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Aus dem Institut für Pathologie

(Direktor Univ.- Prof. Dr. med F. Dombrowski)

Abteilung für Neuropathologie (Leiter: Univ.-Prof. Dr. med. R. Warzok)

der Medizinischen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

Thema: Die Expression von P-Glycoprotein, Survivin, Ki-67 und Caspase-3 in menschlichen Astrozytomen und Oligodendrogliomen unterschiedlicher WHO-Grade

Inaugural - Dissertation

zur

Erlangung des akademischen

Grades

Doktor der Medizin (Dr. med.)

der

Medizinischen Fakultät

der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität

Greifswald

2008

vorgelegt von: Alexandra Dreßler geb. am: 19.06.1976 in: München

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Dekan: Prof. Dr. rer. nat. H. K. Kroemer

1. Gutachter: Prof. Dr. R. Warzok (Greifswald)

2. Gutachter: Prof. Dr. Ch. Hagel (Hamburg)

Ort, Raum: Universitätsklinikum Greifswald, Klinik und Poliklinik für Neurochirurgie,

Raum D 0.31

Tag der Disputation: 29.06.2009

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Torsten Dreßler gewidmet.

München, November 2008

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Inhaltsverzeichnis II

Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis I

Abkürzungsverzeichnis III

1. Einleitung 1

1.1 Astrozytäre und oligodendrogliale Hirntumoren 1

1.2 Genetische Grundlagen der Hirntumorentstehung 3

1.3 P-Glycoprotein (P-gp) 4

1.4 Apoptose 6

1.5 Survivin 8

1.6 Zielsetzung dieser Arbeit 11

2. Material und Methoden 12

2.1. Puffer und Lösungen 12

2.2 Chemikalien 13

2.3 Kits und Fertiglösungen 13

2.4 Antikörper 14

2.5 Primer 14

2.6 Gewebeproben 14

2.7 Methoden 15

2.7.1 Immunhistochemie 15

2.7.1.1 Nachweis von P-Glycoprotein (P-gp) 15

2.7.1.2 Nachweis von Survivin 16

2.7.1.3 Nachweis von Caspase-3 16

2.7.1.4 Nachweis von Ki-67 17

2.7.2 In situ Hybridisierung 17

2.7.2.1 Herstellung der DIG-markierten RNA-Sonden 17

2.7.2.2 In situ Hybridisierung von P-Glycoprotein (P-gp) und Survivin 19

2.8 Auswertung der immunhistochemischen Färbungen und in situ

Hybridisierung 20

2.9 Statistische Auswertung 20

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Inhaltsverzeichnis III

3. Ergebnisse 21

3.1 Aufteilung der Gewebeproben 22

3.2 Lokalisation der Hirntumoren 22

3.3 Die Expression von P-Glycoprotein (P-gp) 24

3.4 Die Expression von Survivin 27

3.5 Die Expression von Ki-67 30

3.6 Die Expression von Caspase-3 34

3.7 Die Expression von P-Glycoprotein-RNA 38

3.8 Die Expression von Survivin-RNA 41

3.9 Korrelationen 44

4. Diskussion 47

4.1 Astrozytäre Hirntumoren 48

4.2 Oligodendrogliale Hirntumoren 53

5. Zusammenfassung 57

6. Literaturangabe 58

7. Eidesstattliche Erklärung 69

8. Lebenslauf 70

9. Danksagung 71

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Abkürzungsverzeichnis IV

Abkürzungsverzeichnis Abb. = Abbildung

APAF 1 = Apoptose protease activating factor 1 (Apoptose Protease

aktivierender Faktor 1)

AIF = Apoptose inducing factor (Apoptose induzierender Faktor)

ABC = Adenosin-Triphosphat-binding-casette (Adenosin

Triphosphat bindende Kasette

Anti-DIG-AP = Anti-Digoxigenin Antikörper, verbunden mit alkalischer

Phosphatase

ATP = Adenosintriphosphat

Bcl-2 = B-cell lymphoma 2 (B-Zell Lymphom 2)

BCIP = 5-Bromo-4-Chloro-Indolyl-Phosphatase

BCRP = Breast cancer resistance proteine (Brustkrebs-Resistenz-Protein)

Bid = Bcl-2 interacting domain (B-Zell Lymphom 2 interagierende

Domäne)

BIR = Baculovirus inhibitor of apoptosis repeat

BIRP = BIR-domain containing proteins

bzw. = beziehungsweise

CBTR-US = Central brain tumor registry of the United States (Zentrales

Hirntumorregister der Vereinigen Staaten von Amerika)

CD = Cluster of differentiation (Differenzierungscluster)

CDK4 = Cyclin dependant Kinase 4 (Cyclin abhängige Kinase 4)

CDKN2A = Cyclin dependant Kinase 2A-Gene (Cyclin abhängige Kinase 2A-

Gen)

DAB = Diaminobenzidin

DD = Death domain (Todesdomäne)

DED = Death effector domain (Todeseffektordomäne)

d.h. = das heißt

DISC = Death induced signalling complex (Zelltod induzierender

Signalkomplex)

DNA/DNS = Desoxyribonucleinacid/-säure

cDNA = Codierende DNA

DIG = Digoxenin

DIG-dUTP = digoxigenin-markiertes Deoxyuridintriphosphat

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Abkürzungsverzeichnis V

DNT = Dysembryoplastischer neuroepithelialer Tumor

dNTP = Deoxinukleotid

DR = Death receptor (Todesrezeptor)

EGFR = Epidermal growth factor receptor (Rezeptor für epidermalen

Wachstumsfaktor)

EGFP = Enhanced Green Fluorescent Protein

FAS = Apoptosis stimulating fragment (Apoptosestimulierendes

Fragment)

FADD = Apoptosis stimulating fragment-associated death domain

(Apoptosestimuliernedes Fragment assoziierte Todesdomäne)

Hep G2 = Zellkultur eines Leberzellkarzinoms

HL 60 = Zellkultur aus humanen promyelozytischen Leukämiezellen

HRP = Horse raddish peroxidise (Meerettichperoxidase)

IAP = Inhibitor of apoptosis protein (Apoptoseinhibierendes Protein)

IHC = Immunhistochemie

ISH = In situ Hybridisierung

kDalton = Kilo Dalton

Ki 67 = Kiel 67 Antigen

LSAB = Labeled (Markierte) (Strept)avidin Biotin Methode

LOH = loss of heterocygosity (Verlust der Heterozygotizität)

M = Mol (Masseneinheit)

MDM2 = Murine-double-minute-2

MiB 1 = Made in Borstel (Antikörper gegen Ki 67)

MOD = mittlere optische Dichte

MDR = multidrug resistance (Multidrug-Resistenz)

MRP = multidrug resistance associated protein (Multidrug-Resistenz-

assoziiertes-Protein)

NBD = Nucleotid binding domain (Nukleotidbindende Domäne)

NBT = Nitroblue Tetrazolium (Nitroblautetrazolium)

PDGF = Platelet derived growth factor (Wachstumsfaktor aus

Blutplättchen)

PDGFR = Platelet derived growth factor receptor (Rezeptor für

Wachstumsfaktor aus Blutplättchen)

PCR = Polymerase chain reaction (Polymerasekettenrekation)

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Abkürzungsverzeichnis VI

P-gp = P-Glycoprotein

P-TEN = Phosphatase and tensin homologue (Phosphatase und Tensin

Homolog)

Rb = Retinoblastom-Gen

RNA/RNS = Ribonucleinacid/-säure

mRNA = messenger RNA (Boten-RNA)

RT-PCR = Reverse transcriptase polymerase chain reaction

(Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion)

SMAC = Second mitochondrial activator of caspases

Tab. = Tabelle

TNF = Tumor necrosis factor (Tumor Nekrose Faktor)

TNFR = Tumor necrosis factor receptor (Tumor Nekrose Faktor Rezeptor)

TP 53 = Tissue Polypetide 53 (Gewebspolypeptid 53)

TRADD = TNF receptor associated death domain protein (Tumor Nekrose

Faktor Rezeptor assoziiertes Todesdomänenprotein)

WHO = World Health Organisation (Weltgesundheitsorganisation)

z. B. = zum Beispiel

ZNS = Zentrales Nervensystem

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Einleitung 1

1. Einleitung

Der Anteil von primären Hirntumoren an der Gesamtzahl aller an malignen

Neubildungen verstorbenen Patienten macht etwa 3-5 % aus. Die Inzidenz beträgt

durchschnittlich 10,2 Neuerkrankungen pro 100000 Einwohner pro Jahr in

Industrieländern. Das bedeutet für Deutschland in etwa 8000 Neuerkrankungen an

primären Hirntumoren pro Jahr. Exakte Zahlen existieren jedoch nicht, da es in

Deutschland kein nationales Krebsregister gibt [STEINER et al., 1998].

Hirntumoren werden nach histologischen Kriterien in WHO-Grade eingeteilt, welche

auch Aussagen über die Dignität bzw. die Prognose liefern (Tabelle 1).

Tab. 1 : Übersicht über die WHO-Grade bei Hirntumoren. (aus: WHO Classification of Tumors, Pathology and Genetics, Tumors of the Nervous System, 2007)

Statistisch ist eine gewisse Häufung in Ländern der Ersten Welt im Vergleich zu

Entwicklungsländern erkennbar. Dies wird unter anderem auf die wesentlich besser

entwickelten diagnostischen Möglichkeiten in den Industrienationen zurückgeführt.

Allgemein ist aber das Risiko eines Angehörigen der kaukasischen Rasse für die

Entwicklung eines Hirntumors höher [OHGAKI et al., 2005].

Sogenannte Risikoberufsgruppen konnten ebenfalls bestimmt werden. Hierzu

gehören Ärzte, besonders Anatomen und Pathologen, Feuerwehrleute und

Landwirte. Hingegen konnte kein Umweltkarzinogen identifiziert werden, das

reproduzierbar zur Entwicklung eines Hirntumors führt. Insbesondere die Strahlung

von Mobiltelefonen oder Nikotinabusus waren hier in den Mittelpunkt des Interesses

geraten [OHGAKI et al., 2005].

1.1 Astrozytäre und oligodendrogliale Hirntumoren

Bei Erwachsenen stehen die neuroepithelialen Tumoren bei den intrakraniellen

Raumforderungen im Vordergrund. Die größte Gruppe bilden die Tumoren, die sich

aus Astrozyten bzw. Oligodendrogliazellen entwickeln, die sogenannten Gliome.

Abgesehen von ihrem unterschiedlichen zellulären Ursprung unterscheiden sich

WHO Grad I gutartig, langsam wachsend, Heilung durch Operation möglich, gute Prognose

WHO Grad II noch gutartig, langsam wachsend, Tendenz zu Rezidiv und maligner Progression

WHO Grad III bereits bösartig, schnell anaplastisch wachsend

WHO Grad IV hochgradig bösartig, rasch fatal anaplastisch wachsend, sehr schlechte Prognose

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Einleitung 2

astrozytäre und oligodendrogliale Tumoren in ihrer Häufigkeit und ihrem

Malignitätsverhalten bzw. in der Prognose [WHO Classification of Tumors, Pathology

and Genetics, Tumors of the Nervous System, 2007] (Tabellen 2 und 3).

Astrozytäre Hirntumoren sind mit etwa 60 % häufiger als oligodendrogliale Tumoren,

die etwa 10 % der Gliome ausmachen (Tabelle 2). Zu den neuroepithelialen Tumoren

werden auch neuronale Tumoren, glioneuronale Mischtumoren, Pinealistumoren und

embryonale Tumoren gezählt.

Tab. 2: Häufigkeiten von Hirntumoren astrozytären und oligodendroglialen Ursprunges und der Subtypen [nach: Central Brain Tumor Registry of the United States, 2000 und WHO Classification of Tumors, Pathology and Genetics, Tumors of the Nervous System, 2007]

Astrozytäre Tumoren ca. 60 %, davon

Pilozytisches Astrozytom ca. 6 %

Diffuses Astrozytom ca. 10 – 15 %

Anaplastisches Astrozytom ca. 10 – 19 %

Glioblastoma multiforme ca. 50 – 60 %

Oligodendrogliale Tumoren ca. 10 %, davon

Low grade Oligodendrogliom ca. 77 %

Anaplastisches Oligodendrogliom ca. 23 %

Männer sind häufiger betroffen als Frauen. Die verschiedenen Malignitätsgrade

zeigen eine unterschiedliche Altersverteilung, mittlere Überlebensdauer und

Langzeitüberlebensraten (Tabelle 3).

Tab. 3: Mittleres Alter bei Diagnosestellung sowie Überlebensdauer bei Hirntumoren astrozytären und oligodendroglialen Ursprunges [OHGAKI et al., 2005]

Tumor WHO-Grad

Mittleres Alter bei Diagnosestellung

(Jahre)

Mittelwert Überlebensdauer

(Monate)

1- bzw. 5-Jahres-

Überlebens-rate

Pilozytisches Astrozytom

I 20

142

95 % / 89 %

Diffuses Astrozytom

II 41

77

92 % / 58 %

Anaplastisches Astrozytom

III 44

30

65 % / 11 %

Glioblastoma multiforme

IV 61

7,3

18 % / 1,2 %

Low grade Oligodendrogliom

II 40

106

98 % / 78 %

Anaplastisches Oligodendrogliom

III 49

37

50 % / 30 %

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Einleitung 3

Trotz aggressiver, multimodaler Behandlungskonzepte, bestehend aus Operation,

Bestrahlung, Chemotherapie und Immuntherapie sind die Daten bei astrozytären

Hirntumoren vor allem der WHO-Malignitätsgrade III und IV alles andere als

zufrieden stellend [BURTON et al., 2000]. Die 5-Jahres-Überlebensrate bei

Glioblastoma multiforme liegt unter 2 % (Tabelle 3). Die Rezidivneigung von

Glioblastomen beträgt trotz (soweit möglich) radikaler Tumorentfernung und

anschließender kombinierter Radio-Chemotherapie 90 % [CANNON et al., 2007].

Die Prognose von oligodendroglialen Tumoren, vor allem die 5-Jahres-

Überlebensrate, ist günstiger [FORTIN et al., 2001; VAN DEN BENT, 2001, 2007].

1.2 Genetische Grundlagen der Hirntumorentstehung

Der Unterschied in der Prognose von Tumoren astrozytären und oligodendroglialen

Ursprunges wird unter anderem in den zugrunde liegenden genetischen

Veränderungen gesehen, die zur Tumorentstehung und -progression führen. Man

geht bei den astrozytären Hirntumoren von einer stufenartigen Entdifferenzierungs-

reihe aus, die den WHO-Malignitätsgraden II - IV entspricht und deren maligner

Endpunkt das Glioblastoma multiforme (sekundäres Glioblastoma multiforme)

darstellt. Das Glioblastoma multiforme kann auch de novo entstehen (primäres

Glioblastoma multiforme). Molekulargenetisch sind die sekundären Glioblastome vor

allem durch Mutationen des TP53-Gens gekennzeichnet, während die primären

Glioblastome eine Polysomie des Chromosoms 7, Deletionen des Chromosoms 10

sowie eine Amplifikation des EGFR-Gens bzw. eine Deletion des PTEN-Gens

aufweisen (Abbildung 1) [SCHLEGEL et al., 2004; OHGAKI et al., 2007; CASKEY et al.,

2000; KLEIHUES et al., 1999].

Hiervon zu trennen ist das dem WHO-Malignitätsgrad I zugehörige pilozytische

Astrozytom, das vorwiegend bei Kindern und Jugendlichen auftritt. Hier konnten

bisher sichere, zur Tumorenstehung führende genetische Veränderungen nicht be-

wiesen werden [SCHLEGEL et al., 2004].

In mehreren Studien konnte nachgewiesen werden, dass Deletionen der

Chromosomen 1p und 19q mit dem oligodendroglialen Phänotyp und einem

besseren Ansprechen auf eine chemotherapeutische Behandlung assoziiert sind

[SCHLEGEL et al., 2004; CASKEY et al., 2000].

