIRILIZZANTI – MATERNI O FETALI (tumori ovarici, surrenalici)

DSD 46,XX da eccesso di androgeni

L’esposizione in utero agli androgeni determina

dopo la 12a settimana di gestazione esclusivamente ipertrofia clitoridea

nelle fasi più precoci della differenziazione persistenza del seno urogenitale e

fusione labioscrotale

se sufficientemente precoce, la fusione delle labbra permette la formazione di

uretra peniena

Grumbach MM & Conte FA 1992

QUADRI CLINICI

46, XX DSD

Genitali Interni Femminili

Genitali Esterni:

- Clitoromegalia isolata

- Completa fusione labioscrotale

46, XY DSD

Genitali Interni Maschili

Genitali Esterni:

-Aspetto completamente femminile (Sindrome Morris o Femminilizzazione Testicolare Completa)

- Ipospadia

… LA CLINICA

… Amoebas at start were not complex: they tore themselves and started sex

(Arthur Guiterman)

DIAGNOSI

Anamnesi familiare Esame obiettivo

Esami di laboratorio e strumentali: - cariotipo - elettroliti - dosaggi ormonali: 17-OHP, T, DHT,DHEA-

S,Androstenedione, ACTH - ecopelvi - genitografia o laparoscopia

colesterolo

Δ5 pregnenolone

Δ4 progesterone

11 desossicorticosterone DOC

corticosterone (composto B)

18 idrossicorticosterone

aldosterone

17-OH progesterone

11 desossicotisolo (composto S)

cortisolo

DHEA DHEA-S

Δ4androstenedione

testosterone

estrone

17-β estradiolo

1

1: 20,22 desmolasi 2: 3-β ol-deidrogenasi tutti 3: 17-α idrossilasi (gene unico codifica enzima anche con attività n. 5:

pazienti con uno od entrambi i difetti) glicocorticoidi e sessuali 4: 21 idrossilasi 6: 11- β idrossilasi glico-mineralcorticoidi 7: 18 idrossilasi 8: 18 deidrogenasi mineralcorticoidi 5: 17,20 desmolasi 9: 17-βOH steroido-deidrogenasi sessuali 10: aromatasi

2

2

3 17-OH pregnenolone

2

3

4

4

5

6

6 7

8

9

5 10

3

10

SINTOMATOLOGIA delle DIFFERENTI FORME di DEFICIT ENZIMI SURRENALI

20, 22 desmolasi

17-α idrossilasi

21 idrossilasi

Blocco sintesi glico-mineralcorticoidi (accumulo 17-α OHP) M: genitali esterni normali F: virilizzazione genitali esterni di vario grado Entrambi i sessi: possibile perdita di sali dopo il 4°-5° g di vita a sintomatologia variabile possibile ipertensione

11-β idrossilasi

3-β idrossisteroido-deidrogenasi

17-20 desmolasi 17-β OHsteroido-deidrogenasi

i

• nel sesso femminile: ambiguità genitali esterni di grado variabile fino all’aspetto di maschio con anorchia Esame strumentale consigliato: ecografia pelvica

• nel sesso maschile: assenza di sintomi

…alla nascita

in entrambi i sessi (potenzialmente letale):

oltre ai sintomi su descritti vomito e dimagramento tardivi

(a partire dal 5°-6° giorno di vita)

DEFICIT 21 IDROSSILASI

DIAGNOSI GENETICA

CYP21: gene funzionale CYP21P: pseudogene

SEDE: cromosoma 6p21.3

CYP21

CYP21P

CYP21P CYP21

LOCUS CYP21 (6p21.3)

Gene e pseudogene, entrambi di 10 esoni, presentano una sequenza nucleotidica omologa al 98% per la parte esonica e al 96% per la parte intronica.

CYP21: gene funzionale CYP21P: pseudogene

DIAGNOSI GENETICA

ACTH

- CORTISOLO

+

-

- CORTISOLO

+

NORMALE

DEFICIT 21-OH

+

ACTH +

PREANDROGENI +

Rare Deficit 11 beta idrossilasi Deficit 3 beta idrossisteroido deidrogenasi

5 alfa reduttasi

5 α REDUTTASI

TUBERCOLO GENITALE

PLICHE LABIO SCROTALI

PLICA URETRALE

Pene ⇐

Scroto ⇐

Uretra ⇐

⇒ Clitoride

⇒ Grandi labbra

⇒ Piccole labbra

T

DHT

FENOTIPO FEMMINILE

FENOTIPO MASCHILE

CASI CLINICI

… Amoebas at start were not complex: they tore themselves and started sex

(Arthur Guiterman)

EG: 38 settimane, SGA

TC per diagnosi prenatale (24a sett.) di malformazione cardiaca e dilatazione borderline IV ventricolo

Anamnesi OSTETRICA:

- Infezione materna da toxoplasma nel I trimestre

- Cariotipo materno: 46 XX t (2;9) (p13; p13)

- Cariotipo fetale (LA): 46 XY, -9, +der (9) t(2;9) (p13; p13)