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Einleitung 4

Differenzierte Astrozyten / neuroepitheliale Vorläuferzellen

NiedriggradigesAstrozytom

Anaplastisches Astrozytom

Sekundäres Glioblastoma

multiforme

Primäres Glioblastoma multiforme

TP 53-Mutation (> 65%)

PDGF-A, PDGFR-a

Überexpression (> 60%)

LOH19q (50%)

Rb-Alteration (25%)

LOH10q

PTEN-Mutation (5%)

PDGFR-a-Amplifikation

(> 10%)

EGFR

Amplifikation (ca. 40%)

Überexpression (ca. 60%)

MDM2

Amplifikation (<10%)

Überexpression (50%)

CDKN2A

Deletionen (40%)

Transkriptive Inaktivierung

LOH10 (80%)

PTEN-Mutationen (30%)

CDK4-Amplifikation (15%)

Rb-Alteration (25%)

Abb. 1: Genetische Veränderungen in astrozytären Tumoren (WHO-Malignitätsgrad II – IV) [modifiziert

nach SCHLEGEL et al., 2004]

Ein wichtiger Aspekt für die Prognose von Hirntumoren ist das Vorhandensein bzw.

die Entwicklung von Resistenzmechanismen gegen die zur Verfügung stehenden

Behandlungsmöglichkeiten. Zu diesen Mechanismen gehört die aktive Blockierung

der Aufnahme von Wirkstoffen in das Tumorgewebe durch Transportproteine, wie

z. B. P-Glycoprotein.

1.3 P-Glycoprotein (P-gp)

P-Glycoprotein ist ein 170 kDalton großes, Adenosin-tri-Phosphat (ATP)-abhängiges,

membranständiges Transportprotein aus der Familie der „ATP-binding-

casette“(ABC)-Transporter, von der aktuell 48 Mitglieder bekannt sind [BORST et al.,

2002]. P-gp besteht aus zwei durch eine Polypeptidkette miteinander verbundenen

Hälften, die ihrerseits aus einer transmembranalen α-Helix und der

charakteristischen, zytoplasmatischen ATP-Bindungsstelle zusammengesetzt sind.

Des Weiteren findet sich eine Bindungsstelle für die zu transportierenden Substrate

(Abbildung 2). In gesundem humanem Gewebe ist P-gp an den apikalen Membranen

verschiedener Organe mit exkretorischen oder Barriere-Funktionen, z. B. im Dünn-

darm, in der Leber und in den Nieren wie auch an den Endothelien der Blut-Hirn-

Schranke nachzuweisen.

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Einleitung 5

Abb. 2 : Schematische Darstellung der Struktur von P-Glykoprotein [aus: SCHINKEL ET JONKER, 2003]. Dargestellt sind die zwei homologen Hälften des Proteins mit jeweils sechs Transmembransegmenten, sowie die N-Glykosylierungen (Äste) an der extrazellulären Seite, das N- und C-terminale Ende des Proteins und die ATP-Bindungsdomäne (nucleotide binding domain, NBD) an der cytoplasmatischen Seite der Zellmembran.

P-gp fungiert als aktive Effluxpumpe, die in die Zelle aufgenommene Substanzen

unter ATP-Verbrauch wieder heraustransportiert. Dadurch schützt es die Zellen vor

möglicherweise schädlichen Effekten [LÖSCHER et al., 2005; AMBUDKAR et al., 2003;

BORST et al., 2002]. Weiterhin ist bekannt, dass P-gp zur Arzneimittelresistenz

(„multidrug-resistance“) von Tumorzellen beiträgt, indem es Chemotherapeutika, die

sich chemisch und funktionell unterscheiden, aus den Zellen entfernt [AMBUDKAR et

al., 2003; BORST et al., 2002; SAUNA et al., 2001]. Die durch P-gp vermittelte

Resistenz gegenüber Chemotherapeutika konnte an verschiedenen Tumoren, vor

allem auch Tumoren des ZNS [MOHRI et al., 2000; TEWS et al., 2000] gezeigt werden.

Zudem sind P-gp-positive Tumorzellen oft auch kreuzresistent gegenüber

Bestrahlung. Die genauen Mechanismen sind aber nicht vollständig geklärt [DENECKE

et al., 1997]. Darüber hinaus gibt es auch Hinweise, dass P-gp bestimmte Caspasen

inhibiert, wodurch es zur Hemmung der Apoptose kommt und so zusätzlich zur

Tumorprogression beitragen kann [RUEFLI et al., 2002; SMYTH et al., 1998;

JOHNSTONE et al., 1999; MATARRESE et al., 2001]. Dieser Zusammenhang wird aber

höchst kontrovers diskutiert, denn dieses Phänomen konnte in anderen Arbeiten

nicht bestätigt werden [SAGOL et al., 2005; WU et al., 2005].

Zellen, die genetische Veränderungen aufweisen, wie z. B. Tumorzellen, werden

normalerweise durch ein körpereigenes System, den „programmierten Zelltod“

(Apoptose), eliminiert.

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Einleitung 6

1.4 Apoptose

Die Apoptose ist ein zelluläres Suizidprogramm, das für die Aufrechterhaltung der

physiologischen Zell- und Organfunktionen unerlässlich ist. Durch Apoptose kann der

Körper Zellen eliminieren, die genetische Veränderungen aufweisen oder die für den

Körper schädlich sind, wie Tumorzellen oder autoaggressive Lymphozyten.

Außerdem spielt die Apoptose in der Embryonalphase für die Organ- bzw.

Gewebeentwicklung eine wesentliche Rolle [KERR et al., 1972; JACOBSON et al.,

1997]. Der Begriff Apoptose (griechisch: „das Abfallen von Laub“) wurde erstmals zu

Beginn der 70er Jahre von Kerr und Wyllie geprägt [KERR et al., 1972].

Histologisch können apoptotische Zellen durch ihre stereotypen morphologischen

Veränderungen identifiziert werden. Die Zelle schrumpft und verliert den Kontakt zu

den benachbarten Zellen. Das Chromatin kondensiert und findet sich randständig

entlang der nukleären Membran. Die Zellmembran wird bläschenartig eingeschnürt.

Zuletzt liegen von der Zelle kleine Fragmente mit Zellmembranumhüllung vor, die

Apoptosekörperchen genannt werden. Diese werden von Makrophagen phagozytiert

[THORNBERRY et al., 1998].

Diese beschriebenen, histologisch fassbaren Veränderungen sind die Folge von

bestimmten molekularen und chemischen Reaktionen, die im Folgenden beschrieben

werden. Das zentrale Element der Apoptose ist die kaskadenartige Aktivierung von

Proteinasen, den sogenannten Caspasen, an deren Endpunkt die Spaltung von DNA

und von wichtigen Funktionsproteinen steht. Die Bezeichnung „Caspasen“ leitet sich

von der Funktion der Proteine ab: Cystein-abhängige Aspartat-spezifische

Proteinasen. Bei Säugetieren wurden bisher 14 verschiedene Caspasen identifiziert,

die man in Initiatorcaspasen (Caspase 2, 8, 9 und 10) und Effektorcaspasen

(Caspase 3, 6 und 7) unterteilt [DENAULT et al., 2002; RICHARDSON et al., 2002]. In der

Zelle liegen sie zunächst als inaktive Procaspasen vor, die durch Spaltung aktiviert

werden.

Nach der auf die Zelle einwirkenden Schädigung kann man bei der Aktivierung der

Caspase-Kaskade einen „extrinsic pathway“ und einen „intrinsic pathway“

unterscheiden. Der „extrinsic pathway“ wird ausgelöst, indem transmembranale,

sogenannte Todesrezeptoren („death receptors“, DR) durch Bindung ihres

spezifischen Liganden aktiviert werden. Diese DR gehören zur Gruppe der Tumor-

Nekrose-Faktor-Rezeptoren (TNFR) [ASHKENAZI, 2002]. Der weitere

Übermittlungsweg läuft über den zytoplasmatischen Anteil des Rezeptors, der eine

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Einleitung 7

Sequenz enthält, die Todesdomäne („death domain“, DD) genannt wird. Intrazelluläre

Adaptermoleküle wie FADD und TRADD enthalten korrespondierende DD, mit denen

sie an die DD des Rezeptors binden und so gemeinsam den „death inducing

signalling complex“ (DISC) bilden. FADD besitzt zudem eine „death effector domain“

(DED), mit der Procaspase-8 an den DISC gebunden wird. Durch die Konzentration

von vielen Procaspase-8 Molekülen im DISC kommt es zur autolytischen Aktivierung

und Freisetzung von Caspase-8 [SCAFFIDI et al., 1998]. Wenn das Signal stark genug

ist, wird durch die Spaltung und Aktivierung der nachgeschalteten Effektorcaspasen

sofort der Zelltod eingeleitet. Ein schwaches Signal bedarf der Verstärkung durch

mitochondrienabhängige Reaktionen. Das Bindeglied ist hier Bid, ein Mitglied der

Bcl-2-Familie. Es wird durch Caspase-8 gespalten und aktiviert, wonach es sich an

die Mitochondrien anlagert. Es bewirkt mit weiteren Mitgliedern der Bcl-2-Familie die

Freisetzung von Cytochrom c in das Zytosol [LUO et al. ,1998]. Cytochrom c bindet

an APAF1-Moleküle, die unter ATP-Verbrauch eine Konformationsänderung

durchlaufen und sich zum sogenannten Apoptosom zusammenschließen. Es löst die

Aktivierung der Initiatorprocaspase-9 aus und somit den Beginn der Kaskade der

nachgeordneten Effektorcaspasen [SLEE et al., 1999].

Beim „intrinsic pathway“ führen DNA-Schäden, oxidativer Streß oder ein Mangel an

Nährstoffen zur Unterbrechung des transmembranalen Potentials und zur

Durchlässigkeit der inneren Mitochondrienmembran mit der Folge eines osmotischen

Anschwellens und der Ruptur der äußeren Mitochondrienmembran. Proapoptotische

Proteine wie Cytochrom c oder AIF (apoptosis inducing factor) aus dem

intermembranalen mitochondrialen Raum werden in das Zytoplasma abgegeben

[LOEFFLER et al., 2000]. Die weitere Aktivierung der Caspasekaskade verläuft wie

oben beschrieben.

Die aufeinander folgenden Reaktionsschritte der Apoptose erlauben es den

„Inhibitors-of-apoptosis-proteins“ wie z. B. Survivin, regulierend in den Ablauf

einzugreifen und den Zelltod zu verhindern.

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Einleitung 8

1.5 Survivin

Survivin ist eines von acht Mitgliedern der Familie der „Inhibitor of apoptosis proteins“

(IAP). Ihr gemeinsames Charakteristikum ist das Vorhandensein einer oder mehrerer

BIR-Domänen („baculoviral-IAP-repeat“). Durch diese erlangen die IAP die Fähigkeit,

die Apoptose zu verhindern. Das Survivin-Gen befindet sich auf dem Chromosom 17

und kodiert für ein 16,5 kDa Protein. Zunächst wurde es bei Baculoviren entdeckt.

Survivin besitzt im Gegensatz zu den anderen IAP nur eine BIR-Domäne und liegt

als Dimer vor [REED, 2001; SCHIMMER, 2004; VERHAGEN et al., 2001; JOHNSON et al.,

2004] (Abbildung 3).

Abb. 3: Struktur des Survivindimers [nach: Chantalat L et al. (1999)] Abgebildet sind die β-Stränge (lila), α-Helices (grün), Schlingen (braun), Zink-Atome (blau), Trypsin-Schneidestellen (schwarze Pfeile). a) Die doppelt gefaltete Dimerachse liegt in der Betrachtungsebene b) 90° Drehung von (A) In sich entwickelndem, fetalem Gewebe konnte eine hohe Survivinexpression

nachgewiesen werden [ADIDA et al., 1998]. In ausdifferenzierten adulten Geweben ist

Survivin nur in Gewebe mit hohem Zellumsatz feststellbar, wie CD34-positiven

Knochenmarkstammzellen, basalem Kolonepithel oder der Magenschleimhaut

[CHIOU et al., 2003; CARTER et al., 2001].

Im Unterschied zu den anderen beim Menschen entdeckten IAP zeigt Survivin eine

klar nachgewiesene Assoziation mit malignen Erkrankungen, z. B. Mammakarzinom,

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Einleitung 9

Kolonkarzinom, Neuroblastom und ZNS-Tumoren [ADIDA et al., 1998; CHAKRAVARTI et

al., 2002; KAWASAKI et al., 1998; PREUSSER et al., 2005; SASAKI et al., 2002; TANAKA

et al., 2000; UEMATSU et al., 2005; XIE et al., 2006; YAMADA et al., 2003]. Bei den

meisten dieser malignen Erkrankungen konnte statistisch belegt werden, dass eine

hohe Survivinexpression mit einer schlechteren Prognose einhergeht [KAJIWARA et

al., 2003; ROUSSEAU et al., 2006; SCHULTZ et al., 2003; UEMATSU et al., 2005].

Survivin ist für eine korrekt ablaufende Mitose unerlässlich. Es bindet mit seiner

carboxy-terminalen α-Helixstruktur an die Mikrotubuli der mitotischen Spindel und

stabilisiert diese, so dass es zur Zellteilung kommen kann [SKOUFIAS et al., 2000;

WHEATLEY et al., 2001]. Survivin wird besonders stark in der G2/M-Phase des

Zellzyklus exprimiert [LI et al., 2006]. Dies unterscheidet Survivin von den anderen

IAPs, da diese unter physiologischen Bedingungen nicht zellzyklusabhängig

exprimiert werden.

Der genaue Mechanismus, mit dem Survivin den Ablauf der Apoptose inhibiert, ist

bislang nicht abschließend geklärt. In einem zellfreien Medium konnten TAMM et al.

(1998) nachweisen, dass Survivin die Aktivierung von Procaspase 3 und 7 inhibieren

kann und auch an die bereits aktivierte Caspase 3 und 7 bindet. In einem anderen

Versuch konnten SONG et al. (2003) eine Apoptoseinhibition von Survivin durch

Bindung an den „second mitochondrial activator of caspases“ (Smac) zeigen. Eine

direkte Bindung an Caspasen ließ sich aber auch unter physiologischeren

Bedingungen nicht darstellen [BANKS et al., 2000; VERDECIA et al., 2000].

In den letzten 5 Jahren konnten vier Survivin-Splicevarianten identifiziert werden, die

zum Teil unterschiedlichen subzellulären Lokalisationen zugeordnet werden können.

Ebenso wie Survivin (sogenanntes Wildtyp-Survivin) lässt sich Survivin2β im

Zytoplasma lokalisieren, während Survivin-δEx3 nukleär nachweisbar ist. Zu den

speziellen subzellulären Lokalisationen von Survivin2α und Survivin3β gibt es

derzeit noch keine abschließenden veröffentlichten Forschungsergebnisse. Man geht

aktuell aufgrund der unterschiedlichen Lokalisationen und der Molekularstruktur von

Survivin und der Splicevarianten von einer inaktiven Heterodimerformierung aus,

bestehend aus Wildtyp-Survivin und Survivin3β bzw. Survivin-δEx3. Dies könnte der

Feinregulierung der Apoptose dienen. Bislang gelang aber weder in vitro noch in vivo

ein sicherer Nachweis dieser vermuteten Heterodimerbildung [MAHOTKA et al., 2002;

LI, 2005; NOTON et al., 2006; SPAN et al., 2006].

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Einleitung 10

Es gibt einige Hinweise, dass ein Zusammenhang zwischen Survivin und P-gp bei

der Entstehung von Multidrug-Resistenz besteht. Die genauen Mechanismen der

Zusammenhänge sind nicht bekannt. LIU et al. (2007) untersuchten die mRNA

Expression von P-gp und Survivin in Zellkulturen einer Zellinie eines

Adenokarzinoms der menschlichen Brustdrüse und der dazugehörigen Adriamycin-

resistenten Variante. Im Vergleich beider Zelllinien fiel auf, dass sowohl die

Expression von P-gp als auch von Survivin bei der resistenten Zelllinie höher war als

bei der nichtresistenten. Durch Zugabe von Verapamil, einem P-gp-Inhibitor, zu der

resistenten Zellinie, konnte die P-gp-mRNA-Expression gesenkt werden; zugleich

verringerte sich auch die mRNA-Expression von Survivin um über 90%. Durch die

Transfektion der nichtresistenten Karzinomzellen mit einem EGFP/Survivin-Plasmid

verringerte sich die Sensibilität gegenüber Adriamycin deutlich. LIU et al. stellten

daher die Hypothese auf, dass bei verstärkter Expression von P-gp der intrazelluläre

Transport von Survivin in die verschiedenen Zellkompartimente erleichtert ist und das

Protein somit die Zielorte seiner promitotischen und antiapoptotischen Wirkung

vermehrt erreicht und dass Survivin seinerseits den Umsatz von P-gp moduliert.

Das Ki-67-Antigen zeigt im Zellzyklus ein Auftreten, das zeitlich mit dem von Survivin

vergleichbar ist. Es handelt sich dabei um einen nukleären Proliferationsmarker, der

während des Zellzyklus in der G1-, S-, G2- und der M-Phase exprimiert wird,

wohingegen er in der Ruhephase, der G0-Phase des Zellzyklus, nicht nachweisbar

ist. Zellpopulationen, die stark proliferieren und sich zu einem großen Teil in einer

aktiven Phase des Zellzyklus befinden, exprimieren somit sehr viel Ki-67. Dieses

Antigen kann mit dem gegen Ki-67 gerichteten Antikörper MiB-1 spezifisch

nachgewiesen werden und erlaubt somit eine Aussage über die Proliferationsaktivität

eines Gewebes [MC CORMICK et al., 1993].

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Einleitung 11

1.6 Zielsetzung dieser Arbeit

Verschiedene Untersuchungen konnten einen Zusammenhang von hoher

Survivinexpression mit einer schlechten Langzeitprognose von astrozytären

Hirntumoren nachweisen. Mit steigendem WHO-Grad konnte eine Zunahme der

P-gp-Expression und somit der Arzneimittelresistenz gezeigt werden, was letztlich

eine schlechtere Prognose für den Patienten bedeutet. Auch die Expression von Ki-

67 und Caspase-3 wurde von einigen Arbeitsgruppen für Astrozytome untersucht,

dabei gilt ein hoher Proliferationsindex als prognostisch ungünstig, ein hoher

Apoptoseindex hingegen als vorteilhaft. Für oligodendrogliale Hirntumoren gibt es

kaum bzw. keine entsprechenden Daten. Oligodendrogliome haben im Vergleich zu

Astrozytomen eines vergleichbaren WHO-Malignitätsgrades eine bessere Prognose.

Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung der pro- bzw. antiapoptotischen Proteine

Caspase-3 sowie Survivin in gliösen Hirntumoren verschiedener WHO-Grade unter

Berücksichtigung des Proliferationsindex und der P-gp Expression. Dadurch sollen

mögliche Beziehungen zwischen diesen Faktoren sowie ihr Einfluss auf die

Tumorprogression und auf eine mögliche Chemoresistenz aufgedeckt werden.

Hierdurch sollen weitere Erkenntnisse über das unterschiedliche Ansprechen auf die

antitumorale Therapie bzw. die unterschiedliche Prognose von astrozytären und

oligodendroglialen Hirntumoren gewonnen werden sowie möglicherweise ein

Ansatzpunkt für die postoperative Kontrolle und Therapie der Patienten geliefert

werden.

Es werden folgende Versuche durchgeführt:

Menschliche Hirntumoren astrozytären und oligodendroglialen Ursprunges werden

auf das Vorhandensein von Survivin und P-Glycoprotein mittels Immunhistochemie

bzw. In-situ-Hybridisierung untersucht. Mit dem immunhistochemischen Nachweis

von aktivierter Caspase-3 als Schlüsselposition der Apoptose wird aufgezeigt, ob mit

steigender Proteinexpression die Apoptoserate abnimmt. Durch Anfärbung mit dem

gegen Ki-67 gerichteten Antikörper MiB-1 wird der Proliferationsindex bestimmt.

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Material und Methoden 12

2. Material und Methoden

Für die Durchführung und Auswertung der Versuche wurden die nachfolgend

aufgeführten Materialien und Kits verwendet. Gebräuchliche Chemikalien wurden mit

der Spezifikation „reinst“ eingesetzt.

2.1. Puffer und Lösungen

10x PBS (pH 7,4) NaCl 1,37 M KCl 26,8 mM Na2HPO4 100 mM K2HPO4 17,6 mM 20x SSPE (pH 7,4) NaCl 3,6 M NaH2PO4 0,2 M EDTA 0,2 M Lösung D (pH 7,0) Guanidinthiocyanat 4,0 M Natriumcitrat 25 mM 20x SSC (pH 7,0) NaCl 2,0 M Natriumcitrat 0,3 M 10x Maleatpuffer (pH 7,5) Maleinsäure 1,0 M NaCl 1,5 M

10x AP-Puffer (pH 9,5) mit MgCl2 Tris Base 1,0 M NaCl 1,0 M MgCl2 0,5 M TE-Puffer (pH 7,5) Tris Base 10 mM EDTA 1 mM Prähybridisierungslösung deionisiertes Formamid 25 µl Lösung D 25 µl 10 % Blockingsolution 2,5 µl tRNA (100 µg/µl) 0,12 µl

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Material und Methoden 13

Blockierungslösung Tween 0,10% Triton X 100 0,20% Blockingsolution 1,00% NaCl 20 mM Maleatpuffer 1x Waschpuffer Maleatpuffer 1x Tween 0,30% Triton 0,20% 10 mM Citratpuffer (pH 6,0) Lösung A: 0,1 M Citronensäure Lösung B: 0,1 M Natriumcitrat 18 ml Lösung A, 82 ml Lösung B, Aqua dest. ad 1l Tris-HCl (pH 7,4) Tris-Base 70 mM Tris-HCl 430 mM NaCl 1,5 M

2.2 Chemikalien

Chemikalien Hersteller

Formaldehyd Roth

Roti®-Histokitt Roth

Aquatex Merck Blocking Solution Roche

2.3 Kits und Fertiglösungen

Kits und Fertiglösungen Hersteller Target Retrieval Solution DAKO Cytomation DAKO REAL™ Detection System DAKO Cytomation DAKO Antibody Diluent DAKO Cytomation i-VIEW DAB Paraffin Kit Ventana XT ultraView DAB Kit Ventana innuPREP RNA Mini Kit Analytik Jena First-Strand cDNA-Synthesis Kit Fermentas Life Science Gel-Band-Purification Kit Amersham DIG RNA Labeling Kit Roche

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Material und Methoden 14

2.4 Antikörper

Antikörper Hersteller Anti-ABCB1 (P-gp) (JSB-1), monoclonal, mouse IgG1 Alexis Anti-Survivin (FL-142: sc-10811) polyclonal, rabbit Santa Cruz Anti-Caspase-3 (Rabbit x Caspase, CPP 32), polyclonal, rabbit Zytomed Systems Anti-Ki67 (MiB-1, M7240), monoclonal, mouse DAKO Cytomation Anti-DIG-AP AK Roche Diagnostics

2.5 Primer

Primer Fragmentlänge Sequenz Gen-Bank-Nr.

Survivin 331 bp NM-001168

Sur fw neu: 5' ctg tca cac ctg tgc ctc 3'

Sur rv neu: 5' cac tgg gcc tgt cta atc 3 P-gp 292 bp M 14758 P-gp f: 5' tga ttg cat ttg gag gac aa 3' P-gp r: 5' tgc ttc aat gct tgg aga tg 3'

2.6 Gewebeproben

Aus dem Archiv des Institutes für Pathologie der Universität Greifswald wurden aus

den Jahren 1995 bis 2007 insgesamt 172 Fälle von astrozytären und

oligodendroglialen Hirntumoren ausgewählt, die von 118 Patienten stammten. Von

manchen Patienten existieren mehrere Gewebsproben, da Tumorrezidive oder ein

Malignitätsprogress auftraten. Bei den ausgewählten Fällen handelte es sich um

formalinfixiertes und in Paraffin eingebettetes Gewebe.

Proben, bei denen 50 % und mehr des Tumorgewebes Nekrosen aufwiesen, wurden

nicht untersucht, da die Aussagekraft der Untersuchungsmethoden bei ausgedehnter

Nekrose stark eingeschränkt ist. Das untersuchte Material ist in Tabelle 4 im

Ergebnisteil aufgelistet.

Da seit 1995 die Klassifikation der Hirntumoren durch die WHO aktualisiert wurde

(2007), wurden alle ursprünglich angefertigten Präparate erneut durch einen

Neuropathologen beurteilt, es musste jedoch in keinem der Fälle eine Änderung der

ursprünglichen Klassifikation vorgenommen werden.

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Material und Methoden 15

2.7 Methoden

2.7.1 Immunhistochemie

Mit Hilfe der Immunhistochemie kann in Gewebsschnitten die Lokalisation von

Proteinen bestimmt werden. Die Basis der Immunhistochemie ist eine Antigen-

Antikörper-Reaktion, bei der markierte Antikörper mit einer Affinität zu einem

bestimmten Epitop eines Proteins an dieses binden und es so sichtbar gemacht

werden kann. Der spezifische Antikörper, der gegen das Epitop gerichtet ist, wird als

Primärantikörper bezeichnet. In einem weiteren Schritt wird ein zweiter Antikörper

(Sekundärantikörper), der gegen den Primärantikörper gerichtet ist, aufgebracht.

Dieser Sekundärantikörper ist enzymgekoppelt, so dass bei entsprechender

Substratzugabe eine Färbung durch eine Enzym-Substrat-Reaktion entsteht. Für die

immunhistochemische Färbung in den durchgeführten Versuchen wurde die Labeled

(Strept)avidin-Biotin-Methode (LSAB) benutzt, die auf der hohen Affinität von

Streptavidin und Avidin für Biotin basiert. Dabei wird zum Primärantikörper ein

biotinylierter Sekundärantikörper gegeben und anschließend ein Avidin-Biotin-

Enzymkonjugat hinzugegeben. Bei dem Enzym handelt es sich um eine Peroxidase

(Meerettich-Peroxidase, „horse raddish- peroxidase“ = HRP), die Wasserstoffperoxid

spaltet, so dass hochreaktive Sauerstoffradikale entstehen. Diese können

Chromogene oxidieren, wodurch es zur Färbung kommt. Die Farbreaktion entsteht

nach entsprechender Substratzugabe.

Um eine möglichst standardisierte Durchführung zu erreichen, wurden die

immunhistochemischen Färbungen für Survivin mit dem NexEs IHC Färbemodul der

Firma Ventana und für MiB-1 und Anti-Caspase-3 mit dem BenchMark XT IHC/ISH

Färbemodul der Firma DAKO vorgenommen. Die immunhistochemische

Untersuchung von P-gp erfolgte manuell, da mit dem Automaten keine optimalen

Ergebnisse zu erzielen waren.

Die 2 µm Gewebeschnitte wurden mit dem HM 360 Rotationsmikrotom der Firma

MICROM hergestellt.

2.7.1.1 Nachweis von P-Glycoprotein (P-gp)

Die Gewebeschnitte wurden 3 x 5 min in Xylol entparaffiniert und durch eine

absteigende Ethanolreihe rehydriert (2 x 5 Minuten 99 % Ethanol, 1 x 3 Minuten

96 % Ethanol). Zur Demaskierung wurden die Schnitte 3 Minuten in Citratpuffer (pH

6) im Dampfdrucktopf gekocht. Nach Abkühlen der Proben wurde 3 x 5 Minuten in

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Material und Methoden 16

Aqua dest. gewaschen und zur Blockade der endogenen Peroxidasen in 3 %-iger

Wasserstoffperoxidlösung inkubiert. Es folgten je 3 fünfminütige Waschschritte in

Aqua dest. und Tris-HCL. Die Inkubation mit dem Primärantikörper (1:100 in DAKO

Antibody Diluent) wurde über Nacht bei 4 °C durchge führt.

Am folgenden Tag wurden die Proben 5 Minuten mit Tris-HCl/Tween gewaschen. Die

Detektion erfolgte mit dem DAKO REAL™ Detection System (HRP/DAB,

rabbit/mouse) nach folgendem Verfahren: 10-minütige Inkubation mit dem

biotinylierten Sekundärantikörper, 5 Minuten waschen mit Tris-HCl/Tween, 20

Minuten Streptavidin Peroxidase HRP und 5 Minuten waschen mit Tris-HCl/Tween.

Die Färbung wurde mit DAB in HRP Substrat Puffer bis zur Braunfärbung

durchgeführt. Die Reaktion wurde mit Aqua dest. gestoppt. Nach 3 x 5 Minuten

Waschen in Aqua dest. wurde für 30 Sekunden mit Mayers Hämalaun gegengefärbt.

Anschließend wurden die Schnitte 2 Minuten unter fließendem Leitungswasser

gebläut und nach kurzen Entwässerungsschritten in 99 % Alkohol, 96 % Alkohol,

Isopropanol und Xylol in Histokitt eingedeckt.

2.7.1.2 Nachweis von Survivin

Der Nachweis von Survivin erfolgte mit dem Färbeautomaten. Es wurde eine 25-

minütige Vorbehandlung der Gewebsschnitte mit Target Retrieval Solution der Firma

DAKO durchgeführt. Die immunhistochemische Färbung und Detektion erfolgte mit

dem i-VIEW DAB Paraffin Kit (Ventana) nach modifiziertem Herstellerprotokoll. Der

Survivin-Antikörper wurde bei 37 °C in einer Verdün nung von 1:100 für 32 Minuten

aufgetragen. Die Gegenfärbung erfolgte manuell für 5 Minuten in Hämatoxilin gefolgt

von je zwei kurzen Inkubationsschritten in Aqua dest. und einer wässrigen

Ammoniaklösung. Nach 5-minütigem Spülen mit Leitungswasser wurde in einer

aufsteigenden Ethanolreihe bis hin zu Xylol dehydriert und mit Histokitt eingedeckt.

2.7.1.3 Nachweis von Caspase-3

Der Nachweis von Caspase-3 und die Gegenfärbung erfolgten mit dem

Färbeautomaten. Hierzu wurde der XT ultraView DAB Kit (Ventana) nach

Herstellerangaben verwendet. Die Antikörperinkubation erfolgte bei 37 °C in einer

Verdünnung von 1:100 für 32 Minuten.

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Material und Methoden 17

2.7.1.4 Nachweis von Ki-67

Der Nachweis von Ki-67 und die Gegenfärbung erfolgten mit dem Färbeautomaten.

Hierzu wurde der XT ultraView DAB Kit (Ventana) nach Herstellerangaben

verwendet. Die Antikörperinkubation erfolgte bei 37 °C in einer Verdünnung von

1:100 für 32 Minuten.

2.7.2 In situ Hybridisierung

Mit der in situ Hybridisierung lassen sich Nukleinsäuren in Chromosomen, Zellen und

Geweben nachweisen. Die Technik basiert auf der Hybridisierung einer spezifischen,

markierten Nukleotidsonde an ihre komplementären Sequenzen an DNA oder RNA.

Hier soll mRNA mit Digoxigenin(DIG)-markierten RNA-Sonden nachgewiesen

werden. Der Versuch kann in vier Abschnitte unterteilt werden: Herstellung der

markierten RNA-Sonden, Fixierung und Vorbehandlung der Gewebe auf

Objektträgern, Hybridisierung und Nachweis der hybridisierten Sonde.

2.7.2.1 Herstellung der DIG-markierten RNA-Sonden

Die Markierung der Sonden erfolgte mittels in vitro Transkription. Hierzu wird das

gewünschte DNA-Fragment über PCR generiert, in einen geeigneten

Transkriptionsvektor ligiert und in Escherichia coli vermehrt. Nach Gewinnung der

Plasmid-DNA folgt die Linearisierung des Vektors sowie die Transkiption durch RNA-

Polymerasen. Wird DIG-dUTP in den dNTP-Mix gegeben, werden die Transkripte an

jedem 20. – 30. Nukleotid mit Digoxigenin markiert.

Zunächst wurde RNA aus HL-60 Zellen (promyeloblastische Leukämiezelllinie) und

HepG2-Zellen (humane Leberzelllinie) (Institut für Pharmakologie und Toxikologie,

Universität Greifswald) mit dem innuPREP RNA Mini Kit (Analytik Jena) nach

Herstellerangaben isoliert. Die cDNA-Synthese wurde mit dem First-Strand cDNA-

Synthesis Kit (Fermentas Life Science) nach Herstellerprotokoll durchgeführt. Die

cDNA wurde in die PCR mit spezifischen Primern für Survivin bzw. P-Glycoprotein

eingesetzt.