APGAR 5-7: ventilazione con AMBU

NAOMI

Esame obiettivo:

cianosi

tachipnea

soffio 3/VI

FENOTIPO FEMMINILE

STIGMATE DISMORFICHE (impianto basso delle orecchie, clinodattilia V )

⇒ Necessità di intubazione e somministrazione di Surfattante dopo 2 ore dalla nascita

CARIOTIPO 46 XY, -9, +der (9) t(2;9) (p13; p13)

TESTOSTERONE 66.4 ng/dl (v.n . O<20 O 100+500)

Androstenedione nella norma

DHEA nella norma

17-OH-P nella norma

hCG test: NON INCREMENTO DEI LIVELLI DI T E DHT

Studio SRY e cromosoma 9

ESAMI DI LABORATORIO

+

IPOTESI DIAGNOSTICHE

Fenotipo genitale femminile con derivati mulleriani presenti

MUTAZIONE GENE SRY

MUTAZIONI DI GENI COINVOLTI NELLA DIFFERENZIAZIONE TESTICOLARE

SU CROMOSOMA 9 ?

DELEZIONE 9p24 → regola lo sviluppo del testicolo ?

DELEZIONE 10q26-q ter → reversione sessuale ?

DESCRIZIONE DI MASCHI XX, FEMMINE XY ED ERMAFRODITI…IN LETTERATURA

Non riferiti ad alterazioni del cromosoma 9 Berger et al, 1970 Kasdan et al, 1973 Skordis et al, 1987 De la Chapelle et al, 1987 Kuhnle et al, 1993 Riferiti ad alterazioni del cromosoma 9 Affara et al, 1989 Hoo et al, 1989 Bennet et al, 1993 Ion et al, 1998 Fleiter et al, 1998 Guioli et al, 1998 Veiol et al, 1998

• M.A. nato a termine, da parto eutocico, alla nascita presentava ipotonia generalizzata e rime palbebrali lievemente rivolte verso l’alto: sospettata sindrome di Down.

E’ stata eseguita quindi la ricerca di sequenze Y specifiche: gene AMEL ed

amplificazione SRY

Alessandro

• All’esame obiettivo, i genitali esterni venivano descritti come maschili normali.

• Gli esami strumentali (Ecorenale ed Ecoencefalo) sono risultati nella norma.

• E’ stato quindi eseguito un cariotipo di tipo femminile: 46,XX.

• E’ stato ricontrollato il corredo cromosomico e confermata la presenza di un cariotipo femminile normale.

AMEL

XY XX 556/07 M

SRY

XY 556/07 M

AMEL

XY XX 556/07 M

AMEL

XY XX 556/07 M

SRY

XY 556/07 M

SRY

XY 556/07 M

Amplificazione di AMEL e SRY

XX= femmina controlloXY= maschio controllo

ZFYSRY

sY254sY86

Yp

YqsY127

XX XY 556/07

ZFYSRY

Yp

sY84sY134Yq

sY255

XX= femmina controlloXY= maschio controllo

ZFYSRY

sY254sY86

Yp

YqsY127

ZFYSRY

sY254sY86

Yp

YqsY127

XX XY 556/07

ZFYSRY

Yp

sY84sY134Yq

sY255

ZFYSRY

Yp ZFYSRY

Yp

sY84sY134Yq

sY255

Analisi delle microdelezioni del cromosoma Y. .

FISH con sonda specifica di SRY (segnale rosso) che evidenzia il trasferimento del gene sull'estremità distale del braccio corto di un cromosoma X.

E. L. nata a termine da parto cesareo, presentava alla nascita: genitali esterni ambigui ed atresia anale, dismorfismi facciali

Sospetto clinico di SAG (virilizzazione genitali esterni) → dosaggio

17 OH-progesterone

• Esami strumentali: Eco encefalo, reni e cuore nella norma, RMN non capace d’ individuare a livello perineale i meati di uretra, vagina e canale anale

• Intervento chirurgico: meato comune urinario-digestivo

• Cariotipo femminile normale

• Analisi molecolare del DNA negativa per geni cromosoma Y

Lucia

CASO non risolto

Esami di laboratorio

Dosaggio 17OH-progesterone elevato Altri ormoni surrenalici nella norma

Ricerca gene CYP 21 (specifico SAG): NEGATIVA

+ Drop-out

Rimangono ancora oggi senza una spiegazione a livello molecolare la maggior parte dei casi di inversione del sesso XY, di inversione XX SRY –

negativa e di ermafroditismo.

• E’ necessario identificare nuovi geni o mutazioni fuori delle regioni codificanti, dei geni conosciuti.

• I progressi di questi ultimi anni lasciano solo intravedere la complessità dello sviluppo

dell’apparato riproduttivo.

• La comprensione del meccanismo d’azione dei geni che governano il differenziamento e lo sviluppo

embrionale resta forse la sfida più affascinante della genetica molecolare.

PUNTI OSCURI

Prospettive future

La sfida è trovare: i membri specifici di ogni famiglia che

sono unici per ogni sistema particolare i geni target tessutali specifici che sono

regolati tramite questa rete comune

GRAZIE

PER L’ATTENZIONE