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Material und Methoden 18

Der Standard-PCR-Ansatz setzt sich folgendermaßen zusammen:

• cDNA 5,0 µl

• 10 x Reaktionspuffer 5,0 µl

• MgCl2 (25 mM) 3,0 µl

• dNTPs (je 10 mM) 1,0 µl

• 5`-Primer (10 pmol/µl) 2,0 µl

• 3`-Primer (10 pmol/µl) 2,0 µl

• InnuTaq-Polymerase (5U/µl) 0,5 µl

• Aqua bidest. Ad 50,0 µl

Survivin PCR

2 Minuten 94 °C

30 Sekunden 94 °C

45 Sekunden 53 °C 35 x

1 Minute 72 °C

7 Minuten 72 °C

∞ 4 °C

P-Glycoprotein PCR

3 Minuten 94 °C

30 Sekunden 94 °C

1 Minute 51 °C 35 x

1 Minute 72 °C

7 Minute 72 °C

∞ 4 °C

Die PCR-Produkte wurden mittels Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt und mit

dem Gel-Band-Purification Kit (Amersham) nach Herstellerangaben aufgereinigt. Die

Klonierung der PCR-Produkte in den pGEM –T Easy Vektor (Promega) wurde von

Frau Dr. Kunert-Keil im Institut für Pathophysiologie (Universität Greifswald)

durchgeführt. Dort erfolgte auch die Sequenzierung und die Spaltung der Plasmide.

Die gespaltenen Plasmide wurden in die in vitro Transkription mit dem DIG RNA

Labeling Kit (Roche) nach Herstellerangaben eingesetzt. Die DIG-markierten Sonden

wurden nach Herstellerprotokoll aufgereinigt und der Gehalt und die

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Material und Methoden 19

Markierungseffizienz photometrisch bzw. mittels Tüpfeltest überprüft. Spezifische

Bindungseigenschaften der Sonden wurden im Northern Blot analysiert.

2.7.2.2 In situ Hybridisierung von P-Glycoprotein (P-gp) und Survivin

Für die in-situ-Hybridisierung stand formalinfixiertes und in Paraffin eingebettetes

Gewebe zur Verfügung. Die 2 µm Gewebeschnitte wurden mit dem HM 360

Rotationsmikrotom der Firma MICROM hergestellt. Durchgeführt wurde die in situ

Hybridisierung unter möglichst RNAse-freien Bedingungen

Die Schnitte wurden 30 Minuten in Xylol entparaffiniert und in einer absteigenden

Ethanol-Reihe rehydriert (je 5 Minuten 100 % Ethanol, 95 % Ethanol, 70 % Ethanol).

Nach 2 x 5 Minuten Waschen in PBS wurde 5 Minuten in 4 % Paraformaldehyd-

Lösung (in 10 x PBS) auf Eis nachfixiert und erneut 3 x 5 Minuten in PBS

gewaschen. Der Verdau erfolgte mit Pepsin (60 mg / 70 ml 0,2 M HCl) in 0,5 M HCl

für 20 Minuten bei 37 °C. Es wurde 2 x 5 Minuten in PBS gewaschen und erneut für

20 Minuten in 4 % Paraformaldehyd-Lösung auf Eis fixiert. Nach 3 x 5 Minuten

Waschen in PBS wurde mit 0,1 M Triethanolamin und Essigsäureanhydrid für 15

Minuten acetyliert. Essigsäureanhydrid wurde zu Beginn und nach 5 Minuten

zugesetzt. Es folgten drei 5-minütige Waschschritte in PBS und 1,5 x SSPE in 50 %

Formamid. Die Prähybridisierung erfolgte mit 50 µl Prähybridisierungslösung in einer

feuchten Kammer bei 56 °C für 1 Stunde. Hybridisier t wurde über Nacht mit

Hybridisierungslösung (Prähybridisierungslösung + 150 – 300 ng Sonde) in einer

feuchten Kammer bei 56 °C. Nach der Hybridisierung wurde 2 x 5 Minuten mit

Prähybridisierungslösung, 3 x 5 Minuten mit 2 x SSC, 3 x 5 Minuten mit 0,1 x SSC

und 3 x 5 Minuten mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Schnitte für eine

Stunde mit Blockierungslösung behandelt und eine Stunde mit dem Anti-DIG-AP

Antikörper (1:500) inkubiert. Nach 3 x 5 Minuten Waschen im Waschpuffer, 2 x 5

Minuten und 10 Minuten Inkubation in AP-Puffer erfolgte die Visualisierung mit

NBT/BCIP in AP-Puffer bei 37 °C im Dunklen. Die Fär bung wurde 1 Stunde in TE

Puffer gestoppt, die Schnitte je 5 Minuten in 10 x PBS, PBS und Wasser gewaschen,

luftgetrocknet und in Aquatex eingedeckt.

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Material und Methoden 20

2.8 Auswertung der immunhistochemischen Färbungen und in situ Hybridisierung

Zur Quantifizierung der immunhistochemischen Färbungen von P-gp, Survivin und

der in-situ-Hybridisierung von P-gp und Survivin wurden mit der Image-Pro Plus

Software von Media Cybernetics pro Objektträger sechs digitale Bilder des Tumors

aufgenommen (200-fache Vergrößerung). Die mittlere optische Dichte wurde mit der

KSRun Software (KSRun Version 3.0, Zeiss, Germany) bestimmt und ausgewertet.

Dazu wurden mit einer speziellen Matrix die minimalen und maximalen

Färbungsintensitäten definiert und auf alle digital erstellten Bilder angewendet. Aus

der als positiv gewerteten Fläche und der Färbeintensität wurde die mittlere optische

Dichte (= mod) berechnet, die ein Maß für die Expressionsstärke darstellt. Zur

Quantifizierung der immunhistochemischen Färbung von MiB-1 und Caspase-3

wurden mit der Image-Pro Plus Software (Media Cybernetics) von 10 Gesichtsfeldern

jeweils die Gesamtzellzahl ermittelt und dann der Anteil der immunhistochemisch

positiven Zellen berechnet. Hierzu wurden zuvor mit einer speziellen Maske die

maximalen und minimalen Färbungsintensitäten definiert, die als positiv gezählt

werden sollten. Aus je 10 Gesichtsfeldern pro Objektträger wurde dann ein Mittelwert

erstellt.

2.9 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung wurde mit dem Statistikprogramm SPSS 12.0.1 der

Firma SPSS durchgeführt. Es wurden unterschiedliche Gruppen definiert, die auf

signifikante Unterschiede überprüft wurden. Zunächst wurden Vergleiche zwischen

den Untergruppen der Astrozytome und Oligodengrogliome angestellt. Als nächstes

wurden die astrozytären und die oligodendroglialen Hirntumoren verglichen und

zuletzt wurden Korrelationsanalysen zwischen den untersuchten Parametern

durchgeführt.

Mit dem Kolmogorov-Smirnov-Anpassungstest wurden die erhobenen Daten auf

Normalverteilung überprüft. Da nicht für alle erhobenen Parameter eine

Normalverteilung vorlag, wurde die anschließende Auswertung mit dem nicht-

parametrischen Mann-Whitney-Test für zwei unabhängige Stichproben durchgeführt.

Für die Korrelationsanalyse wurde der Korrelationstest nach Pearson angewandt. Als

Irrtumswahrscheinlichkeit wurde p ≤ 0,05 festgelegt.

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Ergebnisse 21

3. Ergebnisse

3.1 Aufteilung der Gewebeproben

Es wurden Gewebsproben von 118 Patienten untersucht, davon waren 47 Proben

von Frauen und 71 Gewebsproben von Männern. Der Altersmittelwert lag für alle

Tumoren zusammen bei 42,8 Jahren (Standardabweichung +/- 14,5 Jahre). In

Tabelle 4 sind die Geschlechtsverteilung und das mittlere Alter bei Diagnosestellung

dargestellt. In Tabelle 5 sind die Daten zur Häufigkeit der verschiedenen

Untergruppen der Astrozytome und Oligodendrogliome aufgeführt und Daten der

CBTR-US bzw. von OHGAKI et al. (2005) gegenübergestellt.

Tab. 4: Geschlechts- und Altersverteilung der untersuchten Gewebsproben.

Tumor Anzahl ♀ ♂ Mittelwert Alter in Jahren (+/- Standardabweichung)

Pilozytisches Astrozytom 10 4 6 14,1 (+/- 6,5) Diffuses Astrozytom 31 12 19 39,7 (+/- 17,8) Anaplastisches Astrozytom 15 5 10 46,9 (+/- 14,2) Glioblastoma multiforme 49 22 27 61,5 (+/- 9,6) Low grade Oligodendrogliom 9 3 6 51,3 (+/- 14,8) Anaplastisches Oligodendrogliom 4 1 3 43,3 (+/- 20,6) Summe 118 47 71 Tab. 5: Häufigkeiten der unterschiedlichen Subgruppen von Astrozytomen und Oligodendrogliomen im untersuchten Gewebe, Gegenüberstellung mit Daten aus: [Central Brain Tumor Registry of the United States (CBTR-US), 2000 und WHO Classification of Tumors, Pathology and Genetics, Tumors of the Nervous System, 2007].

Hirntumor (WHO Grad) Daten der WHO bzw.

CBTR-US eigene Daten

Anteil aller Astrozytome Anteil aller

Astrozytome Pilozytisches Astrozytom (WHO I) ca. 6 % 9,5 %

Diffuses Astrozytom (WHO II) ca. 10 – 15 % 29 %

Anaplastisches Astrozytom (WHO III) ca. 10 – 19 % 14 %

Glioblastoma multiforme (WHO IV) ca. 50 – 60 % 46 %

Anteil aller

Oligodendrogliome

Anteil aller Oligodendro-

gliome Low grade Oligodendrogliom (WHO II) ca. 77 % 69 %

Anaplastisches Oligodendrogliom (WHO III) ca. 23 % 30 %

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Ergebnisse 22

In Tabelle 6 wurden die erhobenen Daten zum mittleren Alter bei Diagnosestellung

der untersuchten Fälle mit den Angaben von OHGAKI et al. (2005) verglichen.

Tab. 6: Mittleres Alter bei Diagnosestellung der unterschiedlichen Subgruppen von Astrozytomen und Oligodendrogliomen, Gegenüberstellung mit Daten nach: [OHGAKI et al., 2005].

Hirntumor (WHO Grad) Mittleres Alter bei Diagnosestellung

(in Jahren) [nach: OHGAKi et al.(2005)]

Mittleres Alter bei Diagnosestellung

(in Jahren) [eigene Daten]

Pilozytisches Astrozytom (WHO I) 20 14,1 Diffuses Astrozytom (WHO II) 41 39,7 Anaplastisches Astrozytom (WHO III) 44 46,9 Glioblastoma muliforme (WHO IV) 61 61,5 Low grade Oligodendrogliom (WHO II) 40 51,3 Anaplastisches Oligodendrogliom (WHO III) 49 43,3

In dem in der vorliegenden Arbeit untersuchten Probenkollektiv war ein höherer

Anteil an Astrozytomen WHO Grad I und WHO Grad II zu verzeichnen als in der

Literatur beschrieben. Der Anteil an Oligodendrogliomen WHO Grad II lag etwas

unter dem Durchschnittswert aus den Literaturangaben, der Anteil an

Oligodendrogliomen WHO Grad III war etwas höher. Bei der Gegenüberstellung des

durchschnittlichen mittleren Alters bei Diagnosestellung zeigt sich eine weitgehende

Übereinstimmung bei den Astrozytomen der WHO Grade II- IV. Das durchschnittliche

Alter bei Diagnosestellung lag bei den Astrozytomen WHO Grad I und den

Oligodendrogliomen WHO Grad III des untersuchten Kollektivs deutlich niedriger als

in der Literatur beschrieben, während bei den Oligodendrogliomen WHO Grad II das

durchschnittliche Alter bei Diagnosestellung höher war.

3.2 Lokalisation der Hirntumoren

Die Lokalisationsangaben der Hirntumoren wurden den Patientenakten der Klinik für

Neurochirurgie der Universität Greifswald (Prof. H. Schröder) entnommen, sofern

diese verfügbar waren. Eine Übersicht über verschiedene Lokalisationen

unterschiedlicher Hirntumoren gibt Abbildung 4. A - D. Dabei zeigte sich, dass

Astrozytome der WHO- Grade II und III überwiegend fronto-parietotemporal gelegen

waren. Glioblastome fanden sich in allen Hirnlappen gleichermaßen.

Oligodendrogliome lagen bevorzugt frontotemporal.

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Ergebnisse 23

frontal

temporo-parietal

occipital

links rechts

multiple Lokalisationen

Kleinhirn

7

6

9

8

8

9

5

C

frontal

temporo-parietal

occipital

links rechts

multiple Lokalisationen

Kleinhirn

5

4 3

1

3

A

1

andere Lokalisationen 5

frontal

temporo-parietal

occipital

links rechts

multiple Lokalisationen

Kleinhirn

1

3

4

4

B

1

1

andere Lokalisationen 4

frontal

temporo-parietal

occipital

links rechts

Kleinhirn

1 5

3

D

Abb.: 4A - D: Lokalisationen der unterschiedlichen Hirntumoren (A: Astrozytome WHO Grad II; B: Astrozytome WHO Grad III; C: Astrozytome WHO Grad IV; D: Oligodendrogliome WHO Grad II)

Es wurden die Lokalisationen der Astrozytome WHO Grad II-IV bzw. der

Oligodendrogliome Grad III dargestellt. Von den Astrozytomen WHO Grad I bzw.

Oligodendrogliomen Grad II waren die Lokalisationsangaben uneinheitlich bzw. nur

teilweise dokumentiert, so dass die Angaben sich nicht grafisch vereinheitlichen

ließen.

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Ergebnisse 24

3.3 Die Expression von P-Glycoprotein (P-gp)

Die Expression von P-Glycoprotein wurde an Gewebsproben von 118 Patienten

immunhistochemisch untersucht. Als Maß für die Expression, dargestellt durch die

Intensität der Färbung, wurde die mittlere optische Dichte (mod) mit Hilfe des KSRun

Programmes, wie in Abschnitt 2.8 erklärt, ermittelt.

In den Abbildungen 5 A - F sind beispielhaft einige immunhistochemische Nachweise

für P-Glycoprotein dargestellt.

A B

DAbb. 6

E F

C

Abb. 5 A - F: Immunhistochemischer Nachweis von P-Glycoprotein an Gewebsproben verschiedener Hirntumoren (200fache Vergrößerung) A: Astrozytom WHO Grad I, B: Astrozytom WHO Grad II, C: Astrozytom WHO Grad III, D: Astrozytom WHO Grad IV, E: Oligodendrogliom WHO Grad II, F: Oligodendrogliom WHO Grad III.

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Ergebnisse 25

Eine für die unterschiedlichen Hirntumoren getrennte Aufschlüsselung der mittleren

optischen Dichte (= mod) für P-Glycoprotein (P-gp) ist in Tabelle 7 dargestellt.

Tab. 7: Darstellung der mittleren optischen Dichte von P-gp (Immunhistochemie) für die unterschiedlichen Hirntumoren.

Bei der immunhistochemischen Reaktion färben sich Gefäßendothelien sowie die

Plasmamembranen der Tumorzellen.

Die P-gp Expression zeigte keine Unterschiede zwischen den Astrozytomen WHO

Grad I und II, stieg dann bei den Astrozytomen WHO Grad III an und fiel bei den

Astrozytomen WHO Grad IV wieder ab.

Es zeigte sich eine insgesamt höhere P-gp Expression bei den Astrozytomen WHO

Grad I, II und III im Vergleich zu den Astrozytomen WHO Grad IV, wobei der

Unterschied zwischen den Astrozytomen WHO Grad I und WHO Grad IV,

Astrozytomen WHO Grad II und IV sowie WHO Grad III und IV statistisch signifikant

war (p= 0,018; p= 0,002 bzw. p= 0,001).

Beim Vergleich von Astrozytomen mit Oligodendrogliomen vergleichbaren Maligni-

tätsgrades war die P-gp-Expression bei den Oligodendrogliomen höher, wobei der

Unterschied bei den Tumoren des WHO Grades II statistisch signifikant war (p=

0,016). Gleiches galt beim Vergleich aller Astrozytome auf der einen Seite und aller

Oligodendrogliome auf der anderen Seite (p= 0,001).

Bei den übrigen angestellten Vergleichen zeigte sich bei den Astrozytomen ein

Anstieg der mod von WHO Grad II zu WHO Grad III und bei den Oligodendrogliomen

ein Anstieg zwischen WHO Grad II und WHO Grad III, die Unterschiede waren

jedoch nicht statistisch signifikant. Grafisch sind die Ergebnisse in Abbildung 6

dargestellt.

Astrozytom WHO Grad

I

Astrozytom WHO Grad

II

Astrozytom WHO Grad

III

Astrozytom WHO Grad

IV Oligodendrogliom

WHO Grad II Oligodendrogliom

WHO Grad III

Mittelwert 54,14 51,97 67,19 32,86 81,75 112,6

Minimum 5,3 0 14,28 0 19,47 12,12

Maximum 102,56 242,93 249,43 129,82 191,82 288,39

Standard-abweichung 28,89 43,59 60,06 27,82 45,26 114,67

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Ergebnisse 26

A1 A2 A3 A4 OII OIII

0

100

200

300

mitt

lere

opt

isch

e D

icht

e P

-Gly

copr

otei

n Im

mun

hist

oche

mie

Abb. 6: Expression von P-Glycoprotein (Vergleich von Astrozytomen WHO Grad I –IV sowie Oligodendrogliomen WHO Grade II –III) (A1 = Astrozytome WHO Grad I; A2 = Astrozytome WHO Grad II, A3 = Astrozytome WHO Grad III, A4 = Astrozytome WHO Grad IV, OII = Oligodendrogliome WHO Grad II, OIII = Oligodendrogliome WHO Grad III ). In der Darstellung sind jeweils die Primärtumoren und ihre Rezidive zusammengefasst.

p =0,001

p =0,018

p =0,002

p =0,001

p =0,016

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Ergebnisse 27

3.4 Die Expression von Survivin

Für die immunhistochemische Untersuchung von Survivin standen Gewebsproben

von 118 Patienten zur Verfügung. Als Maß für die Expression, dargestellt durch die

Intensität der Färbung, wurde die mittlere optische Dichte (mod) mit Hilfe des KSRun

Programmes, wie in Abschnitt 2.8 erklärt, ermittelt. In den Abbildungen 7 A - F sind

beispielhaft einige immunhistochemische Nachweise für Survivin dargestellt.

Abb. 4 Abb. 12

Abb. 7Abb. 6

Abb. 8 Abb. 9

Abb. 6

A B

C

E

D

F

Abb. 7 A - F: Immunhistochemischer Nachweis von Survivin an Gewebsproben verschiedener Hirntumoren (200fache Vergrößerung). A: Astrozytom WHO Grad I, B: Astrozytom WHO Grad II, C: Astrozytom WHO Grad III, D: Astrozytom WHO Grad IV, E: Oligodendrogliom WHO Grad II, F: Oligodendrogliom WHO Grad III Eine für die unterschiedlichen Hirntumoren getrennte Aufschlüsselung der Survivin-

Expression zeigt Tabelle 8.

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Ergebnisse 28

Tab. 8: Darstellung der mittleren optischen Dichte von Survivin (Immunhistochemie) für die unterschiedlichen Hirntumoren.

Astrozytom WHO Grad

I

Astrozytom WHO Grad

II

Astrozytom WHO Grad

III

Astrozytom WHO Grad

IV Oligodendrogliom

WHO Grad II Oligodendrogliom

WHO Grad III

Mittelwert 290,78 307,42 312,28 243,19 77,17 199,38

Minimum 9,49 12,4 37,52 12,11 14,1 48,29

Maximum 2647,81 2050,89 992,64 1113,87 406,24 674,93

Standard-abweichung 782,8 460,74 301,51 269,89 110,97 222,33

Mit dem verwendeten Antikörper ließ sich sowohl eine nukleäre als auch eine

zytoplasmatische Anfärbung der Tumorzellen erzielen.

Die Survivinexpression war bei den Astrozytomen WHO Grad III größer als beim

WHO Grad I (p= 0,008) und bei den Astrozytomen WHO Grad IV niedriger als beim

WHO Grad I (p= 0,007). Bei Oligodendrogliomen fand sich ein Anstieg von WHO

Grad II zu WHO Grad III (p= 0,019).

Die Survivin-Expression war bei Astrozytomen WHO Grad II und III im Vergleich zu

den Oligodendrogliomen WHO Grad II und III höher, der Unterschied war jedoch nur

für die Tumoren des WHO Grades II signifikant (p= 0,021). Ein ähnliches Bild ergab

sich beim Vergleich aller Astrozytome auf der einen Seite und aller

Oligodendrogliome auf der anderen Seite; hier war die mod bei den Astrozytomen

höher als bei den Oligodendrogliomen (p= 0,009). Diese Unterschiede waren jeweils

statistisch signifikant.

Der Mittelwert der mod als Maß für die Expression stieg von den Astrozytomen WHO

Grad I zu WHO Grad III an und fiel bei den Astrozytomen WHO Grad IV wieder ab,

wobei der Anstieg von WHO Grad I zu WHO Grad II, von WHO Grad II zu WHO Grad

III und von WHO Grad II und zu WHO Grad IV jeweils nicht statistisch signifikant war.

Auch die niedrigere mod bei Astrozytomen WHO Grad IV im Vergleich zu WHO Grad

III zeigte keinen statistisch signifikanten Unterschied.

In Abbildung 8 sind die Ergebnisse grafisch dargestellt.

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Ergebnisse 29

A1 A2 A3 A4 O2 O3

0

500

1000

1500

2000

2500m

ittle

re o

ptis

che

Dic

hte

Sur

vivi

n Im

mun

hist

oche

mie

Abb. 8 : Expression von Survivin (Vergleich von Astrozytomen WHO Grad I – IV sowie Oligodendrogliomen WHO Grade II – III) (A1 = Astrozytome WHO Grad I; A2= Astrozytome WHO Grad II, A3 = Astrozytome WHO Grad III, A4 = Astrozytome WHO Grad IV, O2 = Oligodendrogliome WHO Grad II, O3 = Oligodendrogliome WHO Grad III). In der Darstellung sind jeweils die Primärtumoren und ihre Rezidive zusammengefasst.

p =0,009

p =0,019

p =0,007

p =0,008

p =0,007

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Ergebnisse 30

3.5 Die Expression von Ki-67

Für die Bestimmung der Zellproliferation durch den gegen Ki-67 gerichteten

Antikörper MiB-1 wurden Gewebsproben von 118 Patienten analysiert.

Eine für die unterschiedlichen Hirntumoren getrennte Aufschlüsselung der

prozentualen Anteile für Ki-67-positive Zellen ist in Tabelle 9 dargestellt. Mit der

immunhistochemischen Reaktion färben sich typischerweise die Zellkerne. In den

Abbildungen 9 A - F sind Beispiele immunhistochemischer Nachweise für Ki-67

dargestellt.

Abb. 6

Abb. 8

A

B

E

A B

C D

E F

Abb. 9 A - F: Immunhistochemischer Nachweis von Ki-67 an Gewebsproben verschiedener Hirntumoren (200fache Vergrößerung). A: Astrozytom WHO Grad I, B: Astrozytom WHO Grad II, C: Astrozytom WHO Grad III, D: Astrozytom WHO Grad IV, E: Oligodendrogliom WHO Grad II, F: Oligodendrogliom WHO Grad III

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Ergebnisse 31

Tab. 9: Darstellung der Mittelwerte von Ki67-immunhistochemisch positiven Zellen (in %) für die unterschiedlichen Hirntumoren.

Astrozytom WHO Grad

I

Astrozytom WHO Grad

II

Astrozytom WHO Grad

III

Astrozytom WHO Grad

IV Oligodendrogliom

WHO Grad II Oligodendrogliom

WHO Grad III

Mittelwert 1,67 1,78 14,21 8,24 1,81 5,56

Minimum 0 0 1,03 0 0 0,84

Maximum 3,02 7,6 34,89 22,91 4,5 11,18

Standard-abweichung 0,97 1,97 8,61 6,13 1,44 3,87

Der Anteil an Ki67-positiven Zellkerne stieg bei Astrozytomen mit steigendem

Malignitätsgrad an, und fiel dann bei den Astrozytomen WHO Grad IV wieder ab,

wobei dieser Abfall von WHO Grad III zu WHO Grad IV signifikant war (p= 0,004).

Der prozentuale Anteil von Ki-67-positiven Zellkernen war bei den Astrozytomen

WHO Grad III und IV höher als beim WHO Grad I und II (p= 0,008; p= 0,007 bzw.

p= 0,00; p= 0,004).

Die Werte der Oligodendrogliome lagen niedriger als die der Astrozytome (p= 0,029),

beim Vergleich der Astrozytome WHO Grad II und III mit den Oligodendrogliomen

vergleichbaren Malignitätsgrades zeigte sich ein höherer prozentualer Anteil an Ki-

67-positiven Zellkerne bei den Astrozytomen WHO Grad III im Vergleich zu den

Oligodendrogliomen WHO Grad III (p= 0,005). Die Werte der Astrozytome WHO

Grad II lagen auf dem Niveau der Oligodendrogliome WHO Grad II. Bei den

Oligodendrogliomen war der Anstieg von WHO Grad II nach WHO Grad III signifikant

(p= 0,037).

Diese Ergebnisse sind zur besseren Übersicht in zwei Grafiken (Abbildungen 10 A

und 10 B) dargestellt.

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Ergebnisse 32

A1 A2 A3 A4 O2 O3

0

10

20

30

40A

ntei

l an

MiB

-1 p

ositi

ven

Zelle

n (in

%)

Abb. 10 A: Anteil an Ki67-positiven (MiB-1 positiven) Zellen in % (Vergleich von Astrozytomen WHO Grad I –IV sowie Oligodendrogliomen WHO Grade II – III) (A1 = Astrozytome WHO Grad I; A2 = Astrozytome WHO Grad II, A3 = Astrozytome WHO Grad III, A4 = Astrozytome WHO Grad IV, O2 = Oligodendrogliome WHO Grad II, O3 = Oligodendrogliome WHO Grad III). In der Darstellung sind jeweils die Primärtumoren und ihre Rezidive zusammengefasst.

p =0,029

p =0,008

p =0,037

p =0,005

10 A

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Ergebnisse 33

A1 A2 A3 A4 O2 O3

0

10

20

30

40A

ntei

l an

MiB

-1 p

ositi

ven

Zelle

n (in

%)

Abb. 10 B: Anteil an Ki67-positiven (MiB-1 positiven) Zellen in % (Vergleich von Astrozytomen WHO Grad I – IV sowie Oligodendrogliomen WHO Grade II – III) (A1 = Astrozytome WHO Grad I; A2= Astrozytome WHO Grad II, A3 = Astrozytome WHO Grad III, A4 = Astrozytome WHO Grad IV, O2 = Oligodendrogliome WHO Grad II, O3 = Oligodendrogliome WHO Grad III). In der Darstellung sind jeweils die Primärtumoren und ihre Rezidive zusammengefasst.

10 B

p =0,00

=

* * p = 0,004 ** p = 0,00

p =0,007

**

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Ergebnisse 34

3.6 Die Expression von Caspase-3

Es standen Gewebsproben von 118 Patienten für die immunhistochemische

Untersuchung des Apoptoseindex mittels des gegen Caspase-3 gerichteten

Antikörpers zur Verfügung.

Eine für die unterschiedlichen Hirntumoren getrennte Aufschlüsselung der

prozentualen Anteile an für Caspase-3 positiven Zellen ist in Tabelle 10 dargestellt.

Bei der immunhistochemischen Reaktion ließ sich eine zytoplasmatische

Anfärbbarkeit von Tumorzellen erzielen. Beispielhaft wird in den Abbildungen 11 A –

F der immunhistochemische Nachweis von Caspase-3 dargestellt.

A A B

C D

E F

Abb. 11 A - F: Immunhistochemischer Nachweis von Ki-67 an Gewebsproben verschiedener Hirntumoren (200fache Vergrößerung). A: Astrozytom WHO Grad I, B: Astrozytom WHO Grad II, C: Astrozytom WHO Grad III, D: Astrozytom WHO Grad IV, E: Oligodendrogliom WHO Grad II, F: Oligodendrogliom WHO Grad III

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Ergebnisse 35

Tab. 10: Darstellung der Mittelwerte (in %) von für Caspase-3 immunhistochemisch positiven Zellen für die unterschiedlichen Hirntumoren.

Astrozytom WHO Grad

I

Astrozytom WHO Grad

II

Astrozytom WHO Grad

III

Astrozytom WHO Grad

IV Oligodendrogliom

WHO Grad II Oligodendrogliom

WHO Grad III

Mittelwert 57,65 46,72 42,42 38,9 32,56 32,33

Minimum 41,57 15,92 7,49 0,7 10,78 18,38

Maximum 80,81 86,13 93,87 65,38 52,88 49,97 Standard-

abweichung 10,96 17,6 23,08 16,76 14,43 12,4

Der Mittelwert des prozentualen Anteiles von Caspase-3 positiven Zellen nahm bei

den Astrozytomen mit steigendem Malignitätsgrad ab. Der Anteil der Caspase-3

positiven Zellen war bei Astrozytomen WHO Grad IV geringer als bei WHO Grad I

und II (p= 0,002 bzw. p= 0,043). Beim Vergleich der zu einer Gruppe

zusammengefassten Astrozytome mit den Oligodendrogliomen war der Anteil an

Caspase-3 positiven Zellen bei den Oligodendrogliomen geringer als bei den

Astrozytomen (p= 0,01), was auch beim direkten Vergleich der Astrozytome mit den

Oligodendrogliomen vergleichbaren Malignitätsgrades festzustellen war, wobei der

Unterschied nur zwischen Astrozytomen WHO Grad II und Oligodendrogliomen WHO

Grad II statistisch signifikant war (p= 0,012).

Diese Ergebnisse sind zur besseren Übersicht in zwei Grafiken (Abbildungen 12 A

und 12 B) dargestellt.

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Ergebnisse 36

A1 A2 A3 A4 O2 O3

0

20

40

60

80

100A

ntei

l an

Cas

pase

-3 p

ositi

ven

Zelle

n (in

%)

Abb. 12 A: Anteil an Caspase-3 positiven Zellen in % (Vergleich von Astrozytomen WHO Grad I – IV sowie Oligodendrogliomen WHO Grade II – III) (A1 = Astrozytome WHO Grad I; A2 = Astrozytome WHO Grad II, A3 = Astrozytome WHO Grad III, A4 = Astrozytome WHO Grad IV, O2 = Oligodendrogliome WHO Grad II, O3 = Oligodendrogliome WHO Grad III).

*

* p = 0,01

12 A

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Ergebnisse 37

A1 A2 A3 A4 O2 O3

0

20

40

60

80

100A

ntei

l an

Cas

pase

-3 p

ositi

ven

Zelle

n (in

%)

Abb. 12 B: Anteil an Caspase-3 positiven Zellen in % (Vergleich von Astrozytomen WHO Grad I – IV sowie Oligodendrogliomen WHO Grade II – III) (A1 = Astrozytome WHO Grad I; A2 = Astrozytome WHO Grad II, A3 = Astrozytome WHO Grad III, A4 = Astrozytome WHO Grad IV, O2 = Oligodendrogliome WHO Grad II, O3 = Oligodendrogliome WHO Grad III).

12 B

* p=0,002 ** p=0,043 *** p=0,012

* ** ***

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Ergebnisse 38

3.7 Die Expression von P-Glycoprotein-RNA

Für den Nachweis der RNA von P-gp mittels in situ Hybridisierung standen

Gewebsproben von 38 Patienten zur Verfügung. Davon stammten 29 Gewebsproben

aus den Gruppen der Astrozytome WHO Grad I – IV und 9 Gewebsproben aus den

Gruppen der Oligodendrogliome WHO Grad II und III. Als Maß für die Expression

wurde die mittlere optische Dichte (= mod) mit dem KSRun Programm, wie in

Abschnitt 2.8 erklärt, ermittelt. In den Abbildungen 13 A – F sind beispielhaft einige in

situ Hybridisierungen für RNA von P-gp dargestellt.

A

C

E

B

D

F

Abb. 13 A - F: Nachweis von RNA von P-Glycoprotein an Gewebsproben verschiedener Hirntumoren mittels in situ Hybridisierung (200fache Vergrößerung). A: Astrozytom WHO Grad I, B: Astrozytom WHO Grad II, C: Astrozytom WHO Grad III, D: Astrozytom WHO Grad 4, E: Oligodendrogliom WHO Grad II, F: Oligodendrogliom WHO Grad III. Wie auch bei der immunhistochemischen Untersuchung war bei P-gp innerhalb der

Gefäßendothelien und des Zytoplasmas von Tumorzellen nachweisbar. Eine für die

unterschiedlichen Hirntumoren getrennte Aufschlüsselung der P-gp-Expression der in

situ Hybridisierung ist in Tabelle 11 dargestellt.

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Ergebnisse 39

Tab. 11: Darstellung der mittleren optischen Dichte von P-Glycoprotein (in situ Hybridisierung) für die unterschiedlichen Hirntumoren.

Astrozytom WHO Grad

I

Astrozytom WHO Grad

II

Astrozytom WHO Grad

III

Astrozytom WHO Grad

IV Oligodendrogliom

WHO Grad II Oligodendrogliom

WHO Grad III

Mittelwert 716,57 1229,19 1699,03 718,69 819,61 792,55

Minimum 192,81 392,32 145,2 178,35 321,51 236,1

Maximum 1647,25 2303,42 4228,16 1359,19 1381,09 1584,6

Standard-abweichung 600,8 799,46 1530,59 485,81 459,91 567,22

Der Mittelwert der P-gp-Expression stieg bei den Astrozytomen von WHO Grad I bis

WHO Grad III an, und fiel dann von WHO Grad III zu WHO Grad IV wieder ab. Bei

den Oligodendrogliomen fiel die P-gp-Expression mit zunehmendem Malignitätsgrad

ab. Die Expression lag bei den Oligodendrogliomen niedriger als bei den

Astrozytomen, was auch beim Vergleich der Astrozytome WHO Grad II und III mit

den Oligodendrogliomen von vergleichbarem WHO Grad erkennbar war. Bei diesen

Ergebnissen ließ sich jedoch keine statistische Signifikanz nachweisen. Die

Ergebnisse sind in Abbildung 14 dargestellt.

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Ergebnisse 40

A1 A2 A3 A4 O2 O3

0

1000

2000

3000

4000

5000M

ittle

re o

ptis

che

Dic

hte

P-G

lyco

prot

ein

in-s

itu-H

ybrid

isie

rung

Abb. 14: Mittlere optische Dichte bei in-situ-Hybridisierung für P-Glycoprotein (Vergleich von Astrozytomen WHO Grad I – IV sowie Oligodendrogliomen WHO Grade II – III) (A1 = Astrozytome WHO Grad I; A2 = Astrozytome WHO Grad II, A3 = Astrozytome WHO Grad III, A4 = Astrozytome WHO Grad IV, O2 = Oligodendrogliome WHO Grad II, O3 = Oligodendrogliome WHO Grad III).

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Ergebnisse 41

3.8 Die Expression von Survivin-RNA

Für den Nachweis der RNA von Survivin mittels in situ Hybridisierung standen

Gewebsproben von 39 Patienten zur Verfügung. Davon stammten 29 Gewebsproben

aus den Gruppen der Astrozytome WHO Grad I – IV und 10 Gewebsproben aus den

Gruppen der Oligodendrogliome WHO Grad II und III. Als Maß für die Expression

wurde die mittlere optische Dichte (mod) mit Hilfe des KSRun Programmes, wie in

Abschnitt 2.8 erklärt, ermittelt.

In den Abbildungen 15 A - F sind beispielhaft einige in situ Hybridisierungen für RNA

von Survivin dargestellt. Die Reaktion in den Tumorzellen war zytoplasmatisch

lokalisiert.

A

C D

E F

B

Abb. 15 A - F: Nachweis von RNA von Survivin an Gewebsproben verschiedener Hirntumoren mittels in situ Hybridisierung (200fache Vergrößerung). A: Astrozytom WHO Grad I, B: Astrozytom WHO Grad II, C: Astrozytom WHO Grad III, D: Astrozytom WHO Grad IV, E: Oligodendrogliom WHO Grad II, F: Oligodendrogliom WHO Grad III.

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Ergebnisse 42

Eine für die unterschiedlichen Hirntumoren getrennte Aufschlüsselung der mittleren

optischen Dichte (= mod) für die Survivin in situ Hybridisierung ist in Tabelle 12

dargestellt.

Tab. 12: Darstellung der mittleren optischen Dichte von Survivin (in situ Hybridisierung) für die unterschiedlichen Hirntumoren.

Astrozytom WHO Grad

I

Astrozytom WHO Grad

II

Astrozytom WHO Grad

III

Astrozytom WHO Grad

IV Oligodendrogliom

WHO Grad II Oligodendrogliom

WHO Grad III

Mittelwert 896,84 1163,12 2451,29 1358,37 825,99 1120,93

Minimum 150,02 291,3 1206,27 269,18 480,31 349,18

Maximum 2658,44 3106,84 7294,4 1979,34 1548,77 2271,55 Standard-

abweichung 879,85 914,15 2163,38 573,47 417,96 960,63

Der Mittelwert der Survivin-Expression stieg bei den Astrozytomen von WHO Grad I

bis WHO Grad III an, und fiel dann von WHO Grad III zu WHO Grad IV wieder ab.

Die höhere Expression bei den Astrozytomen WHO Grad III im Vergleich zu den

WHO Graden I und II war statistisch signifikant (p= 0,026 und p= 0,017). Bei den

Oligodendrogliomen stieg der Mittelwert der Expression mit zunehmendem

Malignitätsgrad an. Er lag insgesamt jedoch niedriger als bei den Astrozytomen, was

man auch bei dem direkten Vergleich von Oligodendrogliomen der WHO Grade II

und III mit den Astrozytomen vergleichbaren WHO-Grades nachweisen konnte.

Diese Unterschiede zeigten jedoch keine statistische Signifikanz. Die Ergebnisse

sind in Abbildung 16 dargestellt.

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Ergebnisse 43

A1 A2 A3 A4 O2 O3

0

2000

4000

6000

8000M

ittle

re o

ptis

che

Dic

hte

Sur

vivi

n in

-situ

-Hyb

ridis

ieru

ng

Abb. 16: Mittlere optische Dichte bei in-situ-Hybridisierung für Survivin (Vergleich von Astrozytomen WHO Grad I – IV sowie Oligodendrogliomen WHO Grade II – III) (A1 = Astrozytome WHO Grad I; A2 = Astrozytome WHO Grad II, A3 = Astrozytome WHO Grad III, A4 = Astrozytome WHO Grad IV, O2 = Oligodendrogliome WHO Grad II, O3 = Oligodendrogliome WHO Grad III )

p =0,026

*

* p=0,017

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Ergebnisse 44

3.9 Korrelationen

Mit dem Korrelationskoeffizienten nach Pearson konnten statistisch signifikante

positive Korrelationen zwischen der Expression von Survivin und Ki-67 (Koeffizient:

0,152; p= 0,048) (Abb. 17 A), zwischen Survivin und Caspase-3 (Koeffizient: 0,197;

p= 0,01) (Abb. 17 B), zwischen Ki-67 und der RNA-Expression von P-Glycoprotein

(Koeffizient: 0,417; p= 0,009) (Abb.17 C), zwischen Ki-67 und der Expression der

RNA von Survivin (Koeffizient: 0,633; p= 0,00) (Abb.17 D) und schließlich auch

zwischen der RNA-Expression von P-Glycoprotein und Survivin (Koeffizient: 0,503;

p= 0,001) (Abb.17 E) festgestellt werden. Die Korrelationen sind in den Abbildungen

17 A bis E graphisch dargestellt.

Zwischen der Expression der RNA und des Proteins konnte weder für P-Glycoprotein

noch für Survivin eine statistisch signifikante Korrelation nachgewiesen werden.

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

Mittlere optische Dichte Survivin (Immunhistochemie )

0

10

20

30

40

MiB

-1 (i

n %

) (Im

mun

hist

oche

mie

)

R-Quadrat linear = 0,023

17 A Koeffizient: 0,152; p = 0,048

Abb. 17 A Korrelation zwischen der Survivin-Expression und dem Anteil an MiB-1 positiven Zellen

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Ergebnisse 45

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

Mittlere optische Dichte Survivin (Immunhistochemie )

0

20

40

60

80

100M

ittle

re o

ptis

che

Dic

hte

Cas

pase

-3 (i

n %

) (Im

mun

hist

oche

mie

)

R-Quadrat linear = 0,039

0 5 10 15 20 25 30

Mittlere optische Dichte MiB-1 (Immunhistochemie)

0

1000

2000

3000

4000

5000

Mitt

lere

opt

isch

e D

icht

e P

-Gly

copr

otei

n (in

-situ

-H

ybrid

isie

rung

)

R-Quadrat linear = 0,174

17 B

17 C

Koeffizient: 0,197; p = 0,01

Koeffizient: 0,417; p = 0,009

Abb. 17 B Korrelation zwischen der Survivin-Expression und dem Anteil an Caspase-3 positiven Zellen

Abb. 17 C Korrelation zwischen dem Anteil an MiB-1 positiven Zellen und der RNA-Expression von P-Glycoprotein

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Ergebnisse 46

0 5 10 15 20 25 30

Mittlere optische Dichte MiB-1 (Immunhistochemie)

0

2000

4000

6000

8000M

ittle

re o

ptis

che

Dic

hte

Sur

vivi

n (in

-situ

-Hyb

ridis

ier

ung)

R-Quadrat linear = 0,401

0 2000 4000 6000 8000

Mittlere optische Dichte Survivin (in-situ-Hybridis ierung)

0

1000

2000

3000

4000

5000

Mitt

lere

opt

isch

e D

icht

e P

-Gly

copr

otei

n (in

-situ

-H

ybrid

isie

rung

)

R-Quadrat linear = 0,253

17 D

17 E

Koeffizient: 0,633; p = 0,00

Koeffizient: 0,503; p = 0,001

Abb. 17 D Korrelation zwischen dem Anteil an MiB-1 positiven Zellen und der RNA-Expression von Survivin

Abb. 17 E Korrelation zwischen der RNA-Expression von Survivin und P-Glycoprotein

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Diskussion 47

4. Diskussion Bei astrozytären Hirntumoren wurde in unterschiedlichen Studien bereits der Zusam-

menhang einer hohen Survivinexpression mit einer schlechten Langzeitprognose

untersucht [CHAKRAVARTI et al., 2002; ROUSSEAU et al., 2006; SASAKI et al., 2002].

Andere Untersuchungen konnten bei Astrozytomen eine Zunahme der P-

Glycoprotein (P-gp)-Expression und somit der Arzneimittelresistenz mit steigendem

WHO-Malignitätsgrad belegen [ASHMORE et al., 1999; DEMEULE et al., 2001; LEE et

al., 2004], was letztlich eine schlechtere Prognose für den Patienten bedeutet. Auch

die Expression von Ki-67 und Caspase-3 wurde von einigen Arbeitsgruppen für

Astrozytome untersucht. Dabei gilt ein hoher Proliferationsindex als prognostisch

ungünstig, ein hoher Apoptoseindex hingegen als vorteilhaft [KAYASELCUK et al.,

2004; KOBAYASHI et al., 2007; PREUSSER et al., 2005]. Im Vergleich zu Astrozytomen

wird den Oligodendrogliomen eine bessere Prognose zugeschrieben [BAEHRING J M,

2005; ENGELHARDT et al., 2003; FORTIN et al., 2001; HARTMANN C et al., 2004; TROST

D et al, 2007; VAN DEN BENT, 2001, 2007], es gibt jedoch kaum bzw. keine Daten

bezüglich der Expression von Survivin, P-gp, Ki-67 und Caspase-3 bei

Oligodendrogliomen.

In der vorliegenden Arbeit wurden daher astrozytäre und oligodendrogliale

Hirntumoren unterschiedlicher WHO Grade auf die Expression von Survivin, P-gp, Ki-

67 und Caspase-3 untersucht und die Ergebnisse quantifiziert.

Die Häufigkeitsverteilung der Hirntumorsubtypen in den untersuchten Fällen verhält

sich ähnlich zu bereits publizierten Daten. Nach Angaben der WHO bzw. des Central

Brain Tumor Registry (CBTR-US) sind Astrozytome häufiger als Oligodendrogliome.

Dieses konnte bei den in der vorliegenden Arbeit untersuchten Gewebsproben

bestätigt werden. Es wurden 105 Fälle von astrozytären Hirntumoren und 13 Fälle

von Oligodendrogliomen untersucht. Insbesondere bei den Astrozytomen lag die

Fallzahl an archivierten Fällen jedoch ursprünglich viel höher, allerdings wurden in

einer ersten Vorauswahl bereits die Fälle eliminiert, bei denen 50 % und mehr des

Gewebes Nekrosen aufwiesen. Der Altersdurchschnitt der Patienten bei

Diagnosestellung der astrozytären Hirntumoren liegt weitgehend im Rahmen der von

OHGAKI et al. (2005) ermittelten Werte. Die Lokalisationen der unterschiedlichen

Hirntumoren sind, soweit sie aus den Akten ermittelt werden konnten (vergleiche

Abb. 4 A - D im Ergebnisteil), in Einklang mit Untersuchungen von WELLER et al.

(2006) bzw. WICK et al. (2006). Diese geben folgende bevorzugte Lokalisationen an:

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Diskussion 48

Astrozytome WHO Grad I: Kleinhirn, Astrozytome WHO Grad II:

Großhirnhemisphären, Astrozytome WHO Grad III: Frontal- und Temporallappen,

Astrozytome WHO Grad IV: Frontal- und Temporallappen, aber auch multiple

Lokalisationen, Oligodendrogliome WHO Grad II: Großhirnhemisphären,

Oligodendrogliome WHO Grad III: Frontallappen. Damit korreliert unser Material mit

den publizierten Daten.

Im Vergleich zu den Daten der WHO bzw. der CBTR-US und den von OHGAKI et al.

(2005) veröffentlichten Daten ergeben sich für das untersuchte Kollektiv an

Oligodendrogliomen kleinere Abweichungen beim mittleren Alter bei

Diagnosestellung und der Häufigkeitsverteilung. Das mittlere Alter bei

Diagnosestellung liegt bei dem untersuchten Kollektiv für die Oligodendrogliome

Grad II geringfügig über und für Grad III etwas unter den von OGAHKI angegebenen

Werten. Die Häufigkeiten für Oligodendrogliome Grad II sind etwas geringer bzw für

Oligodendrogliome des WHO Grades III etwas häufiger im Vergleich zu den von der

WHO bzw. CBTR-US angegebenen Zahlen. Diese Abweichungen sind mit den relativ

geringen Fallzahlen des untersuchten Kollektivs zu erklären. Bei einem größeren

Kollektiv wären die Daten mutmaßlich ausgewogener (vergleiche Tab. 5 im

Ergebnisteil).

4.1. Astrozytäre Hirntumoren

In der vorliegenden Arbeit fanden sich bei der Untersuchung der astrozytären

Hirntumoren auf die Expression von P-gp immunhistochemisch und durch in situ

Hybridisierung mit zunehmendem Anaplasiegrad steigende P-gp-Expressionslevel.

Diese Ergebnisse sind vereinbar mit den Daten der Arbeitsgruppen von DIETZMANN

und von VON BOSSANYI, die bei astrozytären Hirntumoren eine vermehrte Expression

von P-gp mit zunehmendem WHO Grad feststellen konnten [DIETZMANN et al., 1994;

VON BOSSANYI et al. 1997].

Auffällig war, dass sich sowohl in der immunhistochemischen Untersuchung als auch

in der in situ Hybridisierung bei den Astrozytomen jeweils ein Abfall der Expression

von WHO Grad III zu WHO Grad IV zeigte. Das Absinken der P-gp-Expression von

Astrozytomen des WHO Grades III zu WHO Grad IV widerspricht zunächst der

Annahme, dass hohe P-gp-Expressionslevel mit hoher Malignität und einer

schlechten Prognose vergesellschaftet sind. Obwohl die Gewebsproben sorgfältig

ausgewählt wurden, waren bei den Glioblastomen (Astrozytom WHO Grad IV) immer

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Diskussion 49

wieder auch größere Nekrosen und Einblutungen vorhanden, da diese, neben

zellmorphologischen Kriterien, die entscheidende Voraussetzung für die Diagnose

„Glioblastoma multiforme“ darstellen. Die nekrotischen bzw. eingebluteten Areale

können sich bei den verschiedenen Nachweismethoden färberisch „stumm“

darstellen, woraus niedrigere Expressionslevel resultieren. Dies würde erklären, dass

der Expressionsabfall alle in der vorliegenden Arbeit untersuchten Proteine betrifft.

Außerdem ist es möglich, dass P-gp nur einer von zahlreichen Faktoren ist, die bei

der „multidrug-resistance“ (MDR) maligner Hirntumoren von Bedeutung sind, so dass

es vorstellbar ist, dass gerade bei den hochmalignen Astrozytomen des WHO

Grades IV (Glioblastoma multiforme) die Überexpression von P-gp nicht (mehr) die

wichtigste Rolle spielt.

In unterschiedlichen Studien wurde die Expression von P-gp an verschiedenen

primären Hirntumoren untersucht [BECKER et al., 1991; LEWEKE et al., 1998; HENSON

et al., 1992; NABORS et al., 1991]. Die Überexpression von P-gp an der Blut-Hirn-

Schranke bzw. den Tumorzellen selbst wird mit verantwortlich gemacht für das sehr

schlechte Ansprechen von Hirntumoren auf Chemotherapie [LEWEKE et al., 1998].

P-gp transportiert in seiner Eigenschaft als aktive Effluxpumpe in die Zelle

aufgenommene Substanzen wieder heraus und schützt das ZNS dadurch vor

möglicherweise schädlichen Effekten [LÖSCHER et al., 2005; AMBUDKAR et al., 2003;

BORST et al., 2002]. Diese Funktion stellt auch das Korrelat der P-gp-vermittelten

Chemoresistenz von Tumorzellen dar. Chemisch und funktionell verschiedene

Chemotherapeutika (wie z.B. Doxorubicin, Daunorubicin, Vincristin, Vinblastin,

Actinomycin-D, Paclitaxel, Docetaxel, Etoposide, Teniposide, Bisantrene oder

Gleevec) werden von P-gp am Eintritt in das Gliom gehindert bzw. aus den Zellen

entfernt [AMBUDKAR et al., 2003; BORST et al., 2002; SAUNA et al., 2001]. Die durch P-

gp vermittelte Resistenz gegenüber Chemotherapeutika konnte an verschiedenen

Tumoren (z.B. Adenokarzinomen des Gastrointestinaltraktes und der Lunge,

Ovarialkarzinomen sowie Tumoren des ZNS) gezeigt werden [SHI et al., 2008; YEH et

al., 2005; MOHRI et al., 2000; TEWS et al., 2000; MEIJER GA et al., 1999]. Die

Bedeutung der P-gp-Expression bei malignen Hirntumoren wird jedoch kontrovers

diskutiert, da in den verschiedenen Studien erhebliche Streuungen in der P-gp-

Expression bei den unterschiedlichen Malignitätsgraden auftraten [TEWS et al., 2000].

Die Ergebnisse sind zudem nur bedingt miteinander vergleichbar, da

unterschiedliche Methoden zum Nachweis und zur Auswertung benutzt wurden. Die

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Diskussion 50

Arbeitsgruppe um SPIEGL-KREINECKER untersuchte die P-gp-Expression mittels RT-

PCR an Zellkulturen von unterschiedlichen Hirntumoren und fand bei Astrozytomen

nur in wenigen Fällen eine Expression [SPIEGL-KREINECKER et al., 2002]. TEWS und

seine Mitarbeiter konnten in ihrer immunhistochmischen Untersuchung von 44 in

paraffingebetteten Gewebsproben astrozytärer Hirntumoren zwar ansteigende

Expressionslevel mit zunehmendem Malignitätsgrad nachweisen, die Ergebnisse

waren jedoch nicht statistisch signifikant [TEWS et al., 2000]. Des Weiteren finden

sich in der Literatur Beschreibungen von Kreuzreaktionen des auch in dieser

Untersuchung verwendeten Antikörpers JSB-1 mit Pyruvatcarboxylase, einem

Enzym, das reichlich in Mitochondrien vorkommt, wodurch in Tumoren z. T. sehr

hohe Expressionslevels gemessen wurden [ASHMORE et al., 1999]. Andererseits

berichten VON BOSSANYI et al. (1997) über die überlegene Nachweismethode mittels

JSB-1 im Vergleich zu anderen monoklonalen Antikörpern. Insgesamt ist die isoliert

betrachtete Aussagekraft der P-gp-Expression bei astrozytären Hirntumoren in

Hinblick auf die Prognose als eingeschränkt zu werten, weil aus einem schwachen

oder negativen Ausfall der immunhistologischen Reaktion vor allem bei

höhergradigen Hirntumoren nicht mit ausreichender Sicherheit eine günstige

Prognose und eine bessere Chemosensitivität abgeleitet werden kann [DIETZMANN et

al., 1994; TEWS et al., 2000].

Ein weiterer Kandidat als prognostischer Marker ist Survivin, ein Mitglied der Familie

der „Inhibitors-of-Apoptosis-Proteins“ (IAP), das mutmaßlich durch Inhibition der

Caspase-Kaskade den programmierten Zelltod (Apoptose) von Tumorzellen

verhindert. Es gibt einige Hinweise, dass zwischen Survivin und P-gp eine

Wechselbeziehung bei der Entstehung von „multidrug-resistance“ (MDR) besteht,

wobei die genauen Mechanismen der Zusammenhänge nicht bekannt sind. LIU et al.

(2007) stellten aufgrund ihrer Untersuchungen der mRNA-Expression von P-gp bzw.

Survivin an Zellkulturen eines Adenokarzinomes der menschlichen Brustdrüse und

der dazugehörigen Adriamycin-resistenten Variante die Hypothese auf, dass eine

verstärkte Expression von P-gp den intrazellulären Transport von Survivin in die

verschiedenen Zellkompartimente erleichtert und Survivin so die Zielorte seiner

promitotischen und antiapoptotischen Wirkung leichter erreichen kann. Sie

vermuteten zudem einen modulierenden Einfluß von Survivin auf den P-gp-Umsatz in

der Zelle.

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Diskussion 51

Daher wurden in der vorliegenden Untersuchung die Hirntumoren immunhisto-

chemisch und durch in situ Hybridisierung auch auf die Expression von Survivin

untersucht.

An zahlreichen unterschiedlichen Tumorerkrankungen wie z. B. Karzinomen des

Gastrointestinaltraktes, Mammakarzinomen, Prostatakarzinomen oder Lymphomen

wurde die Expression von Survivin untersucht [CHIOU et al., 2003; KAJIWARA et al.,

2003]. Von unterschiedlichen Arbeitsgruppen konnte gezeigt werden, dass eine

höhere Survivinexpression mit einer höheren Malignität und somit mit einer

schlechteren Prognose einhergeht. Die Arbeitsgruppe um CHAKRAVARTI untersuchte

die Protein-Expressionslevels von Survivin an 92 Gliomen mittels des Western Blot

Analyseverfahren. KAJIWARA und seine Mitarbeiter führten eine PCR-Analyse der

mRNA-Expression von Survivin an 43 astrozytären Hirntumoren durch. Insbesondere

für Astrozytome konnte nachgewiesen werden, dass die Survivinexpression mit einer

schlechteren Prognose assoziiert ist [KAJIWARA et al., 2003; CHAKRAVARTI et al.,

2002]. SASAKI et al. (2002) fanden bei immunhistochemischen Untersuchungen von

112 primären Hirntumoren in allen Hirntumoren eine Expression von Survivin, wobei

die Expression bei den Glioblastomen am höchsten war.

In der vorliegenden Arbeit konnte bei den Astrozytomen ebenfalls ein Anstieg der

Survivinexpression (Protein und RNA) mit zunehmendem Anaplasiegrad gezeigt

werden. Jedoch war ein Abfall der Expression bei den Astrozytomen des WHO-

Grades III zu WHO Grad IV erkennbar. Die Arbeitsgruppe um CHAKRAVARTI (2002)

stellte bei einer Untersuchung von 92 Gliomen fest, dass bei etwa 40 % der

Glioblastome keine Expression von Survivin nachzuweisen war. Es gibt Hinweise,

dass vor allem die Glioblastome nicht nur Survivin exprimieren, sondern dass auch

andere Proteine aus der „Inhibitors-of-apoptosis“-(IAPs)-Familie aktiviert werden, um

der Apoptose zu entgehen. Neben der Annahme, dass die bei den Glioblastomen

naturgemäß auftretende Nekrose sich immunhistochemisch „stumm“ verhält, ist dies

eine weitere Erklärung für das Absinken der Survivin-Expressionslevel bei den

Astrozytomen WHO Grad III zu WHO Grad IV.

Die Frage nach der Wertigkeit von Survivin als prognostischer Faktor wird durchaus

kontrovers diskutiert. Die Arbeitsgruppe von UEMATSU (2005) stellte bei einer

immunhistochemischen Untersuchung von 29 Astrozytomen fest, dass der

Survivinindex im Vergleich zum Proliferationsindex bei den niedrigmalignen

Astrozytomen ein sensitiverer Marker zur Abschätzung der Prognose ist. ROUSSEAU

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Diskussion 52

et al. (2006) untersuchten 20 Gangliogliome immunhistochemisch auf eine

Expression von Survivin und empfehlen bei hohen Survivinexpressionslevel eine

besonders engmaschige Nachkontrolle, da hohe Survivinlevel mit einer höheren

Malignität der Tumoren gleichzusetzen waren. Dagegen fanden PREUSSER et al.

(2005) in einer immunhistochemischen Untersuchung von 104 Glioblastomen keinen

signifikanten Zusammenhang der Survivinexpression mit dem Gesamtüberleben bei

malignen Hirntumoren. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit erlauben keine

Aussage über die Korrelation des Survivin-Expressionslevels mit der Überlebenszeit

der Patienten, da keine einheitlich erhobenen Verlaufsdaten vorliegen. Dies hängt

auch mit der oftmals andernorts durchgeführten Weiterbehandlung bzw.

Weiterbetreuung der Patienten, vor allem auch in der Palliativsituation, zusammen.

Zur weiteren Charakterisierung der proliferativen Aktivität wurden die Präparate auf

die Expression des Ki-67-Antigens untersucht. Das Ki-67-Antigen zeigt im Zellzyklus

ein Auftreten, das zeitlich mit dem von Survivin vergleichbar ist. Es handelt sich dabei

um einen nukleären Proliferationsmarker, der während des Zellzyklus in der G1-, S-,

G2- und der M-Phase exprimiert wird, wohingegen er in der Ruhephase, der G0-

Phase des Zellzyklus, nicht nachweisbar ist. Zellpopulationen, die stark proliferieren

und sich zu einem großen Teil in einer aktiven Phase des Zellzyklus befinden,

exprimieren somit sehr viel Ki-67. Dieses Antigen kann mit dem gegen Ki-67

gerichteten Antikörper MiB-1 spezifisch nachgewiesen werden und erlaubt somit eine

Aussage über die Proliferationsaktivität eines Gewebes [MC CORMICK et al., 1993].

Mit steigendem Malignitätsgrad war bei den Astrozytomen ein Anstieg des

Proliferationsindex nachweisbar, wobei auch hier ein Abfall des Index von

Malignitätsgrad III zu IV zu erkennen war. Die Zunahme des Proliferationsindex als

Maß für die Aggressivität des Tumors und somit für eine schlechtere Prognose wurde

für astrozytäre Hirntumoren der verschiedenen WHO-Grade auch von der

Arbeitsgruppe um RALTE (2001) nachgewiesen. Der MiB-1-Index stellt eine

Messeinheit für die Proliferation eines Gewebes, d.h. für die mitotische Aktivität bzw.

für die Malignität dar. Somit überrascht die in der vorliegenden Arbeit festgestellte

positive Korrelation der Expression von Survivin und des MiB-1-Index nicht, da

Survivin eine wichtige Rolle in der Zellteilung spielt [LI et al., 2005; SKOUFIAS et al.,

2000; WHEATLEY et al., 2001].

Über die prognostische Wertigkeit des Proliferationsindex gibt es unterschiedliche

Ansichten. UEMATSU et al. (2005) kamen zu dem Schluss, dass sich insbesondere für

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Diskussion 53

die niedrigmalignen Astrozytome der Survivinindex für Prognoseaussagen eher

eignet. Bislang die Frage ungeklärt, welche Grenzwerte des Proliferationsindexes für

die jeweiligen Malignitätsgrade gelten. Da selbst innerhalb einer Gewebsprobe bei

der Durchmusterung mehrerer Gesichtsfelder Unterschiede in der Proliferation

auftreten und zudem noch die Methoden zur Auswertung (Anzahl der untersuchten

Gesichtsfelder, ausschließliche Berücksichtigung von Arealen mit der höchsten

Proliferation) erheblich variieren, konnte bisher auch beim Vergleich der

verschiedenen Publikationen kein eindeutiger Grenzwert für den Proliferationsindex

festgelegt werden [REAVEY-CANTWELL et al., 2001; RICKERT et al., 2005].

Als Gegenprobe zum Proliferations- bzw. Survivinindex wurde immunhistochemisch

der Apoptoseindex ermittelt. Die aktivierte Caspase-3 ist eine der Effektorcaspasen

und eines der Schlüsselproteine der Apoptose. Sie wird zur Ermittlung des

Apoptoseindex in einem Gewebe verwendet [DUAN et al., 2003; GOWN et al., 2002].

Die hohe Expression von aktivierter Caspase-3 gilt als Anhaltspunkt für eine

niedrigere Malignität [KOBAYASHi et al., 2007]. Umgekehrt bedeutet dies, dass mit

ansteigendem Malignitätsgrad die Expression von aktivierter Caspase-3 absinken

sollte.

In der vorliegenden Arbeit fand sich bei den Astrozytomen ein mit steigendem

Malignitätsgrad sinkender Apoptoseindex. Dies steht im Einklang mit unserer

Hypothese sowie mit anderen Daten. So fanden KOBAYASHI et al. (2007) ebenfalls

sinkende Apoptoseindices bei steigendem Anaplasiegrad in Gewebsproben von 65

Patienten mit unterschiedlichen astrozytären Hirntumoren.

Bislang gibt es erst wenige Publikationen hinsichtlich der prognostischen Bedeutung

des Apoptoseindex bei malignen Hirntumoren. KOBAYASHi et al. (2007) halten die

immunhistochemische Bestimmung von aktivierter Caspase-3 für eine nützliche

Untersuchung, um Aussagen über das Langzeitüberleben von Patienten mit

Astrozytomen treffen zu können.

4.2. Oligodendrogliale Hirntumoren

In der vorliegenden Arbeit fanden sich bei der immunhistochemischen Untersuchung

der Oligodendrogliome ebenfalls mit steigendem Malignitätsgrad ansteigende P-gp-

Level. Im Vergleich mit den Astrozytomen waren die P-gp-Expressionslevel höher.

Zur Expression von P-gp in Oligodendrogliomen gibt es nur wenige veröffentlichte

Daten. Die Arbeitsgruppe um DEMEULE konnte mittels Western Blot Analyse an

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Diskussion 54

Homogenisaten von unterschiedlichen primären und sekundären Hirntumoren,

darunter auch anaplastische Oligodendrogliome, eine Expression von P-gp

nachweisen [DEMEULE et al, 2001]. Nach ASHMORE et al. (1999), die Zellkulturen

einer Reihe unterschiedlicher Hirntumoren immunzytochemisch mit verschiedenen

P-gp-Antikörpern untersuchten, ist die Expression von P-gp bei Oligodendrogliomen

im Allgemeinen niedrig, vergleichbar mit benignen Hirntumoren. Allerdings scheint

diese Aussage sehr allgemein gehalten, da es auch relativ gutartige Hirntumoren

gibt, die eine Überexpression von P-gp aufweisen können. Dysembryoplastische

neuroepitheliale Tumoren (DNT), die oft eine Ursache für eine medikamentös nur

unzureichend therapierbare Epilepsie darstellen, sind verhältnismäßig benigne

Hirntumoren. In einer Studie von 14 DNT-Fällen untersuchten VOGELGESANG et al.

(2004) die Expression von P-gp bzw. anderen Multidrug-Transportern mittels

Immunhistochemie. Dabei fand sich eine erhöhte Expression aller untersuchten ABC-

Transporter (P-gp, BCRP, MRP2, MRP5) innerhalb des Tumorgewebes.

Interessanterweise zeigte sich eine unterschiedliche Lokalisation der verschiedenen

Transportproteine, so dass anzunehmen ist, dass der Einfluss der ABC-Transporter

auf die Entwicklung einer Pharmakoresistenz nicht auf die Blut-Hirn-Schranke

begrenzt ist.

Bei der Untersuchung der Oligodendrogliome auf die Expression von Survivin fand

sich mit steigendem Malignitätsgrad ein Anstieg der Protein- und RNA-Level. Die

Survivin- Expressionslevel lagen bei den Oligodendrogliomen niedriger als bei den

Astrozytomen mit vergleichbarem WHO-Malignitätsgrad, was auf eine geringere

Hemmung der Apoptose hinweist. In ähnlicher Weise wie die Expression von

Survivin verhielt sich auch der bei den Oligodendrogliomen untersuchte

Proliferationsindex. Mit ansteigendem Malignitätsgrad nahm der Proliferationsindex

zu, er blieb jedoch auf einem niedrigeren Level als bei den Astrozytomen. Diese

Ergebnisse unterstützen die Aussage von ENGELHARD et al. (2003) bzw. TROST et al.

(2007), wonach Oligodendrogliome im Vergleich zu Astrozytomen eine bessere

Prognose aufweisen.

Wie auch bei den Astrozytomen wurde anhand der Caspase-3-Färbung die

antiproliferative Aktivität mit dem Apoptoseindex untersucht. Die Apoptoseindices

veränderten sich bei den Oligodendrogliomen mit steigendem WHO-Grad nicht, sie

lagen jedoch auf einem signifikant niedrigeren Niveau als die der Astrozytome. Die

niedrigeren Werte bei den Oligodendrogliomen stehen auf den ersten Blick im

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Diskussion 55

Widerspruch zur Annahme, dass eine niedrigere Expression von aktivierter Caspase-

3 eine höhere Malignität bedeutet. Bei der Interpretation dieses Ergebnisses ist

allerdings zum einen die verhältnismäßig geringe Anzahl der Oligodendrogliome, die

in dieser Studie untersucht wurden, zu berücksichtigen. Zum anderen handelt es sich

bei den Tumoren, bei denen bislang hohe Level an aktivierter Caspase-3

nachgewiesen werden konnten, vor allem um hochmaligne Tumoren wie z. B.

maligne Lymphome, Ösophaguskarzinome und das kleinzellige Bronchialkarzinom

[KOBAYASHi et al., 2007]. Das bedeutet, dass bei der großen Zahl gering

differenzierter Tumorzellen auch die Anzahl der Zellen, die apoptotisch werden

können, größer ist. Hierin ergibt sich eine weitere mögliche Erklärung für die

verhältnismäßig niedrigeren Level an aktiverter Caspase-3 bei den

Oligodendrogliomen: da hier im Verhältnis weniger anaplastische Tumorzellen

auftreten, befinden sich von diesen Tumorzellen auch weniger in Apoptose. Dies wird

in der vorliegenden Untersuchung zudem durch die positive Korrelation zwischen der

Survivin-Protein-Expression und dem Nachweis der aktivierten Caspase-3 deutlich.

Die Daten der unterschiedlichen Expressionmuster für P-gp, Survivin, Ki-67 und

Caspase-3 der Oligodendrogliome im Vergleich mit den Astrozytomen erklären

zumindest zum Teil, dass sich oligodendrogliale Hirntumoren prognostisch günstiger

verhalten als Astrozytome.

Prognostisch günstig ist das Zusammentreffen folgender Parameter:

oligodendroglialer Tumor, niedrige P-Glycoproteinexpression, geringe Expression

von Survivin, niedriger Proliferationsindex, hoher Apoptoseindex.

Dementsprechend ungünstig ist folgende Konstellation: höhergradiger astrozytärer

Tumor, hohe Expression von P-Glycoprotein, hohe Expression von Survivin, hoher

Proliferationsindex, niedriger Apoptoseindex.

Um festzulegen, welche Grenzen der P-gp-, Survivin-, Caspase-3- und Ki-67-

Expression prognostisch relevant sind, sollten weitere prospektive Untersuchungen

durchgeführt werden, in denen der klinische Verlauf einheitlich erhoben und genau

untersucht wird. Dabei wären vor allem Untersuchungen an deutlich größeren

Kollektiven von Oligodendrogliomen wertvoll.

Die erhobenen Daten lassen Rückschlüsse auf mögliche therapeutische

Konsequenzen zu. In den letzten Jahren wurden erhebliche Anstrengungen

unternommen, um die Chemoresistenz von Hirntumoren zu durchbrechen, um so die

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Diskussion 56

therapeutischen Möglichkeiten besser nutzen zu können. BOROWSKI et al. (2005)

formulieren vier mögliche Strategien, um die P-gp-vermittelte Resistenz von

Tumorzellen aufzuheben: die Entwicklung von Chemotherapeutika, die aufgrund

ihrer Beschaffenheit kein Substrat für den aktiven Transport durch P-gp darstellen;

den Einsatz von P-gp-Inhibitoren; die Herstellung von Zytostatika, die sich durch eine

besonders schnelle Aufnahme in die Zelle auszeichnen, um so rein quantitativ den

Abtransport zu übertreffen sowie den Einsatz von Wirkstoffzusammensetzungen, bei

denen, neben dem Wirkstoff, mehrere Bestandteile ein Substrat für P-gp darstellen

und somit verhältnismäßig weniger Wirkstoff wieder aus der Zelle entfernt wird. Die

Entwicklung neuer Substanzen ist ein langwieriger Prozess und es besteht immer die

Gefahr einer erheblichen Toxizität im nicht-tumoralen Gewebe. Auch der Einsatz von

P-gp-Inhibitoren (z.B. Verapamil) ist nicht immer unproblematisch, da nicht nur der

Auswärtstransport aus der Tumorzelle gehemmt wird, sondern auch die

physiologische Funktion von P-gp an natürlichen Barrieren wie z.B. der Blut-Hirn-

Schranke oder der Mukosa des Gastrointestinaltraktes (BOROWSKI E et al., 2005;

CHOI CH, 2005). P-gp unterliegt, wie auch andere Proteine, im Rahmen der

Apoptose einer caspase-abhängigen Spaltung (MANTOVANI et al., 2006). Ein weiterer

möglicher Therapieansatz wäre also in Form einer Umkehr bzw. Verhinderung der

Apoptose-Inhibition, wie sie z.B. durch Survivin vermittelt wird, denkbar. Möglich wird

die Inhibition von Survivin z.B. durch den Einsatz von Survivin-Antisense-

Oligonukleotiden, wie sie von SHANKAR et al. (2001) bzw. ANSELL et al. (2004) mit

Erfolg an Zellkulturen von Neuroblastom- bzw Oligodendrogliomzellen und an

Lymphomzellen eingesetzt wurden. Inwieweit sich diese Erkenntnisse auch in eine

am Patienten einsetzbare Therapie umsetzen lassen, werden künftige Studien

zeigen.

Da der Entstehung bzw. Aufrechterhaltung der Chemoresistenz von Tumorzellen

offenbar ein noch unzureichend verstandenes, multifaktorielles Geschehen zugrunde

liegt, das sich aus völlig unterschiedlichen Mechanismen, unter anderem dem aktiven

Abtransport von Chemotherapeutika und der Immortalisierung der Tumorzelle durch

Inhibition der Caspasekaskade, zusammensetzt, muss weiter intensiv am

Zusammenwirken bzw. der Funktion der verschiedenen Komponenten, aber auch an

möglichen therapeutischen Optionen geforscht werden.

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Zusammenfassung 57

5. Zusammenfassung

In Deutschland gibt es pro Jahr etwa 8000 Neuerkrankungen an primären

Hirntumoren. Bei Erwachsenen stehen die neuroepithelialen Hirntumoren, zu denen

die Astrozytome und die Oligodendrogliome zählen, im Vordergrund. Die größte

Gruppe stellen die Astrozytome. Diese Tumoren sind verhältnismäßig häufig und

hinsichtlich verschiedener prognostischer Marker eingehend untersucht worden.

Oligodendrogliome sind seltener und weniger ausführlich untersucht als Astrozytome.

Ihnen wird im Vergleich zu den Astrozytomen eine bessere Prognose zugeschrieben.

In der vorliegenden Arbeit wurden vier unterschiedliche Prognosemarker untersucht:

P-Glycoprotein (P-gp), Survivin, Ki-67 und Caspase-3. Bei den Astrozytomen fand

sich mit steigendem Malignitätsgrad eine Zunahme der Expression von P-gp,

Survivin und Ki-67, während die Expression von Caspase-3 abfiel. Bei den

Oligodendrogliomen stellten sich ebenfalls mit zunehmendem Anaplasiegrad

steigende Expressionslevel von P-gp, Survivin und Ki-67 dar, diese jedoch auf einem

signifikant niedrigeren Niveau als bei den Astrozytomen. Die Level für Caspase-3

waren niedriger als bei den Astrozytomen. Dies bedeutet, dass mit zunehmendem

Malignitätsgrad der Hirntumoren die proliferative Aktivität zu-, und die apoptotische

Aktivität abnimmt. Dies steht im Einklang mit dem biologischen Verhalten der Gliome

in Abhängigkeit vom Malignitätsgrad.

Die signifikant niedrigeren Expressionslevels bei den Oligodendrogliomen im

Vergleich mit den Astrozytomen untermauern weiter die These, dass

oligodendroglialen Hirntumoren eine bessere Prognose zukommt als astrozytären

Hirntumoren.

Um sichere, für die Prognose relevante Grenzwerte für die einzelnen Marker

bestimmen zu können, sollten weitere prospektive Studien durchgeführt werden, in

denen der klinische Verlauf einheitlich erhoben und analysiert wird. Hierbei wären vor

allem Untersuchungen an größeren Kollektiven von Oligodendrogliomen sinnvoll.

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(Frankreich), 2007

Ein Teil der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wurde als Poster bei der 52.

Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Neuropathologie und Neuroanatomie

(DGNN) (05.09.2007 – 08.09.2007, Greifswald) vorgestellt.

Abstract in: Acta Neuropatholgica (2007), 114: 320.

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Eidesstattliche Erklärung

69

7. Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und

keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.

Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät vorgelegt worden.

Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und

dass eine Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.

Datum Unterschrift

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Lebenslauf

70

8. Lebenslauf Alexandra Dreßler (geb. Mesko) Matterhornstr. 22 b 81825 München Geboren am 19.06.1976 in München Beruflicher Werdegang 01.08.2003 – 30.09.2004 Ärztin im Praktikum in der 1. Chirurgischen Abteilung,

Krankenhaus Neuperlach, München 01.10.2004 – 31.03.2005 Assistenzärztin in der 1. Chirurgischen Abteilung,

Krankenhaus Neuperlach, München 01.09.2005 - 30.11.2007 Assistenzärztin im Institut für Pathologie der Ernst-Moritz-

Arndt-Universität, Greifswald 01.01.2008 – 31.05.2009 Assistenzärztin im Institut für Pathologie der Ludwig-

Maximilian-Universität, München seit 01.06.2009 Assistenzärztin im Institut für Pathologie des Klinikums

Memmingen

Berufsausbildung/Studium __________________________________ 5/1996 – 8/1998 Vorklinisches Studium/ LMU München 9/1998 – 4/2002 Klinisches Studium/ LMU München 4/2002 – 8/2002 I. Tertial des Praktischen Jahres (Kinderheilkunde) im

Zentralklinikum Augsburg 8/2002 – 9/2002 II. Tertial des Praktischen Jahres (Innere Medizin) im

Zentralklinikum Augsburg (1. Hälfte) 9/2002 – 11/2002 II. Tertial des Praktischen Jahres (Innere Medizin)

University of Toronto (2. Hälfte) 12/2002 – 3/2003 III. Tertial des Praktischen Jahres (Chirurgie)

Krankenhaus Neuperlach München 08.05.2003 Abschluß des Studiums durch bestandenes

III. Staatsexamen

01.09.1995 - 30.11.1995 Krankenpflegepraktikum KKH Mering 01.03.1999-31.03.1999 Famulatur Innere Medizin KKH Mering 01.10.1999-31.10.1999 Famulatur Chirurgie KKH Mering 16.08.2000-15.09.2000 Famulatur Kinderchirurgie München Schwabing 18.09.2000-19.10.2000 Famulatur Kinderarztpraxis Dr. Riechert, München

Schulbildung ________________________________________________ Sept .1982 - Jul.1986 Grundschule Penzberg Sept. 1986 - Jul.1987 Gymnasium Penzberg Sept. 1987 - Jul.1989 Rudolf-Diesel-Gymnasium Augsburg

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Lebenslauf

71

Sept. 1989 - Mai 1995 Gymnasium Schondorf am Ammersee Abitur im Mai 19959. Danksagung

Ich bedanke mich bei meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. Rolf Warzok für die

freundliche Überlassung des Themas sowie für die fachliche Beratung und

Unterstützung, die er mir in vielen Gesprächen zuteil werden ließ. Dies gilt

insbesondere auch für Frau PD Dr. Silke Vogelgesang, die mir nicht nur bei der

statistischen Aufarbeitung der Ergebnisse sondern auch bei der Korrektur der Arbeit

mit Rat und Tat zur Seite stand.

Ohne die Unterstützung von Frau Dr. Michele Peters und Frau Dr. Christiane Kunert-

Keil wäre weder die Planung noch die Umsetzung des experimentellen Teils der

Arbeit möglich gewesen. Von Frau Maria Grumbt und Frau Eva Simon kamen

zahlreiche Vorversuche und Optimierungen der Protokolle für die

immunhistochemische Untersuchung und die in situ Hybridisierung. Frau Cathrin

Müller, Frau Anke Wolter, Frau Heike Reiter und Frau Sigrid Balk fertigten die

benötigten Serienschnitte an und führten die standardisierten Färbungen zum Teil

auch von Hand durch. Allen bin ich zu tiefem Dank verpflichtet.

In der vorliegenden Form wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen ohne die

freundliche finanzielle Unterstützung durch das Department für Neurowissenschaften

der Universität Greifswald, welches diese Arbeit bezuschusste.

Die klinischen Angaben wurden den freundlicherweise von der Klinik für

Neurochirurgie (Direktor Prof. Dr. Henry W.S. Schröder), Universität Greifswald

überlassenen Patientenakten entnommen.

Auch ohne direkten Zusammenhang mit dieser Dissertation bin ich einigen

Menschen sehr dankbar, da ich ohne sie in meinem Leben nicht das erreicht hätte,

was ich bisher erreichen konnte. Daher geht auch ein besonderer Dank an meine

Eltern, die mir das Studium der Medizin durch jede Art der Unterstützung im In- und

Ausland ermöglichten.

Meinem Mann Torsten Dreßler, der die beruflich bedingte Trennung mit mir

gemeinsam durchgestanden hat und immer ein Fels in der Brandung war und ist,

danke ich für alles was war und was kommt.

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Danksagung

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Nicht zuletzt danke ich Herrn Prof. Manfred Heuser aus München, der in seinen

Gesprächen mit mir mit einer Prise Humor und Weisheit immer wieder für die richtige

Balance gesorgt hat.

Ein herzlicher Dank gebührt auch Frau Dr. Frauke Steinmüller, mit der mich nicht nur

die Erfahrung der ersten „Gehversuche“ in der Pathologie verbindet.

In liebevoller Erinnerung an meine Großmutter, Dr. med. Gerlind I. Mesko.


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